Nghiên cứu phương pháp tiền xử lý Lignocellulose trong sinh khối cỏ VA06 (Varisme 6) làm nguyên liệu sản xuất cồn sinh học

Cellulose không đứng một mình riêng lẻ mà được bao bọc và liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như lignin và hemicellulose tạo thành cấu trúc vững chắc lignocellulose [19].Việc loại

vv

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐOÀN VĂN THU

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TIỀN XỬ LÝ LIGNOCELLULOSE TRONG SINH KHỐI

CỎ VA06 (Varisme 6) LÀM NGUYÊN

LIỆU SẢN XUẤT CỒN SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGHÀNH: HÓA SINH

MÃ SỐ: 60 42 30 Người hướng dẫn khoa học: TS BÙI MINH TRÍ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên con xin gửi tới Bố Mẹ lòng biết ơn sâu sắc nhất Bố Mẹ đã sinh thành ra con và luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con phấn đấu trong cuộc sống này Dù con có thế nào thì Bố Mẹ luôn là nơi bình yên và che chở cho con

Em xin cảm ơn Thầy Bùi Minh Trí, Thầy là người đã cho em ước mơ và sự tin tưởng, sẽ không có từ ngữ nào để nói hết lòng biết ơn của em đối với Thầy Em luôn chúc cho Thầy và gia đình mạnh khỏe và thành công

Xin cảm ơn tất cả các Thầy, Cô đã từng dạy em, cho em những kiến thức để ngày hôm nay em vững bước trên đường đời

Cảm ơn các anh, chị, và các em sinh viên ngành Công nghệ sinh học trong Viện công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nông Lâm TPHCM đã giúp

đỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi làm đề tài

Cảm ơn các anh chị thuộc phòng kỹ thuật của Đại học Chung Nam – Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi thực hiện chụp hình kính hiển vi điện tử

Xin cảm ơn cuộc sống và những người thân yêu trong mái ấm nhỏ đã luôn cùng nhau vượt qua mọi khó khăn

Xin chân thành cảm ơn!

Đoàn Văn Thu

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ x

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii

Chương 1: Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1

1.2.1 Mục tiêu 1

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Thời gian và địa điểm thực hiện 2

Chương 2: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học 3

2.1.1 Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH) 3

2.1.2 Vai trò sinh khối trong sản xuất NLSH 4

2.2 Tổng quan về cây cỏ ở Việt Nam 6

2.2.1 Thành phần của các cây thân cỏ 6

2.2.1.1 Thành phần cấu tạo cellulose 8

2.2.1.2 Thành phần cấu tạo hemicellulose 11

2.2.1.3 Thành phần cấu tạo lignin 14

2.2.1.4 Các chất trích ly 17

2.2.1.5 Tro 18

2.2.2 Sự thủy phân cellulose 19

2.2.2.1 Cấu trúc enzyme cellulase 19

2.2.2.2 Cơ chế hoạt động 20

2.2.3 Sự phong phú của cây cỏ Việt Nam 19

2.3 Tổng quan về quá trình tiền xử lý trên thế giới và trong nước 23

2.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 23

2.3.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam 30

ii

2.3.3 Quá trình tiền xử lý thực hiện trong quá trình nghiên cứu 31

Chương 3 Vật liệu và phương pháp 32

3.1 Vật liệu 32

3.2 Trang thiết bị và dụng cụ 33

3.3 Hóa chất và các vật tư tiêu hao 34

3.4 Địa điểm thực hiện 35

3.5 Trình tự tiến hành 35

3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng Cellulose trong một số loại cỏ 36

3.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sự tác động của vi sóng và một số hóa chất kết hợp lên hàm lượng lignin và cellulose trong cỏ VA06 42

3.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng đường glucose tạo thành từ nguyên liệu đã qua tiền xử lý thủy phân bằng enzyme cellulase 46

3.5.4 Thí nghiệm 4: Phân lập các chủng nấm mốc có khả năng phân hủy cellulose, tiến hành nuôi cấy canh trường thu cellulase và kiểm tra khả năng thủy phân của enzyme trên cơ chất đã qua tiền xử lý 47

3.5.5 Xử lý số liệu 49

Chương 4:Kết quả và biện luận 50

4.1 Hàm lượng các thành phần chính có trong chất khô một số loại cỏ 50

4.2 Ảnh hưởng của vi sóng và một số hóa chất lên hàm lượng lignin và cellulose trong cỏ VA06 53

4.2.1 Ảnh hưởng của vi sóng lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 54

4.2.2 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp của vi sóng và NaCl lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 55

4.2.3 Ảnh hưởng của dung dịch NH4OHvới nhiệt độ khác nhaulên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 58

4.2.4 Ảnh hưởng của dung dịch H2O2 lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 60

iii

4.2.5 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NH4OH và H2O2 lên khả

năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 61

4.2.6 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và NH3 lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 63

4.2.7 Ảnh hưởng của sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và H2O2 lên khả năng loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose 64

4.2.8 Quy trình tối ưu 65

4.3 Hàm lượng đường glucose tạo thành từ nguyên liệu đã qua tiền xử lý thủy phân bằng enzyme cellulase 66

4.4 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính cellulase cao và tiến hành canh trường thu enzyme cellulase và kiểm tra khả năng thủy phân của enzyme trên cơ chất đã qua tiền xử lý 68

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 72

5.1 Kết luận: 72

5.2 Kiến nghị: 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

Phụ lục 78

1

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề.

Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên.Trong hàng ngàn năm lịch sử nhân loại, cellulose được xem như một vật liệu không thể thiếu cho quần áo, nhà ở, và còn đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự hình thành nền văn hóa của con người[15] Cellulose được hình thành bởi các liên kết 1-4 glucoside giữa các đơn phân là glucose Trong tự nhiên cellulose là thành phần vô cùng quan trọng trong cấu trúc của thực vật Cellulose không đứng một mình riêng lẻ mà được bao bọc và liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như lignin và hemicellulose tạo thành cấu trúc vững chắc lignocellulose [19].Việc loại bỏ lignin nhằm thu hồi cellulose là công việc được quan tâm trên toàn thế giới Đặc biệt khi các vấn đề về

“an ninh năng lượng”, môi trường sống thay đổi… trở thành vấn đề cấp thiết mang tính chất toàn cầu, thì việc thu hồi được cellulose và hemicellulose từ các phế phẩm nông nghiệp, các loài cỏ dại… như là một giải pháp “ nhất cử lưỡng tiện” được ưu tiên hàng đầu

Việt Nam là quốc gia nông nghiệp, được thiên nhiên ưu đãi, đất đai màu mỡ nên ngoài các phụ phẩm nông nghiệp còn là nơi tập trung tới 12.000 loài cây cỏ[2] Đây là một thuận lợi vô cùng lớn về nguồn nguyên liệu chứa cellulose Nhưng nguồn cellulose này hiện nay ở nước ta vẫn chưa được sử dụng một cách hữu hiệu nhất Nếu có một phương pháp tốt để thu hồi, lượng cellulose này sẽ đem lại những lợi ích vô cùng lớn cả về mặt kinh tế lẫn môi trường

Chính vì những lý do trên, dưới sự hướng dẫn của TS.Bùi Minh Trí tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp loại bỏ lignin trong sinh khối cây thân cỏ

nhằm thu hồi cellulose làm nguyên liệu trong sản xuất cồn sinh học”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu

- Đánh giá được thành phần cơ bản và tiềm năng sử dụng sinh khối của một

số loại cỏ thu nhận được

2

- Xây dựng kỹ thuật tiền xử lý tối ưu đối với giống cỏ điển hình nhằm thu hồi được lượng cellulose cao nhất có thể làm nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa tạo cồn sinh học

- Phân lập, tuyển chọn những chủng nấm có khả năng phân hủy cellulose Tiến hành canh trường thu enzyme cellulose

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định hàm lượng cellulose trong mẫu trước và sau quá trình tiền xử lý

- Xác định biện pháp tiền xử lý loại bỏ lignin tối ưu

- Nắm vững các kỹ thuật phân lập, tuyển chọn và canh trường thu enzyme

1.3.Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện tại: Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM từ tháng 11/2010 đến tháng 1 năm

2012

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học

2.1.1 Khái niệm nhiên liệu sinh học (NLSH)

Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, được sản xuất từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối Gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bản carbon (C) nằm trong chu trình lục hoá ngắn hạn, xả thải khí CO2, rồi thực vật hấp thụ lại CO2 đó để tạo thành sinh khối Chế biến nhiên liệu sinh học trên lý thuyết coi như không làm gia tăng CO2 trong khí quyển[31] Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi (than đá thuộc loại cổ sinh, không tái tạo), thể lỏng như xăng sinh học, diesel sinh học, hay thể khí như khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải)

Nhiên liệu ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễ dàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe

Hình 2.1.Chu trình carbon trong nhiên liệu sinh học

4

2.1.2 Vai trò sinh khối trong sản xuất nhiên liệu sinh học

Hiện nay, nhân loại đang phải đối mặt với một cuộc khủng hoảng về năng lượng khi các nguồn nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn kiệt và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Giải pháp mà con người tìm đến để khắc phục những vấn đề

đó chính là các nguồn năng lượng mới như năng lượng gió, mặt trời, sinh khối… Khác với các nguồn năng lượng tái tạo khác, năng lượng sinh khối không chỉ thay thế năng lượng hoá thạch mà còn góp phần xử lý ô nhiễm môi trường Vì vậy, năng lượng sinh khối thường được gắn liền với nền kinh tế carbon thấp hay nền kinh tế hydro, bảo vệ môi trường sinh thái, phát triển nông nghiệp, xóa đói, giảm nghèo, làm cho trái đất xanh hơn, sạch hơn Nhiên liệu sinh học không giống như các nguồn năng lượng tái sinh khác, NLSH có thể ở dạng lỏng dùng cho các phương tiện vận tải (ô tô, xe máy, máy bay, tàu hoả) Có hai dạng nhiên liệu sinh học phổ biến nhất là ethanol và diesel sinh học

Theo Bộ năng lượng Hoa Kỳ, sản lượng nhiên liệu sinh học tối đa theo lý thuyết, tính toán dựa trên hàm lượng carbon có trong phân tử của đường (trong nguyên liệu) và hàm lượng carbon có trong phân tử của ethanol Theo phản ứng sinh hoá như sau:

C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2

Bảng 2.1 Sản lượng ethanol tính theo lý thuyết từ các nguồn

nguyên liệu khô [33]

Nguyên liệu Sản lượng ethanol/ 1 tấn nguyên liệu khô

Hạt bắp ngô 124,4 gallon (470,854 lít)

Thân và lá bắp ngô 113,0 gallon (427,705 lít)

Rơm rạ 109,9 gallon (415,971 lít)

Phế phẩm của bông sợi 56,8 gallon (214, 988 lít)

Phế phẩm lâm nghiệp 81,5 gallon (308,477 lít)

Mạt cưa 100,8 gallon (381,528 lít)

Bã mía 111,5 gallon (422,027 lít)

Giấy vụn 116,2 gallon (439,817 lít)

5

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp, nên phế phụ phẩm từ nông nghiệp (

rơm, rạ, trấu…) là rất dồi dào Bên cạnh đó, Việt Nam còn là nơi tập trung hơn

12.000 loài cỏ dại, trong số đó có những loài cỏ du nhập vào nước ta có sinh khối

lớn Đó sẽ là thuận lợi lớn về nguồn nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học

Bảng 2.2 Tiềm năng nhiên liệu sinh học tại Việt Nam

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Nguồn sinh khối Tiềm năng (triệu

Giải pháp NLSH đã được nước ta quan tâm và chú trọng từ năm 2007, việc

sử dụng nguồn nguyên liệu từ nông sản như gạo, sắn, ngô để sản xuất NLSH đã

mang lại nhiều chuyển biến tích cực nhưng những vấn đề mới cũng đã nảy sinh như

diện tích đất canh tác, an ninh lương thực…Diện tích đất canh tác của nước ta ít (

khoảng 9.3 triệu ha), dân đông (88 triệu năm 2011, trung bình mỗi đầu người 0.107

ha), lại nghèo (GDP trung bình toàn dân là 1197usd /đầu người năm 2011, của nông

dân chỉ khoảng 1/2), vùng sản xuất nông nghiệp chính là đồng bằng Sông Cửu Long

và Sông Hồng đã quá tải Đất canh tác hiện nay phải tiếp tục sản xuất nông phẩm

thiết yếu cho đời sống người dân (chủ yếu là lúa, hoa màu phụ, cây kỹ nghệ) để tự

túc và xuất khẩu[30] [33]

¾ Vì vậy Việt Nam phải tìm nguồn nguyên liệu thực vật nào để sản xuất

NLSH mà:

6

- Không tranh giành đất đai với canh tác hoa màu, chăn nuôi gia súc, nuôi cá tôm

- Không ảnh hưởng tới diện tích rừng

- Thích hợp trên diện tích đất bỏ hoang cằn cỗi, sa mạc hoá, tổng cộng khoảng

10 triệu ha, gồm đất đồi trọc ở Miền Bắc (4.77 triệu ha), Bắc Trung Bộ (1.9 triệu ha), phía Nam Trung Bộ (1.63 triệu ha), và Tây nguyên (1.05 triệu ha)[33]

- Có hiệu quả kinh tế cao, giúp xoá đói giảm nghèo cho nông dân

¾ Việc tập trung nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu theo giai đoan hai ( sử dụng sinh khối biomass) là một giải pháp đáp ứng và phù hợp nước ta và xu hướng thế giới

2.2 Tổng quan về cây thân cỏ ở Việt Nam

2.2.1 Thành phần của các cây thân cỏ.

Cây thân cỏ thuộc lọai thực vật phi gỗ, cấu tạo chúng bao gồm các thành phần chính như: Cellulose chiếm 20-50%, hemicellulose khoảng 20 – 30%, lignin chiếm khoảng 10-30%, còn lại là thành phần các chất trích ly và khoáng[19] Các thành phần này không nằm riêng rẽ mà chúng liên kết với nhau tạo thành phức hợp được gọi là lignocellulose bền vững, giúp chúng chống lại các tác nhân phá hủy ngoài môi trường Điều này đã gây ra cản trở chính trong việc chuyển hóa sinh khối của chúng thành nhiên liệu sinh học mà bước đầu tạo thành các đường

Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt Tuy nhiên

nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc sử dụng nguồn phế liệu lignocellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu[10]

Lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin, chất trích ly, và một số chất vô cơ

Theo Hetti Palonen, về cơ bản trong cấu trúc phân tử của lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và chất kết dính như lignin Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và hình thành liên kết cộng hóa trị với nhau Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-

7

methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin[18]

Bảng 2.3 Các thành phần chính trong một số nguyên liệu giàu cellulose [19] Tên Cellulose Hemicellulose Lignin Tro Chất

Hình 2.2 Cấu trúc của lingocellulose [27]

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm Các

vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi

sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân[18]

2.2.1.1 Thành phần cấu tạo cellulose

Cellulose là một polysaccharide bao gồm một chuỗi của vài trăm đến hơn 10.000 đơn vị D-glucose mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc

từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình[12] Kiểu liên kết này khác mối liên kết α-1,4 glucose của tinh bột, chẳng hạn như tinh bột ngô từ hạt ngô[27]

Sự khác biệt về cấu trúc được chứng minh là khá đáng kể Chuỗi Cellulose là chuỗi thẳng và có phần cứng nhắc, nhưng tinh bột có cấu trúc chuỗi cuộn Điều đó làm cho các chuỗi cellulose hình thành các liên kết hydro rất nhiều, không giống như tinh bột, các chuỗi cellulose ráp thành bó cablelike, sợi tinh thể có độ bền cao

9

và có khả năng kháng thủy phân thành glucose Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi

đó OH tại C4 có tính chất của rượu[18]

Đầu không khử Đầu khử

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000 - 2.500.000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vanderwar và liên kết hydro

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi

sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng tồn tại thành hai vùng, vùng kết tinh và vô định hình Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình[4]

Hình 2.5 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain

10

- Vùng kết tinh (Fringed Fibrillar): phân tử cellulose được kéo thẳng và

định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình Các sợi cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch carbon của sợi cellulose bên cạnh Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động bên ngoài Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi của vùng này

Hình 2.6 Các kiểu liên kết trong vùng kết tinh và vô định hình [14]

- Vùngvô định hình (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều

sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 1800 cho toàn mạch Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể

vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm

độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro[4]

Chiều dài vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của vùng kết tinh Các cây gỗ lớn lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều vùng cellulose vô định hình[18]

Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại tự do, hydrogen của

Kết tinh Vô định hình

2.2.1.2 Thành phần cấu tạo hemicellulose

Hemicellulose cũng là một polysaccharide, nhưng nó thường tạo ra các chuỗi xylose xen kẽ với chuỗi bên có chứa arabinose, galactose, glucose, mannose, acetyl,

và các nhóm đường khác, tùy thuộc vào loại thực vật Hemicellulose chứa 500 đến 3.000 đơn vị đường và bao gồm một lượng nhỏ pectin, một số polysaccharide khác Thành phần cơ bản của hemicellulose là các D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4)[12] Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm[27]:

- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4)

- Xylose là thành phần quan trọng nhất

- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl -O liên kết với vị trí 2 hoặc 3

- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân

Hình 2.7 Cấu trúc của hemicellulose

- Galactoglucomannan là hemicellulose chủ yếu trong các loại gỗ mềm, mạch

chính của nó là một chuỗi tuyến tính hoặc phân nhánh bởi mannopyranose và glucopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 Phần dư D-Galactopyranose được liên kết như chuỗi bên một bởi liên kết α 1-6 Galactoglucomannan có thể được tạm chia thành hai loại: loại chứa nồng độ galactose thấp - đôi khi được gọi đơn giản như glucomannan và loại chứa galactose cao.Tỷ lệ của galactose, glucose

D-và mannose là 0.1-0.2:1:3-4 D-và 1:01:03 trong hai loại tương ứng Các nhóm hydroxyl ở vị trí C2 và C3 trong mạch chính có một phần thay thế bởi nhóm O-acetyl, một nhóm trung bình có 3-4 đơn vị hexose[12]

Hình 2.8 Galactoglucomannan

- Arabinoglucuronoxylan (gọi tắt là xylan), cấu tạo từ các D-xylopyranose

liên kết với nhau bằng liên kết β –(1,4), các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic trung bình từ 5-6 đơn vị xylose, ở vị trí 3 bằng α- L-arabinofuranose trung bình 5-12 đơn vị xylose[12]

13

Hình 2.9 Xylan

- Arabinogalactan chủ yếu được biết đến như một thành phần lõi của gỗ

arabinogalactan có một mạch chính gồm các D-galactopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β –(1,3) và các mạch nhánh là các liên kết β –(1,6) giữa D-galactose, D-galactose, L-arabinose , hoặc L-arabinose với nhau Arabinose hiện diện trong furanose và pyranose với tỷ lệ xấp xỉ 1:02[12]

Hình 2.10 Arabinogalactan

™ Gỗ cứng:

Hemicellulose chính trong gỗ cứng là xylan cụ thể hơn là methylglucurono-β-D-xylan Giống như xylan của gỗ mềm, mạch chính là các liên kết β (1-4)-xylopyranose Hầu hết các nhóm hydroxyl ở C2 và / hoặc C3 của các đơn vị xylose được thay thế bằng nhóm acetyl Ngoài ra, các đơn vị xylose được thay thế bằng liên kết β - (1 2) liên kết với phần dư của axit 4-O-methylglucuronic, trong hầu hết xylan của gỗ cứng trung bình tại xylose thứ 10 Không giống như xylan gỗ mềm, xylan gỗ cứng không chứa chuỗi bên arabinose Gỗ cứng cũng chứa glucomannan với mạch chính là liên kết β-(1-4) giữa D-mannopyranose và D-glucopyranose Tỷ lệ của mannose và glucose là 1:1 và 2.3:1[12]

O-acetyl-4-O AcetylO-acetyl-4-O 4O-acetyl-4-O OO-acetyl-4-O methylglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính

gồm β-D- xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4) Trong đó 70% các nhóm OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl-D-glucuronic[12]

2.2.1.3 Thành phần cấu tạo lignin

Lignin là một thuật ngữ chung cho một tổ hợp gồm các nhóm lớn polymer thơm được cấu tạo từ tổ hợp của 4 – hydroxyphenylpropanoid Các thành phần chính của lignin là các các rượu hydroxycinnamyl alcohol ( monolignol) như

coniferyl alcohol, sinapyl alcohol, và một lượng nhỏ p-coumaryl alcohol

Monolignol được tổng hợp từ Phe qua con đường cụ thể phenylpropanoid - monolignol Phe có nguồn gốc từ con đường sinh tổng hợp shikimate plastid

15

Enzym của con đường sinh tổng hợp lignin, cụ thể là các enzyme cytochrome P450,

cinnamate-4-hydroxylase (C4H), p-coumarate-3-hydroxylase (C3H), và

ferulate-5-hydroxylase (F5H), protein màng tế bào được cho là hoạt động tại các cytosolic bên của lưới nội chất[24]

Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn[18]

Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin

Các đơn vị monolignol, khi được trùng hợp tạo thành các polymer lignin,

được gọi là guaiacyl (G), syringyl (S), và p-hydroxyphenyl (H) Lignin của thực vật

hạt trần gồm chủ yếu là loại G và một lượng nhỏ loại H, trong khi thực vật hạt kín lignin được bao gồm loại G và S Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin[24]

Hình 2.15 Phản ứng trùng hợp tạo lignin

Qúa trình trùng hợp lignin ban đầu thông qua oxy hóa của phenol, tiếp theo là hình thành các liên kết căn bản Trong bước đầu tiên, phenol monolignol bị oxy hóa tạo thành các phenolic tương đối ổn định chứa các electron lẻ trong hệ thống liên

Trong thực vật, lignin liên kết với holocellulose thông qua liên kết hóa học lignin - carbonhydrate Có các kiểu liên kết sau

- Kiểu liên kết benzyl ether: liên kết hình thành giữa nhóm α-hydroxyl của một đơn vị lignin và một nhóm hydroxyl carbohydrate

- Kiểu liên kết ester benzyl: liên kết được hình thành giữa nhóm α-hydroxyl của một đơn vị lignin và gốc axit của cacboxylic carbohydrate

- Kiểu liên kết glycoside: liên kết được hình thành giữa axit béo hoặc nhóm hydroxyl thơm với nhóm cuối cùng của carbohydrate

- Kiểu liên kết acetal: liên kết được hình thành giữa hai nhóm hydroxyl của carbohydrates và một nhóm cacbonyl của lignin

Hình 2.16 Các dạng liên kết giữa lignin với carbonhydrate [25]

ly trong việc phân tích thành phần sơ sợi lignocellulose Những chất này có thể có

cả tính ưa dầu và ưa nước và không được xem là thành phần cấu trúc của gỗ[1] Chất nhựa là những chất ưa dầu, có lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong tác nhân trích ly, nên thường chất trích ly còn được gọi là nhựa (resin)

Các chất trích ly thường có màu, mùi và vị khá đặc trưng Chúng rất quan trọng để giữ lại những chức năng sinh học của cây Đa phần các chất nhựa bảo vệ

gỗ khỏi những tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay côn trùng Terpenoid, steroid, chất béo, và những phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và flavonoid đều là những chất trích ly Các phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh hưởng đến màu của gỗ Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là nhựa dầu[6] Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và côn trùng Một

số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng Ví dụ, flavonoid được sử dụng như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus Một số cấu trúc chất trích ly được thể hiện ở những hình sau :

Hình 2.17 : Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin) ; (b)

cathechin(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)

18

2.2.1.5 Thành phần tro

Một phần đáng kể của các sinh khối thân thảo bao gồm các thành phần vô cơ, thường được gọi là tro Tro có nguồn gốc từ sinh khối và có tác động tiêu cực trên các hệ thống chuyển đổi sinh khối Đặc biệt trong hệ thống chuyển đổi sinh hóa (chẳng hạn như sản xuất ethanol), nơi mà việc sử dụng các hoá chất vô cơ trong quá trình tiền xử lý thì tro thêm vào tổng số dư lượng vô cơ không chuyển đổi trong hệ thống chuyển đổi Tro bao gồm các thành phần chủ yếu[27]:

Kali cần thiết cho sự tăng trưởng thực vật, kali thường chiếm 1-5% trọng lượng vật chất khô, tùy thuộc vào loài, trong khi nồng độ kali trong cây trưởng thành thường không vượt quá 2% chất khô Kali tham gia trong một số lượng lớn các quy trình cần thiết cho sự phát triển của thực vật, bao gồm kích hoạt enzyme, tổng hợp protein, quang hợp, quy định áp suất thẩm thấu, giao thông mạch dẫn, và

Clo là một yếu tố tự nhiên phong phú và tồn tại trong các hình thức của ion clorua.Clo đóng một vai trò thiết yếu trong một số quy trình, bao gồm cả việc mở và đóng của khí khổng.Tương tự như kali, clorua có tính cơ động cao trong thực vật,

và hàm lượng clo trung bình từ 0,2 - 2,0% trọng lượng thực vật khô[27]

Ở thực vật C3 thì hàm lượng tro cao hơn thực vật C4 do đó cần nhiều nước hơn trong việc tổng hợp một gam chất khô và hàm lượng tro cũng khác nhau ở các

bộ phận của cây

19

2.2.2 Sự thủy phân cellulose

Theo con đường sinh học Cellulose được thủy phân bằng enzyme cellulase

2.2.2.1 Cấu trúc enzyme cellulase

Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết Nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành

hệ enzym gọi là Citolase Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1,

Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose[17]

+ Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên

thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình)

+ Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thuỷ phân cellulose phản ứng

thành cellobiose Enzym này được chia thành hai loại[37]:

Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân

liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên khoảng giữa mạch phân tử cellulose

Được chia làm hai loại EGI, EGII Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao

Hình 2.18 Các phần của enzyme cellulase [37]

20

Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành

disaccarit gọi là cellobiose ở các đầu chuỗi Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:

* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit

amin Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC

* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin

CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên cellulose biến tính

+ β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành

glucose Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4

đến 8,4 Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao

2.2.2.2 Cơ chế hoạt động [3]

Hình 2.19: Cơ chế tác động của enzym cellulase

2.2.3 Sự phong phú của cây cỏ Việt Nam

Bên cạnh nguồn sinh khối thải nông nghiệp như rơm rạ, thân cây ngô,…thì nguồn cỏ hoang dại ở nước ta cũng đóng góp một lượng sinh khối vô cùng lớn Theo GS Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam là một đất nước có hệ thực vật phong phú hàng đầu thế giới với khoảng 12.000 loài khác nhau Trong khi đó Pháp chỉ có khoảng 4.800 loài, châu Âu 11.000 loài, Ấn Độ có khoảng 12.000 – 14.000 loài Cả Bắc Mỹ, rộng hơn nước ta gần 65 lần cũng chỉ có hơn 14.000 loài[2]

Từ xa xưa những loại cỏ được người Việt Nam sử dụng rộng rãi với các công dụng đặc biệt như: loại thuốc chữa bệnh, làm nhà ở… và làm thức ăn cho gia súc Nhưng cho tới nay, chưa có một công trình nào thống kê về mặt khối lượng các loại

cỏ này Cỏ gần như mọc mọi nơi ở Việt Nam, từ những vùng đất khô cằn sỏi đá, đất phèn chua có các cây cỏ năng, những rạch nước ô nhiễm có cây cỏ vertiver…và những nơi đất đai màu mỡ Một số loài cỏ có thân lớn, số lượng nhiều, thích nghi nhiều loại đất không thể canh tác sẽ đem lại một lượng sinh khối lớn và hết sức có ý nghĩa nếu tận dụng và thành công trong việc tạo ra nhiên sạch thay thế

Một số loại cỏ nghiên cứu trong đề tài:

¾ Cỏ VA06

Giới (regnum): Plantae Cỏ VA06 là giống cỏ được lai tạo giữa

giống cỏ voi và cỏ đuôi sói của châu Mỹ, được

Bộ (ordo): Poales

22

Họ (familia): Poaceae đánh giá là “Vua các loại cỏ” VA 06 dạng như

cây trúc, thân thảo, cao lớn, họ hòa thảo, dạng bụi, mọc thẳng, phiến lá rộng, mềm,VA06 có thể trồng hầu hết ở các loại đất, tính thích hầu hết ở các loại

Chi (genus):

Loài (species):

Tên tiếng anh: Varisme 6

đất, tính thích ứng rộng, sức chống chịu mạnh, sức sinh sản nhanh Ở vùng nhiệt đới

VA 06 có thể sinh trưởng quanh năm VA06 có thể trồng được ở hầu hết các loại đất,

kể cả đất cát sỏi, đất mặn kiềm nhẹ, chịu được độ pH 4,5 Trên đất khô hạn, đất đọng nước, đất dốc, đất bằng, bờ ruộng, ven đê, ven hồ đều có thể sử dụng để trồng loại cỏ này Cỏ được nông dân trồng làm thức ăn gia súc

¾ Cỏ Voi

Giới (regnum): Plantae Cỏ voi được trồng rất rộng rãi ở

tất cả các nước nhiệt đới và á nhiệt đới Cỏ voi được đưa vào Việt Nam từ rất sớm.Thân cỏ cao từ 2 - 4m, thân có lóng đốt như thân cây mía nhưng đường kính nhỏ hơn ( 1 -2cm), nhiều

Bộ (ordo): Poales

Họ (familia): Poaceae

Chi (genus): Pennisetum

Loài (species): P purpureum

Tên khoa học: Pennisetum purpureum

lá và còn giữ được lá xanh khi cây đã cao Hiện nay, cỏ voi được trồng làm thức ăn cho gia súc [31]

¾ Cỏ Vetiver:

Giới (regnum): Plantae Cỏ vetiver dạng bụi rậm, lưu niên,

phiến lá tương đối cứng, tán lá phần lớn nằm ở phần gốc Các bẹ lá phủ lên nhau,

ép sát và xếp úp vào nhau tạo thành một rào cản cơ học mật độ dày trên bề mặt đất, sẽ rất hiệu quả trong bảo vệ đất[31]

Bộ (ordo): Andropogoneae

Họ (familia): Graminae

Chi (genus): Vetiveria

Loài (species): Vetiveria zizanioides

Tên khoa học: Vetiveria zizanioides L

¾ Cỏ Sậy:

Giới (regnum): Plantae Là một loài cây lớn thuộc họ Hòa

thảo (Poaceae) có nguồn gốc ở những

vùng đất lầy ở cả khu vực nhiệt đới và

Bộ (ordo): Poales

Họ (familia): Poaceae

23

Chi (genus): Phragmites ôn đới của thế giới Các thân cây mọc

đứng cao từ 2-6 m, với các thân cây cỏ thường là cao hơn trong các khu vực có

Loài (species): P australis

Tên khoa học: Phragmites australis

mùa hè nóng ẩm và đất màu mỡ Lá của nó là rộng đối với các loài cỏ, dài từ 20-50

cm và bản rộng 2-3 cm Hoa có dạng chùy có màu tía sẫm mọc dày đặt, dài 20-50

cm Cỏ mọc hoang dại tại nước ta, một số nơi người dân thu về làm đồ thủ công[36]

¾ Cỏ Đuôi chồn:

Giới (regnum): Plantae Cỏ mọc hoang dại ở Việt Nam, người

dân thường đốt chúng như những loài cỏ dại ảnh hưởng tới cây trồng và mùa vụ Cỏ thường khô rạc vào mùa khô và phát triển rất nhanh vào mùa mưa[36]

Bộ (ordo): Poales

Họ (familia): Poaceae

Chi (genus): Setaria

Loài (species): Setaria parviflora

Tên khoa học Setaria palmifolia

¾ Lục bình:

Giới (regnum): Plantae Lục bình xuất xứ từ châu Nam Mỹ,

du nhập Việt Nam khoảng năm 1905, do

đó trong tiếng Việt còn có tên bèo tây Cây bèo tây mọc cao khoảng 30 cm với dạng lá hình tròn, màu xanh lục, láng và nhẵn mặt Lá cuốn vào nhau như những

Bộ (ordo): Commelinales

Họ (familia): Pontederiaceae

Chi (genus): Eichhornia

Loài (species): E crassipes

Tên khoa học: Eichhornia crassipes

cánh hoa Cuống lá nở phình ra như bong bóng xốp ruột giúp cây bèo nổi trên mặt nước Ba lá đài giống như ba cánh Rễ bèo trông như lông vũ sắc đen buông rủ xuống nước, dài đến 1m.Cây bèo tây sinh sản rất nhanh nên dễ làm nghẽn ao hồ, kinh rạch Một cây mẹ có thể đẻ cây con, tăng số gấp đôi mỗi 2 tuần Lục bình được phơi khô để làm giỏ xách đồ kỹ nghệ, một số vùng làm thức ăn cho gia súc[36]

2.3 Tổng quan về quá trình tiền xử lý trên thế giới và trong nước

2.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

24

Lignocellulose là thành phần chính đôi khi là thành phần duy nhất trong các phế thải từ các nghành công nghiệp, nông nghiệp, lâm nghiệp và rác thải đô thị.Thủy phân các vật liệu này là bước đầu tiên để tạo thành khí sinh học (metan) hoặc lên men tạo thành ethanol Tuy nhiên, các enzyme thủy phân lignocellulose thường không hiệu quả vì sự ổn định cao trong cấu trúc của các nguyên liệu.Vì vậy

để quá trình này hiệu quả thì việc trước tiên là tiến hành tiền xử lý nguyên liệu để chuyển đổi nguồn lignocellulose thành ethanol hoặc khí sinh học[14]

Như trên đã đề cập, thì cellulose chứa hai vùng kết tinh và vùng vô định hình Vùng kết tinh rất khó bị phân hủy bởi enzyme cellulase Như vậy có hai vấn

đề lớn đặt ra là tiền xử lý ngoài việc loại bỏ lignin thì còn phải phá vỡ cấu trúc vùng kết tinh[16]

Hình 2.20 Quá trình tạo NLSH từ lignocellulose

Như vậy việc tiền xử lý đạt các mục đích sau:

- Tạo ra sợi cellulose phản ứng tăng khả năng thủy phân của enzyme,

- Tránh phá hủy hemicellulose và cellulose,

- Tránh hình thành các chất ức chế enzym thủy phân và lên men vi sinh vật,

- Giảm thiểu chi phí năng lượng,

- Tiêu thụ hóa chất ít hoặc sử dụng một số hóa chất giá rẻ ít độc hại

25

Một số phương pháp đã được giới thiệu về tiền xử lý của vật liệu lignocellulose trước khi thủy phân enzyme Những phương pháp này được phân thành 4 nhóm cơ bản: "tiền xử lý vật lý", "tiền xử lý lý - hóa", "tiền xử lý hóa học", và "tiền xử lý sinh học"

2.3.1.1 Tiền xử lý bằng phương pháp vật lý

Tiền xử lý bằng phương pháp vật lý có thể làm tăng diện tích bề mặt và kích thước của lỗ trên cellulose, và làm giảm vùng kết tinh và mức độ trùng hợp của cellulose Các quá trình vật lý như phay (ví dụ như: xay xát, nghiền búa, và xay xát năng lượng vibro…) và chiếu xạ (ví dụ như: chiếu tia gamma, hoặc lò vi sóng) có thể được sử dụng để cải thiện, tạo sự thuận lợi cho việc thủy phân enzyme hoặc tăng khả năng phân huỷ sinh học của các vật liệu chất thải lignocellulose[21]

a Phay

Phay có thể được sử dụng để thay đổi kích thước vốn có của lignocellulose

và mức độ của vùng kết tinh, và do đó làm cho thủy phân được dễ dàng hơn Phay làm giảm kích thước đã được áp dụng trước khi thủy phân enzyme, hoặc quá trình tiền xử lý với axit loãng, hơi nước hoặc amoniac Trong số các quá trình xay xát, nghền keo chỉ dành cho vật liệu ẩm ướt, ví dụ như giấy ướt phân loại rác thải trong nước hoặc bột giấy, trong khi các máy đùn, máy con lăn, nghiền búa thường được

sử dụng đối với nguyên liệu khô Nghiền bóng có thể được sử dụng cho nguyên liệu khô hoặc ướt Sidiras và Koukios cho thấy rằng phay bóng làm giảm hơn 50% vùng kết tinh cellulose trong rơm lúa Jim và Chen nghiên cứu nghiền siêu mịn, kích thước sợi 60 mm, của rơm rạ sau nổ hơi Rơm đã được cắt 5-8 cm và cho nổ hơi tại

180, 195, 210 và 2200C trong 4-5 phút một cách riêng biệt bằng hơi nước bão hòa.Vật liệu sau nổ hơi được nghiền thành bột bằng cách sử dụng một máy nghiền siêu mịn Khi thủy phân enzyme đã thu được một lượng đường khử rất cao Như vậy phay làm giảm kích thước lignocellulose và tăng khả năng thủy phân bởi enzyme cellulase Một bất lợi của xay xát là không có khả năng loại bỏ lignin hạn chế sự gắn của các enzym cellulase và ức chế cellulases[22]

b Chiếu xạ

26

Chiếu xạ bằng tia gamma, chùm điện tử và vi sóng có thể cải thiện thủy phân enzyme Sự kết hợp của bức xạ và các phương pháp khác, chẳng hạn như xử lý bằng axit có thể tăng tốc hơn nữa enzyme thủy phân Kumakura và Kaetsu nghiên cứu các ảnh hưởng của chiếu xạ cho tiền xử lý bã mía trước khi thủy phân enzyme

Bã mía sau khi xử lý cho lượng glucose tăng gấp đôi sau thủy phân so với việc không được xử lý Các thành phần cellulose của các vật liệu lignocellulose dưới tác dụng của chiếu xạ sẽ phân thành các loại sợi mỏng và oligosaccharides trọng lượng phân tử thấp và thậm chí cellobiose Một bức xạ rất cao, trên 100 MR, có thể dẫn đến sự phân hủy của oligosaccharides và vòng cấu trúc glucose Nhưng lignin không giảm sau chiếu xạ Hơn nữa, việc chiếu xạ là tốn kém và khó áp dụng mức quy mô công nghiệp

nổ hơi nước cũng đã được thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và thí điểm áp dụng

ở một số công ty Chi phí năng lượng của phương pháp này là tương đối vừa phải,

và đáp ứng tất cả các yêu cầu của quá trình tiền xử lý Các quá trình nổ hơi nước đã được chứng minh trên một quy mô thương mại tại nhà máy Masonite, Mỹ Ruiz và cộng sự nghiên cứu nổ hơi nước để tiền xử lý thân cây hướng dương trước khi thủy phân enzyme ở nhiệt độ trong khoảng 180-2300C Sản lượng đường cao nhất đã đạt được sau sử lý ở 2200C, trong khi hemicellulose thu được cao nhất đạt được ở

2100C Sử dụng nổ hơi nước cho tiền xử lý sinh khối cây Populus nigra, ở 2100C trong 4 phút, kết quả lượng cellulose thu được trên 95%, hiệu suất thủy phân enzyme khoảng 60%, và xylose thu được 41% trong phần chất lỏng Ballesteros và cộng sự áp dụng nổ hơi nước để sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose rơm lúa mì tại 1900C trong 8 phút, bạch dương và bạch đàn ở 2100C trong 4 phút Sau

nổ hơi hemicellulose bị hòa tan, giảm 75-90% xylose Nổ hơi có thể kết hơp xử lý

27

cơ học để có hiệu quả trong việc phá vỡ cấu trúc cellulose Nhưng nổ hơi nước có các nhược điểm rất rõ là hao hụt nguyên liệu nhiều, nhiệt độ cao sẽ phân hủy Xylose thành furfural và glucose thành 5-hydroxylmethyl furfural, gây ức chế cho quá trình nên men của nấm men[20]

2.3.1.2 Tiền xử lý bằng phương pháp hóa – lý kết hợp

a.Xử lý bằng nổ hơi nước với bổ sung SO 2

Tiền xử lý nổ hơi nước có thể được thực hiện với sự bổ sung của sulfur dioxide (SO2), trong khi mục đích của việc thêm hóa chất này là để cải thiện sự thu hồi cả cellulose và các phần phân đoạn hemicellulose Việc đó có thể đượcthực hiện với bổ sung 1-4% SO2 Eklund và cộng sự nghiên cứu tiền xử lý hơi nước của cây liễu với việc bổ sung SO2 hoặc H2SO4 để thu hồi cả cellulose và hemicellulose Sản lượng đường được thu hồi tối đa 95% khi xử lý với 1% SO2 ở 2000C Tuy nhiên, sản lượng xylose thu được khi dùng SO2 không cao như là bổ sung axít sulfuric loãng[21]

b Nổ hơi trong amoniac (AFEX)

AFEX là sự kết hợp giữa lý hóa trong tiền xử lý Sinh khối được tiếp xúc với amoniac lỏng ở nhiệt độ tương đối cao cho một khoảng thời gian khoảng 30 phút,

và áp suất tăng cao sau đó được giảm đột ngột Quá trình AFEX làm giảm một phần lignin của các vật liệu lignocellulose, trong khi hemicellulose và cellulose có thể vẫn còn nguyên vẹn Ở điều kiện tối ưu, AFEX có thể cải thiện đáng kể hiệu suất thủy phân enzyme Các điều kiện tối ưu cho AFEX phụ thuộc từng vật liệu lignocellulose Ví dụ, các điều kiện tối ưu trong tiền xử lý cỏ đã được báo cáo là khoảng 1000C, ammonia 1:1 kg chất khô, trong 5 phút Một trong những lợi thế chính của tiền xử lý AFEX là không hình thành một số chất ức chế Tuy nhiên, một phần phenolic và thành phần khác có thể vẫn còn trên bề mặt cellulose Do đó, rửa với nước có thể là cần thiết để loại bỏ một phần của các thành phần ức chế, mặc dù tăng số lượng nước thải từ quá trình này Tuy nhiên, có một số nhược điểm trong việc sử dụng quá trình AFEX so với một số các quá trình khác AFEX hiệu quả hơn đối với sinh khối có chứa ít lignin, hòa tan lượng hemicellulose đáng kể Hơn nữa,

d Tiền xử lý bằng nước siêu tới hạn (LHW)

Nước dưới áp lực cao có thể thâm nhập vào sinh khối, và loại bỏ hemicellulose và một phần của lignin Ưu điểm của kỹ thuật này là không có bổ sung hóa chất và không yêu cầu vật liệu chống ăn mòn trong quá trình này Nhưng đòi hỏi năng lượng rất lớn nếu áp dụng trên quy mô thương mại Laser và cộng sự

so sánh tiền xử lý LHW và nổ hơi với bã mía, sau đó được sử dụng trong sản xuất ethanol bằng SSF Họ thực hiện tiền xử lý trong lò phản ứng 25-l ở 170-2300C trong 1-46 phút với nồng độ chất rắn 1% đến 8% Kết quả cho thấy rằng cả hai phương pháp có thể cải thiện đáng kể hiệu suất thủy phân Tuy nhiên, LHW thu hồi xylose tốt hơn nhiều so với nổ hơi nước Cũng giống nổ hơi, LHW chủ yếu là loại bỏ hemicellulose và sinh các chất ức chế quá trình lên men[11]

2.3.1.3 Tiền xử lý bằng hóa chất

a Xử lý băng kiềm

Xử lý có thể dụng NaOH, Ca(OH)2, hoặc ammonia để loại bỏ lignin và một phần hemicellullose tăng hiệu quả thủy phân của enzyme Tiền xử lý có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp, thời gian dài hoặc nhiệt độ cao thời gian ngắn ví dụ rơm được ngâm trong ammonia (10%) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, hemicellulose và lignin giảm tương ứng 41,45% và 30,16% Tuy nhiên, tiền xử lý kiềm được thể hiện là hiệu quả hơn trên các phụ phẩm nông nghiệp so với gỗ nguyên liệu Vaccarino và cộng sự đã nghiên cứu các tác động của SO2, Na2CO3, và NaOH trên cỏ và thấy rằng lượng lignin giảm nhiều nhất với dung dịch NaOH 1% ở 1200C Silverstein và

29

cộng sự nghiên cứu hiệu quả của axit sulfuric, sodium hydroxide, hydrogen peroxide, ozon đối với thân cây bông Họ phát hiện rằng tiền xử lý sodium hydroxide kết quả loại lignin cao nhất (65% với dung dịch NaOH 2% trong 90 phút

ở 1210C) và cellulose bị thủy phân với enzyme 60,8% So với axit hoặc các chất phản ứng oxy hóa, kiềm là phương pháp hiệu quả nhất trong việc phá vỡ liên kết este giữa lignin, hemicellulose và cellulose, và tránh sự phân mảnh của các polyme hemicellulose Tiền xử lý bằng kiềm cũng được sử dụng như một phương pháp tiền

xử lý trong sản xuất khí sinh học[11]

b Tiền xử lý axit

Xử lý lignocellulose bằng axit ở nhiệt độ cao có thể cải thiện thủy phân enzyme Sulfuric acid được nghiên cứu là chủ yếu, trong khi axit khác như HCl và axit nitric cũng được nghiên cứu Tiền xử lý axit có thể thực hiện dưới nhiệt độ cao

và nồng độ axit thấp hoặc dưới nhiệt độ thấp và nồng độ axit cao Nhiệt độ thấp (400C) trong tiền xử lý nồng độ cao axit là một lợi thế rõ ràng so với các quy trình pha loãng axit Tuy nhiên, nồng độ axit cao (ví dụ như 30-70%) dẫn tới ăn mòn thùng chứa và nguy hiểm Vì vậy, quá trình này đòi hỏi các công trình xây dựng hoặc thùng kim loại đắt tiền Sau xử lý phải thu hồi axit Mặt khác, quá trình trung hòa axit cần số lượng lớn thạch cao Đầu tư cao và chi phí bảo dưỡng cũng làm giảm lợi ích thương mại trong phương pháp tiền xử lý axit loãng, một giải pháp được đưa là phương pháp này được thực hiện trong thời gian lưu giữ ngắn (ví dụ như 5 phút) ở nhiệt độ cao (ví dụ 1800C) hoặc trong một thời gian lưu giữ tương đối dài (ví dụ như 30-90 phút) ở nhiệt độ thấp hơn (ví dụ 1200C) Sun và Cheng xử lý rơm lúa mạch và cỏ Bermuda để sản xuất ethanol ở 1210C với nồng độ acid sulfuric (0,6; 0,9; 1,2 và 1,5%) thời gian là 30, 60, 90 phút Emmel và cộng sự xử lý gỗ bạch đàn với nồng độ H2SO4 0,087 đến 0,175 %, nhiệt độ 200-210 trong 2-5 phút Thấy rằng các điều kiện tốt nhất cho việc thu hồi hemicellulose tại 2100C trong 2 phút, trong khi tiền xử lý nhiệt độ thấp hơn 2000C thì cellulose chuyển đổi (90%) sau thủy phân enzyme Tiền xử lý với acid acetic và nitric cũng được sử dụng để loại bỏ lignin[12]

30

2.3.1.4 Xử lý bằng phương pháp sinh học

Vi sinh vật cũng có thể được sử dụng xử lý các lignocellulose và tăng cường thủy phân bởi enzyme Các vi sinh vật được áp dụng thường phân hủy lignin và hemicellulose và một phần rất nhỏ của cellulose, vì cellulose bền hơn các phần khác của lignocellulose Taniguchi và cộng sự đã đánh giá kết quả tiền xử lý rơm rạ bằng

cách sử dụng bốn chủng nấm trắng (Phanerochaetechrysosporium, Trametes

versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, và Pleurotus ostreatus) trên cơ sở những

thay đổi về số lượng và cấu trúc trong các thành phần của rơm rạ qua tiền xử lý

cũng như hiệu quả enzyme thủy phân Tiền xử lý với P ostreatus cho kết quả lignin

loại được nhiều nhất và làm tăng tính hiệu quả thủy phân enzyme Kurakake và

cộng sự nghiên cứu một số chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và

Circulans Bacillus đối với giấy thải từ văn phòng Nhưng nhìn chung việc xử lý

theo con đường sinh học hiệu quả thấp[29]

2.3.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam [5][8]

So với thế giới chúng ta đi sau trong khuynh hướng sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thải, các hướng chính ở Việt Nam là làm lại một số hướng của thế giới Điển hình như phương pháp nổ hơi được Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và ứng dụng[5], một số tác giả khác cũng đi theo những hướng mới như Lương Bảo Uyên – Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh sử dụng các chủng nấm để phân hủy lignin trong mạt dừa bước đầu thu được một số kết quả[8]

Như vậy: Các phương pháp đã được nghiên cứu và trình bày đều nhằm mục đích:

- Tăng vùng vô định hình của cellulose,

- Tăng diện tích bề mặt nguyên liệu,

- Loại bỏ lignin,

- Bảo toàn hemicellulose

31

Đều đạt được những kết quả nhất định, việc sử dụng hiệu quả hemicellulose

là một giải pháp làm giảm chi phí sản xuất ethanol.Một số phương pháp đã được áp dụng trên quy mô công nghiệp, nhưng vẫn còn đó những vấn đề cần tháo gỡ

2.3.3 Quá trình tiền xử lý thực hiện trong quá trình nghiên cứu của đề tài

Trên cơ sở phân tích các công trình nghiên cứu được thực hiện trên thế giới

và trong nước trước đó, tôi nhận thấy rằng: các phương pháp xử lý đều chứa đựng những ưu nhược điểm Phương pháp sinh học có ưu thế về mặt môi trường nhưng khả năng loại bỏ lignin kém nên trong thời điểm hiện tại, thì việc xử lý bằng các phương pháp vật lý và hóa học vẫn được thế giới đặc biệt quan tâm bởi những hiệu quả của nó trong việc loại lignin cũng như tạo sợi cellulose vô định hình Việc tiền

xử lý bằng vật lý, hóa học hoặc kết hợp cho thấy khả năng loại bỏ lignin tốt hơn phương pháp sinh học, bên cạnh đó thời gian tiền xử lý cũng thu ngắn rõ rệt Dựa trên điều này tôi sử dụng hai phương pháp vật lý và hóa học kết hợp, với việc lựa chọn những hóa chất và phương pháp xử lý sao cho rẻ nhất, loại bỏ được lignin tốt nhất đồng thời thu hồi lại lượng holocellulose cao và việc xử lý chất thải tốt sau tiền

xử lý là những vấn đề được quan tâm hàng đầu đến phương pháp xử lý tôi đề cập trong luận văn này

- Các loại hóa chất được xử dụng trong nghiên cứu là: NaCl, NH4OH, H2O2đây là những hóa chất được sản xuất trên quy mô công nghiệp, giá thành rẻ, công nghệ sản xuất phổ biến và việc xử lý chất thải sau tiền xử lý là thuận lợi

- Phương pháp vật lý được xử dụng trong nghiên cứu là: vi sóng, xay, nghiền

32

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu là một số loại cỏ trên địa bàn khu vực thành phố HCM

và các vùng lân cận

¾ Phương pháp thu thập mẫu:

- Mẫu thu thập phải là mẫu cỏ mới để đảm bảo tính đồng nhất

- Mẫu được thu thập cho vào túi nylon có dán nhãn ghi thông tin đầy đủ về địa

chỉ lấy mẫu, tên mẫu, ký hiệu mẫu, ngày lấy mẫu, nơi lấy mẫu, người lấy mẫu

- Trọng lượng mỗi mẫu tươi: khoảng 3-4 kg

- Mẫu sau khi thu thập, cắt nhỏ khoảng 5 cm đưa vào tủ sấy, sấy mẫu ở 900C

cho đến khi khô kiệt sau đó bảo quản mẫu để phân tích

¾ Các loại mẫu thu thập bao gồm:

a Cỏ voi (Pennisetum purpureum):

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy phần thân dưới của cỏ (phần không còn lá non), phần trên ( phần có bẹ

lá còn non trở lên) và lá loại bỏ

- Địa điểm lấy mẫu: huyện Trảng Bom – tỉnh Đồng Nai

- Thời điểm lấy mẫu: Tháng 6/2011

b Cỏ VA06 (Varisme 6):

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy phần thân dưới của cỏ, phần trên ( phần có bẹ lá còn non trở lên) và lá loại bỏ

- Địa điểm lấy mẫu: Khu thực nghiệm của trường Đại học Nông Lâm TpHCM

- Thời điểm lấy mẫu: Tháng 6/2011

c Cỏ Vertiver (Vetiveria zizanioides L):

33

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy mẫu tại ruộng vào thời điểm thu hoạch

- Lấy toàn bộ cây, bỏ phần rễ cây

- Địa điểm lấy mẫu: Khu thực nghiệm của trường Đại học Nông Lâm TpHCM

- Thời điểm lấy mẫu: Tháng 6/2011

d Cỏ sậy (Phragmites australis):

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy toàn bộ thân, bỏ lá

- Địa điểm: quận Thủ Đức –TpHCM

- Thời điểm: lấy mẫu vào tháng 6/2011

e Cỏ đuôi phụng (Setaria palmifolia):

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy toàn bộ thân, bỏ lá của cỏ

- Địa điểm: Tp.HCM

- Thời điểm: 6/2011

f Bèo lục bình (Eichhornia crassipes):

Phương pháp lấy mẫu:

- Lấy toàn bộ cây, bỏ phần rễ cây

- Địa điểm lấy mẫu: Sông Sài Gòn, địa phận quận 9

3.2 Trang thiết bị và dụng cụ

- Máy siêu âm của hãng Elma S30

- Máy ly tâm Hettich Rotina 420

- Máy VoltexVortex Genius 3

- Nồi hấp tiệt trùng SA-300VF

- Tủ sấy BPH-9050 A

- Lò nung DAIHAN JSC

- Lò vi sóng SANYO EM-G3597VS

- Bộ Soxhlet 150ml

3.3 Hóa chất và các vật tư tiêu hao

Bảng 3.1 Hóa chất và vật tư tiêu hao trong các thí nghiệm

Hóa chất nuôi cấy

K2HPO4, KH2PO4., KCl, NaCl, NaOH,

NaNO3, MgSO4 7H2O, FeSO4.7H2O,

HgCl2, Na-acetate, lugol, lactophenol, CMC

Trung Quốc

3.4 Địa điểm thực hiện: