Phân loại, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các chất có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ tại việt nam

Các nghiên cứu cho thấy rằng vân chi đỏ được tìm thấy ở rất nhiều vùng trên thế giới và có một số chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, saponin, carotenoid, hay alkaloid… Ở Việt

NGUYỄN THỊ THU TRANG

PHÂN LOẠI, NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT SƠ BỘ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI VÂN CHI ĐỎ TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN ĐỨC HOÀNG

Tp Hồ Chí Minh, Năm 2012

MỞ ĐẦU

Trametes là nấm có khả năng hóa sube, tai nấm khi khô trở nên cứng giòn

Trên thế giới có khoảng 50 loài thuộc chi Trametes, trong số đó có một số loài là nấm phá gỗ, nhưng cũng có một số khác thuộc chi Trametes là nấm dược liệu Hiện nay, đã ghi nhận có khoảng 820 chủng Trametes khắp trái đất [102]

Vân chi đỏ (Trametes sanguinea) là một loài nấm có nhiều ứng dụng tiềm

năng về dược liệu cũng như xử lý môi trường Các nghiên cứu cho thấy rằng vân chi đỏ được tìm thấy ở rất nhiều vùng trên thế giới và có một số chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, saponin, carotenoid, hay alkaloid…

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cũng phát hiện nhiều loài vân chi trong tự nhiên, trong đó có vân chi đỏ Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân loại cũng như khảo sát các chất có hoạt tính sinh học của nấm có nguồn gốc từ Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Đề tài nhằm định danh, nuôi trồng và khảo sát sơ bộ các hợp chất

có hoạt tính sinh học của loài vân chi đỏ được phát hiện tại Việt Nam

Kết quả phân loại dựa trên hình thái và rDNA đã xác định nấm vân chi đỏ

được phân lập là Trametes sanguinea, sẽ là cơ sở cho việc phân loại chi Trametes

nói riêng và các loài nấm lớn khác tại Việt Nam nói chung trong các nghiên cứu tiếp theo Ngoài ra, kết quả khảo sát các hoạt chất sinh học sẽ rất có giá trị trong các nghiên cứu hướng đến việc khai thác các chất có lợi của nấm vân chi đỏ

i

Trang Trang phụ bìa

Mục lục i

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vẽ, đồ thị viii

MỞ ĐẦU Chương 1-TỔNG QUAN 1.1 Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học 1

1.2 Phương pháp phân loại nấm 4

1.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý 4

1.2.1.1 Giới thiệu chung về giới nấm 4

1.2.1.2 Ngành Basidiomycota (nấm đảm) 4

1.2.2 Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử 7

1.2.2.1 DNA ribosome 7

1.2.2.2 DNA mã hóa cho enzyme ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6) .9

1.2.2.3 DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1) 10

1.2.2.4 Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2) 10

1.2.2.5 Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub) 11

1.2.2.6 Gen mã hóa cho enzyme cytochrome oxidase (cox) 11

1.3 Khái quát về nấm được nuôi trồng 12

1.3.1 Đặc điểm sinh lý nấm trồng 13

1.3.1.1 Nhu cầu dinh dưỡng của hệ sợi nấm 13

1.3.1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 14

1.3.2 Phương pháp nuôi trồng 15

1.3.2.1 Nguyên liệu trồng nấm 15

1.4 Nấm dược liệu và dược tính 18

1.5 Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 21

1.5.1 Polysaccharides 21

1.5.1.1 β- D- glucan 21

1.5.1.2 Các dị polysaccharide (Heteropolysaccharides) 21

1.5.2 Saponin 22

1.5.3 Steroid 23

1.5.4 Carotenoid 25

1.5.5 Alkaloid 26

Chương 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Môi trường sử dụng 28

2.1.2.1 Môi trường dinh dưỡng 28

2.1.2.2 Môi trường nuôi trồng 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phân lập nấm vân chi đỏ 29

2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 29

2.2.1.2 Phương pháp phân lập 29

2.2.2 Phân loại nấm bằng hình thái và di truyền 29

2.2.2.1 Phân loại nấm bằng hình thái 29

2.2.2.2 Phân loại dựa trên DNA Ribosome 29

2.2.3 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý của hai loài nấm vân chi 31

2.2.3.1 Khảo sát tốc độ lan tơ 31

2.2.3.2 Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 32

2.2.4 Trồng để thu nhận nấm 32

2.2.4.1 Chuẩn bị meo giống cấp 2 32

2.2.4.2 Chuẩn bị meo cọng 32

iii

2.2.5 Khảo sát các hoạt chất sinh học 33

2.2.5.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 34

2.2.5.2 Phương pháp định lượng β-1,3-glucan 38

2.2.5.3 Phương pháp định tính và định lượng saponin 39

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 42

Chương 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập mẫu nấm vân chi đỏ 44

3.1.1 Hình thái mẫu nấm vân chi đỏ ngoài tự nhiên 44

3.1.2 Phân lập nấm vân chi đỏ 45

3.2 Phân loại nấm vân chi đỏ và đen 45

3.2.1 Phân loại nấm bằng hình thái 45

3.2.2 Phân loại bằng sinh học phân tử 52

3.2.2.1 Kết quả PCR 52

3.2.2.2 Kết quả giải trình tự 54

3.2.2.3 Xây dựng cây phân loại 54

3.3 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý hai loài nấm 56

3.3.1 Khảo sát tốc độ lan tơ 56

3.3.2 Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc 58

3.4 Nuôi trồng hai loài nấm 59

3.4.1 Nuôi trồng nấm vân chi đỏ 59

3.4.1.1 Chuẩn bị giống 59

3.4.1.2 Quy trình nuôi trồng 60

3.4.2 Nuôi trồng nấm vân chi đen 62

3.4.2.1 Chuẩn bị giống 62

3.4.2.2 Quy trình nuôi trồng 63

3.5 Khảo sát các hoạt chất sinh học 64

3.5.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 64

3.5.3.1 Định tính saponin 70 3.5.3.2 Định lượng saponin 73 Chương 4 -KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến nghị 74

PHỤ LỤC

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí của giới nấm trong hệ thống phân loại học

Phân loại học đã có từ lâu đời, phát triển theo sự phát triển của lịch sử loài người, nó ra đời khi con người phân biệt được các loại thực vật gây độc và có thể sử dụng làm thực phẩm và dược liệu, cũng như sự ghi nhớ và phân loại các loài vật nuôi Sự phát triển của phân loại học của nấm đi sau thực vật và động vật Trong các hệ thống phân loại cũ từ 2 giới (kingdom) của Carl Linnaeus đến 4 giới của Herbert F Copeland năm 1938, nấm được coi là thuộc trong giới thực vật (Plantae), mặc dù các đặc điểm mô tả về hình thái nấm đã được biết đến trước đó rất nhiều thế

kỉ Khi hệ thống phân loại 5 giới của Robert Whittaker ra đời năm 1969 thì sự khác biệt giữa nấm và các sinh vật khác đặc biệt là thực vật sau một thời gian mới được nhận biết và phân loại một cách có hệ thống Ông phân loại sinh vật đa bào dựa vào khả năng dinh dưỡng: giới Animalia là sinh vật dị dưỡng, không có khả năng tự tạo

ra dinh dưỡng cho cơ thể mà phải lấy từ các nguồn khác, giới Plantae là sinh vật tự dưỡng, thực vật sử dụng ánh sáng mặt trời tạo nguồn dinh dưỡng cho chính chúng

và nguồn thức ăn cho các loài dị dưỡng khác, còn giới Fungi là dị dưỡng, nấm tiết các enzym ra ngoài môi trường, tiêu thụ các chất hữu cơ thông qua sợi nấm gọi là

hệ sợi, chúng không thể thiếu được trong chu trình biến đổi vật chất Về căn bản Robert Whittaker vẫn chia giới Monera thuộc nhóm sinh vật nhân sơ và giới Protista là sinh vật nhân thực, chúng đều là sinh vật sống đơn bào

Vào giữa những năm 70 của thế kỉ XX, sự phát triển của sinh học phân tử đã giúp cho sự phân loại sinh vật sống đi vào bản chất của gen hơn là quan tâm tới hình thái và hành vi của thế giới sống bằng việc so sánh các vùng gen tương đồng

và bảo tồn cao (ban đầu là rDNA) Lúc này đã chia ra nhiều nhóm loài có những đặc điểm chung về gen bảo tồn Hơn nữa, liên tiếp các khám phá về sự sống đã đưa luận điểm chung: tất cả các sinh vật đều có một tổ tiên chung Sự bao quát về sự sống không còn chỉ ở mức giới mà còn tổ chức sự sống ở mức cao hơn, bao quát hơn Dựa trên các nghiên cứu về RNA, Carl Woese đã tìm ra sự khác biệt trong giới Monera, đó là vi khuẩn và vi khuẩn cổ Một cách khái quát, đến thập niên 1990, Carl Woese cho rằng, sự sống được chia làm 3 lãnh giới (domain): lãnh giới

Bacteria gồm giới Bacteria, lãnh giới Archaea gồm giới Archaea, lãnh giới Eukarya gồm giới Protista, Fungi, Plantae và Animalia Theo như hệ thống phân loài này thì giới Fungi có mối quan hệ gần gũi với giới Animalia (Hình 1.1) [21]

Phân loại học đầu thế kỉ XXI dựa trên phân loại 3 lãnh giới của Woese, nhưng đi sâu vào phân loại lãnh giới Eukarya Đó là kết quả một quá trình phát triển của công nghệ sinh học và sinh tin, phôi thai học, hóa thạch học và lịch sử học, ngày càng nhiều các loài sinh vật thuộc lãnh giới nhân thực được giải trình tự và phân loại Do vậy, hội nghị phân loại học quốc tế năm 2005 đã đưa ra cách phân loại mới của lãnh giới Eukarya (Eukaryota) Theo đó, lãnh giới Eukarya được chia làm 6 siêu giới và tiếp tục khẳng định quan điểm của Woese là giới nấm có mối quan hệ gần với giới Metazoa (Animalia) hơn là giới Plantae Do vậy, giới Fungi nằm trong siêu giới Opisthokonts (Opisthokonta) cùng với giới Metazoa (Hình 1.2) [21]

Hình 1.1 Hệ thống phân loại 6 giới và 3 lãnh giới [72].

Sau năm 2005, các nghiên cứu về phân loại học càng đi sâu đặc điểm của lãnh giới Eukarya, đặc biệt các bằng chứng về rDNA trên nguyên sinh động vật đã thay đổi quan điểm về 6 siêu nhóm Lãnh giới Eukarya được chia làm hai siêu nhóm

 Unikonts-Unikonta (một roi): gồm siêu giới Amoebozoa và Opisthokonts [22, 30, 31, 32]

 Bikonts-Unikonta (hai roi): gồm siêu giới Excavata, Rhizaria, Chromalveolata, Archaeplastida Trong đó, ngành Heterkontophyta (Stramenopiles)

và Alveolata thuộc siêu giới Chromalveolata và siêu giới Rhizaria có quan hệ gần gũi với nhau, được gọi là siêu giới SAR, giới Plantae nằm trong siêu giới Archaeplastida [13]

Hình 1.2 Hệ thống phân loại 6 siêu giới của lãnh giới Eukarya [19]

1.2 Phương pháp phân loại nấm

1.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý

1.2.1.1 Giới thiệu chung về giới nấm

Nấm được phân loại từ rất lâu và đến hết thế kỉ XIX các nhà phân loại học vẫn còn cho rằng nấm thuộc giới Plantae Chỉ khi các nghiên cứu sau này về đời sống, cách thức sinh sản, đặc điểm biến dưỡng mới tách nấm ra một giới riêng biệt Cho tới ngày nay việc phân loại nấm vẫn chủ yếu dựa vào mô tả hình thái, nghiên cứu trên đặc điểm sinh lý để đưa ra phân loại nấm nói chung

Theo công ước phân loại mới vào năm 2007, giới nấm được chia làm 5 ngành: Chytridiomycota (nấm roi), Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota) và 1 giới phụ Dikarya (nấm bậc cao) bao gồm có hai ngành Ascomycota (nấm nang khuẩn) và Basidiomycota (nấm đảm) [28]

Trong đó nấm vân chi đỏ thuộc ngành nấm đảm và sẽ được trình bày rõ hơn trong phần tiếp theo

1.2.1.2 Ngành Basidiomycota (nấm đảm)

Hình 1.3 Hệ thống phân loại 2 siêu nhóm của lãnh giới Eukarya [13].

Nấm đảm là những nấm dạng sợi, trong chu trình sống cơ quan sinh sản được tạo thành từ những sợi nấm thứ cấp mà có thể nhìn thấy được bằng mắt thường gọi là quả thể (basidiocarp), mang đảm (basidia), thông thường mỗi đảm mang 4 đảm bảo tử (basidiospore) (Hình 1.4) Ngoài ra có một số loài nấm thuộc ngành này sinh sản vô tính Đặc điểm nổi bật của ngành Basidiomycota là có hệ sợi thứ cấp có hình thành các mấu liên kết (clamp connections)

 Các loại hệ sợi tơ nấm ở ngành Basidiomycota

 Hệ sợi cấp 1 hay hệ sợi sơ cấp (primary mycelium)

Hệ sợi sơ cấp phát triển từ sự nảy mầm của một đảm bào tử, gồm những tế bào đơn nhân gọi là đồng nhân Tuy nhiên, sau đó phát triển thành những tế bào đa

Hình 1.4 Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota [46]

nhân có vách ngăn ngang thành những tế bào đơn nhân Đảm không bao giờ phát triển trên hệ sợi cấp 1

 Hệ sợi cấp 2

Hệ sợi cấp 2 gồm những tế bào nhân kép và phát triển bởi sự hợp nhân của 2

tế bào đơn nhân Trong những loài dị tản, tế bào hợp nhân khi hệ sợi của những loài khác nhau nhưng ở trường hợp đồng tản (homothallic) thì sự hợp nhân xảy ra giữa hai hệ tơ nấm cấp 1 Quá trình phối hợp của hệ sợi sơ cấp để trở thành hệ sợi cấp 2 hay nhân kép gọi là nhân kép hóa (dikaryotization) hay nhị bội hóa (diploidization) Bắt đầu từ hệ sợi cấp 2, tơ nấm được gọi là tơ nấm thứ cấp (secondary mycelium)

Sự tạo mấu liên kết hình thành suốt trong sự phân chia của hệ sợi cấp 2, quá trình tạo mấu liên kết bắt đầu khi giữa hai nhân của tế bào song nhân xuất hiện một đoạn dài, một nhân di chuyển hình thành một mấu, đồng thời hai nhân phân chia Hai nhân mới di chuyển về phía trước, hình thành vách ngăn giữa các nhân, tạo thành tế bào song nhân mới (Hình 1.5)

 Hệ sợi cấp 3

Hệ sợi cấp 2 tạo thành cơ quan sinh sản hữu tính là quả thể mang các đảm, đảm được gọi là hệ sợi cấp 3 ở nấm đảm Ngoài ra, một số loài trong ngành nấm đảm tạo các tế bào Cystidia nằm gần với các đảm, hình dạng của Cystidia rất đa

Hình 1.5 Quá trình hình thành mấu liên kết ở ngành Basidiomycota [75]

dạng và đặc trưng cho từng chi [52] Ngành Basidiomycota có 3 ngành phụ, 16 lớp,

52 bộ, 177 họ, 1589 giống và 31525 loài [71]

 Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota

- Đảm bào tử (đơn bội-n) phát tán ra môi trường nếu gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm thành dạng sợi, là các tế bào đồng nhân và đơn nhân, đây hệ sợi sơ cấp

- Hệ sợi sơ cấp dung hợp thành các tế bào song nhân (n+n), trong mỗi tế bào tồn tại hai nhân riêng biệt Các tế bào song nhân tăng trưởng bằng cách hình thành

các mấu liên kết

- Khi gặp điều kiện thích hợp, hệ sợi cấp 2 sẽ phát triển thành cơ quan sinh sản

là quả thể Trong quả thể có một lớp thụ tầng, tế bào ngọn của lớp thụ tầng hình thành một mấu tạo thành một tế bào chuyên hóa lưỡng bội (2n) hay đảm, tế bào này

giảm phân tạo 4 đảm bào tử ngoại trừ chi Dacrymyces, Calocera, nấm mỡ

(Agaricus bisporus) đảm chỉ tạo 2 đảm bào tử

1.2.2 Phân loại học giới nấm dựa vào sinh học phân tử

Sinh học phân tử có ứng dụng lớn trong phân loại học giới nấm, dựa vào các vùng gen bảo tồn trên DNA bộ gen mà các nhà phân loại có thể tìm ra và phân loại nấm một cách nhanh chóng, chính xác

1.2.2.1 DNA ribosome

Nấm là một sinh vật nhân thực (Eukaryote) do vậy cấu trúc ribosome cũng giống như những loài Eukaryote khác Ribosome có hệ số lắng là 80S gồm có hai tiểu phần:

 Tiểu phần lớn (large subunit)

Tiểu phần lớn có hệ số lắng là 60S bao gồm đoạn 5S RNA, 28S RNA, 5.8 RNA và khoảng 49 protein

 Tiểu phần nhỏ (small subunit)

Tiểu phần nhỏ có hệ số lắng là 40S được cấu trúc từ 18S RNA và 33 protein DNA mã hóa cho hai tiểu phần của ribosome ở nấm đã được nghiên cứu từ lâu và trên vùng gen mã hóa này có nhiều vùng bảo tồn có ý nghĩa trong phân loại

Trong vùng gen liên kết từ vùng 18S, 5.8S và 28S có hai vùng trình tự không mã hóa: ITS1 và ITS2

 ITS1 và ITS2

Là hai vùng trình tự không mã hóa, chúng không có chức năng gì trong cấu trúc của ribosome, do đó chúng sẽ được cắt đi khi tạo thành ribosome trưởng thành (Hình 1.6) Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy rằng hai vùng ITS bảo tồn cao và biến thể của hai vùng này cũng khác biệt ở cấp độ loài cũng như dưới loài [25] Hiện nay, vùng DNA mã hóa cho ITS1, ITS2 và 5.8S ribosome được sử dụng cho

hệ thống phân loại phân tử của giới phụ Dikarya là chủ yếu [28]

 DNA tiểu phần lớn ribosome (LSU) và tiểu phần nhỏ ribosome (SSU)

Vùng này mã hóa cho vùng 28S của ribosome, tiểu phần D1/D2 của LSU và toàn bộ DNA mã hóa cho SSU Hầu hết các loài trong giới nấm đều phân loại dựa vào gen mã hóa cho LSU và SSU [28]

 DNA mã hóa cho tiểu phần nhỏ ribosome ti thể

Hình 1.6.Cấu trúc rDNA ở Eukaryote[60]

Ti thể có chức năng chính là chuyển hóa vật chất hữu cơ thành năng lượng dưới dạng ATP ở hầu hết các tế bào sinh vật nhân thực và có cấu trúc khác biệt Theo như thuyết cộng sinh, thì “ti thể” bắt nguồn từ một loài vi khuẩn có khả năng tạo ra ATP, do đó ti thể có DNA và ribosome của riêng nó Ribosome có hệ số lắng

là 70S giống như ở các loài prokaryote khác Hiện nay, vùng DNA mã hóa cho tiểu phần nhỏ của ribosome ti thể là được sử dụng trong phân loại các loài nấm trong lớp Eurotiomycetes, Lecanoromycetes, Lichinomycetes, Agaricomycetes và lớp phụ Pleosporomycetidae [28]

1.2.2.2 DNA mã hóa cho enzym ATPase của ti thể tiểu phần số 6 (atp6)

ATPase của ti thể là một enzym có khả năng tổng hợp ATP từ ADP và một phân tử phosphate và giải phóng năng lượng Enzym này nằm trong màng trong của

ti thể và có cấu trúc gồm [4]:

- Phần F1: hình cầu, thích nước, nhô ra ngoài matrix (ti thể) là phần xúc tác của enzym

- Phần F0: hình trụ, thích lipid, xen trong màng, là kênh proton

Hình 1.7 Cấu trúc ATPase của nấm men Saccharomyces cerevisiae [7]

Nguyễn Thị Thu Trang 10

rằng Atp6 liên kết với tiểu phần Apt4 tạo lên cánh tay quay của tiểu phần F0 Sự kết

hợp giữa các phần của ATPase và Atp6 cần thiết có sự hiện diện của Atp10 (Hình

1.7) [7]

atp6 thường được dùng để phân loại nấm trong lớp Ustilaginomycetes,

Exobasidiomycetes và Agaricomycetes [28]

1.2.2.3 DNA mã hóa cho nhân tố kéo dài dịch mã alpha 1 (tef1)

Tef1 nằm trong phức hợp efF-1, phức hợp có nhiệm vụ gắn acid amin mở đầu lên ribosome tiểu phần 40S, sau đó các nhân tố kéo dài dịch mã khác gắn với

RNA tới vị trí của Tef1 để bắt đầu quá dịch mã ở Eukaryote tef1 được bảo tồn cao

trong các loài sinh vật, do vậy nó đã được đề nghị sử dụng trong xây dựng cây phát sinh loài cũng như xác định loài mới [14]

1.2.2.4 Gen mã hóa cho protein RPB1 và RPB2 (rpb1, rpb2)

RNA polymerase II là enzym xúc tác quá trình sao mã RNA từ DNA ở Eukaryote, enzym có khoảng 12 tiểu phần do 12 gen mã hóa ở người và nấm (Hình 1.9) Trong đó, tiểu phần 1 và 2 là lớn nhất, tiểu phần 1 chứa vùng carbon đầu cuối

là 52 vùng lập lại heptapeptide có chức năng quan trọng trong sự hoạt động của enzym RNA polymerase, ngoài ra chính vùng lập lại có ý nghĩa quan trọng trong

tiến hóa cũng như phân loại các loài nấm nói riêng

Tiểu phần 2 có chức năng liên kết với các tiểu phần khác tạo nên cấu trúc liên kết giữa DNA và RNA mới được tổng hợp

rpb1 và rpb2 có thể được dùng để phân loại hầu hết tất cả các loài trong giới

nấm [26]

1.2.2.5 Gen mã hóa α-tubulin và β-tubulin (α-tub, β-tub)

Tubulin là protein cấu trúc lên vi ống ở tế bào sinh vật nhân thực, vi ống là một trong ba cấu trúc tạo nên bộ xương của tế bào, có chức năng quan trọng trong vận chuyển bên trong tế bào, vận động của lông roi, thoi vô sắc và lớp bảo vệ ở màng tế bào thực vật Vi ống là chuỗi polypeptide hình trụ rỗng, được tổ hợp từ α

và β tubulin

Hai gen trên được sử dụng để phân loại ngành Chytridiomycota,

Microspodia và bộ Mucorales Riêng β-tub ở ngành phụ Taphrinomycotina, lớp phụ

Sodariomycetidae, lớp Ustilaginomycetes, Exobasidiomycetes [26]

1.2.2.6 Gen mã hóa cho enzym cytochrome oxidase (cox)

Hình 1.8 Cấu trúc RNA polymerase II của Schizosaccharomyces pombe và

S cerevisiae [86]

Nguyễn Thị Thu Trang 12

Enzym cytochome oxidase nằm trong màng trong của ti thể, có chức năng quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử tổng hợp ATP Enzym có từ 3 đến 4 tiểu phần, trong đó các tiểu phần 1, 2, 3 là được nghiên cứu nhiều trên khía cạnh phân loại học của nấm [68]

Gen cox được dùng chủ yếu trong phân loài ngành Neocallimastigomycota

1.3 Khái quát về nấm được nuôi trồng

Hầu hết nấm ăn trên thế giới đều thuộc giới phụ Dikarya, đặc biệt là các loài nấm trồng nằm trong ngành Basidiomycota Hiện nay có khoảng 1,5 triệu loài nấm nói chung, nhưng số lượng loài được trồng làm thực phẩm và dược liệu chỉ chiếm một phần nhỏ Loài người đã biết tới nấm từ rất lâu, sự hiện diện của nấm đã có từ những nền văn hóa từ Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á Trong một số tín ngưỡng cổ, nấm được coi như là những món quà của Thần Chết bởi chúng mang những độc

chất do đó mang tới sự chết chóc Nấm ma thuật (Plilocybe) được thu hoạch từ tự

nhiên và ngày nay được trồng ở một vài nước trên thế giới, nấm gây hiện tượng ảo giác vì độc tính của nó, việc trồng nấm này được coi là phạm pháp bởi vì chiết xuất

từ nấm này là tiền chất để tổng hợp ma túy Mặc dù các thổ dân Châu Mỹ sử dụng nấm ma thuật trong rất nhiều hoạt động nghi lễ và săn bắn từ lâu Ngoài biểu tượng của Thần Chết, nấm còn được coi là món quà của Chúa Trời Người Trung Quốc và Nhật Bản thu hoạch nấm linh chi và đông cô từ trước công nguyên, người Châu Âu

thu hoạch nấm từ trong rừng, đặc biệt là nấm Cesár (Amanita caesarea) Ngay từ xa

xưa, việc thu hoạch nấm chủ yếu từ tự nhiên, do vị khác biệt so với các loài thực phẩm khác và điều kiện để thu hoạch mà nấm được coi là một thực phẩm quý hiếm, các loài nấm ăn và dược liệu chỉ để vua chúa và tầng lớp quý tộc sử dụng [73] Người Trung Quốc được coi là dân tộc đầu tiên trồng được nấm đông cô Tuy nhiên, sự phát triển của trồng nấm nhân tạo chỉ từ khi kĩ thuật vô trùng ra đời, nuôi trồng nấm quy mô đầu tiên tại Châu Âu với kĩ thuật nuôi trồng loài nấm mỡ

(A bisporus) vào năm 1707 [73] Đến ngày nay, nấm đã được trồng tại hơn 60 nước

trên thế giới, 5 nước đứng đầu về tổng sản lượng là Trung Quốc, Mỹ, Hà Lan, Pháp

 Nguồn Nitơ (đạm)

Là thành phần dinh dưỡng quan trọng của nấm, tham gia vào tổng hợp acid nucleic-vật liệu di truyền, protein, các enzym và vách chitin của tế bào nấm Nguồn nitơ cung cấp cho nấm có thể ở dạng vô cơ muối nitrat (NO3), muối amon (NH4), hoặc dạng hữu cơ như cám gạo, cám bắp, bột đậu nành, peptone…

 Nguồn khoáng

Các khoáng chất như phospho (P), kali (K), sulfur (S), magie (Mg) tham gia vào cấu trúc vật liệu di truyền, protein và là đồng cấu trúc cho nhiều loại enzym khác, tạo khuynh độ điện hóa và sự thẩm thấu nước vào tế bào Các nguyên tố vi lượng như sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn)… chỉ cần một lượng nhỏ nhưng lại cần thiết trong việc hoạt hóa các enzym, tổng hợp vitamin, quá trình hấp thu và trao đổi chất, kể cả việc hình thành quả thể một cách bình thường

 Vitamin

Là những phân tử hữu cơ được dùng với số lượng rất ít chúng không phải là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào mà giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động

Nguyễn Thị Thu Trang 14

của enzym Hai vitamin tối cần thiết cho nấm là Biotin (vitamin H) và Thiamin (vitamin B1)

1.3.1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Sự phát triển của nấm cơ bản là hệ sợi nấm và quá trình hấp thu chất dinh dưỡng cũng thông qua hệ sợi này Nấm là loài nhạy cảm với các yếu tố vật lý của môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng và chế độ thông khí Mức độ tác động của từng yếu tố tới nấm là khác nhau và tùy thuộc vào từng loài nấm

 Nhiệt độ

Đây là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển của nấm Do ảnh hưởng tới

sự hoạt động của các enzym Nhiều loài nấm phát triển ở nhiệt độ 10-200C, có loài nấm khác như nấm nhiệt đới phát triển và ra quả thể ở 25-300C, cá biệt như nấm

độ tăng trưởng của hệ sợi sinh dưỡng khoảng vài độ [3]

 Độ ẩm

Tất cả các loài nấm đều lấy chất dinh dưỡng và nước thông qua thẩm thấu vào các tế bào của hệ sợi, do vậy chúng đều cần độ ẩm cao và ổn định Thông thường độ ẩm của hệ sợi (khoảng 40-60%) cũng nhỏ hơn độ ẩm của quả thể (80-95%) Do độ ẩm quá cao hệ oxi khó khuếch tán qua màng tế bào dẫn tới nấm sẽ chết, quả thể cần độ ẩm cao để không bị mất nước và phát triển bình thường Do vậy khi nuôi trồng nấm, cần quan tâm tới độ ẩm của nguyên liệu trồng nấm và độ

ẩm của không khí khi nấm ra quả thể

 pH

Hầu hết các loài nấm phát triển tại pH trung tính, pH môi trường cũng chi phối rất nhiều đến sự tăng trưởng của nấm, đặc biệt trong quá trình hình thành quả thể pH chua hoặc phèn (pH thấp) làm tơ nấm mọc chậm thưa và thường xoắn đầu, quả thể bị biến dạng pH kiềm (pH cao) tơ mọc chậm hoặc ngừng tăng trưởng, quả thể bị chai và không tiếp tục phát triển

 Chế độ thông khí

phát triển nhưng trong suốt giai đoạn phát triển quả thể, nhiều loài nấm rất nhạy

bị ức chế sự phát triển [73]

 Ánh sáng

Ánh sáng gần như chỉ có giá trị trong giai đoạn ra quả thể Ở nhiều loài nấm, ánh sáng góp phần quan trọng trong việc kích thích sự hình thành nụ nấm và giúp tai nấm phát triển bình thường

được trồng chủ yếu trên gỗ sồi (Fagus crenata), trừ nấm mỡ (A bisporus) được

trồng trên rơm rạ phủ đất bổ sung một số dưỡng chất khác Còn ở các nước nhiệt

đới, nguyên liệu trồng nấm chủ yếu trên mạt cưa cao su (Hevea brasiliensis), ngoài

ra còn có cùi bắp, rơm rạ và bã mía

1.3.2.2 Kỹ thuật trồng nấm

Nấm ngày càng phổ biến trên thế giới và trở thành một sản phẩm thương mại

có giá trị Sự thành công của việc nuôi trồng nấm nhân tạo đã phát triển một số lượng lớn nấm ăn và nấm dược liệu, là những nấm có tiềm năng sản xuất cao

Nguyễn Thị Thu Trang 16

Trước khi trồng nấm cần có giống tốt, các bước làm giống

 Phân lập nấm và giữ giống

Nấm được phân lập trên môi trường PDA hay PGA, nước chiết malt từ lúa hoặc lúa mạch, môi trường được chứa trong ống nghiệm hoặc đĩa Petri Hệ sợi từ quả thể nấm được chuyển vào trong ống nghiệm hoặc Petri chứa môi trường, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Khi tơ nấm lan đầy cấy chuyền sinh khối sang môi trường mới Đây được coi là giống cấp 1 [73]

 Chuẩn bị giống cấp 2 và meo giá môi

Tùy theo điều kiện từng địa phương và loài nấm mà người ta chọn cơ chất giống cấp 2 Do đó nguyên liệu của giống cấp 2 rất đa dạng từ lúa mạch, lúa mì hay rơm rạ Mục tiêu của việc chuẩn bị giống ở giai đoạn này là nhân cấp giống để chuẩn bị bước vào giai đoạn nuôi trồng, mặt khác giúp nấm quen với môi trường giàu các chất khó tan Một số vùng còn giai đoạn meo giá môi sau giai đoạn giống cấp 2, meo giá môi nhằm nhân cấp để tạo một số lượng giống lớn hơn và giúp nấm mọc tốt khi nuôi trồng [3]

Sau khi giống chuẩn bị xong, bước cuối cùng là nuôi trồng nấm

Những kỹ thuật trồng nấm nhân tạo hiện nay

 Trồng nấm trong nhà

Nhà trồng cho phép người trồng điều khiển các thông số về điều kiện môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… phù hợp cho từng loại nấm Những nấm nhạy cảm với các điều kiện về độ ẩm và nhiệt độ cần được nuôi trong nhà, như kim

châm (Flammulina velutipes), đuôi gà (Grifola frondosa), bào ngư vua (Pleurotus

eryngii) Trong khi đó, đa số nấm bào ngư (Pleurotus) có thể phát triển tốt trong

nhà trồng ít cần sự điều chỉnh

 Trồng nấm trên khay

Nấm mỡ được trồng phổ biến bằng kỹ thuật này Hai loài nấm mỡ thường

được nuôi trồng là A bisporus và Agaricus bitorquis Nguyên liệu sau khi ủ được

cho vào khay, cấy giống khi tơ nấm lan đầy, phủ lên bề mặt một lớp đất mùn hay đá vôi Lớp bề mặt này giúp cơ chất không bị khô và kích thích tơ nấm tạo quả thể

 Trồng nấm trong chai nhựa hoặc túi ni-lông

Phương pháp này thường dùng để trồng đa số các loài nấm như nấm linh chi

(Garnoderma lucidum), đông cô (Lentinus edodes), bào ngư tím (Pleurotus

ostreatus), đuôi gà (G frondosa), bào ngư vua (P eryngii), kim châm (F velutipes),

ngọc bích (Hypsizygus marmoreus) Những cơ chất thường sử dụng là mạt cưa, dăm

bào, rơm rạ, cùi bắp, cỏ khô, bã mía Những cơ chất này thường được bổ sung thêm cám gạo, cám lúa mạch, lúa mì, bột bắp, bột hạt bông để tăng hàm lượng đạm Ngoài ra còn có thể bổ sung thêm đường, mật rỉ đường, thạch cao, đá vôi Hỗn hợp được phối trộn và bổ sung nước sao cho đạt độ ẩm khoảng 60-70% là được Sau đó phân phối hỗn hợp vào các túi PP hoặc PE Các túi này được khử trùng từ 1-2 giờ ở

1210C, 1atm, thời gian khử trùng phụ thuộc vào trọng lượng của túi Cấy giống và ủ

tơ nhiệt độ thích hợp, sau khi ủ tơ các túi phôi được chuyển vào nhà tưới

 Trồng nấm ngoài trời trên gỗ khúc

Gỗ thường dùng là gỗ của cây gỗ mềm như sồi, liễu, cao su, so đũa… Cây nên đốn vào thời điểm chứa nhiều chất dự trữ nhất Cây đốn xuống, nếu chuẩn bị trồng thì cưa thành những khúc 0,8-1,2m Cây khi cưa khúc phải xử lý đầu gốc bị cưa, nếu không sẽ dễ bị mốc Cấy meo giống vào những lỗ được khoan trên khúc cây Đậy lỗ khoan lại và phủ lên một lớp sáp để tránh làm khô meo giống và tránh nhiễm khuẩn

Phương pháp này sử dụng phổ biến trong nuôi trồng nấm đông cô, nấm mèo, nấm tuyết, nấm đuôi gà tạo ra sản phẩm có chất lượng cao Đôi khi các khúc cây còn được chôn dưới đất, phủ lên một lớp lá mục hoặc vải ni-lông Đây là phương

pháp để trồng nấm trân châu (Pholiota nameko) và nấm linh chi (G lucidum)

Khác với kỹ thuật trên là các khúc cây được thay bằng các cơ chất như mạt cưa, dăm bào, rơm rạ, cùi bắp, bã mía… Sau khi tơ nấm lan kín cơ chất các túi phôi được đem ra ngoài trời và cho xuống đất sao cho 1/3 túi phôi nhô lên khỏi mặt đất Quả thể sẽ mọc ra từ trên miệng túi phôi Kỹ thuật này chỉ áp dụng ở các vùng có khí hậu thích hợp như độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định Ở Trung Quốc, phương pháp này để trồng nấm đông cô

Nguyễn Thị Thu Trang 18

 Trồng nấm ngoài trời

Thích hợp cho những loài nấm ra quả thể khi ở ngoài trời Cơ chất được sử dụng là rơm rạ, mạt cưa và dăm bào Cơ chất được xếp thành từng lớp tạo thành luống hay mô dưới bóng râm Cuối cùng cho meo giống vào giữa các lớp Mô nấm được tưới nước hàng ngày và được phủ bằng áo mô làm từ rơm rạ bện thành tấm Việc thiết kế mô nấm và áo mô tùy theo từng vùng Áo mô chỉ được mở ra khi cần thu đón nấm Những loài thường trồng theo phương pháp này là nấm rơm

1.4 Nấm dược liệu và dược tính

Nấm dược liệu chỉ những loài nấm có khả năng ngăn chặn, phòng chống bệnh tật và được sử dụng làm thuốc từ hàng ngàn năm nay tại Châu Á Theo kinh nghiệm tích lũy có rất nhiều loài nấm được thu hái từ tự nhiên và trồng khắp thế giới Ngày nay, các nhà khoa học đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh nấm dược liệu có những khả năng trên Một số loại nấm đang được trồng nhiều trên thế giới như: nấm vân chi, nấm linh chi và chân chim…

tế bào lớn, nghiên cứu trên các bệnh nhân cho thấy rằng sau khi sử dụng PSP trong

28 ngày, các triệu chứng gây bệnh đã giảm mạnh [58] PSP thử nghiệm lâm sàng trên 967 bệnh nhân ung thư vú ở giai đoạn IIA, IIB, IIIA và đang hóa trị Các bệnh nhân sử dụng 20 mg tamoxifen, 600 mg ftoraflur và 3 g PSK mỗi ngày trong vòng 2 năm Kết quả cho thấy rằng 914 bệnh nhân (94,5%) chỉ số sống sót trong 5 năm (OS) và sống sót không có sự quay trở lại của bệnh (RFS) trong 5 năm [66] Các nghiên cứu lâm sàng của PSK trên bệnh ung thư phổi, bạch cầu, đại trực tràng giai đoạn II và III, dạ dày cho kết quả tốt các chỉ số OS, RFS cao và các bệnh nhân sống lâu hơn so với không bổ sung PSK PSP và PSK còn được biết tới với các nghiên cứu trên nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư ruột kết, tuyến tiền liệt, tương bào (plasmacytoma), biểu mô tuyến dạ dày (adenocarcinoma), fibrosarcoma, mastocytoma trên động vật có kết quả khả quan [85] Cao chiết bằng methanol (chứa các terpenoid và polyphenol) cũng cho thấy nấm vân chi có kết quả cao trong điều trị bệnh ung thư da (dòng B16) sau 14 ngày điều trị trên chuột [62]

 Nấm linh chi

Các nghiên cứu đã chỉ ra linh chi rất tốt cho sức khỏe, nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng các thành phần trong nấm linh chi tăng cường và cải thiện trọng lượng cũng như khả năng đề kháng bệnh [15] Chiết xuất từ sợi nấm linh chi có khả năng thúc đẩy quá trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) của ti thể trong tế bào ung thư phổi của người trên chuột [92] Ngoài ra, dịch ly trích quả thể cũng có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở người nhờ vào tác dụng vào chu trình tế bào và quá trình apoptosis của dòng này [45] Cao chiết linh chi sử dụng cùng với các dược liệu khác có kết quả khả quan trong điều trị lâm sàng các bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt [49,55] Polysaccharide từ linh chi tăng khả năng đáp ứng miễn dịch và chống khối u thông qua thúc đẩy sản xuất cytokine của đại thực bào và tế bào lymphocyte T [79] Dịch ly trích từ quả thể thử nghiệm invitro có khả năng kìm hãm sự phát triển của rất nhiều loại ung thư khác nhau [50]

 Nấm đông cô

Nấm đông cô là loài nấm sử dụng làm thực phẩm phổ biến ở Châu Á Nhưng hiện nay nấm đông cô được nghiên cứu rất nhiều về khía cạnh dược tính Hợp chất

Nguyễn Thị Thu Trang 20

HACC là hỗn hợp các polysaccharide, amino acid, lipid và khoáng chất được chiết xuất từ sợi nấm đông cô HACC tăng cường khả năng miễn dịch ở người cao tuổi (lớn hơn 50 tuổi) do tế bào CD4+ và CD8+ tăng tiết IFN-γ và nhân tố hoại tử khối u

α (TNF-α), điều hòa nồng độ NO trong tế bào gan thông qua điều hòa iNOs [57, 96] Các nghiên cứu cho thấy rằng HACC còn gia tăng sự biểu hiện của tế bào NK, các cytokine như IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 [80] Thêm vào đó, HACC làm tăng

số lượng tế bào γ-δ T do đó lượng IFN loại 1 quan trọng trong ngăn cản sự xâm nhiễm của virus West Nile gây bệnh viêm não và chữa trị căn bệnh rụng lông gây ra bởi cytosine arabinoside (Ara-C) ở chuột [20, 82]

Chiết xuất từ hệ sợi ngăn cản sự xâm nhiễm của HSV-1, lentinan là một beta glucan chiết xuất từ quả thể chống lại sự phát triển của virus HIV [38, 78] Do chúng cùng có các glycoprotein ngăn cản quá trình tạo thành vỏ nuclecapsid của virus LEM làm giảm Concanavalin A gây tổn thương gan, còn tăng sự hoạt động đại thực bào trong hệ miễn dịch ở chuột [16, 43]

 Nấm chân chim (Schizophyllum commune)

Nấm chân chim có dạng hình quạt, mỏng, bìa quăn, quả thể nhỏ, màu trắng cho tới xám Schizophyllan là chiết xuất polysaccharide từ nấm chân chim, các nghiên cứu cho thấy rằng schizophyllan có khả năng chống ung thư rất tốt, đặc biệt

là ung thư cổ tử cung và dạ dày Một số công ty tại Nhật đã bán các sản phẩm thương mại trong việc hỗ trợ và phòng ngừa hai loại ung thư trên [73] Từ nấm chân chim cũng đã chiết xuất được enzym fibrinolytic protease, nặng 21,32 kDa, một enzym quan trọng giúp phân hủy các cục máu đông có fibrin trong mạch máu Mặc

dù lượng enzym thu được chỉ chiếm 0,07% nhưng hoạt tính tăng 9,29 lần [24] Ngoài các nấm trên còn rất nhiều loài nấm dược liệu khác như hầu thủ

(Hericium erinaceus), thượng hoàng (Phellinus linteus), đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis), đuôi gà (G frondosa)…

Nấm dược liệu có nhiều tiềm năng trong phòng chống ung thư vì nấm chứa một số hoạt chất có hoạt tính sinh học quan trọng như polysaccharide, triterpenoid saponin, alkaloid, carotenoid, steroid…

1.5 Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu

1.5.1 Polysaccharide

1.5.1.1 β-D-glucan

Hoạt chất sinh học quan trọng nhất từ nấm là các polysaccharide, chúng được tách chiết chủ yếu bằng phương pháp nước nóng β-D-glucan với nhiều kiểu liên kết glucoside khác nhau, được coi như là các dị glucan, ngoài ra chúng liên kết với protein tạo ra phức hợp polysaccharide-protein Không giống sự liên kết giữa protein và nucleic acid, các polysaccharide là polymer của các đơn phân saccharide kết hợp với nhau bởi các nối kết glycoside β-D-glucan là monosaccharide cơ bản tạo nên sợi polysaccharide, bằng các lặp lại các đơn vị D-glucose nối tiếp nhau bởi liên kết beta Do vậy, có các nối kết từ carbon số 1 của saccharide này và carbon số

3 của saccharide kế tiếp tạo liên kết β1→3, tương tự có các liên kết β1→4, β1→6 Thông thường polysaccharide tạo ra từ kiểu liên kết β1→3, β1→4 hoặc sự kết hợp của nhiều kiểu liên kết tạo ra sự đa dạng cho polysaccharide Một ví dụ của β-D-glucan chống ung thư tách chiết từ nuôi cấy tơ nấm vân chi đen là phức chất D-II Cấu trúc của D-II là nối kết β1→3-D-glucan, mỗi một phân tử liên kết với ba phân

tử glucose tại vị trí C6 với một liên kết β1→6 Hiện nay polysaccharide chứa glucan được tách chiết nhiều nhất từ nấm linh chi, vân chi, đông cô, đuôi gà [84]

arabinose, ribose, glucouronic acid, uronic acid tạo nhiều loại polysaccharide khác nhau [75]

1.5.2 Saponin

Saponin là hợp chất được tạo ra từ quá trình trao đổi thứ cấp ở sinh vật, tìm thấy chủ yếu ở thực vật, một số loài động vật như hải sâm, cá đao, ngoài ra các nhà khoa học còn tìm thấy ở một số loài nấm lớn Saponin là hợp chất glucoside lưỡng cực, tạo bọt khi ở trong pha nước do làm giảm sức căng bề mặt, có tính chất phá huyết, độc với côn trùng và sinh vật máu lạnh như cá [33, 37] Dựa vào cấu trúc saponin được chia làm 3 nhóm lớn: triterpenoid saponin có tính acid hay trung tính, steroid saponin thì trung tính và alkaloid saponin có tính kiềm

Hoạt tính sinh học đặc trưng của saponin đó là tạo phức với cholesterol hình thành các lỗ trên màng tế bào gây ly giải tế bào như tế bào hồng cầu [36] Mặt khác,

do tính chất lưỡng cực của saponin nên nó được sử dụng làm chất hoạt động bề mặt nhằm tăng cường sự xâm nhập của các đại phân tử qua màng tế bào Saponin còn

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của một số saponin [9].

được dùng như là một tá dược trong vaccine Saponin ở thực vật là một chất thứ cấp tạo ra để chống lại vi khuẩn và nấm, nó có vị đắng do vậy làm giảm khả năng bị ăn

từ các loài động vật ăn cỏ khác Y học cổ truyền Châu Á sử dụng saponin trong thực vật như là một chất bổ sung và tăng cường sức khỏe [27] Triterpenoid saponin

có vai trò quan trọng là chất cảm ứng quá trình tạo quả thể ở nấm Pleurotus

ostreatus [76, 99, 100], saponin cũng tìm được ở một số loài nấm như họ Ganoderma, Psathyrella atroumbonata, Omphalotus nidiformis, Termitomyces albuminosus, Oxyporus populinus… [12, 17, 37, 48, 97]

1.5.3 Steroid

Steroid là một hợp chất hữu cơ chứa sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau, cấu trúc lõi gồm có 20 carbon với hình dạng của 4 vòng: ba vòng Cyclohexane và một vòng Cylopentane Trong đó nhóm methyl thường hiện diện tại Carbon số 10 (C10) và C13, nhóm alkyl thường được nối tại C17 Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với vùng lõi Sterol là

trúc lên hầu hết các cholesterol [41]

Steroid có ở mặt hầu hết các sinh vật từ động vật, thực vật và nấm Ecdysteroid ở côn trùng là các hormon trong quá trình lột xác và giới tính ở côn trùng Đối với động vật có xương, steroid là các hormon giới tính như androgen,

Hình 1.11 Cấu trúc của ergosterol [91]

Nguyễn Thị Thu Trang 24

estrogen và progestagen Nhóm corticosteroid có chức năng điều khiển và ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất, chức năng hệ miễn dịch, duy trì thể tích máu, kiểm soát các chất điện giải bài tiết của cơ thể Nhóm steriod đồng hóa tương tác với thụ thể của androgen, làm gia tăng sự phát triển của cơ và tổng hợp xương Đặc biệt một nhóm steroid quan trọng là cholesterol, thành phần không thể thiếu của màng tế bào, giúp tế bào có tính linh động [56] Cholesterol là tiền chất để sinh tổng hợp lên acid mật, vitamin D và các hormon steroid khác ở động vật Tuy nhiên, quá nhiều cholesterol ở người cũng gây nên những căn bệnh nguy hiểm như xơ vữa động mạch, Alzheimer…[70] Phytosterol là steroid ở thực vật, cấu tạo của chúng cũng giống như cholesterol nhưng chỉ khác ở phần carbon nhánh bên và có mặt hay vắng mặt của liên kết đôi, phytosterol được chiết xuất từ các loại dầu thực vật không tan trong nước [90] Một loại khác của steroid ở thực vật đó là brassinosteroid, cấu trúc các kích thích tố thực vật, chức năng của chúng bao gồm: kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào [81], vai trò trong quá trình phân chia tế bào và tái tạo vách, kích thích sự biệt hóa các ống mạch với brassinosteriod là chất dẫn truyền [10], là chất cần thiết cho quá trình kéo dài và hình thành ống phấn [36], đẩy nhanh quá trình lão hóa ở các mô nuôi cấy, hỗ trợ bảo vệ cây trong các stress của thời tiết lạnh và hạn hán [81] Nhóm steroid hiện diện ở nấm là ergosterol, một thành phần trong màng tế bào của nấm men và nấm nói chung, cấu trúc của ergosterol cũng giống như cholesterol ở động vật Mặt khác, ergosterol còn là tiền chất của vitamin D2, chúng biến đổi thành viosterol bởi tia cực tím, sau đó là

đặc biệt là nấm lớn tiếp xúc với ánh sáng mặt trời hoặc tia UV, sẽ tạo ra một lượng lớn vitamin D2 [53, 65] Ergosterol peroxide có tác động gây độc tế bào, được chiết xuất từ rất nhiều loài nấm ăn và dược liệu [59, 93] Acid clavaric được tổng hợp từ triterpene thông qua con đường sinh tổng hợp ergosterol, đây là hợp chất chống ung thư thông qua kìm hãm enzym Ras-farnesyl transferase ở người [74] Ngoài ra, các nhà nghiên cứu tìm ra các kích thích tố có bản chất là steroid, đóng vai trò quan trọng trong sự sinh sản của nấm [6]

vừng đậu đỏ (Acyrthosiphon pisum) có khả năng tự chuyển gen sản xuất torulene để tạo màu đỏ và nhện đỏ (Tetranychus urticae) tự chuyển gen sản xuất màu đỏ, xanh

từ nấm vào cơ thể nhằm trốn tránh kẻ thù ăn thịt [18, 69, 87] Carotenoid có hai nhóm chính: xanthophyll (có sự hiện diện của nguyên tử oxigen trong cấu trúc), carotene (không có nguyên tử oxigen)

Carotenoid hấp thụ ánh sáng màu xanh, do đó nó có vai trò trong thực vật và tảo: hấp thu năng lượng ánh sáng dùng cho quá trình quang hợp, bảo vệ diệp lục khỏi các tác nhân phá hủy từ ánh sáng mặt trời Carotenoid đóng vai trò tạo lên sắc

tố của thực vật trong cơ chế phát tán và hấp dẫn các loài thụ phấn Ngoài ra, carotenoid có khả năng ngăn chặn các gốc tự do trong cơ thể, tăng cường hệ thống miễn dịch của động vật [77] Một dạng của carotenoid được biết tới nhiều đó là vitamin A, có nhiều chức năng quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở người: cần thiết cho hoạt động thị lực và phát triển xương, vai trò trong các biểu mô (bài tiết chất nhày và ức chế quá trình sừng hóa), chống oxi hóa, ức chế các nguy cơ ung thư, đặc biệt nghiên cứu trên tế bào ung thư phổi [8, 34] Một số chủng vi khuẩn tạo

Hình 1.12 Cấu trúc của một carotenoid, vitamin A [26]

Nguyễn Thị Thu Trang 26

ra carotenoid để chống lại cơ chế oxi hóa của hệ miễn dịch vật chủ như

Staphylococcus aureus [63] Nhóm carotenoid được tìm thấy ở nấm bao gồm

β-carotene, γ-β-carotene, phillipsiaxanthin, canthaxanthin, torulene, astaxanthin,

zeaxanthin, lycopen Một số vi nấm có khả năng tạo carotenoid như Chytriomyces

aureus, Phycomyces blakesleeanus, Allomyces, Blascladiella, Aleria aurantina, Scutellinia umbrarum, Phillipsia carminera, Neurospora, Peniphora, Calscypha fulgens, Cookeina sulcipes, Xanthophyllomyces dendrorhous, Blakeslea trispora…[42] Đối với nấm bậc cao gồm Cantharellus, Ganoderma applanatum, Hypomyces odoratus, Kuehneromyces mutabilis, một số loài trong chi Trametes…[35, 98] Cơ chế tạo carotenoid ở nấm cũng giống như ở thực vật, tảo, vi

khuẩn đó là cơ chế bảo vệ khỏi các mối nguy hiểm khác, tăng sự sống sót và sinh sản cho thế hệ sau Hơn nữa, các nghiên cứu cho thấy rằng sự tổng hợp carotenoid ở nấm cần tới sự hiện diện của ánh sáng mặt trời [42]

1.5.5 Alkaloid

Là hợp chất hữu cơ tự nhiên mà sườn cấu tạo là các nguyên tử nitrogen Ngoài nitrogen còn có carbon, hidrogen, một số alkaloid còn có nguyên tử oxigen, lưu huỳnh, phospho, clo hay bromine Là một hợp chất trong con đường chuyển hóa thứ cấp, có rất nhiều loài có thể tạo ra được alkaloid từ vi khuẩn, nấm, động vật và thực vật, nhiều alkaloid có khả năng gây độc Alkaloid chiết xuất từ nấm, động vật

và thực vật được sử dụng trong một số nghi lễ tôn giáo Đối với người, alkaloid có nhiều tác dụng như là một dược chất và chất gây nghiện, là thành phần trong thuốc giảm đau, chống ung thư, chất kháng khuẩn, chống giãn mạch, thuốc chống sốt rét,

ma túy (cocaine, nicotine), chất gây ảo giác… Vị của alkaloid là đắng, tham gia vào quá trình trao đổi chất của người và động vật Cấu trúc của alkaloid rất gần với các chất có sườn cấu tạo cơ bản là nitrogen như acid amin, nucleotide [55]

Alkaloid có nhiều trong nấm lớn, được biết tới nhiều nhất trong nấm ảo giác chứa psilocin và psilocybin, một dạng ma túy nhẹ, được trồng bất hợp pháp ở Châu

Âu Tuy nhiên, có nhiều loại alkaloid trong nấm ma thuật cũng được sử dụng như là thuốc an thần, giảm đau cho người [56] Một số alkaloid được tìm thấy trong một số

loài nấm lớn như sanguinone A, sanguinone B và sanguinolentaquinone ở Mycena

sanguinolenta, iso-quinoline trên nấm Cortinarius subtortus,

4-hydroxymethyl-quinoline trong nấm vân chi đen và vân chi đỏ…[83, 94]

Hình 1.13 Cấu trúc của psilocin [29].

v

RNA Ribonucleic acid

Trang

Bảng 3.1 So sánh hậu bào tử giữa một số loài nấm nhiệt đới 51 Bảng 3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học nấm vân chi đỏ và đen 65 Bảng 3.3 Đường kính (cm) vòng tan huyết của dịch chiết nấm vân chi đỏ và đen ở

các nồng độ khác nhau 73

Biểu đồ 3.1 Tốc đô lan tơ của hai loài vân chi sau 2 và 3 ngày 58

Trang

Hình 1.1 Hệ thống phân loại 6 giới và 3 lãnh giới 2

Hình 1.2 Hệ thống phân loại 6 siêu giới của lãnh giới Eukarya 3

Hình 1.3 Hệ thống phân loại 2 siêu nhóm của lãnh giới Eukarya 4

Hình 1.4 Chu trình sống của các loài trong ngành Basidiomycota 5

Hình 1.5 Quá trình hình thành mấu liên kết ở ngành Basidiomycota 6

Hình 1.6 Cấu trúc rDNA ở Eukaryote 8

Hình 1.7 Cấu trúc ATPase của nấm men Saccharomyces cerevisiae 9

Hình 1.8 Cấu trúc RNA polymerase II của Schizosaccharomyces pombe và

Saccharomyces cerevisiae 11

Hình 1.9 Cấu trúc một phân đoạn β-D-glucan 21 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của một số saponin 22 Hình 1.11 Cấu trúc của ergosterol 23 Hình 1.12 Cấu trúc của một carotenoid, vitamin A 25

Hình 1.13 Cấu trúc của psilocin 27

Hình 3.1 Vân chi đỏ còn non: mặt trước (a), mặt sau (b) 44

Hình 3.2 Vân chi đỏ trưởng thành: mặt trước (a), mặt sau (b) 44

Hình 3.3 Tơ nấm vân chi đỏ trên môi trường PGA: sau 2 ngày (a), sau 7 ngày (b) 45

Hình 3.4 Mấu liên kết của nấm vân chi đỏ (100x) 46

Hình 3.5 Cấu trúc đảm và đảm bào tử ở nấm vân chi đỏ (100x) 46

Hình 3.6 Mấu liên kết của vân chi đen (100x) 47 Hình 3.7 Cấu trúc đảm và đảm bào tử ở nấm vân chi đen (100x) 47

Hình 3.8 Cấu trúc ống của nấm vân chi đỏ dưới kính lúp 48

Hình 3.9 Cấu trúc cắt ngang một ống của nấm vân chi đỏ (100x) 48

Hình 3.10 Cấu trúc ống của nấm vân chi đen dưới kính lúp. 48

Hình 3.11 Cấu trúc cắt ngang một ống của nấm vân chi đen (100x). 48

ix

Hình 3.14 Phẫu thức cắt dọc quả thể nấm vân chi đỏ 49

Hình 3.15 Đảm bào tử nấm vân chi đỏ (100x) 49

Hình 3.16 Mặt dưới nấm vân chi đen khi còn non. 50

Hình 3.17 Mặt dưới nấm vân chi đen khi trưởng thành 50

Hình 3.18 Phẫu thức cắt dọc quả thể nấm vân chi đen 51

Hình 3.19 Đảm bào tử nấm vân chi đen (100x) 51

Hình 3.20 Hình thái hậu bào tử (100x): Nấm vân chi đỏ-Trametes sanguinea (a); linh chi-Ganoderma lucidum (b); bào ngư nhật-Plerotus albalonus (c); nấm rơm-Volvariella

volvacea (d) 52

Hình 3.21 Vị trí các mồi trên rDNA 53 Hình 3.22 Kết quả khuếch đại rDNA bằng PCR 54 Hình 3.23 Cây phân loại thể hiện mối quan hệ họ hàng giữa nấm vân chi đỏ và các loài nấm khác Tên chủng của từng loài trong Bảng 3, phụ lục 55

Hình 3.24 Tơ nấm vân chi đỏ trên môi trường PGAY: sau 2 ngày (a), 4 ngày (b), 6 ngày (c), 8 ngày (d), 10 ngày (e), 12 ngày (f) 56

Hình 3.25 Tơ nấm vân chi đen trên môi trường PGAY: sau 2 ngày (a), 4 ngày (b), 6 ngày (c), 8 ngày (d), 10 ngày (e), 12 ngày (f). 57

Hình 3.26 Hình thái tơ nấm vân chi đỏ trong khi nuôi cấy: sau 2 ngày (a), sau 4 ngày (b), sau 5 ngày (c). 58

Hình 3.27 Hình thái tơ nấm vân chi đen: sau 5 ngày nuôi cấy (a), sau 10 ngày nuôi cấy (b) 59

Hình 3.28 Các cấp giống của vân chi đỏ: giống cấp 1 (a), giống cấp 2 (b), meo cọng (c) 60

Hình 3.29 Sự phát triển của nấm vân chi đỏ theo thời gian trên môi trường mạt cưa 61

Hình 3.30 Các cấp giống của vân chi đen: giống cấp 1 (a), giống cấp 2 (b), meo cọng (c) 62

Hình 3.31 Sự phát triển của nấm vân chi đen theo thời gian trên môi trường mạt cưa 64

Hình 3.34 Sắc kí đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ. 68

Hình 3.35 Sắc kí đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ thêm β-1,3-glucan chuẩn 68

Hình 3.36 Sắc kí đồ của dịch chiết nấm vân chi đen 68

Hình 3.37 Sắc kí đồ của dịch chiết nấm vân chi đen thêm β-1,3-glucan chuẩn 69

Hình 3.38 Khả năng tạo bọt của hai loài vân chi: lúc 0 phút (a), 30 phút (b), và 60 phút (c) 1-vân chi đỏ, 2-vân chi đen 70

Hình 3.39 Chỉ số bọt vân chi đỏ 70

Hình 3.40 Chỉ số bọt vân chi đen 70

Hình 3.41 Hồng cầu trước và sau khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đỏ (40x) 71

Hình 3.42 Hồng cầu trước và sau khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đen (40x). 71

Hình 3.43 Đĩa thạch máu khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đỏ theo những nồng độ khác nhau: sau 12 giờ (a), sau 24 giờ (b) 72

Hình 3.44 Đĩa thạch máu khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đen theo những nồng độ khác nhau: sau 12 giờ (a), sau 24 giờ (b) 72