ứng dụng kỹ thuật qfpcr vào phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể trong chẩn đoán trước sinh trên mẫu gai nhau

TRẦN NGUYỄN AN PHÚ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT QF-PCR VÀO PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH TRÊN MẪU GAI NHAU Chuyên ngành: Di Truyền Mã số : 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC

TRẦN NGUYỄN AN PHÚ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT QF-PCR VÀO PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ

TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

TRÊN MẪU GAI NHAU

Chuyên ngành: Di Truyền

Mã số : 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

2 ThS.BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2012

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị đồng nghiệp trong Khoa Xét nghiệm

Di truyền Y học Bệnh viện Từ Dũ đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giảng dạy tại khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học đại học cũng như cao học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong gia đình đã

hỗ trợ tôi về mặt tinh thần trong suốt thời gian thực hiện đề tài

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ix

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp 4

1.1.1 Hội chứng Down 4

1.1.2 Hội chứng Edwards 5

1.1.3 Hội chứng Patau 6

1.1.4 Các rối loạn nhiễm sắc thể giới tính 6

1.2 Các phương pháp tầm soát dị tật bẩm sinh trong ba tháng đầu thai kỳ 8

1.2.1 Dựa trên yếu tố tuổi mẹ 8

1.2.2 Siêu âm đo khoảng mờ gáy 9

1.2.3 Xét nghiệm double test 9

1.3 Các phương pháp lấy mẫu trong chẩn đoán trước sinh 11

1.3.1 Chọc hút dịch ối 11

1.3.3 Chọc hút máu cuống rốn 12

1.3.4 Sinh thiết mô thai và nội soi thai 13

1.3.5 Phân lập tế bào và DNA của thai trong máu mẹ 13

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán rối loạn nhiễm sắc thể 14

1.4.1 Kỹ thuật karyotype 14

1.4.2 Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang 14

1.4.3 Kỹ thuật MLPA 15

1.4.4 Kỹ thuật CGH 16

1.4.5 Kỹ thuật Array CGH 16

1.4.6 Kỹ thuật QF-PCR 17

1.5 Giới thiệu về gai nhau 19

1.5.1 Khái niệm 19

1.5.2 Sinh thiết gai nhau 20

1.5.3 Lịch sử chẩn đoán trước sinh trên mẫu gai nhau 22

1.5.4 Bất lợi của gai nhau trong chẩn đoán trước sinh 23

1.6 Thông tin về bộ kit Devyser 24

Chương 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Thiết bị 26

2.2 Phương pháp thực hiện 28

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Vật liệu sinh học 29

2.3.2 Xử lý gai nhau sau sinh thiết 29

2.3.3 Nuôi cấy tế bào gai nhau 30

2.3.4 Thu hoạch và nhuộm băng nhiễm sắc thể 31

2.3.5 Ly trích DNA từ gai nhau 33

2.3.6 Lựa chọn nồng độ DNA thích hợp 33

2.3.7 Muliplex PCR khuếch đại các STR đặc trưng cho NST 13, 18, 21 và X, Y 34 2.3.8 Kỹ thuật FISH 43

2.4 Vấn đề về Y đức 44

Chương 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 45

3.1 Đặc điểm của thai phụ và thai 45

3.1.1 Tuổi mẹ 45

3.1.2 Đặc điểm thai kỳ 45

3.2 Kết quả tối ưu hóa kỹ thuật QF-PCR 47

3.2.1 Nồng độ DNA thích hợp 47

3.2.2 Quy trình điện di mao quản 49

3.3 Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR 49

3.4 Trường hợp không kết luận từ mẫu gai nhau bằng kỹ thuật QF-PCR 54

3.5 Kết quả kỹ thuật karyotype 57

3.5.1 Kết quả nuôi cấy tế bào gai nhau 57

3.5.2 Kết quả kỹ thuật karyotype 58

3.6 Kết quả chẩn đoán lệch bội 60

3.7 Độ dị hợp tử của các locus STR 61

3.8 Mối tương quan giữa kết quả chẩn đoán và các yếu tố nguy cơ 63

3.8.1 Mối tương quan giữa tuổi mẹ và kết quả chẩn đoán 63

3.8.2 Mối tương quan giữa khoảng mờ gáy và kết quả chẩn đoán 64

3.8.3 Mối tương quan giữa nguy cơ sinh hóa và kết quả chẩn đoán 64

3.8.4 Tổng hợp mối tương quan giữa các nguy cơ chọn mẫu và kết quả chẩn đoán 67

Chương 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 69

4.1 Kết luận 69

4.2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO x

Phụ lục 1 Danh sách bệnh nhân xix

Phụ lục 2 Một số kết quả QF-PCR xxvii

Phụ lục 3 Một số kết quả Karyotype xxxi

CĐTS chẩn đoán trước sinh

CGH Comparative Genomic Hybridization

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

FBS Fetal Bovine Serum

FISH Fluorescence in situ Hybridization

GTG Giemsa trypsin G-banding

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

PAPP-A Pregnancy – Associated Plasma Protein – A

PCR Polymerase Chain Reaction

PBS Phosphate Buffered Saline

QF-PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction

rfu relative fluorescence units

STGN sinh thiết gai nhau

STR Short Tandem Repeat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Độ dị hợp tử của một số chủng tộc trên thế giới 24

Bảng 2.1 Các marker được sử dụng trong hỗn hợp phản ứng 1 36

Bảng 2.2 Các marker được sử dụng trong hỗn hợp phản ứng 2 37

Bảng 2.3 Các marker khác trong Devyser Resolution 38

Bảng 2.4 Đánh giá tỉ số giữa các alen trong cùng một marker 42

Bảng 3.1 Tuổi của thai phụ trong nghiên cứu 45

Bảng 3.2 Khoảng mờ gáy của thai trong nghiên cứu 45

Bảng 3.3 Nguy cơ trisomy 21 trong xét nghiệm double test 46

Bảng 3.4 Nguy cơ trisomy 18 trong xét nghiệm double test 46

Bảng 3.5 Nguy cơ trisomy 13 trong xét nghiệm double test 47

Bảng 3.6 Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR 50

Bảng 3.7 Kết quả kỹ thuật karyotype 58

Bảng 3.8 Tương quan kết quả giữa karyotype và QF-PCR 59

Bảng 3.9 Kết quả chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể trong nghiên cứu 60

Bảng 3.10 Tỉ lệ dị hợp tử của các marker trong nghiên cứu 61

Bảng 3.11 Mối tương quan giữa tuổi mẹ và kết quả chẩn đoán 63

Bảng 3.12 Mối tương quan giữa khoảng mờ gáy và kết quả chẩn đoán 64

Bảng 3.13 Mối tương quan giữa nguy cơ trisomy 21và kết quả chẩn đoán 65

Bảng 3.14 Mối tương quan giữa nguy cơ trisomy 18 và kết quả chẩn đoán 66

Bảng 3.15 Mối tương quan giữa nguy cơ trisomy 13 và kết quả chẩn đoán 66

Bảng 3.16 Mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ và kết quả chẩn đoán 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm [80] 12

Hình 1.2 Chọc hút máu cuống rốn dưới sự hướng dẫn của siêu âm [77] 13

Hình 1.3 Mô tả kết quả phân tích QF-PCR [24] 17

Hình 1.4 Thai ở giai đoạn ba tháng đầu tiên [79] 19

Hình 1.5 Cấu tạo sợi gai nhau [74] 20

Hình 1.6 Kỹ thuật lấy mẫu gai nhau [79] 21

Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng cho kỹ thuật QF-PCR 27

Hình 2.2 Nguyên tắc QF-PCR [72] 34

Hình 2.3 Vị trí các marker trên các NST khảo sát 39

Hình 2.4 Marker 7X [24] 40

Hình 3.1 Kết quả QF-PCR với 3 nồng độ DNA khác nhau 48

Hình 3.2 Kết quả QF-PCR XX, bình thường 51

Hình 3.3 Kết quả QF-PCR XY, bình thường 52

Hình 3.4 Kết quả QF-PCR trisomy 21 52

Hình 3.5 Kết quả QF-PCR trisomy 18 53

Hình 3.6 Kết quả QF-PCR trisomy 13 53

Hình 3.7 Kết quả QF-PCR monosomy X 54

Hình 3.8 Kết quả QF-PCR nghi ngờ khảm XO/XX 55

Hình 3.9 Kết quả FISH HC Turner khảm 55

Hình 3.10 Kết quả mẫu gai nhau nhiễm DNA mẹ (a) và xét nghiệm lại bằng dịch ối (b) 56

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR 28

Sơ đồ 2.2 Quy trình kỹ thuật QF-PCR 35

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trẻ có rối loạn nhiễm sắc thể (NST) thường bị đa dị tật, chậm phát triển tâm thần vận động, bất thường cơ quan sinh dục, vô sinh Các bất thường NST gặp ở trẻ sinh ra sống hầu hết liên quan đến NST 21, 18, 13 và các NST giới tính Lệch bội NST 21, 18,

13, X và Y chiếm đến 90% các bất thường về lệch bội và chiếm 65% trong tổng các bất thường NST Các dị tật này lại không điều trị được nên cách duy nhất là tầm soát và chẩn đoán trước sinh nhằm tư vấn cho thai phụ để có biện pháp cần thiết, kịp thời giúp giảm tỉ lệ những trẻ bệnh tật này được sinh ra

Từ năm 1966, kỹ thuật karyotype ra đời nhằm phát hiện các bất thường về cấu trúc, số lượng bộ NST và được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh Tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là thời gian trả kết quả dài, từ 14 – 21 ngày nên một số phương pháp chẩn đoán nhanh ra đời nhằm khắc phục nhược điểm này như kỹ thuật

FISH (Fluorescence in situ Hybridization), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification), QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) Trong đó thì kỹ thuật QF-PCR có ưu điểm vượt trội là có thể tự động hóa cùng lúc nhiều mẫu, tốn ít nhân công lao động, chi phí xét nghiệm thấp và thời gian trả kết quả nhanh, chỉ từ 24 – 36 giờ kể từ lúc nhận mẫu Từ năm 1993, QF-PCR đã được ứng dụng vào chẩn đoán nhanh lệch bội một số NST chọn lọc

Ở Việt Nam, quy trình sàng lọc trước sinh qua siêu âm, xét nghiệm máu và chẩn đoán các bất thường NST qua chọc hút ối vào ba tháng giữa thai kỳ đã được triển khai tại nhiều nơi nhưng chưa có trung tâm nào thực hiện quy trình chẩn đoán xác định sớm các bất thường thai ở ba tháng đầu thai kỳ Chẩn đoán sớm vào giai đoạn đầu thai kỳ không những giúp ích cho tâm lý của thai phụ và người nhà khi chờ đợi kết quả mà còn đảm bảo an toàn cho sức khỏe của người mẹ trong trường hợp phải chấm dứt thai kỳ Ngoài ra, việc triển khai sàng lọc máu mẹ và đo khoảng sáng sau gáy ở ba tháng đầu thai kỳ trong tầm soát các bất thường tại bệnh viện Từ Dũ (BVTD) để sàng lọc các

nhóm thai phụ có thai kỳ nguy cơ cao tạo tiền đề cho việc chẩn đoán xác định các bất thường vào giai đoạn sớm

Nhằm mang lại tiện ích cho thai phụ và gia đình, thu ngắn thời gian chờ đợi kết quả và cho phép chấm dứt thai kỳ ở thời điểm an toàn và kín đáo, chúng tôi thực hiện đề tài với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh các lệch bội NST trong ba tháng đầu thai kỳ

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu chung:

Thử nghiệm, đánh giá kỹ thuật QF-PCR nhằm phát hiện lệch bội NST 13, 18, 21

và NST giới tính trong chẩn đoán trước sinh (CĐTS) trên mẫu gai nhau trong ba tháng đầu thai kỳ

Nội dung thực hiện:

- Khảo sát quy trình xử lý tế bào gai nhau sau khi sinh thiết chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy tế bào và ly trích DNA

- Tối ưu hóa quy trình QF-PCR trong chẩn đoán phát hiện các lệch bội NST 13,

18, 21 và NST giới tính X, Y

- Tìm mối tương quan của các yếu tố nguy cơ và kết quả chẩn đoán để lựa chọn thai phụ phù hợp trong tư vấn xét nghiệm gai nhau

1.1 Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp

1.1.1 Hội chứng Down

Hội chứng Down được bác sĩ người Anh – John Langdon Haydon Down mô tả lần đầu vào năm 1866 Đây là một loạt bệnh lý liên quan đến hiện tượng rối loạn thừa một hoặc một đoạn NST thứ 21 ở người Hội chứng (HC) này thường gặp nhất trong số các bệnh do rối loạn NST, cứ 800 – 1000 trẻ sinh ra thì có 1 trẻ bị HC Down [41].

Các trẻ mắc HC Down thường có chung một số đặc điểm hình thái như mặt dẹt, mắt xếch, tai nhỏ, rãnh khỉ (là rãnh ngang liên tục ở lòng bàn tay), lưỡi dầy và dài, cổ ngắn Trẻ thường chậm phát triển về thể chất và tâm thần vận động Trẻ bị HC Down thường kèm theo các bất thường bẩm sinh khác, trong đó dị tật bẩm sinh tim là phổ biến nhất như thông liên thất, còn ống động mạch, tứ chứng Fallot Ngoài ra còn có các dị tật

về thính giác, thị giác, rối loạn tuyến giáp, bất thường về tiêu hóa, động kinh, các vấn đề

về hô hấp, béo phì, dễ bị nhiễm trùng và ung thư bạch huyết [54]

Nguyên nhân di truyền gây ra HC Down được các nhà khoa học tìm ra vào năm

1959 Bình thường thai được thừa hưởng vật chất di truyền gồm 46 NST, trong đó có 23 NST từ mẹ và 23 NST từ cha Hầu hết các trường hợp Down có 47 NST do thừa một NST 21 Chính sự dư thừa vật chất di truyền này gây nên các rối loạn về thể chất và trí khôn của trẻ 95% người mắc HC Down do rối loạn phân chia giao tử ở cơ thể bố mẹ bình thường dẫn đến tế bào trứng hoặc tinh trùng thừa một NST 21 Bên cạnh đó, 3 – 4% là HC Down khảm – cơ thể gồm các tế bào mang ba NST 21 và các tế bào mang hai NST 21 Cơ chế xảy ra có thể do trứng hoặc tinh trùng thừa một NST 21 kết hợp với nhau tạo hợp tử bất thường, sau đó các hợp tử này tiếp tục phân chia bất thường tạo thành các dòng tế bào có hai NST 21 và các dòng tế bào có ba NST 21 Hoặc có thể do trứng và tinh trùng bình thường tạo hợp tử bình thường, sau đó do rối loạn trong quá trình phân chia tạo các tế bào có một, hai hoặc ba NST 21 Tuy nhiên chỉ có các tế bào

khảm Ngoài ra còn có HC Down do chuyển đoạn chiếm 1 – 2% do nhà khoa học Mỹ

W R B Robertson phát hiện ra vào năm 1961 Nguyên nhân do hiện tượng chuyển đoạn trong phân bào giảm nhiễm tạo giao tử dẫn đến tình trạng cánh dài của NST 21 chuyển đoạn gắn vào cánh dài của NST 14 Sau đó giao tử thừa một đoạn NST 21 kết hợp với giao tử bình thường sẽ phát triển thành cơ thể mang bệnh Down chuyển đoạn Các trường hợp này được gọi là trisomy một phần [12]

1.1.2 Hội chứng Edwards

HC Edwards lần đầu tiên được nhà di truyền y học người Anh Edwards và cộng

sự mô tả vào năm 1960 Đây là bệnh do bất thường NST thường gặp thứ hai sau HC Down Tần số xuất hiện của bệnh vào khoảng 1/3000 lần sinh [40]

Các biểu hiện lâm sàng ở HC này rất đa dạng Cấu tạo mặt và hệ thống cơ xương

bị tổn thương, vành tai bị biến dạng, xẻ môi, dị tật chi Các bất thường ở tim và mạch máu chiếm tới 90,8% các trường hợp, thường là các tổn thương ở vách liên thất và van tim Ngoài ra, bệnh nhân cũng gặp những dị tật bẩm sinh ở hàng loạt các cơ quan khác như: hệ thần kinh, tiêu hóa, hô hấp, bài tiết, sinh dục Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan nên thời gian sống của các trẻ HC Edwards không lâu, có tới 60% các trường hợp chết trước 3 tháng tuổi, chỉ 10% trẻ sống được đến 1 tuổi [40]

Cơ sở di truyền tế bào chủ yếu của HC này là do trong nhân các tế bào của cơ thể người bệnh thừa ra một NST 18 Nguyên nhân là do trong quá trình phát sinh giao tử ở cha hoặc mẹ cặp NST 18 không được phân ly tạo nên các tinh trùng hoặc tế bào trứng thừa một NST 18, khi tế bào sinh dục bất thường thụ tinh với tế bào sinh dục bình thường sẽ tạo nên hợp tử có bộ NST bất thường Trường hợp tồn tại ba NST 18 trong tất

cả các tế bào cơ thể chiếm đến 95%, 5% còn lại là thể khảm hoặc các thể phối hợp khác như lệch bội kép, chuyển đoạn [74], [79]

1.1.3 Hội chứng Patau

HC Patau được quan sát lần đầu tiên vào năm 1957 bởi Erasmus Bartholin nhưng mãi đến năm 1960 mới được bác sĩ Klaus Patau cùng cộng sự mô tả đầy đủ Tần số xuất hiện của bệnh vào khoảng 1/10.000 lần sinh [77]

Trên 95% trường hợp thai HC này bị sẩy ngẫu nhiên trong thai kỳ Đặc điểm kiểu hình của HC Patau bao gồm dị tật chi, đầu nhỏ, não trước không phát triển, khuôn mặt bất thường như mắt nhỏ, mũi dị dạng, hở vòm miệng Đa số các trẻ bị tổn thương hệ thống thần kinh, các dị tật khác như dị tật tim chiếm 80%, dị tật hệ thống bài tiết (trên 60%) và ở cơ quan sinh sản (75%) Do có quá nhiều dị tật nặng nề, những trẻ tam thể 13 không sống được lâu, 90% bệnh nhân bị chết trong vòng 1 tuổi [40]

HC Patau phát sinh chủ yếu do hai dạng đột biến do hậu quả của sự không phân

ly của cặp NST 13 khi phát sinh giao tử ở cha hoặc mẹ Các giao tử bất thường khi thụ tinh với các giao tử bình thường sẽ tạo nên các hợp tử bất thường chứa ba NST 13, trường hợp này chiếm đến 90% 10% bất thường còn lại là do thể khảm hoặc chuyển đoạn t(13q;14q) [74], [77]

1.1.4 Các rối loạn nhiễm sắc thể giới tính

điển hình là lùn, tóc mọc thấp, cổ ngắn, nếp da thừa ở cổ, biến dạng xương chi… Nguyên nhân chính gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khoẻ và đời sống của người bệnh là các dị tật nội quan như dị tật tim, thận và rối loạn chức năng Bệnh nhân thường có biểu hiện thiểu năng sinh dục, giới tính thứ cấp không phát triển, vô sinh, các rối loạn nội tiết gây chậm phát triển về thể chất, đôi khi chậm phát triển về trí tuệ [50], [67]

1.1.4.2 Hội chứng Klinefelter

HC Klinefelter là tình trạng không phân ly NST ở nam giới, dẫn đến bệnh nhân

có một cặp NST giới tính X thay vì chỉ một NST X (47,XXY) HC này được bác sĩ Harry Klinefelter mô tả lâm sàng lần đầu tiên vào năm 1942 Tần suất bệnh khoảng 1/500 ở các bé trai [37]

Hầu hết người nam 47,XXY có trí thông minh bình thường Bệnh nhân có thể mất các đặc điểm giới tính thứ phát do giảm sản xuất androgen, với biểu hiện lông ở mặt, thân, cơ quan sinh dục thưa, giọng nói cao và phân bố mỡ theo kiểu phụ nữ Vào giai đoạn trễ của tuổi dậy thì, khoảng 30 – 50% trẻ nam mắc HC Klinefelter biểu hiện

vú to thứ phát Tất cả bệnh nhân 47,XXY bị vô sinh, bệnh nhân thể khảm có thể còn khả năng sinh sản Về mặt di truyền: 80 – 85% các trường hợp có NST đồ là 47,XXY, còn lại là khảm 47,XXY/46,XY hay 47,XXY/46,XX hoặc 45,X/46,XY/47,XXY Nguồn gốc của NST bất thường hầu hết do hiện tượng không phân ly NST xảy ra ở người mẹ hoặc

bố, một số khác do rối loạn trong phân chia của hợp tử [37], [76]

1 1.4.3 Hội chứng 47,XYY

Tần suất bệnh khoảng 1/1000 bé trai HC này có kiểu hình ít đặc trưng như vóc dáng cao lớn hơn bình thường Về khả năng phát triển tâm thần, người mang HC 47,XYY có chỉ số IQ bình thường Tuy nhiên người bệnh nóng tính, thường hay gây hấn Trong các nhà tù phạm tội nặng, có khoảng 3% tù nhân là XYY, trong số đó có 20% có chiều cao hơn bình thường [1]

1.1.4.4 Hội chứng triplo X

Hội chứng triplo X (47,XXX) được Jacobs mô tả đầu tiên vào năm 1959 Tần suất gặp khoảng 1/1000 bé gái Hầu hết trẻ gái dậy thì và sinh sản bình thường, tuy nhiên một số trường hợp bị vô kinh thứ phát và thường mãn kinh sớm Trẻ có thể có chỉ

số IQ thấp hơn bình thường [1]

Các bất thường NST trên thường không thể điều trị khỏi chính là gánh nặng cho gia đình và xã hội Biện pháp phòng ngừa tích cực nhất là sàng lọc dựa trên tuổi mẹ, siêu âm, các dấu hiệu sinh hóa… và chẩn đoán trước sinh bằng các xét nghiệm di truyền

1.2 Các phương pháp tầm soát dị tật bẩm sinh trong ba tháng đầu thai kỳ

1.2.1 Dựa trên yếu tố tuổi mẹ

Tuổi mẹ là yếu tố đầu tiên được sử dụng để sàng lọc thai có nguy cơ dị tật Nguy

cơ này tăng cao ở những thai phụ trên 35 tuổi [24] Nghiên cứu vào năm 2002 ở Mỹ ghi nhận 51% trường hợp HC Down xảy ra ở thai phụ trên 35 tuổi và chiếm 14% trong tổng

số trường hợp, trong đó 5% thai phụ từ 38 – 39 tuổi nhưng chiếm đến 30% trường hợp con bị Down [61]

Phương pháp tầm soát HC Down và các dị tật bẩm sinh khác theo yếu tố tuổi mẹ

có tính ứng dụng không cao vì tỉ lệ thai phụ dưới 35 tuổi chiếm đến 91% trường hợp khám thai [5] Ngoài ra, yếu tố tuổi mẹ là dấu hiệu lâm sàng có tính đặc hiệu khá thấp nên bác sĩ tư vấn thường không yêu cầu tiếp tục xét nghiệm để chẩn đoán chính xác các bất thường NST nếu các dấu hiệu lâm sàng khác là âm tính

1.2.2 Siêu âm đo khoảng mờ gáy (Nuchal Translucency)

Khoảng mờ gáy (KMG) là một trong những dấu hiệu lâm sàng khá đặc hiệu, do thai bị HC Down thường kèm theo hiện tượng ứ đọng dịch bạch huyết tại vùng gáy Năm 1992, Nicholaides đề xuất phương pháp siêu âm đo KMG bằng máy siêu âm 2D trên thai từ 10 – 13 tuần 6 ngày tuổi Sau đó kết quả được phân tích bằng phần mềm FMF (Fetal Medicine Foundation) để xác định nguy cơ các dị tật bẩm sinh trong thai kỳ Thông thường, vào tuần thứ 11 của thai kỳ, hệ bạch huyết của thai đã phát triển đầy đủ, lượng bạch huyết lưu thông vùng gáy sẽ tạo hình ảnh bóng mờ có độ dày nhỏ hơn 2,5mm Nếu kết quả siêu âm cho thấy KMG lớn hơn 2,5mm thì thai có nguy cơ cao bị

HC Down [9], [55]

Siêu âm đo KMG là chỉ định thường quy trong tầm soát dị tật bẩm sinh vì phương pháp này đơn giản, không xâm lấn và cho kết quả nhanh Tuy nhiên, chỉ khoảng 85% thai bị dị tật bẩm sinh có KMG lớn hơn 2,5mm Ngoài ra, độ chính xác của siêu âm còn phụ thuộc vào chủ quan của bác sĩ siêu âm, độ phóng đại thai, kỹ thuật đo, máy siêu

âm, thế nằm của thai và thể trạng thai phụ [8] Vì vậy độ nhạy của phương pháp này không cao, chỉ khoảng 62% với tỉ lệ dương tính giả là 5% [53]

1.2.3 Xét nghiệm double test

Double test đo lường nồng độ 2 chất PAPP-A (Pregnancy – associated plasma protein – A) và Free βhCG (free beta human chorionic gonadotrophin) có trong huyết tương của mẹ vào tuần thai thứ 11 đến 13 tuần 6 ngày

PAPP-A là chất xuất hiện sớm nhất trong huyết tương của thai phụ, do màng nuôi (trophobast) tiết ra Nồng độ PAPP-A tăng dần trong suốt thai kỳ, cao nhất vào khoảng

12 tuần (100µl/l) Trong ba tháng đầu thai kỳ, những thai mắc HC Down sẽ có nồng độ PAPP-A trong máu mẹ giảm đáng kể tạo nên một trong những chỉ điểm sinh hóa có giá

Free βhCG là một thành phần trong cấu trúc hormone hCG (human chorionic gonadotrophin) hCG đầu tiên được các tế bào lá nuôi của trứng thụ tinh tiết ra, sau đó

sẽ do nhau thai bài tiết hCG được cấu thành từ hai tiểu đơn vị là α và β Thai mắc HC Down thì nồng độ của tiểu đơn vị free βhCG tăng [4]

Theo nghiên cứu của Wald và cộng sự, xét nghiệm double test 3 tháng đầu thai

kỳ có tỉ lệ phát hiện là 75% [71] Tuy nhiên, xét nghiệm này không thể chẩn đoán tình trạng thai mà chỉ cho biết thai hiện tại có nguy cơ bị rối loạn di truyền NST như thế nào

và có cần phải làm thêm xét nghiệm khác nữa không Để ước tính chính xác mức độ nguy cơ phải kết hợp kết quả xét nghiệm hai chất trên với nhiều yếu tố khác như tuổi của người mẹ, chủng tộc, cân nặng, chiều cao, tiền sử bản thân như tiểu đường, hút thuốc, tình trạng đơn thai hay song thai, tuổi thai vào thời điểm xét nghiệm và tiền sử sản khoa

* Kỹ thuật xét nghiệm

Sử dụng bộ kit ELISA để xác định nồng độ PAPP-A và free βhCG trong huyết tương thai phụ Từ bảng kết quả nồng độ các chất, dùng phần mềm T21 để tính nguy cơ thai bất thường Nồng độ PAPP-A và free βhCG trong huyết tương thay đổi tùy thuộc vào các yếu tố: cân nặng của thai phụ, tuổi thai, tình trạng tiểu đường phụ thuộc Insulin,

số thai, tình trạng hút thuốc lá cũng như máy móc, quy trình và trình độ kỹ thuật viên của cơ sở xét nghiệm Vì vậy, mỗi cơ sở xét nghiệm có những giá trị trung vị đa yếu tố MoM (Multiple of the median) chuẩn khác nhau, được thiết lập dựa trên bảng thống kê nồng độ các chất trong huyết tương, của quần thể thai phụ (100 người) ở các tuần thai khác nhau, đến xét nghiệm sinh hóa tại các cơ sở đó trong một khoảng thời gian dài [2] Phần mềm T21 sẽ tính toán kết quả xét nghiệm sinh hóa theo các bước:

(1)Tính tuổi thai chính xác theo chiều dài đầu mông

(2)Ước tính nồng độ các chất cần xét nghiệm theo tuổi thai bằng cách so sánh với số

(3)Kết quả nhân với các hệ số cân nặng, tiểu đường, số lượng thai, tình trạng sử dụng thuốc lá, cho ra giá trị MoM hiệu chỉnh

(4)So sánh giá trị MoM đã hiệu chỉnh của mỗi cá nhân với nồng độ thực tế đo lường được trong mẫu, cho kết quả thai có nguy cơ cao hay thấp

1.3 Các phương pháp lấy mẫu trong chẩn đoán trước sinh

Để thực hiện các xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán trước sinh, cần phải lấy các tế bào hoặc những vật chất di truyền có nguồn gốc từ thai Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp khác nhau để lấy tế bào thai

1.3.1 Chọc hút dịch ối

Chọc hút dịch ối là phương pháp lấy tế bào thai bằng cách đưa kim vào buồng ối

để hút dịch ối Thời điểm chọc hút dịch ối lý tưởng là ở tuần thai 16 đến 18 khi tỷ lệ thể tích dịch ối/thai là lớn nhất Chọc hút dịch ối là một trong những thủ thuật xâm lấn có thể gây một số tai biến cho thai như sẩy thai (0,5 – 0,8%), chảy máu bánh nhau gây nhiễm tế bào mẹ trong dịch ối, rỉ ối hoặc gây nhiễm trùng mẹ Ngày nay chọc hút dịch

ối là phương pháp được lựa chọn nhiều nhất Các tế bào thu được trong dịch ối có nguồn gốc từ nhiều mô khác nhau của thai: màng ối, da, đường tiết niệu, đường hô hấp, đường tiêu hoá và có thể có cả tế bào máu thai Tế bào ối thu được ít nguy cơ nhiễm tế bào của

mẹ giúp cho chẩn đoán di truyền có độ chính xác cao [30], [38]

Hình 1.1 Chọc hút dịch ối dưới sự hướng dẫn của siêu âm [81]

1.3.2 Sinh thiết gai nhau

Sinh thiết gai nhau (STGN) được biết đến từ cuối những năm 1960, nhưng tới năm 1983 khi có sự hướng dẫn của siêu âm, kỹ thuật này mới phổ biến để chẩn đoán trước sinh ở ba tháng đầu của thai [28], [39]

1.3.3 Chọc hút máu cuống rốn

Chọc hút máu cuống rốn được thực hiện từ tuần thai 18 Đây là kỹ thuật có tai biến cao như: sẩy thai, chảy máu kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang nước… Vì vậy ngày nay, chọc hút máu cuống rốn chỉ áp dụng trong chẩn đoán các bệnh về máu [30], [38], [39]

Đầu dò siêu âm Dịch ối

Thai Bánh nhau

Tử cung

Hình 1.2 Chọc hút máu cuống rốn dưới sự hướng dẫn của siêu âm [78]

1.3.4 Sinh thiết mô thai và nội soi thai

Quan sát thai bằng nội soi được tiến hành lần đầu tiên vào những năm 1950 Cho đến nay, tỷ lệ tai biến của kỹ thuật nội soi thai vẫn ở mức cao: sẩy thai (5 – 7%), đẻ non (khoảng 10%), rỉ ối, nhiễm trùng ối, chảy máu, tổn thương bàng quang và ruột… Vì vậy chỉ áp dụng kỹ thuật này khi cần sinh thiết thai lấy mẫu cho những xét nghiệm đặc biệt như các bệnh về da [30], [38], [39]

1.3.5 Phân lập tế bào và DNA của thai trong máu mẹ

Bằng phương pháp phân biệt tính kháng nguyên giữa mẹ và thai đã phân lập được một số loại tế bào của thai lưu hành trong máu mẹ Tuy nhiên, tỉ lệ các tế bào thai

và DNA nguồn gốc từ thai trong máu mẹ rất ít Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong các kỹ thuật nhằm làm giàu tế bào con trong máu mẹ nhưng hiệu quả của các phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế vì tỉ lệ rất thấp và dễ lẫn nguyên hồng cầu của mẹ Với sự phát triển của khoa học công nghệ, các kỹ thuật xác định tế bào con và làm tăng số lượng tế bào con sẽ tốt hơn, hứa hẹn vai trò to lớn của phương pháp này trong chẩn đoán trước sinh ở tương lai [19], [71], [72]

Thai Máu thai

Đầu dò siêu âm

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán rối loạn nhiễm sắc thể

1.4.1 Kỹ thuật karyotype

Nuôi cấy tế bào và phân tích karyotype (nhiễm sắc thể đồ) là phương pháp truyền thống được xem như một tiêu chuẩn vàng trong phân tích rối loạn NST ở người Ứng dụng kỹ thuật này vào CĐTS bắt đầu được nghiên cứu và thực hiện vào năm 1966 khi Steele và Breg báo cáo về nuôi cấy tế bào ối để xác định bộ NST của thai [56], [65] Tế bào ối, máu cuống rốn hoặc gai nhau được đem nuôi cấy từ 3 – 14 ngày, sau đó sẽ dừng chu kỳ tế bào ở kỳ giữa dưới tác động của colchicine Tiến hành thu hoạch tế bào và trải

tế bào lên lam kính, nhuộm GTG (Giemsa trypsin G-banding) rồi phân tích bộ NST bằng phần mềm chuyên dụng Kỹ thuật này có thể xác định bất thường về số lượng lẫn cấu trúc các NST với độ chính xác lên đến 99,4 – 99,8% và rất đáng tin cậy [15], [18]

Tuy nhiên karyotype có nhiều bất lợi là thời gian trả kết quả dài từ 14 – 21 ngày Điều này vừa tạo ra tâm lý bất an kéo dài đối với thai phụ và khiến cho việc chấm dứt thai kỳ nếu được khuyến cáo trở nên phức tạp và nguy hiểm hơn Ngoài ra, karyotype cần kỹ thuật viên có hiểu biết và thành thạo về kỹ thuật nuôi cấy tế bào cũng như nhuộm băng NST, cần phải tiến hành việc nuôi cấy tế bào ngay sau khi làm thủ thuật để đảm bảo sự phát triển của tế bào và lượng tế bào phải đủ lớn cho nuôi cấy Một nhược điểm nữa của karyotype là các bất thường NST trong phạm vi nhỏ hơn 5 – 10 Mb không thể phát hiện được do độ phân giải kém [56]

1.4.2 Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang

Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) là sự kết hợp giữa di truyền phân tử

và di truyền tế bào được nghiên cứu áp dụng vào chẩn đoán trước sinh đầu những năm

1990 Nguyên tắc kỹ thuật sử dụng các đoạn dò phân tử được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu Dưới kính hiển vi huỳnh quang,

hiệu màu huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào lệch bội cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu [39], [46]

Vì không cần nuôi cấy nên kỹ thuật FISH cho kết quả xét nghiệm nhanh chỉ trong vòng 2 – 3 ngày Tuy nhiên giá thành hóa chất xét nghiệm khá cao nên kỹ thuật này khó được áp dụng tại một nước đang phát triển như Việt Nam Ngoài ra, FISH tốn nhiều công thao tác nên chỉ thực hiện được số lượng mẫu nhất định trong một lần xét nghiệm Vấn đề phân tích mẫu trong phòng tối thời gian dài cũng ảnh hưởng đến tinh thần của người làm xét nghiệm [33], [46]

1.4.3 Kỹ thuật MLPA

MLPA được ứng dụng để chẩn đoán lệch bội các NST 13, 18, 21 và NST giới tính vào năm 2002 Kỹ thuật này có ưu điểm là có kết quả từ 2 – 4 ngày, chỉ cần 2ml dịch ối và cần ít nhân lực thích hợp cho việc chẩn đoán một số lượng lớn bệnh phẩm

Nguyên tắc: Đối với mỗi gen mục tiêu, 2 đoạn dò được thiết kế để lai với đoạn liền Đoạn dò chứa một trình tự đích đặc hiệu ngắn và một đoạn gắn mồi Một trong những đoạn dò chứa một trình tự đệm Đối với mỗi đoạn dò cho phản ứng multiplex, phần đệm có một trình tự dài đặc hiệu Sau khi lai qua đêm với đoạn DNA mục tiêu, mỗi cặp đoạn dò liền kề được nối lại nhờ phản ứng nối Sau đó PCR được thiết lập với cặp mồi có gắn huỳnh quang, đảm bảo rằng mỗi sản phẩm PCR tỉ lệ thuận với DNA mục tiêu ban đầu Sản phẩm PCR sau đó được phân tách bằng hệ thống điện di mao quản [16], [23]

MLPA có ưu điểm là xác định trên 40 locus khác nhau trong một phản ứng duy nhất So sánh với FISH và karyotype, MLPA có thể chẩn đoán với số lượng lớn hơn và giá thành rẻ hơn Nhược điểm của kỹ thuật này là không thể phát hiện được các trường hợp tam bội và không phát hiện được ngoại nhiễm DNA mẹ [33]

1.4.4 Kỹ thuật CGH

CGH (Comparative Genomic Hybridization) cho phép phân tích toàn thể bộ NST với kết quả chính xác hơn karyotype Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên mạch đơn DNA lai đặc hiệu với nhau Trong kỹ thuật CGH, các DNA bộ gen mẫu và DNA bộ gen chứng được đánh dấu bởi các màu huỳnh quang khác nhau, ví dụ màu xanh và màu đỏ, sau đó trộn lẫn chúng và tiến hành lai với NST ở kỳ giữa rồi phân tích tỉ lệ màu huỳnh quang Kết quả xét nghiệm cho màu vàng (kết hợp của đỏ và xanh) khi số lượng DNA bằng nhau ở mẫu chứng và mẫu bệnh, nếu có 3 NST thì DNA đặc hiệu của NST đó sẽ chuyển sang màu đỏ Kỹ thuật này có thể phát hiện sự mất cân bằng NST trong chẩn đoán trước sinh Tuy nhiên hạn chế của nó là phải đảm bảo NST ở giai đoạn metaphase và độ phân giải đạt được chỉ là 3 Mb [44]

1.4.5 Kỹ thuật Array CGH

Kỹ thuật array CGH có thể phát hiện bất thường toàn bộ bộ gen với thời gian nhanh chóng hiện đang được nghiên cứu để đưa vào ứng dụng tại nhiều nước trên thế giới Array CGH cũng như kỹ thuật CGH truyền thống kỹ thuật này sử dụng các trình tự DNA thay vì NST ở giai đoạn metaphase làm mục tiêu lai Array CGH có thể phát hiện được lệch bội NST, các vi mất đoạn và các vi lặp đoạn Array CGH có nhiều thuận lợi trong chẩn đoán trước sinh, là kỹ thuật có độ nhạy và hiệu quả cao, có thể tự động hóa

do đó giảm nhân công và thời gian thực hiện xét nghiệm cũng như giá thành Mặc dù array CGH có nhiều ưu điểm trong chẩn đoán trước sinh nhưng khả năng ứng dụng của

kỹ thuật này còn nhiều hạn chế do cần một hệ thống máy móc trang thiết bị đắt tiền Ngoài ra kỹ thuật này còn cho phép phát hiện những biến đổi rất nhỏ bao gồm cả những biến đổi không ảnh hưởng xấu đến sự biểu hiện kiểu hình, điều này làm cho việc tư vấn kết quả trở nên phức tạp và gây hoang mang cho bệnh nhân[44], [45]

1.4.6 Kỹ thuật QF-PCR

Nhu cầu thiết thực hiện nay là cần một phương pháp chẩn đoán đơn giản, có thể

tự động hóa giúp mang lại kết quả chính xác, nhanh chóng và giá thành rẻ QF-PCR được xem là phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả hiện nay, được nhiều nơi trên thế giới ứng dụng trong phát hiện các lệch bội NST phổ biến 13, 18, 21 và NST giới tính [22], [33], [56], [57]

1.4.6.1 Nguyên tắc

QF-PCR sử dụng các cặp mồi gắn huỳnh quang để khuếch đại các chuỗi DNA có trình tự lặp lại ngắn (STR – Short Tandem Repeat) đặc hiệu cho các NST và có tính đa hình cao Sản phẩm PCR sau đó được định lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST Các trường hợp dị hợp tử (DHT) bình thường, sản phẩm STR đặc hiệu NST khi phân tách đoạn sẽ cho 2 đỉnh huỳnh quang với tỉ số giữa 2 đỉnh là 1:1 Ở các trường hợp trisomy, 3 NST sẽ biểu hiện 3 đỉnh huỳnh quang với tỉ số là 1:1:1 (trisomy 3 alen) hoặc chỉ có 2 đỉnh với tỉ số là 2:1 (trisomy 2 alen) Nếu đồng hợp tử, sản phẩm sẽ cho 1 đỉnh huỳnh quang duy nhất và không có ý nghĩa chẩn đoán [22], [25]

Kết quả khảo sát được biểu thị như hình 1.3

Hình 1.3 Mô tả kết quả phân tích QF-PCR [25]

1.4.6.2 Khái niệm về STR

STR là các trình tự lặp lại ngắn có kích thước dưới 1000 bp với các trình tự lõi từ

2 đến 6 nucleotide Số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể nên STR có tính đa hình rất cao Trên các NST khác nhau chứa các trình tự đa hình STR khác nhau và đặc hiệu cho từng loại NST

Một locus STR được sử dụng cho phương pháp QF-PCR phải thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên không phải đoạn lặp nào cũng có thể sử dụng được Locus STR phải có tính đa hình và mức độ DHT cao vì một marker trong bộ kit chẩn đoán với nhiều alen đồng hợp tử thì không có ý nghĩa chẩn đoán Ngoài ra, các STR sử dụng làm marker phải có độ dài trung bình từ 100 – 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác Các đoạn DNA ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy do tác động của điều kiện bên ngoài nên phản ứng PCR thực hiện sẽ hiệu quả hơn Do đó, STR chứa trình tự lặp lại gồm 2 – 4 nucleotide thường được sử dụng trong các bộ kit QF-PCR [49]

1.4.6.3 Ưu điểm của phương pháp QF-PCR

Kỹ thuật QF-PCR có thể sử dụng mẫu khảo sát với khối lượng mẫu rất nhỏ, khoảng 0,5 – 1ml dịch ối hoặc 3 – 5 sợi gai nhau Phương pháp PCR khuếch đại DNA trong nhân tế bào nên không nhất thiết đó phải là tế bào sống và đang hoạt động nên không đòi hỏi phải xử lý ngay sau khi lấy mẫu [48] Ngoài ra, do các locus STR có tính chất là DNA marker đặc hiệu cho từng cá thể nên kỹ thuật QF-PCR còn có khả năng phát hiện các trường hợp mẫu khảo sát của thai bị ngoại nhiễm DNA của mẹ [21],[45],[56] Một ưu điểm lớn của kỹ thuật này là có thể tự động hóa nhiều mẫu cùng một lúc, giảm nhân công lao động và quá trình phân tích kết quả nhanh trong vòng 30 phút nên chỉ trong vòng 24 – 36 giờ làm việc có thể trả kết quả cho bệnh nhân và giá thành xét nghiệm thấp hơn so với các kỹ thuật khác như FISH, MLPA hay array CGH [15], [22], [56]

1.5 Giới thiệu về gai nhau

1.5.1 Khái niệm

Vào tuần thứ tư của quá trình phát triển phôi, các tế bào màng nuôi phát triển kéo dài thành gai nhau, lan sâu vào màng rụng thuộc nội mạc tử cung nhằm gia tăng diện tích tiếp xúc giữa thai và cơ thể mẹ Quá trình này hoàn tất vào khoảng tuần thứ tám Lúc này gai nhau ngoài tế bào màng nuôi bao xung quanh còn có các tế bào thuộc lá phôi giữa, nguyên bào sợi và đại thực bào mang thông tin di truyền của thai [3]

Hình 1.4 Thai ở giai đoạn ba tháng đầu tiên [80]

Sợi gai nhau gồm 3 thành phần (hình 1.5):

- Lớp ngoài cùng syncytiotrophoblast

- Lớp giữa cytotrophoblast có nguồn gốc từ syncytiotrophoblast

- Lớp tế bào lõi mesenchymal chứa mạch máu, ống vận chuyển oxy và chất dinh dưỡng

Nhau thai

Tử cung Thai

Cổ tử cung Gai nhau

Hình 1.5 Cấu tạo sợi gai nhau [75]

1.5.2 Sinh thiết gai nhau

STGN là kỹ thuật thu mẫu tế bào thai được sử dụng phổ biến nhất trong ba tháng đầu thai kỳ Kỹ thuật này được thực hiện dưới sự hướng dẫn của siêu âm trong khoảng giai đoạn từ 11 đến 13 tuần 6 ngày Có 2 cách lấy mẫu gai nhau là con đường qua thành bụng và qua ngã âm đạo STGN qua âm đạo được thực hiện bằng kim dẻo có nòng bên trong, đường kính khoảng 1,5mm Dưới sự hướng dẫn siêu âm, kim được đưa thẳng đến bao lá nuôi ở túi thai Sau khi rút bỏ nòng, 10 – 25mg gai nhau được hút ra bằng ống tiêm 20 hoặc 30 ml Khi STGN qua bụng, thai phụ nằm ngửa và được siêu âm xác định

vị trí bánh nhau, sát trùng vùng bụng dưới rồi đâm kim đi dọc theo chiều dài bánh nhau Rút nòng rồi gắn ống tiêm, đưa kim lên xuống 4 – 5 lần trong vùng bánh nhau Gai nhau sau khi lấy được giữ trong ống Falcon 15ml chứa dung dịch NaCl 0,9% có 1% heparin STGN qua bụng được ưa chuộng hơn vì có tỉ lệ sẩy thai thấp, nguy cơ chảy máu và biến chứng nhiễm trùng thấp, ít phải thực hiện nhiều lần và tỉ lệ lấy mẫu thành công ở lần đầu tiên cao [6]

A

B

Hình 1.6 Kỹ thuật lấy mẫu gai nhau [80]

A: Qua ngã bụng B: Qua ngã tử cung

Đầu dò siêu âm

1.5.3 Lịch sử chẩn đoán trước sinh trên mẫu gai nhau

Năm 1968, Mohr ở Scandinavia giới thiệu khái niệm về chẩn đoán di truyền trước sinh trên mẫu gai nhau Ông đã thành công trong việc lấy mẫu với một dụng cụ có đường kính 5mm qua ngã tử cung nhưng thai phụ sau đó lại bị chảy máu âm đạo và nhiễm trùng, quá trình nuôi cấy gai nhau cũng không thành công Việc tiếp cận STGN càng chậm chạp hơn khi việc sử dụng mẫu ối vào 3 tháng giữa thai kỳ cho CĐTS diễn ra

an toàn và thuận tiện Kullander và Sandahl (1973) và Hahnem ann (1974) đã báo cáo các phân tích bộ NST của thai từ mẫu gai nhau qua ngã tử cung, tuy nhiên một số thai phụ bị nhiễm trùng và vỡ màng ối Ca STGN thành công đầu tiên trong CĐTS được thực hiện tại bệnh viện Tietung ở Trung Quốc được công bố vào năm 1975 trên Chinese Medical Journal nhằm xác định giới tính thai Họ đã sử dụng một dụng cụ mỏng đâm xuyên vào dạ con chỉ dưới các cảm giác xúc giác mà không có bất kỳ sự hướng dẫn nào Tuy thủ thuật còn thô sơ nhưng với việc chẩn đoán chính xác trên gai nhau cũng như tỉ

lệ sẩy thai không quá cao đã thúc đẩy các ý tưởng về CĐTS trong 3 tháng đầu của thai

kỳ [35]

Vào đầu thập niên 1980, hai tiến bộ về công nghệ mới cho phép sự trở lại của việc lấy mẫu gai nhau phục vụ cho CĐTS Đầu tiên là sự xuất hiện của kỹ thuật siêu âm, dưới sự hướng dẫn của máy siêu âm, lấy mẫu gai nhau trở nên dễ dàng hơn rất nhiều Ngoài ra, các dụng cụ lấy mẫu được thiết kế nhỏ gọn và tinh xảo hơn cũng giúp cho thủ thuật này an toàn và chính xác hơn Năm 1982, Kazy và cộng sự báo cáo ca thủ thuật gai nhau đầu tiên qua ngã tử cung dưới sự hướng dẫn của siêu âm Cũng trong năm này, Old báo cáo về chẩn đoán bệnh β thalassemia trong ba tháng đầu thai kỳ từ gai nhau Tương

tự, Brambati và Simoni đã chẩn đoán thành công HC Down từ tế bào gai nhau[29], [70]

Sau những báo cáo đầu tiên này, nhiều chương trình CĐTS vào ba tháng đầu thai

kỳ từ vật liệu di truyền là gai nhau được triển khai ở Châu Âu và Mỹ

1.5.4 Bất lợi của gai nhau trong chẩn đoán trước sinh

1.5.4.1 Các tai biến xảy ra do sinh thiết gai nhau

Các tai biến xuất hiện do STGN thường là xuất huyết, nhiễm trùng thai, rỉ ối, vỡ

tử cung Tai biến nghiêm trọng nhất thường là sẩy thai và gây dị tật chi cho thai Tỉ lệ sẩy thai do STGN (1 – 2 %) cao hơn so với chọc hút dịch ối (0,5 – 0,8%) trong đó tỉ lệ

do STGN qua âm đạo cao hơn so với sinh thiết qua thành bụng Tuy nhiên, tỉ lệ sẩy thai

do STGN giảm dần theo thời gian [11], [13], [43], [68] Dị tật chi xảy ra thường do tổn thương bánh nhau, chảy máu dẫn đến thiếu máu ở động mạch cung cấp cho chi Tỉ lệ dị tật chi vào khoảng 1% khi thực hiện sinh thiết trước 11 tuần tuổi và giảm dần khi thai lớn [17], [31]

1.5.4.2 Thể khảm ở gai nhau

NST khảm là hiện tượng xuất hiện cùng lúc nhiều hơn hai dòng tế bào trong cùng một mẫu khảo sát gây khó khăn cho việc CĐTS Nguyên nhân thể khảm là do bất thường trong quá trình phân chia của hợp tử

NST khảm được phân loại dựa vào thời gian xảy ra đột biến và vị trí bị ảnh hưởng Nó có thể diễn ra vào giai đoạn rất sớm của quá trình phát triển phôi, ở giai đoạn biệt hóa thành phôi thai và màng đệm, lúc này thể khảm xuất hiện ở cả nhau và thai (true fetal mosaicism – TFM), chiếm 0,1 – 0,3% Loại NST khảm này vẫn được phát hiện khi kiểm tra lại bằng chọc hút nước ối vào ba tháng giữa thai kỳ Loại thứ hai xuất hiện trể hơn và chỉ giới hạn ở bánh nhau hoặc ở thai Khảm bánh nhau (confined to placenta mosaicism – CPM) là loại NST khảm phổ biến chiếm tỉ lệ 1 – 2% [32], [36], [42], [43]

1.6 Thông tin về bộ kit Devyse

Bộ kit Devyser trong chẩn đoán QF-PCR được chứng nhận bởi CE và được áp dụng tại nhiều phòng xét nghiệm chẩn đoán trên thế giới Phương pháp QF-PCR sử dụng các locus STR để đánh giá số lượng NST cần khảo sát nên độ dị hợp tử của các locus STR là yếu tố quan trọng trong việc cho thông tin về marker và ứng dụng QF-PCR trong CĐTS Các marker sử dụng trong bộ kit của Devyser là các marker có độ DHT cao và đã được đánh giá bởi các phòng thí nghiệm trên thế giới [14], [20], [27], [34], [51], [58], [60], [62] Độ dị hợp tử của một số chủng tộc trên thế giới được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Độ dị hợp tử của một số chủng tộc trên thế giới

Kí hiệu

marker

Locus

Độ dị hợp tử (%) Czech Hàn Quốc + Iran Singapore

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết bị

Bao gồm một số dụng cụ và thiết bị cơ bản:

- Tube vô trùng các loại 200µl, 500µl và 1,5ml

- Pipette: 0,5 – 10µl, 2 – 20µl, 10 – 100µl, 100 – 1000µl (Eppendorf) và đầu tip tương ứng

- Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf)

- Máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf)

- Hệ thống điện di mao quản ABI 3500/ABI 3130 (Applied Biosystems)

- Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Heraeus)

2.2 Phương pháp thực hiện

Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR

Kỹ thuật karyotype trong nghiên cứu này được tiến hành song song với kỹ thuật QF-PCR để khảo sát các giá trị của kỹ thuật QF-PCR và phát hiện các bất thường cấu trúc NST nếu có