Nghiên cứu thành phần hóa học của rễ cây thông đỏ taxus wallichiana zucc. Họ thanh tùng (taxaceae)

Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật làm probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng sơ i

Danh mục c c n ản iii

Danh mục các t iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi

ĐẶT VẤ ĐỀ 1

CHƯƠ G 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Probiotic 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 10

1.1.3 Vi khuẩn Bifidobacterium 11

1.2 Tổng quan về vi gói 18

1.2.1 Khái niệm vi gói; ưu và n ược iểm của vi gói 18

1.2.2 Các vật liệu sử dụng ể vi gói 20

1.2.3 C c p ương p p vi gói 27

1.2.4 Các yếu tố ản ưởng ến hiệu quả vi gói probiotic 29

1.2.5 Hoạt ộng của vi gói ến hoạt ộng của tế bào vi sinh vật và quá trình lên men 31

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi gói vi khuẩn probiotic 31

1.4 Tổng quan về chanh dây 35

1.4.1 Ngu n gốc chanh dây 35

1.4.2 Đặc iểm hình thái 35

1.4.3 Thành phần din dưỡng của chanh dây 36

1.4.4 Công dụng của chanh dây 36

CHƯƠ G 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠ G PHÁP THÍ GHIỆM 2.1 Trang thiết b , hóa chất, vật liệu 38

2.1.1 Trang thiết b 38

2.1.2 Hóa chất 38

2.1.3 Vật liệu 38

2.2 Nội dung thí nghiệm 38

2.2.1 Sơ nội dung thí nghiệm 38

2.2.2 P ương p p t í ng iệm 40

2.3 C c p ương p p liên quan 48

2.3.1 P ương p p ng iên cứu n t i vi sin vật 48

2.3.2 P ương p p n lượng vi sin vật bằng p ương p p ếm k uẩn lạc 49

2.3.3 T u n ận sin k ối bằng p ương p p ly tâm 49

2.3.4 Đ n lượng acid lactic 50

2.3.5 X c nh pH 50

CHƯƠ G 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát một số ặc iểm sinh học của chủng Bifidobacterium longum 51

3.1.1 Quan sát vi thể - ại thể 51

3.1.2 Khảo s t ường cong sin trưởng của chủng B.longum 52

3.2 Khảo sát một số hoạt tính probiotic của chủng B.longum 53

3.2.1 Khả năng sống trong môi trường có pH thấp 53

3.2.2 Khảo sát khả năng t n tại trong môi trường pepsine 54

3.2.3 Khảo sát khả năng t n tại trong môi trường muối mật 55

3.2.4 Khảo sát khả năng k ng k uẩn 56

3.3 Thực hiện vi gói vi khuẩn B.longum 57

3.4 Khảo sát chất lượng hạt vi gói 59

3.4.1 Khảo sát khả năng t n tại của vi khuẩn B.longum trong ạt vi gói trên môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) pH=2 59

3.4.2 Khảo sát khả năng t n tại của vi khuẩn B.longum trong môi trường muối mật 0,3% 61

3.5 Khảo sát biến ộng của pH, acid lactic trong quá trình lên men 62

3.5.1 Khảo s t c c iều kiện của quá trình lên men chanh dây 62

3.5.2 Khảo sát biến ộng pH, acid lactic trong quá trình lên men bằng chế phẩm vi gói 72

3.6 Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm 74

CHƯƠ G 4 KẾT UẬ VÀ ĐỀ GH 4.1 Kết luận 77

4.2 Đề ng 78

TÀI IỆU TH KHẢ 79

PH C 86

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.1 Tổng quan về Probiotic

1.1.1 Giới thiệu chung

1.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20 khi Tisser, một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh vào năm 1900 [52]

Sau đó, vào năm 1907, Metchnikoff đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ

Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải

thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cozak ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách

“sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [52]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [22]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [23]

Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus

acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học

đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [22] Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất và đặt tên là “yakult” [23]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa vi khuẩn Bifidobacterium hoặc

Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những

nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi 1.1.1.2 Định nghĩa Probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “cho sự sống”

Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974

để chỉ “những vi sinh vật và cơ chất làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” [22]

Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic là “ vi sinh vật sống bổ sung vào thức

ăn giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ”

Năm 1992, Havernaar và Huis định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật đơn

lẻ hay kết hợp những vi khuẩn có lợi, mang lại lợi ích cho vật chủ bằng cách cải thiện các đặc tính của vi sinh vật đường ruột” [42]

Theo Viện khoa học Quốc tế (International Life Sciences Institute) (1998) định nghĩa probiotic “ là những vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn, tác động có lợi đến vật chủ” [42]

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một lượng cần thiết sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [19]

Hiện nay, thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích được đưa vào cơ thể động vật và người thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ [19]

1.1.1.3 Vai trò của probiotic

Hiện nay, các nhà khoa học đã chứng minh được nhiều lợi ích mà probiotic mang lại như: điều hoà hiện tượng không dung nạp lactose, đề phòng được ung thư

- Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính và cạnh tranh nguồn dinh dưỡng

+ Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí

thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E coli, Salmonella

Một số nấm men probiotic như Saccharomyces cereviese, S.boulardii không

chỉ cạnh tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột [15]

Một vài vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh Salmonella enterica, Yersinia entercolitica Lactobacillus

GG và Lactobacillus plantarum 299V cạnh tranh vị trí bám với E coli O157H7 và

HT-29 Lactobacillus fermentum RC-14 cạnh tranh vị trí bám với Staphylococcus

aureus, do đó làm giảm sự bám dính của các tác nhân gây bệnh [43]

+ Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất

vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển

Sự phát triển vi khuẩn probiotic sử dụng đường đơn (glucose, fructose) làm

giảm sự phát triển của Clostridium difficile ( sử dụng đường đơn) [42]

Sắt là yếu tố quan trọng đối với các tế bào sống, ngoại trừ Lactobacillus

plantarum và Borrelia burgdorferi Nó cần thiết trong các quá trình sinh hóa trong

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

tế bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao Sự hấp thu và lưu trữ sắt được điều chỉnh bởi tế bào Siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng gắn kết với các ion sắt Siderophore có thể hòa tan sắt tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật Do đó tận dụng yếu tố này, có thể chọn những sinh vật vô hại có khả năng sản xuất siderophore làm probiotic, cạnh tranh ion sắt với vi sinh vật gây bệnh [8]

Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và cạnh tranh ion sắt trong ruột già

với E coli [26] Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản

sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như bacteriocin, lactoferrin, lysozyme, hydrogen peroxide cũng như một số acid hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên

vi khuẩn có hại, chủ yếu là giảm thấp pH trong ruột [14]

+ Bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như Lactobacilus plantarum,

L acidophilus NCFM, L johnsonii NCC 533, L casei Chúng thường độc với vi

khuẩn Gram dương như Lactococcus, Steptococcus, Staphylococcus, Listeria và

Mycobacteria Bacteriocin được sinh ra từ B.bifidum NCDC 1452 có khả năng

kháng rất nhiều vi khuẩn như E.coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,

Micrococcus flavus và Pseudomonas fluorescens [26] Cơ chế hoạt động cơ bản của

bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn gây bệnh Một vài vi

khuẩn thuộc giống Bifidobacterium cũng có khả năng sản xuất ra bacteriocin gây

độc cho cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Đặc biệt probiotic còn kích thích các

tế bào biểu mô ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [43]

+ Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acid acetic, acid lactic, acid propionic làm giảm pH môi trường, ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh Một vài

loài vi khuẩn giống Lactobacilus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica

bằng cách sản xuất ra acid lactic [43]

Hydrogen peroxide cũng là chất kháng khuẩn, do một vài vi khuẩn

Lactobacillus sản sinh có khả năng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Gonococci

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Ngoài ra, vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát triển của Gardnerella

vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, acid lactic và bacteriocin [43]

- Tăng cường hệ miễn dịch: Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có

vú Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù với nhau Năng lực miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống và loài probiotic [17]

Spanhaak và cộng sự (1998) thử nghiệm sử dụng Lactobacillus casei Shirota

trên 20 người đàn ông Những người đàn ông này được ăn theo chế độ trong 8 tuần,

10 người được uống sữa lên men bổ sung 1x1012 CFU/ml L casei Shirota, 10 người

còn lại uống sữa lên men Kết quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng

sữa chua bổ sung L.casei Shirota [51] Nhiều chủng Lactobacillus có khả năng hoạt

hóa đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bào dendritic làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma

Chúng tôi sử dụng sơ đồ sau đây như một sự tổng kết trọn vẹn các lợi ích cho

sức khỏe mà probiotic mang đến cho con người (Sơ đồ 1.1)

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Sơ đồ 1.1 Những lợi ích từ việc tiêu thụ probiotic [48]

1.1.1.4 Vi sinh vật probiotic

Hầu hết những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic thuộc nhóm vi khuẩn

lactic, gồm 2 loài vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và Bifidobacterium như : L

acidophilus, L brevis, L casei, Lactobacillus GG, L bulgaricus, L fermentum, L johnsonii, L lactis, L plantarum, L rhamnosus, B bifidum, B breve, B infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum

Hạ cholesterol máu

Tăng cường miễn dịch bẩm sinh

Giảm dị ứng ở trẻ em

Kiểm soát bệnh viêm ruột

Giảm nguy cơ

ung thư ruột

Probiotic

Hiệu quả trao đổi chất

Điều hòa miễn dịch

Hệ vi sinh vật tạo sự bình thường cho ruột

Đáp ứng cân bằng miễn dịch

Tách muối mật

và bài tiết

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Ngoài ra, còn một số vi sinh vật không phải vi khuẩn lactic được sử dụng làm probiotic như: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces

boulardii, Saccharomyces cerevisiae [22]

1.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật làm probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và định cư trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này được khảo sát thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng làm probiotic [20]

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

 Khả năng tồn tại trong môi trường acid dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của người và động vật là nơi có môi trường acid pH từ 2÷3 và có mặt các enzyme tiêu hoá (amylase, protease, lysozyme…) Các chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này Hiện nay, xu hướng là dùng chế phẩm vi gói probiotic (microencapsulation) nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày

 Khả năng chịu muối mật: Để phát huy hiệu quả probiotic, các chủng vi khuẩn probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật từ

0,15÷0,3% [27] Ngoài ra, một số chủng probiotic (Bacillus và Lactobacillus) có

khả năng sinh enzyme tiêu hoá như: amylase, xenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

 Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá và sinh sôi nảy nở Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả

như E coli, Salmonella và Campylobacteria Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như: sản sinh ra các chất bacteriocin, làm giảm độ

pH bởi tạo ra acid lactic, tạo ra H2O2, làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau, làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt, cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh…

1.1.3 Vi khuẩn Bifidobacterium

Bifidobacterium được phân lập và khám phá ra bởi một bác sĩ người Pháp tên là

Tissier khi ông nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh vào những năm 1899-1900

Ông đặt tên là Bacillus bifidus communis hoặc Bacillus bifidus Sau đó vi sinh vật này được phân loại lại thành Bifidobacterium [35]

Bifidobacterium là loài vi sinh vật có mặt trong ruột già của người (chiếm

5-35% trong tổng số vi sinh vật đường ruột) được sử dụng như probiotic trong các sản phẩm sữa lên men cung cấp cho con người do có các tác dụng: sản sinh acid lactic

và acid acetic, làm giảm pH nên ức chế được vi sinh vật gây bệnh (hiệu quả như chất kháng khuẩn), hạn chế amonia tự do vào máu do biến NH3 tự do thành NH4+, tổng hợp được các vitamin nhóm B và enzyme tiêu hóa như Caseinphosphatase và Lyxozyme, một số thành phần tế bào có khả năng kích thích hoạt động miễn dịch của cơ thể, tạo sự cạnh tranh với các vi khuẩn đường ruột khác [40]

1.1.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bifidobacterium

a Phân loại

Bifidobacterium là vi khuẩn Gram dương, không di động, kỵ khí bắt buộc và

được phân loại như sau:

Vi khuẩn Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với

nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, dạng hình gậy, dạng phân

nhánh… và thường xuất hiện ở dạng chữ “Y” Các tế bào vi khuẩn Bifidobacterium

thường đứng riêng lẽ, xếp thành cặp hoặc xếp thành hình chữ “V” Kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,5 - 1,3mm

Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhiều nhánh và

dưới điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào có nhiều hình dạng khác nhau Thành phần trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hình thái của

Bifidobacterium như : N-acetylglucosamin, các thành phần liên quan đến tổng hợp

vách peptidoglycan, sự có mặt của các amino acid chính (alanine, acid aspartic, acid glutamic, serine) và ion Ca2+ [35]

Tế bào Bifidobacterium không có vỏ bao và không có hệ thống tim mao bao

quanh Vách tế bào được cấu tạo bởi ba thành phần chính: peptidoglycan, polysaccharide, acid lipoteichoic [30]

c Đặc điểm sinh lý

Bifidobacterium cư trú trong ruột già của người và động vật Chúng đóng vai

trò quan trọng trong việc kiểm soát pH của đường ruột và kết tràng, tính ổn định của chúng liên quan đến tuổi tác, tuổi càng lớn thì lượng vi khuẩn càng giảm Ngoài ra

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

lượng vi khuẩn Bifidobacterium trong cơ thể còn bị tác động bởi nhiều yếu tố như

thức ăn, thức uống, sử dụng kháng sinh và tình trạng cơ thể [40]

- Nhu cầu oxy: Bifidobacterium là sinh vật kỵ khí bắt buộc, tuy nhiên tính

nhạy cảm với oxy thay đổi tùy theo loài và các giống khác nhau của mỗi loài Một

số loài cũng có thể chịu được oxy khi có sự hiện diện của CO2 Khi có mặt CO2, tính nhạy cảm với oxy khác nhau phụ thuộc vào các dòng Một số dòng có thể phát triển trong sự hiện diện của oxy, một vài dòng có thể âm tính hoặc dương tính với

catalase Bifidobacterium có nhiều dạng hô hấp khác nhau bao gồm:

Tăng trưởng hiếu khí không có sự tích lũy H2O2: một dòng vi khuẩn B

bifidum chịu được điều kiện hiếu khí tạo ra một lượng nhỏ H2O2 bởi quá trình oxy

hóa NADH

Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H2O2: sự tích lũy H2O2 là một độc tố đối với enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase trong quá trình chuyển hóa

đường của giống Bifidobacterium

Tăng trưởng không có sự tích lũy H2O2: một số dòng Bifidobacterium có

mức oxy hóa khử thấp trong quá trình chuyển hóa các chất và tạo H2O2

- Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium ở người là từ 36-380C, trong khi ở động vật là 41- 430C Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 200C và trên 460C Tuy nhiên B thermacidophilum có khả năng phát

triển ở nhiệt độ 49,50C và B psychraerophilus có thể phát triển ở nhiệt độ dưới 40C

[35], [40]

- pH: pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 6,5-7,0 Tế bào vi khuẩn

Bifidobacterium không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4,5 và cao hơn 8,0 [35] Riêng

chủng B lactic và B animalis có thể tăng trưởng ở pH 3,5 Bifidobacterium là loài

chịu được acid nhưng không phải là vi sinh vật ưa acid [ 40]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

d Nhu cầu dinh dưỡng

Bifidobacterium là loài vi sinh vật hóa dị dưỡng, có khả năng lên men nhiều

nguồn carbon Sản phẩm chính của quá trình lên men glucose chủ yếu là lactate và acetate với tỷ lệ 2:3, và một số sản phẩm phụ như acid formic, ethanol, acid succinic, acid butyric, acid propionic… và không tạo CO2 [35]

L(+)-Khả năng chuyển hóa carbohydrate khác nhau đáng kể giữa các chủng

Bifidobacterium Hầu hết các chủng Bifidobacterium đều có thể chuyển hóa được

các nguồn đường ribose, galactose, fructose, glucose, sucrose, maltose, melibiose nhưng không thể lên men L- arabinose, rhamnose, N-acetyl glucosamine, sorbitol melezitose, trehalose, glycerol, xylitol và inulin [50]

Bifidobacterium đặc trưng bởi sự trao đổi chất hexose thông qua con đường

phosphoketolase, con đường này còn được gọi là “Bifid-shunt”, bằng cách sử dụng một enzyme chủ chốt là fructose-6-phosphate phosphoketolase (F6PPK) Sự hiện

diện của F6PPK thường được sử dụng phân biệt Bifidobacterium với các vi khuẩn khác có hình thái tương tự như Lactobacillus, Arthrobacter, Propionibacterium,

Corynebacteruim, và Actinomycetaceae [35]

Bên cạnh việc sản xuất hỗn hợp L (+)-lactic acid và acid acetic (2:3), đặc

điểm chức năng probiotic của Bifidobacterium được tăng cường bằng việc sản xuất

các vitamin ngoại bào (B1, B6, B9) và các acid amin như alanine, valine, aspartic

và threonine

Schell và cộng sự (2002) đã xác định chuỗi trình tự 2,26 Mb của chủng B

longum có nguồn gốc từ trẻ sơ sinh và xác định được 1.730 trình tự mã hóa 60%

GC của NST Phân tích tin sinh học cho thấy rằng một số đặc điểm sinh lý có thể

giải thích một phần thích ứng thành công của Bifidobacterium trong ruột già [35]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.1.3.2 Một số đặc điểm giúp Bifidobacterium được sử dụng làm probiotic ở

người

a Tính chất an toàn

Bifidobacterium là vi khuẩn hiện diện trong ruột của người, nhưng cũng

được tìm thấy trong miệng và âm đạo, và trong đường tiêu hóa của các loài động vật khác nhau, kể cả ong mật và các loài chim Chúng là những sinh vật bản địa chiếm ưu thế trong ruột già của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ, chiếm khoảng 99% hệ sinh vật trong phân (109-1011 CFU/g phân), trong khi Enterobacteria, Enterococcus và

Lactobacillus chiếm khoảng 1% hệ vi sinh đường ruột Sự phân bố của loài Bifidobacterium sẽ thay đổi theo hàm lượng dịch dạ dày của từng cá nhân [35]

Bảng 1.1 Sự phân bố của loài Bifidobacterium trong ruột người

Trẻ sơ sinh bú sữa mẹ

Trong số 33 loài của giống Bifidobacterium, 12 loài được phân lập từ ruột

của người Không phải là tác nhân gây bệnh nên chủng vi sinh vật này không liên

quan đến bất kỳ bệnh đường ruột nào ở người Bifidobacterium cũng có mặt trong

ruột non, nhưng với số lượng thấp hơn trong ruột già

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Bifidobacterium có thể chịu đựng được pH thấp, acid mật và dịch tụy Tuy

nhiên, dịch vị có thể gây tử vong cho các tế bào Bifidobacterium tự do không vi gói Ngoài ra, Bifidobacterium có khả năng bám dính vào biểu mô ruột, và tăng đáp ứng miễn dịch Bifidobacterium cũng không liên quan đến các tác dụng phụ lâm sàng không mong muốn nào Bifidobacterium cũng không có khả năng truyền gen kháng kháng sinh Do đó, Bifidobacterium đáp ứng được các yêu cầu an toàn của một

probiotic [35], [58]

b Tính chất chức năng

- Sự bám dính của Bifidobacterium trên biểu mô ruột

Việc duy trì sự cân bằng hệ nội vi sinh vật đường ruột có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người Hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột sẽ bảo vệ vật chủ tránh khỏi tác nhân gây bệnh nhờ sự hình thành ranh giới màn nhầy Thực hiện

thử nghiệm in vitro, cho thấy rằng Bifidobacterium bám vào các dòng tế bào biểu

mô Caco-2 và HT-29-MTX của người, từ đó tạo ra các “hốc” (niches) duy trì sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Bất kể những thay đổi trong môi trường sống, các

hốc cho phép Bifidobacterium mang lại hiệu quả probiotic đích thực Điều này được

giả định rằng màng vi khuẩn gắn vào thành biểu mô tăng cường sản xuất tại chỗ các chất chuyển hóa đa dạng, có tác dụng có lợi cho vật chủ [35]

- Kích thích phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu

Lớp biểu mô ruột của người là một khu vực rộng lớn giúp hấp thu các phân

tử, đóng vai trò như là một rào cản đối với nhiều kháng nguyên lạ có khả năng đi qua ruột Việc loại trừ những kháng nguyên này được thực hiện bởi hệ thống miễn

dịch đường ruột, được gọi là mô bạch huyết đường ruột Bifidobacterium kích thích

sự sản sinh cytokine để tăng cường đáp ứng miễn dịch Probiotic kích thích hệ thống

miễn dịch được chứng minh có khả năng ngăn chặn E.coli O157: H7 bám dính vào

các tế bào ruột của người

Một số nghiên cứu in vitro và in vivo đã điều tra sự tương tác giữa các vi khuẩn acid lactic (LAB) và khả năng miễn dịch Bằng cách gia tăng đáp ứng miễn

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của vật chủ, LAB bảo vệ vật chủ chống lại nhiễm trùng bởi các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, ngăn chặn khối u phát triển và hoạt động thực bào của các tế bào bạch cầu hạt gia tăng sau khi cơ thể được tiêu thụ

Bifidobacterium

Trong khi các vi khuẩn probiotic kích thích hệ thống miễn dịch bằng cách kích hoạt cả đại thực bào và tế bào lympho, IgA cũng gia tăng và kích thích sản xuất

IFN-γ Ngoài ra, Bifidobacterium cũng tham gia vào quá trình làm thoái hóa và thay

thế dịch nhầy của đường ruột, bảo vệ niêm mạc ruột khỏi bị ăn mòn [35]

- Hoạt tính kháng khuẩn

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh về hoạt tính kháng khuẩn của

vi khuẩn Bifidobacterium Bifidobacterium giảm sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella typhimurium , Clostridium difficile , Campylobacter jejuni ,

Escherichia coli và Shigella sp trong ruột bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng và

cho các vị trí bám dính trên bề mặt biểu mô.Ngoài ra, Bifidobacterium còn sản xuất

ra acid lactic, acid acetic hay các peptide kháng khuẩn (bacteriocin) cũng có tác dụng ức chế tác nhân gây bệnh đường ruột [35]

- Phòng ngừa và điều trị tiêu chảy

Bệnh nhiễm khuẩn đường ruột ở trẻ em có thể được ngăn chặn hoặc giảm

thiểu khi đường ruột có chứa lượng lớn vi khuẩn Bifidobacterium Tại Nhật Bản đã

điều trị thành công bệnh tiêu chảy ở trẻ em bằng cách cho chúng ăn các sản phẩm

sữa có chứa vi khuẩn Bifidobacterium

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã chứng minh vai trò của probiotic trong điều trị bệnh tiêu chảy khi sử dụng kháng sinh Thuốc kháng sinh được sử dụng để chữa trị các bệnh nhiễn khuẩn có thể làm thay đổi thành phần vi sinh đường ruột và phá vỡ sự cân bằng của hệ sinh thái đường ruột dẫn đến tiêu chảy Việc sử dụng

probiotic dạng uống (bao gồm cả Bifidobacterium) có thể giảm thiểu tác động của

kháng sinh liên quan đến sự thay đổi hệ vi sinh vật trong đường ruột và còn mang lại lợi ích trong điều trị tiêu chảy cấp tính do rotavirus và tiêu chảy mãn tính [35]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.2 Tổng quan về vi gói

Hiện nay, một trong các hướng tiếp cận mới để khắc phục những nhược điểm

về khả năng chống chịu của các chủng probiotic đối với các điều kiện về acid, muối mật trong cơ thể là thực hiện vi gói chủng probiotic trong các loại vật liệu khác nhau, một mặt vẫn đảm bảo được hoạt tính của chủng probiotic, mặt khác nâng cao khả năng sống sót của chủng probiotic khi đi qua đường tiêu hóa của người và động vật

1.2.1 Khái niệm vi gói; ưu và nhược điểm của vi gói

1.2.1.1 Khái niệm vi gói

Vi gói có thể được định nghĩa là quá trình ngậm, bao vây các tế bào vi sinh vật bằng cách phủ lên chúng một chất tạo màng (gel) thích hợp, để cô lập các tế bào với môi trường xung quanh [36], [45], [57]

Vi gói giúp duy trì sự tồn tại của các tế bào đối với các yếu tố gây hại từ môi trường như acid cao và pH thấp, muối mật, sốc lạnh gây ra bởi điều kiện của các quá trình như làm lạnh sâu và lạnh khô, phân tử oxy trong trường hợp của vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, sốc nhiệt gây ra bởi quá trình sấy phun; bacteriophage và hóa chất kháng khuẩn Một lợi thế khác của vi gói là ổn định hoặc nâng cao tính cảm quan của sản phẩm, đồng thời phân phối đồng nhất các tế bào trong toàn sản phẩm [45]

Vi gói tạo ra các hạt, gọi là vi nang Có các loại vi nang như [5]

- Vi nang đơn nhân (mononuclear microcapsule) là phần nhân bên trong nang hình thành một khối cầu rõ rệt

- Vi nang đa nhân (polynuclear microcapsule) là bên trong vi nang có chứa nhiều nhân nhỏ (vi gói trong vi gói)

- Vi nang nhiều lớp là vi nang được thiết kế với nhiều lớp bao khác nhau

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Hình 1.1 Các loại vi nang [5]

1.2.1.2 Ưu, nhược điểm của vi gói

 Ưu điểm của vi gói

Vi gói giúp bảo vệ tế bào sống, tạo ra mật độ vi sinh vật lớn, hạt vi gói bảo

vệ các tế bào sống chống chịu được điều kiện khắc nghiệt của môi trường cực đoan như acid, nhiệt độ…

Vi gói có thể làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại, từ đó giúp cho thời gian bảo quản chủng, giống tế bào vi sinh vật được lâu dài

Tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các chất ức chế trong môi trường lên men

Tạo ra các gradient nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men Từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bàotrong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau

Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là các ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi gói tế bào có ý nghĩa rất quan trọng Nó giúp cho sản phẩm khi đến tay người tiêu dùng vẫn còn nguyên giá trị sử dụng

Vi gói là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn

Bảo vệ tế bào chống lại tác nhân bacteriophage, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại [45]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

 Nhược điểm của vi gói

Tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzyme trong quá trình trao đổi chất của

nó, có những enzyme có thể xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi gói và cả chính tế bào Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật cho thích hợp (có thể biến đổi hoặc xử lý giống) để tế bào vi sinh vật không tạo ra các enzyme không mong muốn và tăng hoạt tính của các enzyme mong muốn

Đa số các vật liệu vi gói như gelatin, thạch, các loại tinh bột,…đều là các nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được Điều này khá nghiêm trọng

vì như thế vi sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài

có thể tiêu hóa lớp vi gói và làm cho lớp vi gói bị rách, thủng và như vậy hiệu quả

vi gói sẽ giảm xuống đáng kể Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi gói Vì vậy phải chọn vật liệu vi gói phù hợp cho từng nhóm đối tượng vi sinh vật

1.2.2 Các vật liệu sử dụng để vi gói

1.2.2.1 Gelatin

a Cấu tạo, nguồn gốc của gelatin

H nh 1 C u tr c hóa học của gelatin [69]

Gelatin là một protein tự nhiên được thu nhận từ sự thủy phân giới hạn sợi collagen có nguồn gốc từ da, gân, xương của động vật như da cá, da và xương

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

heo…Collagen được biến tính ở nhiệt độ cao làm tháo cấu trúc xoắn ba tạo thành các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh để tạo thành gelatin Gelatin có chứa 18 loại acid amin, có hàm lượng cao glycine (21,4%), proline (12,4%) và hydroxyproline (11,9%) [65], [68]

Có hai loại gelatin Gelatin loại A được điều chế bằng cách thủy phân trong môi trường acid, có điểm đẳng điện trong khoảng 4,8-5,0 Quy trình thủy phân bằng acid mất khoảng 7-10 ngày, nguyên liệu sử dụng chủ yếu là da động vật Gelatin loại B thu được bằng cách thủy phân xương động vật trong môi trường kiềm, có điểm đẳng điện trong khoảng 7- 9 Quy trình thủy phân bằng kiềm lâu hơn quá trình thủy phân bằng acid khoảng 10 lần do có nhiều công đoạn hơn Trên thực tế, hai loại gelatin này hoàn toàn có thể sử dụng riêng, nhưng thường được phối hợp với nhau để cho hiệu quả cao hơn Khi phối hợp với nhau, gelatin thủy phân từ xương

có chức năng tạo độ cứng, gelatin thủy phân từ da có chức năng tạo độ trong và độ dẻo dai cho vật liệu [65], [68]

Bảng 1.2 Các đặc tính tiêu biểu của các loại Gelatin

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

phẩm và y học ở tất cả các nước Gelatin có khả năng tạo màng phim bền chắc, ngay cả trong trường hợp màng phim rất mỏng đến khoảng 100µm Dung dịch có nồng độ gelatin cao đến 40% vẫn có tính linh động ở nhiệt độ 500C Độ bền gel của gelatin được biểu thị bằng độ Bloom, là một đại lượng dùng đolường độ kết dính của các liên kết chéo có trong gelatin Độ Bloom của gelatin thường phải đạt khoảng 100 -200 Bloom gram Độ nhớt của gelatin được xác định trên dung dịch gelatin 6,67%, ở 600C

Gelatin được biết đến như là một trong những môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật nên nó là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nếu có hàm lượng ẩm cao Theo quy định thì một gram gelatin phải không được chứa nhiều

hơn 1000 vi sinh vật và tuyệt đối không được có Samonella, Staphylococus, E coli

[65]

c Ưu điểm và nhược điểm của chất gói là gelatin

Ưu điểm: Rẻ tiền, thao tác đơn giản, dễ dàng, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, không độc với vi khuẩn và cơ thể người, dễ dàng bị thủy giải trong môi trường

dạ dày- ruột để phóng thích tế bào, vi gói gelatin có thể lơ lửng trong bể lên men giúp giảm chi phí khuấy trộn để phân phối đều tế bào ra khắp bể lên men,…

Nhược điểm: Gelatin dễ dàng đông đặc lại khi nhiệt độ xuống dưới 400C nên phải luôn duy trì nhiệt độ này để gelatin ở dạng dung dịch, tuy nhiên nhiệt độ cao khi bổ sung tế bào để vi gói sẽ làm chết tế bào Mất nhiều thời gian sau vi gói (gelatin sau khi vi gói phải để lạnh 6-8 giờ để gelatin đông lại hoàn toàn) Gelatin

dễ tan chảy ở nhiệt độ 400C cũng gây ảnh hưởng cho quá trình sấy khô vi gói [5] 1.2.2.2 Alginate

a Cấu tạo, nguồn gốc của alginate

Alginate là một polysaccharide dị hợp mạch thẳng, chiết xuất từ các loại tảo khác nhau, đặc biệt là tảo nâu, bao gồm các monomer β-D-mannuronic (M) và α-L-

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4– glucoside Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình 1.2) [18], [62], [66]

Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau

Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau

Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau.

Hình 1.3 C u trúc của alginate [18], [62], [66]

a) Các monomer của alginate b) Chuỗi alginate c) Sự phân bố các block

b Khả năng tạo gel của dung dịch alginate

Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thành gel đồng thể i lực của alginate đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự: Pb2+ > Cu2+ = Ba2+ > Sr2+ >Cd2+> Ca2+> Zn2+ > Co2+>Ni2+ [66] Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người ta thường sử dụng calcium để làm ion tạo gel Khi cho kết hợp với cation hóa trị II và III, thường là ion Ca2+ sẽ thấy xuất hiện các vùng nối giữa các mạch phân tử alginate và tạo gel theo mô hình “hộp trứng” Các gel này

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

được hình thành ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ <1000C và tan chảy khi đun nóng Dung dịch alginate cũng tạo gel khi bị acid hóa, nhưng loại gel này mềm hơn so với calcium gel Theo mô hình“hộp trứng” của Grant (1973) thì trong quá trình hình thành gel cần có những cơ chế liên kết giữa hai hay nhiều chuỗi alginate Chuỗi phân tử alginate cấu tạo từ các đơn vị glucoronic acid có hình dạng tương tự như một hộp đựng trứng với các nếp và khe hở mà ion Ca2+ có thể chui vào, định vị và liên kết, trong khi các ion Ca2+ giữ các phân tử alginate lại với nhau thành các chuỗi alginate Cấu trúc giữa các mạch glucoronic acid tạo khoảng cách giữa các nhóm carboxyl và hydroxyl thích hợp với một lượng lớn các liên kết của calcium [18], [25], [66]

c Ưu, nhược điểm của chất gói là alginate

Alginate có ưu điểm là dễ dàng hình thành gel xung quanh tế bào vi khuẩn, không độc hại cho cơ thể, giá thành rẻ, có thể được chuẩn bị dễ dàng và thích hợp phân giải trong ruột và giải phóng các tế bào probiotic

Tuy nhiên, nhược điểm của alginate là rất nhạy cảm với môi trường acid và mất tính ổn định ở trong môi trường có acid lactic, hình thành lỗ thủng trên bề mặt Ngoài ra, vì gel alginate được hình thành trong sự hiện diện của các ion canxi, tính toàn vẹn của nó xấu đi khi bị các ion hóa trị 1 hoặc các tác nhân hấp thụ ion canxi như phosphate, lactates và citrate [45]

Hình 1.4 Mô h nh “hộp trứng” mô tả sự gắn cation hóa trị 2 vào vị trí trên chuỗi GG [18]

Màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm và hạn chế sự thấtthoát Chitosan hòa tan trong nước ở pH < 6 và giống như alginate, tạo cấu trúc gel bằng cách gel hóa kích thích ion Chitosan là polycation chứa các nhóm amine, nên liên kết với các anion và polyanion như polyphosphate, [Fe(CN)6]4-, [Fe(CN)6]3 acid polyaldehydrocarbonic.

Chitosan được sử dụng cho các lớp phủ của viên nang do việc hình thành liên kết chéo trong sự hiện diện của anion và polyanion Thông thường, nồng độ chitosan áp dụng làm vỏ áo trên viên nang như gelatin là 0,4 Hỗn hợp chitosan và diisocyanate hexamethylene hoặc glutaraldehyde làm vững chắc viên nang hơn so với chitosan đơn thuần [45], [64]

b κ-carrageenan và hỗn hợp của nó

κ-carrageenan là hỗn hợp các polysaccharide trung tính tương tự agar -agar được chiết tách từ các loài tảo algae lớn ở biển, hòa tan trong nước hoặc trong dung dịch muối, có khoảng 4÷5% carrageenan, là polysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate Ở nhiệt độ cao (60- 900C) mới phân hủy κ-carrageenan có nồng

độ từ 2-5% Gel hóa κ-carrageenan thực hiện việc thay đổi nhiệt độ κ-carrageenan được ứng dụng trong cố định enzyme, cố định tế bào Theo Chibata và các cộng sự, κ-carrageenan là nguyên liệu tốt để cố định tế bào vi sinh vật dùng trong công

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

nghiệp sản xuất nhiều chất khác nhau Nguyên tắc: bổ sung từ từ dung dịch tạo gel (potassium chloride, hoặc các cation khác như ammonium, calcium, alumium) vào trong dung dịch muối κ-carrageenan có chứa sẵn tế bào (hoặc enzyme) sẽ thu được chế phẩm bao gói tế bào Hỗn hợp κ-carrageenan-locust bean tạo hiệu quả tốt cho sản phẩm lên men lactic (sữa chua) vì tính mẫn cảm với acid hữu cơ thấp hơn Hỗn hợp này được sử dụng rộng rãi cho vi gói probiotic trong những sản phẩm lên men Tuy vậy, việc tạo gel của hỗn hợp κ-carrageenan-locust bean lại phụ thuộc ion Ca2+,

là ion ảnh hưởng xấu đến sức sống của Bifidobacterium spp và cơ thể người Đặc

tính xuất hiện do tác động không mong muốn lên trạng thái cân bằng điện tích của chất lỏng trong cơ thể Tỉ lệ hợp lí là 2:1 cho κ-carrageenan-locust bean gum để tạo gel chắc chắn cho vi gói nhờ tương tác đặc biệt của các chuỗi galactomannan của locust với carrageenan [12], [45]

c Hỗn hợp Xanthan -gelan

Hỗn hợp Xanthan -gelan gum được sử dụng để vi gói vi khuẩn probiotic Tỉ

lệ tối ưu cho Xanthan: gelan là 1:0,75 [58] Ngược với alginate, hỗn hợp này có sức chống chịu trong điều kiện acid Cũng có thể sử dụng thêm carrageenan chứa ion K+

để ổn định cấu trúc (nhưng ion này lại có hại cho sức khỏe nếu nồng độ cao), gum

có thể được ổn định nhờ ion Ca2+ Mặc dù gelan gum có cấu trúc hạt gel để vi gói nhưng nó không được sử dụng cho mục đích này vì nhiệt độ tạo gel cần phải cao (80-900C trong 1 giờ) sẽ làm tổn thương tế bào [45], [58]

d Cellulose và các dẫn xuất của cellulose

Cellulose acetate phethalate (CAP) là hợp chất mang điện tích âm của phethalate CAP hòa tan ở pH ≥ 6, không hòa tan ở pH ≤ 5 Do có tính an toàn đối với sự tiêu hóa của người, CAP được sử dụng rộng rãi cho thuốc dạng viên nang

Ngoài ra, Bifidobacterium pseudolongum được vi gói bởi hợp chất này và bọc bằng

sáp ong, có khả năng sống sót cao hơn khi vào hệ tiêu hóa [36], [41], [45] Cellulose

vi tinh thể (Avicel) là cellulose thủy phân, sấy phun, dạng hạt, kích cỡ từ 20μm

-CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

180μm, có tính trơn khá tốt Nó còn phối hợp với silic dioxide tạo hỗn hợp cellulose-silic dioxide vi tinh thể (CsiMC) Một số dẫn xuất của cellulose nhưNatri carboxy methyl cellulose (NaCMC), Calcium CMC, Methyl cellulose và Hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) Trong đó HPMC thường sử dụng để làm vật liệu gói So với gelatin, vỏ nang HPMC có độ bền cao hơn và ít tương tác với nhân bên trong hơn Một số tính chất của HPMC như: bền về mặt hóa học, bền với nhiệt, hàm lượng ẩm thấp, ít giòn khi bị sấy mất độ ẩm, vỏ vi gói tan nhanh, hàm lượng ẩm trong vi gói thấp (4- 6%) so với gelatin (13-15%), tuy nhiên hiện nay vật liệu vi gói bằng dẫn xuất cellulose chưa được sử dụng nhiều do giá thành cao [5]

1.2.3 Các phương pháp vi gói

Từ cuối thập kỷ 80, phương pháp vi gói tế bào vi sinh vật đã được quan tâm nghiên cứu Hai phương pháp được ứng dụng rộng rãi là phương pháp nén ép (extrusion) và phương pháp nhũ tương hóa (emulsion)

Bảng 1.3 So sánh ưu, nhược điểm của phương pháp vi gói

Phương pháp nén ép Phương pháp nhũ tương

1 Tính áp dụng Không khả thi với quy

mô công nghiệp

Khả thi để áp dụng trên quy mô công nghiệp

Phương pháp này được áp dụng thành công để vi gói vi khuẩn lactic So với phương pháp nén ép, phương pháp vi gói với hệ nhũ tương có nhiều ưu điểm vượt trội, nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao hơn và chi phí nhiều hơn do cần sử dụng dầu thực

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

vật để hình thành nhũ tương Trong kỹ thuật này, pha phân tán là huyền phù tế bào- vật liệu vi gói được thêm vào một thể tích lớn dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu bắp Dung dịch trở nên đồng nhất bằng cách khuấy với tốc độ thích hợp, cho đến khi nước trong dầu hình thành hệ nhũ tương Chất nhũ hóa có thể được sử dụng để tạo hệ nhũ tương tốt hơn Tween 80 ở nồng độ 0,2% là lựa chọn tốt nhất [54] Khi đã hình thành hệ nhũ tương, thêm CaCl2 vào để tạo mầm hạt gel trong pha dầu Các hạt nhỏ hơn của phase nước trong hệ nhũ tương dầu sẽ dẫn đến sự hình thành các hạt có đường kính nhỏ hơn Tốc độ lắc của hỗn hợp và loại chất nhũ hóa sử dụng cũng là yếu tố quyết định đường kính của hạt [36]

Việc sử dụng chất nhũ hoá sẽ hình thành các hạt với đường kính nhỏ hơn, bởi vì các thành phần này làm giảm áp lực bề mặt giữa hai pha nước và dầu Khi sử dụng Tween 80 và Lauryl sulphate làm các chất nhũ hoá, có thể tạo được hạt có đường kính khoảng 25-35 µm Vi hạt sản xuất bằng phương pháp nhũ tương thường được thu bằng kỹ thuật lọc qua màng [36], [45], [54]

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu vi gói bằng phương pháp nhũ hóa

sự, 1989

L casei ssp casei 3% κ-carrageenan

và locust bean gum

B longum

Lactococcus lactic

κ-carrageenan và locust bean gum

cộng sự, 2004

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.2.3.2 Phương pháp nén ép

Trong phương pháp này, vi nang được hình thành nhờ sự tạo giọt đồng thời

và lồng vào nhau của dung dịch tế bào và dung dịch tạo vỏ nang khi chảy qua 2 ống tạo giọt đồng tâm Trong điều chế vi nang, sự nhỏ giọt không thể thực hiện bằng cách cho chảy tự nhiên nhờ vào trọng lực do các ống tạo giọt có đường kính rất nhỏ

Sự tạo giọt trong vi gói phải được thực hiện bằng cách ép các chất lỏng qua các ống đồng tâm, ở quy mô nhỏ có thể dùng bơm tiêm để ép chất lỏng qua bộ phận tạo giọt Hệ thống còn có thể được gắn thêm một thiết bị siêu âm để ngắt giọt nên có thể điều chỉnh được kích thước của vi gói [5]

Bảng 1.5 Một số nghiên cứu vi gói bằng phương pháp nén ép

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vi gói probiotic

1.2.4.1 Đặc điểm viên nang trong mối quan hệ với môi trường xung quanh

Lựa chọn đúng vật liệu vi gói liên quan đến môi trường xung quanh là rất quan trọng Ví dụ, sự thoát ra của các ion canxi từ viên nang alginate dẫn đến phân

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

hủy viên nang, vì vậy, viên nang alginate nên tránh môi trường có chứa nồng độ acid cao Tuy nhiên, trong môi trường sữa do sẵn có nồng độ ion canxi cao, sự thẩm thấu của ion canxi từ hạt gel có thể bị ức chế đáng kể, do đó giúp hạt gel duy trì được hình dạng và cấu trúc ổn định [61]

Nếu mục tiêu là tế bào probiotic đến ruột non, lựa chọn vật liệu vi gói theo cách là sự phân hủy viên nang xảy ra lệ thuộc vào pH ruột non hay các enzyme tuyến tụy Nếu các vi sinh vật phải được định cư trong ruột già, thì vật liệu vi gói phải chống lại được các điều kiện của tuyến tụy và ruột non Tuy nhiên, do sự hạn chế về đặc tính hóa học của vật liệu đóng gói nên cần phải thực hiện các phương pháp như bao thêm lớp áo bên ngoài vi nang, hoặc trộn chung các vật liệu đóng gói

để tạo nên viên nang có những tính chất mong muốn Đôi khi cần thiết phải sử dụng vật liệu kị nước để đóng gói, làm cho hạt chống lại điều kiện độ ẩm cao của sản phẩm [45], [61]

1.2.4.2 Vỏ của vi nang

Lớp vỏ của viên nang là một cách hiệu quả để cải thiện đặc tính hóa lý của viên nang Ví dụ, lớp vỏ phủ trên các viên nang alginate làm cho viên nang kháng với các tác nhân hấp thụ ion canxi, gia tăng sự bền vững cơ học của chúng Vỏ canxi clorua trên viên nang alginate, đặc biệt là nồng độ alginate cao, làm cho hạt bền vững với sự phân tầng tốt [13] Lớp vỏ này cũng không ảnh hưởng đáng kể đến

sự khuếch tán của các viên nang alginate [45], [58]

1.2.4.3 Đường kính vi nang

Đường kính vi nang là yếu tố quan trọng trong hiệu quả đóng gói Đường kính hạt gia tăng có tác dụng bảo vệ tốt tế bào chống lại các yếu tố khắc nghiệt của môi trường [61] Sultana và cộng sự (2000) nhận thấy rằng viên nang alginate với đường kính khoảng 0,5-1,0 mm làm gia tăng đáng kể khả năng tồn tại của

Bifidobacteria trong sữa chua, với pH bình thường trong suốt quá trình lưu trữ lạnh

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Tuy nhiên đường kính vi nang gia tăng hơn giới hạn cho phép sẽ ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm [45]

1.2.4.4 Điều kiện môi trường

Loại và mức độ của các yếu tố bất lợi của môi trường là các thông số quan trọng nhất làm giảm hiệu quả đóng gói Ví dụ, sức chịu đựng của viên nang trong môi trường acid thấp như sữa chua cao hơn điều kiện acid khắc nghiệt của dịch vị [57], [ 61] Hiệu quả đóng gói không chỉ chú ý các điều kiện của sản phẩm, mà còn phải quan tâm đến các tác động của đường tiêu hóa trên các viên nang trong quá trình phân phối trong cơ thể [45]

1.2.5 Hoạt động của vi gói đến hoạt động của tế bào vi sinh vật và quá trình lên men

Trong hạt vi gói tế bào vi sinh vật, tác nhân hoạt động của hạt là tế bào sống Tác nhân này được ngăn cách với môi trường bên ngoài bằng lớp vỏ Lớp vỏ này làm giảm tương tác giữa vi sinh vật và môi trường, làm giảm ảnh hưởng của môi trường đến vi sinh vật bên trong và cũng hạn chế ảnh hưởng của vi sinh vật đến môi trường ngoài, tùy thuộc vào tính chất hạt vi gói

Tuy nhiên, bản chất lớp vỏ vi gói là một lớp màng thấm được (gel nước) nên với cơ chế thẩm thấu, khuếch tán, tương tác giữa môi trường vẫn xảy ra với cường

độ khác nhau cho từng trường hợp vi gói khác nhau Do đó, tùy vào tính chất hạt vi gói, vi sinh vật vẫn hoạt động chuyển hóa, hấp thu cơ chất từ môi trường và khuếch tán sản phẩm trao đổi chất ra ngoài [16], [28], [32] Ngoài ra, khi được đặt trong môi trường thuận lợi, sự phóng thích phần lõi sẽ xảy ra Tế bào vi sinh vật khi đó được giải phóng và bắt đầu hoạt động toàn phần Cơ chế giải phóng bắt nguồn từ sự xuất hiện của các tác nhân hóa lý, cơ học hay sinh học, chúng hòa tan hay phá vỡ một phần vỏ, giải phóng tế bào, thường là do sự thay đổi pH, áp suất cơ học, hoạt động của enzyme, áp suất thẩm thấu, thời gia lưu trữ [28]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi gói vi khuẩn probiotic

Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp vi gói vi khuẩn probiotic từ đó ứng dụng sản xuất các loại sản phẩm khác nhau Khalil và Mansour (1998) đã sử dụng cả dạng tế bào tự do và dạng vi gói của

hai chủng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum và Bifidobacterium infantis trong sản

phẩm mayonnaise probiotic Sự tồn tại của Bifidobacterium và ảnh hưởng của nó

đến chất lượng mayonnaise được đánh giá Kết quả thử nghiệm ghi nhận rằng các

tế bào vi khuẩn tự do không còn tồn tại sau 2 tuần, nhưng B bifidum trong hạt vi gói sống sót sau 12 tuần và B infantis sống sót sau 8 tuần Mayonnaise trong

nghiên cứu này có pH là 4,42 (do sự hiện diện của acid acetic) trong suốt 4 tuần lưu trữ Mayonnaise chứa hạt vi gói Bifidobacterium có tổng số vi khuẩn thấp hơn so

với phương pháp khác Nấm men và nấm mốc chỉ bắt đầu xuất hiện sau 12 tuần lưu

trữ đối với mayonnaise chứa hạt vi gói Bifidobacterium và sau 6 tuần với các mẫu khác ( mẫu đối chứng, mẫu chứa các tế bào Bifidobacterium tự do) Mayonnaise có chứa hạt vi gói Bifidobacterium có lượng acid cao hơn và tính chất cảm quan của

sản phẩm cũng được cải thiện [34]

Kebary và cộng sự (1998) cũng báo cáo rằng vi gói trong alginate hoặc

κ-carrageenan giúp cải thiện đáng kể sự tồn tại của Bidobacterium bifidum và

B.infantis trong sữa đông lạnh trong suốt thời gian lưu trữ (ở -200C trong 10 tuần)

từ 43-44 % đến khoảng 50-60% và Bifidobacterium được vi gói trong alginate sống sót cao hơn so với vi gói bằng κ-carrageenan Số lượng Bifidobacterium trong hạt vi

gói sống sót trong sản phẩm sau 10 tuần lưu trữ cao hơn (6,1-8,9 x107 CFU/g) so với lượng vi khuẩn cần có để đạt được các hiệu quả trong liệu pháp điều trị bằng probiotic ( > 106 CFU/g) [33]

Sultana và cộng sự (2000) thực hiện vi gói Lactobacillus acidophilus và

Bifidobacterium spp bằng hỗn hợp canxi alginate- tinh bột và đánh giá các tác động

của vi gói đối với khả năng sống sót của L acidophilus và Bifidobacterium spp

trong sữa chua trong 8 tuần lưu trữ ở 40C Nghiên cứu này chứng minh rằng sự sống

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

sót của L acidophilus và Bifidobacterium spp trong hạt vi gói tốt hơn so với sự tồn

tại của tế bào tự do [57]

Ozer và cộng sự (2009) nghiên cứu bổ sung vi gói Bifidobacterium bifidum BB-12 và Lactobacillus acidophilus LA-5 bằng cả hai kỹ thuật nhỏ giọt và nhũ

tương hóa vào pho mát trắng Cả hai kỹ thuật vi gói đều có hiệu quả trong việc giữ

số lượng vi khuẩn probiotic cao hơn mức tối thiểu sử dụng trong liệu pháp điều trị bằng probiotic ( > 107 CFU/g) Trong khi số lượng vi khuẩn probiotic giảm khoảng

3 log trong mẫu pho mát đối chứng sử dụng các tế bào tự do, mẫu pho mát có chứa các tế bào vi gói giảm khoảng 1 log Các chuỗi acid béo tự do dài và trung bình có trong pho mát chứa tế bào vi gói cao hơn nhiều trong các mẫu pho mát đối chứng Tương tự, trong pho mát chứa hạt vi gói có lượng acetaldehyd và diacetyl cao hơn

so với các mẫu pho mát đối chứng và đặc tính cảm quan không có gì khác biệt so với mẫu đối chứng [47]

Hiện nay tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về probiotic, tuy nhiên chưa định hướng phát triển tạo sản phẩm thực phẩm chức năng cho người mà chỉ dừng lại ở bước phân lập những chủng có hoạt tính probiotic cao và sản xuất chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi Các nghiên cứu gần đây về vi gói probiotic ứng dụng trong thực phẩm có thể kể đến là:

Tác giả Nguyễn Lưu Huyền Trang (2009) đã thực hiện đề tài “Khảo sát hiệu quả vi gói vi khuẩn lactic nhằm nâng cao hoạt tính probiotic và ứng dụng lên men sữa chua đậu nành” với mục đích khảo sát hoạt lực lên men, hiệu quả probiotic của

chế phẩm vi gói vi khuẩn lactic Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus

thermophilus bằng gel Na-alginate với phương pháp nén ép và ứng dụng trong lên

men sữa chua đậu nành Kết quả cho thấy rằng chế phẩm vi gói 1 mm giữ được hơn 30% tế bào sống sót bên trong nó trong khoảng thời gian 60 phút Hoạt lực lên men của vi gói vi khuẩn không khác biệt so với tế bào tự do Vi gói có kích thước 1mm lên men tối ưu ở 420C trong 9 giờ với mật độ tế bào khởi động là 5x105 tế bào/ml

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Vi gói cải thiện đáng kể thời gian bảo quản sản phẩm cuối, tăng 2 lần khi so sánh với sản phẩm lên men bằng tế bào tự do truyền thống [7]

Tác giả Bùi Hà Tuyết Vi (2010) đã tiến hành thử nghiệm vi gói vi khuẩn

Lactocbacillus bulgaricus bằng gel gelatin kết hợp alginate bằng phương pháp nhũ

tương, sau đó khảo sát hoạt lực lên men, hiệu quả probiotic của chế phẩm vi gói và ứng dụng trong lên men sữa chua Kết quả xác định được nồng độ tối ưu của gelatin là 10% và alginate là 2%, tạo ra hạt có kích thước nhỏ 0,4-0,5mm chứa 0,9x108 tế bào/g Chế phẩm vi gói này bảo vệ vi khuẩn tốt hơn so với tế bào tự do trong các khoảng thời gian khảo sát, đồng thời ứng dụng trong lên men sữa chua, chế phẩm này có sự tương đồng so với tế bào tự do về hoạt lực lên men, tạo sản phẩm có chất lượng cảm quan khá tốt [9]

Tác giả Liêu Mỹ Đông (2012) đã thực hiện đề tài “Cải thiện khả năng sống

của Bifidobacterium bifidum bằng phương pháp vi gói và các tác nhân kháng lạnh

để ứng dụng pháp triển một số sản phẩm sữa synbiotic” bằng cách thực hiện vi gói

vi khuẩn B.bifidum trong Ca-alginate (CA), Ca-alginate kết hợp xanthan gum

(CAXI) và Ca-alginate được bao phủ bằng xanthan gum (CAXII) Ảnh hưởng của mật độ tế bào, prebiotic( FOS) và các chất kháng lạnh (fructose, glycerol, sữa gầy)

lên khả năng sống sót của B.bifidum trong môi trường dạ dày nhân tạo và trong suốt

quá trình bảo quản sữa chua synbiotic và kem synbiotic được khảo sát thông qua hai nội dung chính là lựa chọn chất mang và lựa chọn chất kháng lạnh Các kết quả thu được chỉ ra rằng cách thức vi gói tạo chế phẩm CAXII cải thiện đáng kể khả

năng sống sót của B.bifidum khi so sánh với hai chế phẩm CA và CAXI Các tác

nhân kháng lạnh khi bổ sung vào quá trình vi gói đã có những ảnh hưởng khác

nhau lên khả năng sống của B.bifidum Mẫu sữa chua và kem synbiotic có bổ sung

chế phẩm vi gói không gây ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị của sản phẩm Sữa chua synbiotic sau 9 tuần bảo quản có mật độ tế bào đạt khoảng 7,7 log CFU/ml, kem synbiotic có mật độ khoảng 7,5 log CFU/ml sau 180 ngày bảo quản [1]

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

1.4 Tổng quan về chanh dây

1.4.1 Nguồn gốc chanh dây

Chanh dây còn có tên gọi khác là lạc tiên, chanh leo, mát mát, dây mát…

Tên khoa học là: Passiflora edulis Thuộc họ Passifloraceae, bộ Violales Chi

Passiflora hiện có hơn 400 loài, trong đó có khoảng 60 loài cho trái ăn được

Chanh dây là loài cây leo nhiệt đới, có nguồn gốc từ nam Brazil, sau đó được mang sang Úc và Châu Âu từ thế kỷ 19 Là loại cây ăn trái có triển vọng ở các nước đang phát triển Ở Việt Nam, chanh dây được trồng nhiều ở Đà Lạt, Đồng bằng sông Cửu Long ( Cần Thơ, An Giang, Kiên Giang)

1.4.2 Đặc điểm hình thái

Thân cây có dạng dây leo mảnh, khá dài Rễ mọc cạn Thân mềm, hình ống

có rãnh dọc, nhiều lông thưa Lá mọc so le, chia làm 3 thùy, phiến lá dài 7.5-20 cm : mặt trên màu lục sậm nhẵn bóng, mặt dưới nhạt hơn và hơi nhám Mép có khía răng; gốc lá hình tim có 2 tuyến nhỏ, đầu nhọn Gân lá chẻ 3 từ gốc Lá kèm nhọn hình mác, lá bắc hình elip, tua cuốn mọc ở kẽ lá

Hình 1.5 Hoa và trái chanh dây

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

Hoa đơn tính, mọc từ nách lá, mùi thơm dịu, mọc xòe rộng, lớn 5-7cm, có cuống dài, màu trắng hồng, phần giữa màu tím Mỗi hoa mang 5 nhị đực với 5 chỉ nhị dính nhau thành ống ở đáy và tách rời ở phần mang bao phấn

Quả mọng, hình cầu hay bầu dục, lớn từ 4,5-7 cm, màu tím sậm hay vàng chanh, vỏ quả trơn láng bóng Vỏ quả mỏng, cứng, trung bì màu xanh, nội bì màu trắng Quả chứa đến 250 hạt nhỏ Hạt có áo bọc màu vàng cam

1.4.3 Thành phần dinh dưỡng của chanh dây

Quả chanh dây có thành phần dinh dưỡng rất phong phú Theo Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ (USDA), trong 100g thành phần ăn được của quả chanh dây tím chứa:

ảng 1 Thành phần dinh dưỡng của chanh d

1.4.4 Công dụng của chanh d

Quả chanh dây được chế biến làm thức ăn tương đối dễ dàng Khi ăn tươi chỉ cần cắt đôi theo bề dọc và dùng thìa để xúc phần thịt có lẫn hạt Tại Australia, phần

CHƯƠNG 1 TỔNG U N T I IỆU

thịt có cả hạt được ăn với đường và kem hay trộn vào salad, yogurt hay dùng làm nước uống Tại các nơi khác, phần thịt được bọc trong 2 lớp vải thô và ép qua một máy ép để loại hạt Dịch ép thu được, hay nước cốt tự nhiên có thể thêm đường để tạo vị ngọt hay pha loãng với nước, hoặc với nước ép từ các loại trái cây khác (thích hợp nhất là pha với nước cam hay nước dứa) để làm nước giải khát Tại Nam Phi, nước ép chanh dây được pha trộn với sữa và thạch từ rong biển [46]

Dịch ép từ quả dây mát có thể đun cô đặc thành một dạng si-rô để sau đó dùng làm nước sốt, món thạch tráng miệng, kẹo, kem, làm nhân bánh…hay pha trộn trong các loại cocktail Phần thịt có hạt được chế biến thành thạch, hay trộn với dứa (thơm) hay cà chua để làm mứt [46]

Nhiều quốc gia trên thế giới đã sử dụng phần vỏ và tách riêng hạt để dùng trong công nghiệp Tuy trong phần vỏ của quả chanh dây chỉ có khoảng 2,4 % pectin nhưng tại Fiji, mỗi năm các nhà sản xuất đã thu hồi được đến 5 tấn pectin giúp giảm lượng chất thải Phần còn lại chứa khoảng 5-6 % protein, được dùng làm chất độn thêm trong thực phẩm cho gia súc và gia cầm Tại Hawaii, pectin không được thu hồi, nên phần vỏ được băm vụn, sấy khô rồi trộn với mật mía hay ủ chua

để làm thức ăn chăn nuôi bò, heo

Hạt chanh dây cung cấp khoảng 23% dầu, có dạng tương tự như dầu hướng dương và dầu đậu nành, có thể dùng nấu ăn và có thể dùng trong kỹ nghệ sơn, véc

ni Mỗi năm các nhà máy ở Fiji ép được đến 13.000 lít dầu Phần bã còn lại tuy chứa đến 12% protein và 50- 55% chất xơ nhưng không thích hợp để làm thức ăn chăn nuôi gia súc [46]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

THÍ NGHIỆM

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

2.1 Trang thiết bị, hóa chất, vật liệu

2.1.3 Vật liệu

Giống vi khuẩn Bifidobacterium longum có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi

sinh vật của Phòng thí nghiệm vi sinh vật, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

Cách thu dịch chanh dây: lựa những quả chanh dây vỏ ngoài hơi nhăn, rửa sạch, cắt quả làm đôi, dùng muỗng nạo khối ruột quả màu vàng, ủ với enzyme pectinase (Sigma), hàm lượng 0,25%, trong 3 giờ, nhiệt độ 40-450C Sau đó tiến hành dùng khăn mịn nhiều lớp lọc thu dịch

2.2 Nội dung thí nghiệm

2.2.1 Sơ đồ nội dung thí nghiệm