Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào lan dendrobium cv. Burana white bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

 Phương pháp gieo hạt không cần nấm cộng sinh Phương pháp này được thực hiện trong điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm: hạt sau khi được rửa sạch và được khử trùng sẽ được gieo trên

HUỲNH NGUYÊN PHÁT

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ

VÀO LAN DENDROBIUM CV BURANA WHITE BẰNG VI

KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ từ các Thầy, các Cô, bạn bè và gia đình Đó là nguồn động lực vô cùng to lớn và quý giá đã giúp tôi vượt qua những khó khăn để hoàn thành tốt luận văn này Tôi xin chân thành tỏ bày lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn, chia sẻ những kiến thức cũng

như những kinh nghiệm quý giá giúp tôi hoàn thành luận văn này

Các Quý Thầy, Quý Cô Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự

Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt những kinh nghiệm đã trải qua trong quá trình giảng dạy cũng như trong quá trình thực nghiệm

Các anh, các chị, các em công tác tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực

Vật và Chuyển Hóa Sinh Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Các bạn và các em sinh viên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận

MỞ ĐẦU

Họ Phong Lan là một họ lớn của thực vật có hoa, gồm hơn 800 giống và 30.000 loài, đặc biệt là hoa rất đẹp Có rất nhiều loài Phong Lan đã được thương mại hóa

trên thế giới, trong số đó có Dendrobium Dendrobium là một trong những giống

lan thương mại quan trọng được trồng phổ biến dùng như hoa cắt cành lẫn cây trồng chậu bởi hoa đẹp, dễ trồng và thích ứng với phổ khí hậu rộng

Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền vào thực vật mở ra cơ hội có thể đưa các tính trạng mới mong muốn vào Phong Lan Kết quả đã tạo ra rất nhiều giống lan mới không chỉ có giá trị kinh tế mà còn góp phần làm tăng thêm tính đa dạng cho Phong lan Tuy có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau vào thực vật, nhưng hai phương pháp chuyển gen thường được sử dụng nhiều nhất, đó là phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và phương pháp chuyển gen gián tiếp

thông qua vi khuẩn Agrobacterium Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm khác nhau, nhưng việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ chuyển

gen sẽ giúp gen mục tiêu gắn chèn vào bộ gen thực vật chủ bền vững hơn

Tuy nhiên, việc chuyển bất cứ gen ngoại lai nào vào bất cứ đối tượng nào không phải lúc nào cũng thành công tốt đẹp Điều này còn tùy vào đặc tính của từng họ, từng loài, từng loại mô, loại kháng sinh sử dụng để diệt khuẩn Do đó, việc chuyển gen ngoại lai vào đối tượng thực vật, đặc biệt là Phong Lan, thì điều trước hết cần phải thực hiện là xây dựng quy trình chuyển gen ổn định, đồng thời tối ưu một số nhân tố khác để nâng cao hiệu suất chuyển gen

Hiện nay, có rất nhiều gen thường được sử dụng trong chuyển gen, chẳng hạn

như gen phát sáng xanh lá cây gfp (từ sứa Aequorea victoria ), gen phát sáng đỏ

Ds-Red (từ bọt biển Discosoma sp.), gen luc (từ đom đóm Photinus pyralis ) trong số

đó có cả gen kháng thuốc diệt cỏ (gen bar) Và đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới sử dụng gen bar như là gen mục tiêu trên một số đối tượng như

Saccharum sp (Manickavasagam và cộng sự, 2004), Pinus radiata (Charity J.A

và cộng sự, 2005), Zea mays (Vega J., 2008) Tuy nhiên, công trình áp dụng chuyển nạp gen bar cho đối tượng Phong Lan là rất ít, và chỉ thấy có một bài báo

đã sử dụng gen bar làm gen mục tiêu để khảo sát trên ba giống Lan (Brassia,

Cattleya, và Doritaenopsis) (Knapp J.E., Kausch A.P và Chandlee J.M., 2000)

Kết quả cho thấy gen bar này biểu hiện rất tốt và có thể sử dụng vừa như gen mục

tiêu vừa như gen chọn lọc

Trên cơ sở phân tích đó, luận văn sẽ tập trung chủ yếu vào việc sử dụng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen bar vào Phong lan Dendrobium

CV BURANA WHITE, nhằm bước đầu xây dựng quy trình chuyển nạp gen bar,

để từ đó góp phần tìm hiểu thêm gen này sẽ biểu hiện như thế nào trên giống lan

Dendrobium CV BURANA WHITE cũng như có thể áp dụng chuyển gen trên các

giống lan khác, và đồng thời làm tiền đề cho việc chuyển nạp gen khác có giá trị

thương mại vào Phong lan nói chung và Dendrobium nói riêng

Trang phụ bìa

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN 3

1.1 Sơ lược về họ Lan 3

1.2 Sơ lược về Phong Lan Dendrobium 3

1.2.1 Vị trí phân loại 3

1.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố 4

1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium 4

1.3 Các phương pháp nhân giống 6

1.3.1 Phương pháp tách chiết 6

1.3.2 Phương pháp gieo hạt 6

1.3.3 Phương pháp lai tạo 7

1.3.4 Phương pháp nuôi cấy mô 7

1.3.5 Phương pháp cắt lát mỏng (Thin Cross Section) 7

1.3.6 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng 7

1.4 PLB (Protocorm-Like Body) 8

1.4.1 Thuật ngữ 8

1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB 8

1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium 8

1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium 8

1.6.1 Giá trị dược liệu 11

1.6.2 Giá trị kinh tế 12

1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nước ta và trên thế giới 12

1.8 Các phương pháp chuyển gen 14

1.8.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14

1.8.2 Một số phương pháp chuyển gen khác vào thực vật 22

1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen 25

1.9.1 Xử lý mẫu 25

1.9.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A tumefaciens 25

1.9.3 Làm khô mẫu cấy 26

1.9.4 Xử lý với chất chống hoại tử 26

1.9.5 Nhiệt độ 27

1.9.6 Chất hoạt động bề mặt 27

1.9.7 Môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy 27

1.9.8 Kháng sinh 28

1.9.9 Marker chọn lọc 30

1.10 Ứng dụng plasmid Ti trong công nghệ chuyển gen ở thực vật 30

1.11 So sánh phương pháp bắn gen với phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens 32

1.12 Cấu trúc của gen chuyển nạp 32

1.12.1 Promoter và terminator 32

1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) 33

1.12.3 Gen chỉ thị (reporter gene) 34

1.13 Một số phương pháp phát hiện gen chuyển 35

1.13.1 Phương pháp thử GUS 35

1.14 Tình hình nghiên cứu thực vật chuyển gen 37

1.14.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan Dendrobium trên thế giới 37

1.14.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen thực vật ở Việt Nam 39

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41

2.1 Vật liệu thí nghiệm 41

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 41

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 41

2.1.3 Chủng vi khuẩn A tumefaciens 41

2.1.4 Thiết bị và hóa chất thực hiện chuyển nạp gen bằng A tumefaciens 42

2.2 Phương pháp thực hiện 44

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV BURANA WHITE 45

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxim và meropenem lên khả năng sống của PLB Dendrobium CV BURANA WHITE và sự tái nhiễm khuẩn qua đồng nuôi cấy 45

2.2.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV BURANA WHITE bằng vi khuẩn A tumefaciens 46

2.2.4 Tái sinh các mẫu PLB giả định chuyển gen bằng A tumefaciens trên môi trường chọn lọc có bổ sung PPT 48

2.2.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật PCR 49

2.2.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV BURANA WHITE chuyển gen 53

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV BURANA WHITE 54

3.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV BURANA

WHITE bằng vi khuẩn A tumefaciens 61

3.4 Tái sinh các mẫu PLB chuyển gen bằng A tumefaciens trên môi trường chọn lọc có bổ sung PPT 67

3.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật PCR 70

3.5.1 Tách chiết DNA 70

3.5.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật PCR 72

3.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV BURANA WHITE chuyển gen 74

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Đề nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 90

PHỤ LỤC 91

TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN

1.1 Sơ lƣợc về họ Lan

Phong Lan thuộc ngành Thực vật hạt kín, lớp Một lá mầm, bộ Lan Orchidales,

họ Lan Orchidaceae Đây là họ lớn thứ hai trong ngành Hạt kín với khoảng 800 chi

và 30.000 loài, phân bố khắp nơi trên Trái Đất, nhưng phong phú nhất là ở trong các rừng ẩm nhiệt đới Đông Nam Á và Châu Mỹ Ở nước ta, có hơn 130 chi, 800 loài Hầu hết đều có hoa đẹp và dùng làm cảnh [6]

Ở Châu Âu, cây lan được nhà Thực vật học Theophratus mô tả từ khoảng năm

300 trước Công Nguyên và đặt tên theo tiếng Hy Lạp là Orchid (có nghĩa là “Ngọc hành”) Mãi đến năm 1836, Lindley J sử dụng từ này để đặt tên cho họ Phong Lan

là Orchidaceae [8]

Ở Việt Nam, lần đầu tiên vào năm 1789, nhà truyền giáo Bồ Đào Nha Joanis Loureio đã khảo sát và mô tả cây lan Sau đó, trong bộ “Thực vật chí Đông Dương” (Lecomte H.; 1932-1934) đã mô tả 101 giống, gồm 750 loài lan ở ba nước Đông Dương Gần đây, trong bộ sách “Cây cỏ Việt Nam” (Phạm Hoàng Hộ, 1993)

đã mô tả tới 653 loài lan [8]

1.2 Sơ lƣợc về Phong Lan Dendrobium

1.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố [4]

Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp: “Dendro” có nghĩa là gỗ, “bios”

có nghĩa là sống Vì vậy, Dendrobium hầu hết là phụ sinh và sống bám trên cây gỗ

Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng lan hoặc Đăng lan

Giống Dendrobium có khoảng trên 1600 loài và đã được lai tạo thêm nhiều giống mới với hình thái và cấu tạo hết sức phức tạp, đa dạng Dendrobium được

tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt Nam Thái Bình Dương, Philippines, Ấn Độ, và xuất hiện một ít ở Nhật Bản và nhiều nhất ở Đông Nam Á

Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông và được phân biệt

bằng thân (giả hành), lá và hoa

1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium [4]

Dendrobium là lan đa thân, có hoa bên nách, nhiều nhánh, sống lâu năm, tăng

trưởng không liên tục, có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng và thường sống trên những cây gỗ lớn với bộ rễ khí sinh Do phân bố rộng nên hình thái rất đa dạng

Nhìn chung, các giống Dendrobium đều có cơ quan sinh dưỡng là thân, giả hành,

lá và rễ; cơ quan sinh sản là hoa, hạt, trái (quả)

 Thân

Dendrobium thuộc nhóm đa thân, nhánh nằm ngang, bò dài trên giá hoặc nằm

sâu trong đất, gọi là thân rễ Kích thước thân dao động từ 0.1-0.2m đến 3-4m, mang rễ và lá Phát hoa mọc trên thân ở các nách lá, song song với lá và thẳng góc với rễ Thân nhẵn hay có nhiều vảy (do thoái hóa) và một phần thẳng đứng mang lá Các lá này bao nhau hợp thành thân giả (giả hành)

giả Trên thân giả, có nhiều mắt ngủ nên có thể nhân giống nhanh bằng phương pháp tách chiết Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh

 Lá

Lá mọc xen, hình giáo thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân, màu xanh bóng, đậm và nhẵn Hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng: hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng,

có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy vào vị trí sống của cây Những lá sát dưới gốc

đôi khi không phát triển nên trở thành vảy Các loài thuộc giống Dendrobium vùng

nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn,

sau đó đâm chồi mới khi gặp trời mưa

 Rễ

Đa dạng về hình thái và cấu trúc (rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn) nên

Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống khác nhau Cây có hệ rễ khí sinh, có

một lớp mô hút ẩm dày bao quanh gồm những tế bào chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xám bạc Rễ có chức năng hấp thu nước mưa hay nước lơ lững trong không khí (sương, hơi nước) và giúp cây bám chặt vào giá thể để không bị gió cuốn đi Hơn nữa, rễ còn có thể chứa diệp lục tố nên có khả năng quang hợp Một

số loài sống hoại, có vòi để hút dinh dưỡng từ xác thực vật

 Hoa

Ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ ở gần ngọn hoặc trên ngọn, gọi

là keikei Có loài trước khi ra hoa sẽ có hiện tượng rụng hết lá Thời gian ra hoa là đầu mùa mưa hay đầu Tết Hoa có thể là hoa đơn hoặc hoa kép Thường thì trung bình khoảng 1-2 tháng, hoa mới tan Thời gian nở hoa có khi suốt năm Cấu trúc

hoa gồm ba cánh đài và ba cánh tràng

 Quả

Thuộc loại quả nang Khi chín, các nang bung ra, đính lại với nhau ở đính và ở gốc Ở một số loài, khi chín, quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát

 Hạt

Một quả lan chứa từ 10.000-100.000 hạt, có khi đến 3 triệu hạt, có kích thước rất nhỏ (trước đây còn gọi là họ Vi tử), phôi hạt chưa phân hóa Sau 12-18 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt sẽ nảy mầm

1.3 Các phương pháp nhân giống

1.3.1 Phương pháp tách chiết

Thời điểm tách chiết tốt nhất đa số các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng Những vùng có khí hậu bốn mùa (xuân, hạ, thu, đông) rõ rệt thì thời điểm tách chiết là vào đầu mùa xuân (như ở miền Bắc) Những vùng có khí hậu bốn mùa không rõ rệt và có hai mùa là mùa khô và mùa mưa, thì thời điểm tách chiết là vào đầu mùa mưa Nếu kiểm soát được nhiệt độ trong vườn ươm hay trong nhà kính thì

có thể tách chiết quanh năm Thường tách ba giả hành thành một đơn vị trồng [4]

1.3.2 Phương pháp gieo hạt

 Phương pháp gieo hạt nhờ nấm cộng sinh

Hạt lan rất nhỏ, không có chất dinh dưỡng dự trữ để tự nảy mầm nên không thể gieo như cách thông thường, mà hạt phải cộng sinh với nấm chuyên biệt để cung cấp chất dinh dưỡng (chủ yếu là đường) Khi đó, hạt mới có thể nảy mầm [4]

 Phương pháp gieo hạt không cần nấm cộng sinh

Phương pháp này được thực hiện trong điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm: hạt sau khi được rửa sạch và được khử trùng sẽ được gieo trên môi trường gieo hạt giàu khoáng và dinh dưỡng Khi lan con được 4 lá và rễ dài thì đem ra trồng Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém và tỷ lệ nảy mầm cao [7]

 Phương pháp gieo hạt xanh

Hai phương pháp trên không thể áp dụng cho những loài từ sự lai bất thường giữa hai loài xa nhau vì thời gian hạt chín lâu (6 tháng đến 1 năm) Vì trái lan còn xanh, vỏ trái chưa bung ra nên hạt bên trong chưa bị nhiễm bệnh và chỉ cần khử

trùng một lần, sau đó cấy lên môi trường gieo hạt [4]

1.3.3 Phương pháp lai tạo

Chọn các cây bố mẹ cùng loài Sau đó, dùng tăm tre vô trùng ấn vào nhị đực và đưa sang quệt vào bề mặt nuốm nhụy cái Tiếp đó, đem cây mẹ để riêng, không tưới nước, bảo quản thật tốt, không để côn trùng bay vào thụ phấn Sau khi thụ phấn thành công, cần bón phân chứa nhiều phospho và đem ra ngoài để trồng [7]

1.3.4 Phương pháp nuôi cấy mô

Phương pháp tách chiết thu được kết quả ít, còn gieo hạt cũng được khá nhiều nhưng cây con lai tạo có một số thì giống cha, một số thì giống mẹ, một số thì vừa giống cha vừa giống mẹ, nhiều khi ra hoa không đạt Do đó, để có một lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn và đồng nhất về tính trạng thì cần phải nuôi cấy

mô với các phương pháp như nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô sẹo, tế bào đơn, hạt phấn đơn bội Vật liệu cho nuôi cấy mô có thể là bất kỳ cơ quan nào của cây như đỉnh sinh trưởng, rễ, lá, hạt

1.3.5 Phương pháp cắt lát mỏng (Thin Cross Section)

Phương pháp này do Nihar Najak và cộng sự (2001) thực hiện trên loài

Cymbidium aloifolium (L.) SW và Dendrobium nobile Lindl Phương pháp này

thường được áp dụng để nhân nhanh các protocorm hay PLB (Protocorm-like body) Protocorm hay PLB được cắt thành những lát có độ dày khoảng 0,5mm và đặt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật thích hợp Sau một khoảng thời gian, các protocorm hay PLB này sẽ tái sinh thành

những cụm protocorm hay PLB mới [4][7]

1.3.6 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

Phương pháp này nhằm tạo điều kiện cho cây con phát triển tốt khi đưa ra vườn ươm Chủ yếu chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy như nồng

độ CO2, sự khuyếch tán khí hòa tan, cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và giá thể Phương pháp này gồm hai giai đoạn: mẫu mô thực vật được đem vào ống nghiệm

và nuôi cấy dị dưỡng hay quang dị dưỡng (giai đoạn 1) Sau khi cơ quan có diệp lục tố (lá) hình thành, thì mẫu cấy được chuyển sang điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng (giai đoạn 2) Phương pháp này có nhiều ưu điểm là nâng cao tốc độ tăng

trưởng và phát triển của cây in vitro, cây phát triển đồng đều, tỷ lệ đột biến thấp,

không đòi hỏi hoàn toàn vô trùng và chi phí thấp [4]

tả những cấu trúc hình cầu nhỏ hình thành từ hạt lan, có vài lông hút đơn bào và

mô phân sinh ở đỉnh Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in

vitro không được gọi là protocorm Các tế bào bề mặt protocorm duy trì tiềm năng

của các tế bào phôi, từ đây chúng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng bất định [4][75][81]

 Thuật ngữ PLB

PLB (Protocorm-Like Body) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúc tương

tự protocorm, được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro Thuật ngữ này

được ông Georges Morel sử dụng đầu tiên khi nuôi cấy chồi đỉnh PLB là một thể

có tổ chức, có thể tái sinh nhiều PLB mới và có thể tái sinh thành chồi Hiện nay, PLB là nguồn nguyên liệu để nhân nhanh lan và thường dùng trong chuyển gen [4]

1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB

Mô lá (in vitro), nốt phát hoa, chồi (in vitro), rễ, chóp rễ, phát hoa

1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium

1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium [4][8]

 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp từ 25-300C, một số thì khoảng 18-220C [8] Dendrobium ưa

vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm

khoảng 6-90C Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Dendrobium là 27-320C (ban ngày) và 16-180C (đêm) Nhiệt độ dưới 100

 Độ ẩm

Ẩm độ thích hợp là 50-70% Nếu quá ẩm thì gốc và rễ thường bị thối Nếu trồng trong nhà kính, nên dùng máy tạo độ ẩm khi điều kiện quá hanh khô

 Bón phân

Lan Dendrobium cũng cần dinh dưỡng tương đối cao Ngoài bón phân hữu cơ,

cần bổ sung phân NPK và vi lượng [8] Thời gian tưới phân tốt nhất trong ngày là sáng sớm hay chiều tối, không nên tưới vào buổi trưa Tuy nhiên, tùy theo mùa mà

có thể dịch chuyển lịch tưới cho phù hợp Trung bình chỉ nên tưới mỗi tuần một lần

và phải tưới từ nồng độ thấp đến nồng độ cao

 Giá thể

Dendrobium là loài phụ sinh, sống trên nhiều loại giá thể như xơ dừa, dớn, than

củi, vỏ cây khô, có thể sử dụng cả mút xốp làm giá thể Giá thể phải xốp, thoáng

khí và không giữ nước quá lâu

 Thay chậu

Lan Dendrobium trồng cỡ 2 năm thì giả hành phát triển, mọc lan ra ngoài nên

cần phải thay chậu và cần tách chiết ra để nhân giống

 Sâu bệnh

Việc bón phân hữa cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau một thời gian nào đó) là nguyên nhân chủ yếu tạo điều kiện cho gián, rệp, côn trùng cắn phá, nấm và virus… gây hại cho cây lan Do đó, cần phải theo dõi thường xuyên để

phòng trừ mầm bệnh một cách nhanh chóng và hiệu quả

1.5.2 Cách trồng lan Dendrobium

 Trồng cây con từ tách chiết

Các lan con từ việc tách chiết được trồng trong chậu nhựa hoặc đất nung, bên trong có thể là than củi, xơ dừa hoặc xốp Cũng có thể trồng thành luống bằng vỏ dừa già Buộc cây lan vào một cái nẹp, gốc lan giáp với xơ dừa Tưới nước đủ ẩm hàng ngày nhưng đừng để đọng nước Sau 2-3 năm, xơ dừa mục thì thay, sau đó

trồng lại [8]

 Trồng cây con nuôi cấy mô

Dùng kẹp móc nhẹ nhàng các lan con trong chai nuôi cấy mô, đem rửa sạch thạch (agar) Sau đó, lấy xơ dừa đã cắt nhỏ, bó nhẹ chung quanh rễ lan con và ràng lại bằng một sợi dây thun nhỏ Có thể tưới phun kích thích tố ra rễ, nước dừa pha loãng, hoặc Vitamin B1 trước khi trồng Chú ý là để bộ rễ thật thông thoáng và tưới nước thường xuyên ba lần mỗi ngày [7]

1.5.3 Cách chăm sóc lan Dendrobium

Dendrobium xuất xứ từ Đông Nam Á nên rất phù hợp với khí hậu Việt Nam Dendrobium rất dễ trồng, chịu nắng 70%, chịu ẩm, tưới nước ngày hai lần Những

ngày nắng nhiều thì tưới ba lần Nếu thiếu nước, giả hành sẽ teo lại, rụng lá

Khi cây ra rễ mạnh, tưới phân NPK (30-10-10) mỗi tuần một lần Đến khi cây trưởng thành, chuyển qua phân NPK (10-30-10) để kích thích ra hoa Khi vừa hé phát hoa, tưới qua phân NPK (10-10-30) để cho hoa đẹp, lâu tàn Khi cắt hoa thì quay trở lại phân NPK (30-10-10) để cây ra chồi và phát triển nhanh Tuy nhiên, cần thường xuyên vệ sinh giàn lan, nhổ cỏ, diệt côn trùng (sên, ốc, dế, bướm) để tránh lây lan mầm bệnh Hàng tháng nên phun thuốc sát trùng, thuốc rầy một lần để phòng tránh nấm mốc, sâu bệnh gây hại [7]

1.6 Giá trị của Phong Lan

1.6.1 Giá trị dƣợc liệu

Ngoài giá trị thẩm mỹ, lan còn được sử dụng trong lĩnh vực dược liệu để trị một

số bệnh Chẳng hạn như Lan Phi Điệp (Dendrobium anosmum Lindl.) (hình 1.2)

[76] (dùng thân cây) có thể trị bệnh suy nhược cơ thể hay thần kinh, đau họng, tiểu

đường, yếu sinh lý [74][75], Lan Củ Khóm (Dendrobium crumenatum Sw.) (hình

1.3) (dùng thân và lá) cũng có thể trị đau họng, lợi tiểu, khử lọc [79]

Hình 1.2 Lan Phi Điệp Dendrobium anosmum Lindl

Hình 1.3 Lan củ khóm Dendrobium crumenatum Sw

Một số chất như dendromoliside, picrotoxane, glucoside… được chiết từ thân

của lan Dendrobium moniliforme (hình 1.4) có khả năng làm tăng số lượng tế bào

B và ức chế tăng sinh tế bào T trong in vitro [71]

Hình 1.4 Lan Dendrobium moniliforme Hình 1.5 Lan Dendrobium salaccense

Một bộ tộc ở Indonesia dùng lan Dendrobium salaccense (hình 1.5) nấu với

cơm như người Việt Nam ở đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa để nấu Ngoài

ra, lá và giả hành còn được dùng làm trà để uống…[4]

1.6.2 Giá trị kinh tế

Ngày nay, đời sống của con người ngày một nâng cao thì nhu cầu trưng bày hoa nói chung và hoa lan nói riêng, làm cảnh quan để thưởng ngoạn là nhu cầu tất yếu

Sự hiện diện của hoa lan thể hiện sự sang trọng và quý phái

Hàng năm, tỷ lệ ngành sản xuất hoa lan trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỷ (2006), đến nay (2012) đã đạt 102 tỷ USD [82] Trong năm 2000, kim ngạch xuất nhập khẩu lan cắt cành và cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó lan cắt cành đạt 128 triệu USD Vì lợi nhuận đem lại khá cao nên nhiều nước đã xem ngành trồng phong lan là một trong những ngành kinh tế quan trọng, góp phần phát triển kinh tế Hiện nay, các quốc gia ở Đông Nam Á đã phát triển rất mạnh nghề trồng hoa nói chung và hoa lan nói riêng, trong đó có cả Việt Nam [4]

1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nước ta và trên thế giới

Trên thế giới, hoa cắt cành nói chung và hoa lan nói riêng là một trong những ngành đem lại nhiều tỷ đô-la (USD) và vô cùng năng động Ở Mỹ, giá trị lan trồng chậu ước tính đạt từ 47 triệu USD (1996) đến 121 triệu USD (2003) Ở Hà Lan,

trong năm 2002-2003, ước tính giá trị lan trồng chậu Phalaenopsis khoảng 87 triệu

bảng Anh (Michel Paul, 2004) Theo số liệu thống kê từ FlowerTECH (2004), đến năm 2014, sản lượng hoa lan trồng chậu đạt khoảng 305 triệu USD

Hình 1.6 Sản lượng lan trồng chậu đến năm 2014

Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã vươn lên trở thành nước không chỉ xuất khẩu lan cắt cành mà còn xuất khẩu giống nhiều nhất trên thế giới Năm 1990, Thái Lan xuất khẩu khoảng 15.5 triệu cành, đến năm 1995 là 26.5 triệu cành Đến năm 2009 xuất khẩu đạt 104 triệu USD Thái Lan cũng dành khoảng 3718 ha (chiếm 30.6%)

để trồng lan (2009) Khoảng 60-70% sản lượng lan cắt cành của Thái Lan được xuất khẩu sang khoảng 38 nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [77]

Chính phủ Malaysia cũng đã thấy được tiềm năng trong ngành hoa lan nên đã quy hoạch khoảng 300 ha và giao cho Hiệp hội hoa lan để sản xuất với mục đích xuất khẩu Đài Loan cũng rất quan tâm đến việc sản xuất hoa lan để xuất khẩu bởi

vì hàng năm ngành trồng hoa đem lại khoảng 9 tỷ Đài tệ Còn ở Singapore, nhiều vườn lan không chỉ phục vụ cho du khách mà còn xuất khẩu sang các nước Châu

Âu, Mỹ, Nhật… Các vườn lan ở các quốc gia này trồng theo quy trình công nghiệp rất hiện đại từ khâu trồng đến khâu thu hoạch cũng như phân phối và đóng gói Riêng ở Việt Nam, lan rất đa dạng, đều có mặt hầu hết cả nước và từ lâu đã trồng làm cảnh trong nhà Diện tích trồng hoa ở Việt Nam khoảng 2500 ha nhưng lan chỉ chiếm khoảng 5-6% Hiện nay, ở Thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng lan khoảng 210 ha, hướng đến 2015 là 400 ha, tập trung chủ yếu ở Quận Thủ Đức, Quận 2, Quận 9, Bình Chánh, Hóc Môn, Củ Chi… Tuy nhiên, giống lan chủ yếu là

Mokara và Dendrobium [78] Theo số liệu của Hội Hoa lan thành phố Hồ Chí

Minh, trung bình mỗi tuần Thành phố Hồ Chí Minh nhập hơn 20.000 cành lan từ Thái Lan, 15.000 cành từ Đài Loan và giá dao động từ 5.000-7.000 đồng/cành Như vậy có thể nói rằng ngành trồng lan tại Thành phố Hồ Chí Minh đang rất cần những nhà đầu tư mạnh dạn mở rộng diện tích sản xuất và áp dụng những kỹ thuật hiện đại để tăng sản lượng hoa cung ứng trong nước và có thể xuất khẩu Ngoài ra, Ủy Ban Nhân Dân Thành Phố Hồ Chí Minh cũng đã ban hành Quyết định số 3330/QĐ-UBND ngày 04/07/2011 để thực hiện Chương trình phát triển hoa, cây kiểng trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh, trong đó cây lan được ưu tiên lựa chọn Sở Khoa học và Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã giao cho Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh thực hiện nhằm chuyển giao cho các hộ nông dân

1.8 Các phương pháp chuyển gen

1.8.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

 Sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

A tumefaciens là vi khuẩn gram âm, hình gậy, đơn bào, không sinh bào tử, gây

bệnh khối u ở thân cây Khối u này chứa một số chất mới như nopalin và octopin, gọi chung là opine, mà ở cây bình thường không có Đặc biệt hơn là khối u không ngừng tăng trưởng ngay cả khi diệt hết các vi khuẩn trong cây bị nhiễm [11]

Bộ gen của A tumefaciens chứa một nhiễm sắc thể và một plasmid lớn có kích

thước khoảng 200kb, gọi là plasmid Ti (Tumor-inducing) Chính plasmid này là tác nhân gây bệnh khối u ở thân cây

Hình 1.7 Bộ gen của vi khuẩn A tumefaciens Khi xâm nhiễm vào cây, A tumefaciens chuyển đoạn T-DNA nằm trên plasmid

Ti vào bộ gen thực vật Sau khi sát nhập vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA

sẽ tiến hành phiên mã và dịch mã để tạo nên các protein đặc biệt mà cây bình thường không có, đó là các opine Kết quả hình thành nên các khối u trên thân cây

Vi khuẩn A tumefaciens dễ dàng xâm nhập vào cây Hai lá mầm, nhưng lại khó khăn với cây Một lá mầm, ngoại trừ vài loài của Asparagus [2]

Hình 1.8 Khối u do A tumefaciens tạo ra

Nhiễm sắc thể Plasmid

Dựa vào đặc tính gây bệnh, Agrobacterium được phân loại như sau:

 Các chủng gây khối u sủi thân (crown gall) được gọi là

Agrobacterium tumefaciens

 Các chủng cảm ứng khối u (cane gall) trên các loại dâu đất, cây mâm

xôi (Rubus idaeus) được gọi là Agrobacterium rubi

 Các chủng cảm ứng rễ tơ (hairy root) được gọi là Agrobacterium

rhizogenes

 Các chủng không gây bệnh được gọi là Agrobacterium radiobacter

Dựa vào các đặc tính sinh lý và sinh hóa: có 3 kiểu sinh học (biotype):

 Biotype I: Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium radiobacter

 Biotype II: Agrobacterium rhizogenes

 Biotype III: Agrobacterium vitis

 Đặc điểm di truyền [2][24]

Bộ gen Agrobacterium gồm hai phần: phần plasmid Ti và phần nhiễm sắc thể

Plasmid Ti là DNA dạng vòng, kích thước khoảng 200kb, có khả năng tự sao chép

độc lập trong tế bào vi khuẩn, gồm hai thành phần chính: T-DNA và vùng gen vir

(vùng độc tính) Ngoài ra, còn có vùng sao chép plasmid, vùng chuyển nạp plasmid

và vùng bị hóa opine (hình 1.10) Plasmid Ti được phân loại theo opine nên có plasmid Ti kiểu octopine, plasmid Ti kiểu nopaline… Có hai nhóm opine chính: một là họ octopine là dẫn xuất của carboxyl ethyl của arginine, hai là nopaline là dẫn xuất của dicarboxylpropyl của arginine Ngoài ra, còn có agropine là dẫn xuất

của “bicyclic sugar” của glutamic acid và succcinamopine là dẫn xuất của dicarboxylpropyl của asparagine (hình 1.11).

Hình 1.10 Cấu tạo của plasmid Ti Vùng T-DNA là một đoạn DNA có kích thước khoảng 25kb, gồm hai loại gen: gen oncogen (gen phát sinh khối u) mã hóa cho các enzym liên quan đến sự tổng hợp auxin, cytokinin và đảm trách việc hình thành khối u Gen thứ hai mã hóa cho việc tổng hợp các opine Vi khuẩn sử dụng các hợp chất này như nguồn carbon và nitơ để sinh sản Đoạn T-DNA trong plasmid Ti được giới hạn bởi bờ trái (Left Border - LB) và bờ phải (Right Border - RB) Các bờ này là những trình tự lặp lại

cùng chiều có kích thước khoảng 25 nucleotide, có vai trò như là tín hiệu cis trong

bộ máy vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật

Nopaline Octopine Agropine

Hình 1.11 Một số loại opine

Vùng gen vir là vùng gen độc tính, dài khoảng 30-40 kb, là một regulon gồm 6

operon cần thiết cho sự vận chuyển T-DNA (virA, virB, virD, virG) và làm tăng hiệu quả chuyển gen (virC và virE) Các gen này mã hóa cho các enzym tương

ứng có chức năng cắt đứt bờ trái và bờ phải để giải phóng T-DNA, đồng thời còn

có chức năng bao bọc T-DNA, vận chuyển và gắn T-DNA vào bộ gen tế bào thực

vật Hai gen virA và virG hợp lại thành một hệ thống điều hòa hai thành phần để điều hòa hoạt động của các gen vir khác Các gen vir thường được kích thích bởi

các hợp chất phenolic được tiết ra từ vết thương của cây Các hợp chất này vừa có tính kháng khuẩn vừa là chất dẫn dụ vi khuẩn

Ngoài vùng T-DNA và vùng gen vir, trên plasmid Ti còn có vùng khởi đầu sao

chép giúp cho vi khuẩn tự sao chép độc lập trong tế bào, vùng gen đồng hóa opine giúp cho vi khuẩn tiêu hóa các opine được tạo ra trong các khối u

Ngoài các yếu tố di truyền từ plasmid Ti, còn có các yếu tố di truyền khác từ

nhiễm sắc thể của vi khuẩn, có vai trò quan trọng trong việc giúp A tumefaciens bám vào tế bào thực vật và dòng hóa vi khuẩn [22], đó là: locus chvA và chvB (tổng hợp và bài tiết β-1,2 glucan), locus chvE (gia tăng đường cảm ứng gen vir và gia tăng tính hướng hóa của vi khuẩn), locus cel: (tổng hợp sợi cellulose), locus

pscA (exoC) (tổng hợp c-glucan và acid succinoglycan) và locus att (liên quan đến

các protein bề mặt tế bào)

 Quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens [22]

Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn

thương trên cây Hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó Khi bị xâm nhiễm, tế bào thực vật tiết ra các chất độc có bản chất phenolic (như

acetosyringone, hydroxyl acetosyringone…) không chỉ để làm lành vết thương, dẫn

dụ vi khuẩn, mà còn gián tiếp hoạt hóa vùng gen vir của plasmid Ti

Quá trình T-DNA của A tumefaciens gắn vào bộ gen thực vật được bắt đầu

bằng sự nhận diện các tín hiệu từ thực vật thông qua hệ thống điều hòa hai thành phần VirA/VirG nằm trên màng tế bào vi khuẩn Hệ thống này ngay sau đó sẽ hoạt

hóa các gen vir cần cho quá trình giải phóng T-DNA khỏi plasmid Ti, vận chuyển

T-DNA, nhập vào nhân tế bào thực vật và sau cùng là gắn vào bộ gen thực vật Các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện qua quá trình phiên mã và dịch mã

Hình 1.12 Mô hình xâm nhiễm của vi khuẩn A tumefaciens

 Cơ chế phân tử của quá trình A tumefaciens xâm nhiễm [22] [18]

Đầu tiên, vi khuẩn A tumefaciens bám vào tế bào thực vật thông qua các

receptor chuyên biệt có trên bề mặt tế bào thực vật (hình 1.13) Người ta đã xác định được một số receptor tham gia, đó là protein giống Vitronectin, CSLA9 (Cellulose synthase-like protein) và các protein tương tác với VirB2 (VirB2 iteractors - BTIs) bao gồm BTI1, BTI2, BTI3 và AtRAB8 Các receptor BTI này liên kết với T-pilus của vi khuẩn Tuy nhiên, chức năng chính xác của các receptor này chưa được biết rõ

Khi mô thực vật bị tổn thương, tế bào thực vật tiết ra các hợp chất phenolic, monosacharid để bảo vệ Tuy nhiên, chính các hợp chất này lại dẫn dụ vi khuẩn và đồng thời kích hoạt hệ thống điều hòa hai thành phần VirA/VirG trên màng tế bào

vi khuẩn bởi quá trình phosphoryl hóa Hệ thống này sau đó hoạt hóa các gen vir

để cuối cùng mã hóa cho hàng loạt các protein Vir (VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF)

Hình 1.13 Các receptor trên bề mặt tế bào thực vật Các protein VirD1, VirD2 như những endonuclease phối hợp với nhau cắt chuyên biệt tại vị trí bờ trái (LB) và bờ phải (RB) trên plasmid Ti để phóng thích sợi đơn ssT-DNA (single-strand T-DNA) Sợi đơn ssT-DNA ngay sau đó liên kết với VirD2 bằng liên kết cộng hóa trị tại đầu 5’ và hình thành phức VirD2-T-strand chưa đầy đủ Ngoài ra, VirD4 còn kết hợp với 11 protein VirB tạo thành phức hệ vận chuyển ssT-DNA vào tế bào thực vật (hệ thống tiết Type IV VirD4/VirB) Sau khi vào tế bào chất của tế bào thực vật, các protein VirE2 sẽ liên kết với phức hợp VirD2-T-strand theo suốt chiều dài của phức hợp để hình thành nên phức hợp T-complex trưởng thành (VirE2-VirD2-T-strand) Phức hợp T-complex được

các protein giống dynein (protein động cơ phân tử) DLC3 (Arabidopsis) hoặc protein phụ thuộc dynein (in vitro) cùng với protein tế bào chủ VIP1 (VirE2

interacting protein1) vận chuyển đến nhân tế bào (hình 1.14)

Hình 1.14 Protein động cơ phân tử tham gia vận chuyển T-DNA

Bởi vì đường kính của phức hợp T-complex trưởng thành khoảng 15nm, trong khi đường kính phức hợp lỗ nhân (NPC) chỉ khoảng 9nm Cho nên, phức hợp này

sẽ vào nhân theo cơ chế hoạt động Cấu trúc T-complex là cấu trúc phân cực nên sẽ

đi vào nhân theo mô hình phân cực với phân tử VirD2 gắn vào đầu 5’ của sợi strand VirD2 trực tiếp đưa T-Strand vào phức hợp lỗ nhân (NPC), trong khi VirE2 đóng gói sợi T-strand ở dạng vận chuyển và hỗ trợ chuyển vị toàn phức T-complex vào trong nhân tế bào thực vật Hơn nữa, quá trình nhập T-complex vào nhân còn

T-có sự tham gia của các protein thực vật VIP1 và importins-α (hình 1.15)

Hình 1.15 Phức hợp T-complex đi vào nhân tế bào thực vật

Sau khi vào nhân, phức hợp T-complex sẽ được đưa đến vị trí gắn chèn trên nhiễm sắc thể của tế bào chủ Tuy nhiên, quá trình này đến nay vẫn còn chưa được biết rõ Tuy vậy, có một vài nhân tố của tế bào thực vật và một vài cơ chế phân tử liên quan đến quá trình này (hình 1.16)

Hình 1.16 Phức hợp T-complex đến vị trí gắn chèn trên bộ gen thực vật

Protein CAK2M và protein TBP (TATA box-binding protein) tham gia gắn chèn ssT-DNA vào DNA tế bào thực vật thông qua cơ chế sửa sai DNA và phiên

mã Cả hai đều gắn vào VirD2 trong phức T-complex, trong khi VIP1 liên kết với VirE2 và với các histone lõi của nhiễm sắc thể CAK2M tương tác với tiểu phần lớn của RNA polymerase II và đồng thời thu hút TBP không chỉ phiên mã mà còn điều hòa quá trình sửa chữa DNA VIP1 vừa là thành phần của cơ chế phiên mã vừa tham gia tháo xoắn nhiễm sắc thể

Việc đầu tiên lúc này là cởi bỏ các protein hiện đang gắn vào DNA để DNA hình thành nên dạng sợi đôi dsT-DNA (double-strand T-DNA) nhờ sự tham gia của các protein VirF (của vi khuẩn), protein thuộc họ ASK (Skp1) và Cullin (của tế bào thực vật) VirF có domain F-box tương tác với Skp1 và với Cullin để hình thành nên phức hợp protein SCFVirF (Skp1-Cullin-F-box) Phức hợp SCFVirF

ssT-sẽ gắn vào VIP1 trong phức T-complex, trong đó domain F-box của VirF gắn trực tiếp vào VIP1 SCFVirF có chức năng làm giảm độ ổn định (ái lực liên kết) của VIP1 và các VirE2, và cuối cùng giải phóng các protein liên kết với ssT-DNA ra khỏi ssT-DNA, chuẩn bị cho quá trình gắn chèn vào bộ gen thực vật (hình 1.17)

Hình 1.17 Quá trình phóng thích sợi ssT-DNA khỏi phức T-complex Bước gắn chèn T-DNA là bước phụ thuộc hầu như vào tế bào thực vật Tuy nhiên, các bước chính xác của quá trình gắn chèn T-DNA vẫn còn chưa rõ Nhưng

có một vài nghiên cứu gần đây cho thấy có một số protein và cơ chế gắn chèn DNA đã được nêu ra Các bằng chứng gần đây cho thấy các đứt gãy đôi (DSB – Double-Stranded Breaks) trong bộ gen tế bào thực vật và các chất trung gian đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn chèn Vì các enzym endonuclease cắt giới hạn chỉ phân tách các DNA sợi đôi nên T-DNA cũng phải chuyển sang dạng sợi đôi dsT-DNA trước khi chèn vào các vị trí DSB Các protein tế bào chủ như KU70, RAD50, MRE1, XRS2, LIG4 và SIR4 sẽ tham gia gắn chèn thông qua cơ chế tái tổ hợp không tương đồng NHR (non-homologous recombination), còn protein RAD51 và RAD52 thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng HR (homologous recombination – HR) Ở thực vật, sự gắn chèn chủ yếu thông qua cơ chế NHR

T-ngay cả khi T-DNA có trình tự tương đồng cao với bộ gen tế bào chủ Vi khuẩn A

tumefaciens sử dụng cơ chế sửa sai DNA nối điểm cuối không tương đồng NHEJ

(non-homologous end-joining) để gắn chèn T-DNA Các protein tham gia cơ chế NHEJ bao gồm protein KU80 (gắn vào hai đầu của T-DNA), enzyme LIG4 (ligase) (nối các lỗ hỏng giữa T-DNA và DNA thực vật) và các protein đóng gói DNA (H2A – Histone)

1.8.2 Một số phương pháp chuyển gen khác vào thực vật

 Phương pháp SAAT (Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated

Transformation) [60][72]

Đây là phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

với sự hỗ trợ của sóng siêu âm Các mô cây được xử lý bằng sóng siêu âm trong

một thời gian ngắn có sự hiện diện của vi khuẩn Agrobacterium hoặc sau khi xử lý

xong mới cho vi khuẩn vào Sóng siêu âm sẽ tạo ra hàng ngàn vết thương rất nhỏ, các lỗ trống rất nhỏ trên khắp bề mặt mô cây Sự tổn thương này giúp cho vi khuẩn

di chuyển dễ dàng vào sâu bên trong mô cây Nhờ đó làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn nên hiệu suất biến nạp cũng tăng lên

Theo kết quả do Pathak và Hamzah (2008) thực hiện trên cây thuộc họ đậu có

tên là chickpeas, hiệu suất chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens tăng khoảng hơn hai lần khi xử lý mẫu cây bằng sóng siêu âm so với

các mẫu cây không xử lý bằng sóng siêu âm Ngoài ra, Trick và Iner (1997) cũng thông báo rằng sự biểu hiện GUS của mẫu cây khi xử lý sóng siêu âm tăng lên so với các mẫu cây chỉ ủ khuẩn mà thôi

 Phương pháp lọc chân không

Phương pháp này đã được áp dụng trên một số loại cây, đặc biệt là cây Một lá mầm Mô cây và dịch vi khuẩn được đặt trong môi trường chân không (thông qua máy hút) Nhờ đó, vi khuẩn có thể bám chặt vào bề mặt mô và có thể chuyển T-DNA vào tế bào thực vật dễ dàng hơn

 Phương pháp Floral-dip

Ngâm hoa trực tiếp vào dịch vi khuẩn A tumefaciens, không cần phải nuôi cấy trong in vitro nên nguy cơ biến dị ít xảy ra (Clough và cộng sự, 1998) Phương pháp này ứng dụng thành công trên Arabidopsis thaliana (Ye và cộng sự, 1999;

Kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị đắt tiền, vi thao tác các tế bào đơn dưới kính hiển

vi, tốn nhiều thời gian Một số cây đã chuyển gen thành công bằng kỹ thuật vi tiêm

là cải dầu, thuốc lá, lúa mạch…Tuy nhiên, thành công trong việc chuyển gen ở thực vật bằng vi tiêm còn rất hạn chế bởi vì vách tế bào dày và hơn nữa là thiếu khả năng tái sinh tế bào đơn thành cây trong hầu hết các loài thực vật

 Phương pháp bắn gen [18]

Phương pháp này có nhiều tên gọi khác nhau như biolistic, bombardement Đây

là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng Hiện nay, có ba loại dụng

cụ “biolistic” khác nhau Điểm khác biệt chủ yếu là phương pháp điều khiển

“microprojectile” bằng tungsten hay bằng vàng

 Dụng cụ thứ nhất là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ một kim lửa (Klein và cộng sự, 1987)

 Dụng cụ thứ hai hoạt động theo nguyên tắc phóng điện, đưa DNA phủ lên các phân tử bằng vàng cực mịn (Christou và cộng sự, 1988) với thuật ngữ “DNA-coated gold particles”

 Dụng cụ thứ ba hoạt động bằng áp suất khí từ một xy lanh chứa

“nitrogen” để thúc đẩy tiến trình bắn DNA (Morikawa và cộng sự, 1989) Vận tốc của tiến trình “microprojectile” của dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với súng bắn gen loại thứ nhất, tuy nhiên hiệu quả chuyển gen lại khá cao (Cao và cộng sự, 1991)

 Phương pháp PEG (PolyEthylene Glycol)[18]

Đây là phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ sử dụng chất PEG Phương pháp này thường dùng tế bào trần (protoplast) là vật liệu để chuyển gen, tương tự như phương pháp điện biến nạp (electroporation), DNA được trộn với tế bào trần và PEG kích thích DNA dung hợp vào tế bào trần Mặc dù dễ xử lý và không đòi hỏi thiết bị chuyên dụng nhưng tần số chuyển gen thấp và nhiều loài không thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và thường bất thụ Tuy nhiên, cũng có một số đối tượng chuyển gen thành công bằng phương pháp này như bắp, lúa mạch

 Phương pháp dùng xung điện [18]

Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200-400V/cm) trong khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây Kết quả làm màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập, và sau cùng gắn vào bộ gen thực vật Quá trình được thực hiện trong cuvette (ống nhỏ hình vuông hoặc tròn bằng nhựa hoặc thủy tinh kín một đầu) chuyên dụng Sau quá trình xung điện, đem tế bào trần sang môi trường nuôi cấy thích hợp và môi trường chọn lọc để tách các dòng tế bào trần

chuyển nạp Tiếp theo là nuôi cấy in vitro, tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen Phương pháp này được áp dụng thành công ở cowpea (Akella và Lurquin, 1993),

Zea mays (Songstad và cộng sự, 1993)

1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen

Trong quá trình chuyển nạp gen, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển cũng như quá trình sát nhập T-DNA vào bộ gen thực vật Từ đó, ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen Một số yếu tố chính thường ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen, đó là kiểu gen thực vật, chủng vi khuẩn, các vector chuyển gen,

các hợp chất cảm ứng gen vir, thành phần môi trường, loại mô, kháng sinh và một

số nhân tố khác như nhiệt độ, chất hoạt động bề mặt (surfactant), mật độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy và gen chọn lọc Do đó, để gia tăng hiệu quả chuyển gen, cần phải khảo sát các yếu tố này để tối ưu quy trình chuyển gen

1.9.1 Xử lý mẫu [13][14]

Để gia tăng khả năng dung nạp T-DNA và thuận lợi cho việc tái sinh sau khi nhiễm, cần phải xử lý mẫu cấy trước một cách cẩn thận Xử lý thẩm thấu mẫu cấy phụ thuộc vào loài Chẳng hạn như khi bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy 200mM sucrose và 200mM glucose đã được dùng rộng rãi trong chuyển gen ở lúa

và bắp (Hiei và cộng sự, 1994; Zhao và cộng sự, 2001; Frame và cộng sự, 2002) Uze và cộng sự (1997) cho rằng khi xử lý với 292mM sucrose sẽ cải thiện hiệu suất biến nạp ở phôi lúa chưa trưởng thành Tuy nhiên, xử lý thẩm thấu lại không có hiệu quả đối với lúa mì (Uze và cộng sự, 2000; Cheng và cộng sự, 2003) [34]

1.9.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A tumefaciens [13][14][57]

Thời gian đồng nuôi cấy cũng như mật độ vi khuẩn sử dụng là khác nhau đối với từng loại cây, loại mô Do đó, cần phải khảo sát các yếu tố này trong quá trình chuyển gen để hiệu suất chuyển gen được cải thiện Chẳng hạn như thời gian đồng

nuôi cấy tối ưu đối với cải dầu (canola) là 48 giờ (Cardoza và Stewart, 2003), với cải bắp Trung Quốc (Chinese cabbage) là 72 giờ (Zhang và cộng sự, 2000)

Mật độ vi khuẩn sử dụng trong chuyển gen ở lúa là 1x106 – 1x1010 (cfu/mL) (cfu: colony-forming units) (Hiei và cộng sự, 1997), tối ưu nhất ở 1x1010 cfu/mL (Hiei và cộng sự, 1994) Mật độ này cũng tối ưu đối với bắp (Ishida và cộng sự, 1996) Ở bắp, khi nồng độ vi khuẩn càng cao thì sự biểu hiện GUS tạm thời càng tăng nhưng lại làm giảm sự hình thành mô sẹo, và hiệu suất tối ưu ở nồng độ

0.5x1010 (Zhao và cộng sự, 2001) Với lúa mì, khi tiến hành thí nghiệm trên các mẫu cấy khác nhau ở nồng độ vi khuẩn càng cao thì sự biểu hiện GUS càng tăng nhưng hiệu suất chuyển gen thì không tương quan (Cheng và cộng sự, 1997) Nồng

độ vi khuẩn cao hơn hay thấp hơn nồng độ tối ưu thường làm tế bào dễ bị tổn thương, hư hại và khả năng tái sinh của mô giảm, dẫn đến hiệu suất chuyển gen giảm Tuy nhiên, đối với những mẫu cấy hay cây “cứng đầu” thì dùng ở nồng độ cao nhưng thời gian ủ ngắn Sau khi ủ xong, rửa lại mẫu hoặc bổ sung các chất sát khuẩn như AgNO3 vào môi trường đồng nuôi cấy (Zhao và cộng sự, 2000,2001; Zhang và cộng sự, 2003)

1.9.3 Làm khô mẫu cấy [14]

Một yếu tố khác có thể làm gia tăng hiệu suất chuyển gen là tình trạng mẫu

trước và ngay sau nhiễm khuẩn A tumefaciens Arencibia và cộng sự (1998) cho

rằng khi trải dịch huyền phù cây mía thành lớp mỏng và phơi khô ngoài không khí khoảng 15-60 phút trước khi ủ sẽ làm gia tăng khả năng vận chuyển T-DNA và hiệu suất chuyển gen Tương tự, khi phơi khô ngoài không khí mô sẹo từ dịch huyền phù cây lúa khoảng 10-15 phút sẽ làm tăng hiệu suất chuyển gen hơn 10 lần

so với không phơi khô (Urushibara và cộng sự, 2001) Tuy nhiên, cơ chế phân tử của việc làm khô mẫu này đến nay vẫn chưa biết rõ, có thể là do hiện tượng co nguyên sinh hoặc vết thương xuất hiện trong quá trình phơi khô sẽ làm tăng tính thẩm thấu, giúp vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật hơn Việc làm khô mẫu cấy không chỉ có hiệu quả đối với cây Một lá mầm mà còn có hiệu quả trên cây Hai lá mầm “cứng đầu” như đậu nành (soybean)

1.9.4 Xử lý với chất chống hoại tử [14][56]

Sử dụng các chất chống hoại tử (antinecrotic) để giảm thiểu sự oxy hóa mẫu cấy cũng giúp hạn chế mẫu cấy chết Enrique-Obregon và cộng sự (1998) cho rằng khi xử lý mô phân sinh mía với môi trường chứa 15mg/L ascorbic acid, 40 mg/L cysteine và 2 mg/L AgNO3 thì hiệu quả chuyển gen gia tăng Quy trình này cũng

đã áp dụng thành công trên lúa (Enrique-Obregon và cộng sự , 1999) Ở đậu nành,

bổ sung các hợp chất thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulphate) vào

môi trường đồng nuôi cấy làm tăng hiệu suất biến nạp khoảng 16.4% (Olhoft và cộng sự, 2003) Ở bắp, thêm AgNO3 vào môi trường đồng nuôi cấy cũng đem lại hiệu quả tương tự (Armstrong và Rout, 2001; Zhao và cộng sự, 2001)

1.9.5 Nhiệt độ [14][23][49][56]

Yếu tố nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự xâm nhiễm của vi khuẩn A tumefaciens,

thường dao động quanh khoảng 220

C, trên 280C sẽ không xảy ra Nhiệt độ ảnh hưởng đến hệ thống điều hòa hai thành phần VirA/VirG trên màng tế bào vi khuẩn,

nên sẽ ảnh hưởng đến sự hoạt hóa các gen vir (trên 320C, gen vir mất hoạt tính) Ở

thuốc lá, nhiệt độ tối ưu cho sự vận chuyển T-DNA là 220C (Dillen và cộng sự, 1997) Tuy nhiên, trong một nghiên cứu khác trên thuốc lá thì nhiệt độ tối ưu là

250C, thậm chí là 190C (Salas và cộng sự, 2001) Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho quá

trình chuyển nạp gen phụ thuộc vào loài, loại mô và chủng A tumefaciens (Salas

và cộng sự, 2001) Với mô sẹo tỏi, nhiệt độ tối ưu là 220C (Kondo và cộng sự, 2000); bắp là 230C và lúa mì là 23-250C (Rout và cộng sự, 1996)

1.9.6 Chất hoạt động bề mặt [14]

Chất hoạt động bề mặt (surfactant) có tác dụng làm gia tăng sự vận chuyển

T-DNA bằng cách hỗ trợ A tumefaciens bám chặt vào mô thực vật hoặc loại bỏ các

chất ức chế quá trình bám đó Chẳng hạn như, bổ sung một số chất hoạt động bề mặt như Silwet L77 và pluronic acid F68 vào môi trường ủ sẽ làm tăng quá trình vận chuyển T-DNA ở phôi lúa mì chưa trưởng thành (Cheng và cộng sự, 1997) Ngoài ra, chất Silwet L77 còn sử dụng thành công trong chuyển gen cây

Arabidopsis thaliana bằng phương pháp floral-drip (Ye và cộng sự, 1999; Bechold

và cộng sự, 2000; Desfeux và cộng sự, 2000) [49][51]

1.9.7 Môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy [14][13][57][56]

Thành phần môi trường như đường, chất điều hòa tăng trưởng và chất cảm ứng

gen vir là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển

gen Môi trường biến đổi N6 (Chu và cộng sự, 1995) bao gồm dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) và casamino acid rất phù hợp cho việc đồng nuôi cấy ở lúa Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) hoặc MS biến đổi

2,4-thích hợp cho việc ủ và đồng nuôi cấy ở lúa (Dong và cộng sự, 1996; Obregon và cộng sự, 1999; Mohanty và cộng sự, 1999; Luca và cộng sự, 2001) Ishida và cộng sự (1996) cho rằng dùng môi trường LS (Linsmaier và Skoog, 1965) rất thích hợp cho việc chuyển gen ở phôi bắp chưa trưởng thành, trong khi dùng môi trường N6 căn bản lại không tạo được cây chuyển gen Khi bổ sung thêm AgNO3 vào môi trường N6 căn bản thì lại phù hợp cho việc ủ và đồng nuôi cấy phôi bắp chưa trưởng thành, và kết quả tạo được cây chuyển gen (Zhao và cộng sự, 2001) Giảm nồng độ muối trong môi trường đồng nuôi cấy và môi trường ủ rất có lợi trong chuyển gen ở cải dầu (Fry và cộng sự, 1987), ở lúa mì (Cheng và cộng sự, 1997), ở bắp (Armstrong và Rout, 2001)

Enriquez-Các chất hóa học cảm ứng gen vir như acetosyringone được sử dụng hầu như

trong tất cả các quy trình chuyển gen (Hiei và cộng sự, 1994; Ishida và cộng sự, 1996; Cheng và cộng sự, 1997; Tingay et al., 1997; Zhao et al., 2000; Kumlehn và cộng sự, 2006) Ở lúa, hành và lúa mạch, khi không bổ sung acetosyringone, sự biểu hiện GUS tạm thời thấp và khả năng tái sinh kém (Rashid

và cộng sự, 1996; Hiei và cộng sự, 1997; Zheng và cộng sự, 2001; Kumlehn và cộng sự, 2006) [51][64][65]

1.9.8 Kháng sinh [14][53][29][26][13][31]

Việc loại bỏ vi khuẩn sau quá trình đồng nuôi cấy để sự tái sinh sau đó của mô cấy được thuận lợi là vấn đề cực kỳ quan trọng Nếu loại bỏ không hết vi khuẩn sẽ ảnh hưởng đến sự tái sinh của mô cấy, thậm chí gây hư hại môi trường và mẫu cấy

có thể bị chết Thường thì người ta dùng kháng sinh để diệt vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy Tuy nhiên, kháng sinh lại gây độc cho mô cấy nên ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen Do đó, cần phải khảo sát các loại kháng sinh để sao cho kháng sinh sử dụng phải ở nồng độ thấp nhất có thể giết chết vi khuẩn và ít gây tổn hại đến mô cấy nhất

Hiện nay có một số loại kháng sinh thường được sử dụng trong chuyển gen

gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium, đó là cefotaxim, carbenicilin và

timentin Các loại kháng sinh này có khả năng ức chế sự hình thành peptidoglycan,

là thành phần cấu tạo vách tế bào vi khuẩn Do đó, vi khuẩn sẽ bị giết chết Tuy nhiên, phải dùng ở nồng độ rất cao mới có thể diệt được (200-500mg/L) Với nồng

độ này, sẽ gây độc cho tế bào nên ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh của mô cấy (Hammerschlag và Zimmerman, 1995) Nồng độ cefotaxim sử dụng trong chuyển

gen thông qua Agrobacterium ở lúa và bắp là 250mg/L, ban đầu diệt khuẩn khá

hiệu quả, tuy nhiên, lại làm giảm sự hình thành mô sẹo khi thêm vào môi trường cảm ứng tạo sẹo (Ishida và cộng sự, 1996) Nồng độ carbenicilin thường dùng trong chuyển gen lúa mì và bắp là 100mg/L (Cheng và cộng sự, 1997, 2003; Zhang và cộng sự, 2003) Vì thế, cần phải phát hiện thêm các loại kháng sinh mới

có đặc tính ưu việt hơn trong vấn đề diệt khuẩn nhưng ở nồng độ sử dụng thấp là điều rất cần thiết Hiện nay, kháng sinh moxalactam, một loại β-lactam kháng sinh, rất hiệu quả trong việc diệt khuẩn, tăng khả năng tạo phôi trong nghiên cứu chuyển gen ở cây cacao hơn so với việc dùng cefotaxim (Mayolo và cộng sự, 2003) Trong

số các kháng sinh cefotaxim, cefbuperazon và meropenem được thử nghiệm trên

các chủng A tumefaciens LBA101 và EHA101 thì meropenem là kháng sinh có

hoạt tính diệt khuẩn tốt nhất và ít gây hại cho mô cấy nhất (Ogawa và Mii, 2004) Cũng thu được kết quả rất tốt khi dùng kháng sinh meropenem thử nghiệm trên các

chủng LBA4404, EHA101 và GV3101 trong chuyển gen trên lan Dendrobium

phalaenopsis khi so sánh với việc dùng kháng sinh ampicilin, carbenicilin,

cefotaxim và cefoperazon Nồng độ meropenem dùng để diệt khuẩn khá thấp (khoảng 0.5mg/L) (Ying và cộng sự, 2006) Theo Sjahril và Mii (2006), nồng độ

cefotaxim và carbenicilin dùng để diệt khuẩn trên lan Hồ Điệp (phalaenopsis) là

500mg/L, trong khi dùng kháng sinh meropenem chỉ ở nồng độ 5mg/L Ngoài ra, kháng sinh meropenem còn có hiệu quả rất tốt trong chuyển gen ở các loài lan khác

như Cymbidium, Vanda và Oncidium (Chin và cộng sự, 2007)

[21][28][45][48][54][67]

1.9.9 Marker chọn lọc [18][46]

Một trong những yếu tố quyết định đến sự thành bại cũng như có thu được dòng

tế bào chuyển gen hay không, đó là các gen chọn lọc được sử dụng Nhờ các gen này nên có thể loại bỏ được các tế bào không được chuyển gen

Có rất nhiều gen chọn lọc được sử dụng, nhưng thường sử dụng nhất là gen hpt (mã hóa cho enzym hygromycin phosphotransferase), gen pat hay bar (mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyltransferase) và gen nptII (mã hóa cho enzym

neomycin phosphotransferase) Các gen này được kiểm soát bởi các promoter 35S

(từ cauliflower mosaic virus), promter ubiquitin (từ bắp) Đối với loài Asparagus

và cây chuối, gen nptII được kiểm soát bởi promoter nopaline synthase và được

chọn lọc bởi kháng sinh kanamycin (May và cộng sự, 1995; Limanton-Grevet và Jullien, 2001) Ngoài ra, để cải thiện các gen chọn lọc, Wang và cộng sự (2005) đã

chèn một đoạn intron vào vùng mã hóa gen hpt để cảm ứng sự biểu hiện của gen

chuyển ở cây Một lá mầm (Simpson và Filipowics, 1996) Việc chèn đoạn intron

vào vùng mã hóa gen hpt không chỉ cải thiện hiệu suất chuyển nạp mà còn giảm

thiểu số lượng bản sao của gen chọn lọc, thậm chí giúp kiểm soát được sự tăng sinh

của vi khuẩn Agrobacterium trong suốt quá trình chuyển gen (Wang và cộng sự,

1997)

1.10 Ứng dụng plasmid Ti trong công nghệ chuyển gen ở thực vật

Khi nghiên cứu quá trình vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ gen DNA thực vật, thấy có 3 sự kiện xảy ra có thể áp dụng vào công nghệ chuyển gen ở thực vật:

 Thứ nhất là sự hình thành khối u là do T-DNA từ plasmid Ti gắn chèn vào bộ gen thực vật và được biểu hiện

 Thứ hai là các gen trên vùng T-DNA chỉ được phiên mã và không có vai trò gì trong quá trình vận chuyển T-DNA

 Thứ ba là bất kỳ đoạn DNA nào nằm giữa 2 bờ (trái và phải) của T-DNA cũng đều được chuyển vào tế bào thực vật

Dựa vào hiện tượng này, các nhà khoa học đã phát triển các plasmid nhân tạo

và các chủng vi khuẩn nhân tạo để biến chúng trở thành công cụ chuyển gen trên thực vật dù là cây Một lá mầm Do kích thức plasmid Ti nguyên thủy rất lớn (200kb) nên rất cồng kềnh trong vận chuyển, vả lại không có vùng MCS

(multicoloning site), không tự sao chép trong E.coli và gây khối u cho cây nên

người ta đã cải tiến plasmid bằng cách loại bỏ các gen không cần thiết, chèn thêm các gen chọn lọc, gen chỉ thị, gen mục tiêu và các promoter mạnh thích hợp Đặc biệt là thu gọn được kích thước plasmid và thêm vào các vị trí của các enzym cắt giới hạn Có hai loại vector plasmid nhân tạo (hình 1.18) thường được chuyển vào

trong A tumefaciens:

 Vector đồng nhập (co-intergrated vector): gen ngoại lai được gắn vào

plasmid chung với vùng gen vir (Ruvkin và Ausubel, 1979) và nằm bất

kỳ đâu trên vùng T-DNA Tuy nhiên, loại vector này có kích thước lớn

và cồng kềnh, trở ngại trong vấn đề vận chuyển

 Vector hai nguồn (binary vector): gen ngoại lai được gắn vào một vùng DNA trên một khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) riêng, không

nằm trong vùng gen vir Do đó, khắc phục được sự cồng kềnh của vector

đồng nhập Vì vậy, loại vector này được sử dụng rất phổ biến [37]

Hình 1.18 Hệ thống các vector nhân tạo Hình A là vector đồng nhập,

hình B là vector hai nguồn

1.11 So sánh phương pháp bắn gen với phương pháp chuyển gen bằng vi

khuẩn A tumefaciens

- Hiệu suất chuyển gen cao

- Gen mục tiêu ít bị đào thải, tồn tại

trong bộ gen thực vật khá bền vững

- Số bản sao DNA gắn vào bộ gen thực

vật thường thấp, giảm sự bất ổn của gen

chuyển

- Thời gian ngắn hơn

- Giá thành thấp

- Ít hình thành cây thể khảm

- Có thể gây khối u ở Khỏa tử và cây

Hai lá mầm nhưng khó gây khối u cho

cây Một lá mầm

- Chỉ đưa gen mục tiêu vào nhân

- Hiệu suất chuyển gen còn rất thấp

- Gen mục tiêu có thể bị đào thải

- Số bản sao DNA gắn vào bộ gen thực vật thường rất cao

- Thời gian lâu hơn

Terminator là trình tự kết thúc, giúp gen được chuyển kết thúc đúng vị trí và không tạo ra các protein khảm với các protein từ thực vật Một trong số những

trình tự terminator được sử dụng phổ biến là terminator nos (từ gen tổng hợp nopaline của plasmid Ti trong vi khuẩn A tumefaciens) [2]

1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) [2][18][46]

Tất cả các vector chuyển gen phải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp sàng lọc được dòng chuyển gen thành công Các gen này thường mã hóa cho một enzym có khả năng khử độc tính của chất chọn lọc trong quá trình chuyển hóa Các gen này còn được dùng để phân tích trong bộ gen cây chuyển gen có tồn tại gen này hay không và chúng ở đâu trong bộ gen đó

Điều kiện chọn một gen chọn lọc để gắn vào plasmid:

 Sự biểu hiện của gen chọn lọc không làm gián đoạn quá trình chuyển hóa của vật chủ

 Sự biểu hiện của gen chọn lọc có thể ức chế được tác nhân chọn lọc, giúp cây chuyển gen sống và phân biệt được với cây không chuyển gen

 Tế bào mang gen chuyển ảnh hưởng ít nhất đến sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ

Những gen chọn lọc thường được sử dụng là các gen mã hóa cho enzym

hygromycin phosphotransferase (hpt), phosphinothricin acetyltransferase (pat hay

bar) hay neomycin phosphotransferase (nptII) Ngoài ra, gần đây gen pmi mã hóa

cho enzym phosphomannose isomerase cũng được sử dụng nhờ phản ứng huỳnh quang trong môi trường có tác nhân chọn lọc là đường mannose [50] Tác nhân này không phải là chất kháng sinh, cũng không phải là thuốc diệt cỏ nên trong tương lai

sẽ có tiềm năng rất lớn Còn gen bar là gen được phân lập từ Streptomyces

hygroscopius, mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyltransferase (PAT)

Enzym này có thể bất hoạt PPT bằng cách acetyl hóa nhóm amin của PPT Chất này ức chế mạnh mẽ enzym Glutamin Synthase (De Block, 1987) hoặc enzym EPSP Synthase (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) Đây là những enzym liên quan đến con đường tổng hợp amino acid (glutamin, tryptophan, tyrosine ) cần thiết cho sự phát triển của tế bào thực vật Nếu các enzym này bị bất hoạt, tế bào thực vật sẽ tích lũy lượng amonia (NH4+) ngày càng cao, gây độc

cho tế bào và mô cây sẽ chết dần Thực vật mang gen bar sẽ có khả năng kháng

được PPT