Luận văn tốt nghiệp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) của thuốc natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E.. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và ngh

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH SÁCH HÌNH 3

DANH SÁCH BẢNG 4

LỜI CẢM TẠ 5

TÓM TẮT 6

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 7

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

2.1 Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra 9

2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri 9

2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E ictaluri 9

2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 10

2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila 10

2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc 10

2.2.3 Hình dạng tế bào 10

2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila 11

2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila 11

2.3 Cây thảo dược 12

2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược 12

2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và công dụng phòng trị bệnh thủy sản 12

2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản 13 2.4 Natsol 14

2.5 Chloramphenicol 14

2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc kháng sinh thảo dược 14

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 16

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Vật liệu nghiên cứu 16

3.2.1 Hoá chất và môi ttrường 16

3.2.2 Thuốc kháng sinh 16

3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 16

3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu 17

3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn 17

3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh 18

3.3.2 Thực hiện nghiên cứu 20

3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò 20

3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ 21

3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch (Lila Ruangpan, 2004): 22

3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002): 23

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra 25

4.2 Xác định nồng độ MIC 26

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E ictaluri và A

hydrophila 27

4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila bằng phương pháp pha loãng 28

4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A hydrophila 28

4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri 30

4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila bằng phương pháp thạch .32

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề xuất 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn 41

Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn 42

Phụ lục C: Pha môi trường 43

Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý và pha môi trường NB 44

Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol và natsol 45

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.3: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A hydrophila (Đĩa

đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)) 34

Hình 4.4: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A hydrophila (Đĩa

đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)) 34

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương

pháp pha loãng hai lần 18

Bảng 3.2: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn

theo phương pháp pha loãng hai lần .19

Bảng 3.3: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi

khuẩn) .19

Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi

khuẩn) .20

Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc

Natsol trên vi khuẩn E ictaluri 26

Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc chloramphenicol trên E coli 27

Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy của thuốc natsol bằng đĩa kháng sinh tự chế 28 Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh natsol trên vi

khuẩn A hydrophila ở chủng CAF2 .29

Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn A

Bảng 4.10: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn A hydrophila với

các đĩa môi trường 5, 6, 7 ứng với các nồng độ 1500; 750; 375ppm 32

Bảng 4.11: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn E ictaluri với các

đĩa môi trường 6, 7, 8 ứng với các nồng độ 750; 375; 187,5ppm 33

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Cảm ơn bạn bè trong lớp cũng như bạn bè khác lớp đã tận tình trao đổi với tôi những kiến thức khiếm khuyết và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã nuôi dạy tôi và tạo điều kiện cho tôi ăn học Tôi có được thành quả như ngày hôm nay thì không thể kể hết công

ơn trời biển của cha mẹ đã dành cho tôi

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Thí nghiệm thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật

natsol lên vi khuẩn E ictaluri và xác định được khoảng nồng độ ức chế của natsol lên vi khuẩn E ictaluri là 50-100ppm

Thực hiện nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật natsol bằng ba phương pháp:

 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp lập kháng sinh đồ, nhưng qua thí nghiệm trên thuốc natsol không cho kết luận gì

 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng,

xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E

ictaluri là 93,75ppm và lên vi khuẩn A hydrophila là 375ppm

 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp thạch, xác

định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E

ictaluri là 187,5ppm và lên vi khuẩn A hydrophila là 750ppm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi

phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Từ những năm 1998-2000 thành công trong nghiên cứu “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá tra thương phẩm” của Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ, đẩy mạnh phong trào nuôi cá tra thương phẩm phát triển ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng Theo Dương Nhật Long (2006) thì sản lượng cá tra năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 đạt 220.000 tấn, năm 2004 đạt trên 300.000 tấn, năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn Song bên cạnh mặt thuận lợi còn tồn tại những vấn đề khó khăn, đó là tình hình bệnh trên cá tra nuôi Trong nhiều năm qua người nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do dịch bệnh xảy ra, như bệnh đốm đỏ, trắng da,

phù đầu phù mắt, bệnh do ký sinh trùng ngoại ký sinh…(Ferguson & ctv,

2001) Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) bệnh trắng gan (còn gọi là bệnh mủ

gan) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) gây ra là bệnh phổ biến,

xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra, gây thiệt hại nghiêm trọng trong nuôi cá tra thâm canh Mặt khác, bệnh đốm đỏ (còn gọi là bệnh xuất huyết) do vi khuẩn

Aeromonas hydrophila (A hydrophila) gây ra trên nhiều loài cá nước ngọt

trong đó có cá tra nuôi (Từ Thanh Dung, 2005)

Từ Thanh Dung (1996) cho rằng bệnh vi khuẩn là một vấn đề quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản, việc điều trị chủ yếu bằng hoá chất hoặc sử dụng thuốc kháng sinh penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracylin, tetracylin Tuy nhiên sử dụng hoá chất phòng và trị bệnh vi khuẩn trong thời gian dài, đặc biệt là kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, như giá thành các loại thuốc kháng sinh cao, lại gây ra hiện tượng kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh, làm giảm hiệu quả phòng và trị bệnh về sau Thêm vào đó là vấn đề ô nhiễm môi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản… ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ người tiêu dùng Theo Direkbusarakom (1995), một giải pháp phòng trị khác là

sử dụng cây thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn trong thuỷ sản, tuy hiệu quả không nhanh chóng nhưng khắc phục được những khó khăn đã gặp khi sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh Vì vậy, ở Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ… kể cả Việt Nam, một vài cây thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dùng làm dược phẩm cho người và gia súc, cũng được thử nghiệm làm thuốc trị bệnh trong

ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994) Chất chiết cây đậu (Clinacanthus nutans) ức chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

(Direkbusarakom & ctv, 1995) Theo Kamei (1988) cho rằng chiết suất thảo dược từ cây ổi (Psidium guajava) phòng trị được bệnh vi rút như IHNV, IPNV,

OMV trên cá Từ Thanh Dung (1996) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của

cây thảo dược lên vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai (Clarias macrocephalus x C.gariepinus) Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu

khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra bằng thảo dược Vì vậy, để làm phong phú thêm cho phương pháp điều trị cũng như làm đa dạng danh mục

thuốc phòng trị bệnh cho cá là lý do chính để đề tài “Xác định nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E

ictaluri và A hydrophila” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A

hydrophila và E ictaluri

Nội dung nghiên cứu

Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng và môi

trường thạch trên vi khuẩn A hydrophila và E ictaluri

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra 2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri

Theo Hawke & ctv (1981) E ictaluri là loài thuộc Enterobacteriaceace, gram

âm, hình que ngắn, kích thước 0,75x1,5-2,5µm, di động yếu ở 25-300C, không

di động khi nhiệt độ cao hơn Catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính

và lên men glucose Không sinh H2S và indole âm tính Vi khuẩn E ictaluri

phát triển trên môi trường TSA (trypton soya agar) chậm 36-48 giờ tại 18-280C

Giống vi khuẩn Edwardsiella còn phát triển tốt trên môi trường BHI (brain

heart infusion) và môi trường TSA, vi khuẩn có dạng khuẩn lạc nhỏ màu xanh

có nhân đen trên môi trường EIA (E ictaluri agar) (Từ Thanh Dung, 2005)

Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E ictaluri ở vật kính 40X

(gram âm – hình que)

2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E ictaluri

E ictaluri có thể truyền bệnh qua môi trường nước, đất và các động vật khác

Vi khuẩn E ictaluri là mầm bệnh nguyên thuỷ trong ngành nuôi cá nheo Mỹ Bệnh do vi khuẩn E ictaluri được chuẩn đoán ở vùng nuôi cá da trơn tại

Mississippi, Arkanas, Alabana, Louisiana, Georgia và Florida Theo Hawke &

ctv (1998), bệnh cũng thường xuyên xảy ra ở Virginia, Texas, Idaho, Kentucky,

California, Arizona và Maryland Ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sau đó, bệnh lây lan sang các

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vùng lân cận Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh ven biển mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng

(Từ Thanh Dung & ctv, 2004) Bệnh mủ gan chủ yếu xuất hiện trên cá tra (ở tất

cả các giai đoạn phát triển), thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa Tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại lớn nhất về kinh tế ở giai đoạn cá tra thịt

cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung & ctv, 2004)

2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila

A hydrophila là vi khuẩn gram âm hình que, được tìm thấy trong môi trường

nước, gây bệnh trên động vật có xương sống máu lạnh và động vật hữu nhũ, tồn

tại tự do trong nước (Ho & ctv, 1990) A hydrophila là mầm bệnh chủ yếu của

động vật thủy sản vùng nước ngọt, động vật trên cạn và kể cả con người (Bùi Quang Tề, 2006)

Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila ở vật kính 40X

(gram âm – hình que)

2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc

A hydrophila có thể sống đơn độc trong hầu hết các môi trường Khuẩn lạc của

vi khuẩn A hydrophila là những cụm màu vàng, hình tròn, như mặt trăng, nổi

(Từ Thanh Dung, 2005)

2.2.3 Hình dạng tế bào

A hydrophila có những đặc trưng sau: gram âm, que thẳng, kích thước khoảng

0,5x1,4-4,0µm, có roi ở cực cơ thể, kỵ khí, lên men cacbonat hình thành acid hoặc khí gas, sản phẩm của 2,3-butandiol, oxydase dương tính, khử nitrat (Shotts & Rimler, 1973)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila

Thông thường, bệnh rất dễ phát sinh do kết quả tương tác giữa vật chủ, mầm bệnh và môi trường Mặc dù khi điều kiện môi trường không thích hợp là nguyên nhân chính của tác nhân gây bệnh nhiễm trùng, thì tác nhân ngẫu nhiên

và tác nhân cơ hội chỉ có thể là nguyên nhân mầm bệnh khi cả hai yếu tố tình trạng sinh lý của vật chủ và điều kiện môi trường của hệ thống nuôi không thích hợp (Subasingha, 1995)

Bệnh xuất huyết do A hydrophila có thể lây truyền qua nước, từ cá bệnh sang

cá khỏe, cá tạp làm thức ăn nhân tạo, và kết hợp động thực vật ký sinh bên ngoài và bên trong cơ thể (Newman, 1993) Các yếu tố gây sốc như mật độ nuôi cao, thức ăn thừa, áp suất nước cao, nồng độ oxy hòa tan thấp, nghèo dinh

dưỡng là nguyên nhân cá dễ mắc bệnh (Shotts & ctv, 1972)

Vi khuẩn A hydrophila tồn tại trong môi trường nuôi, đặc biệt ở trong nước có

hàm lượng hữu cơ cao (Snieszko & Axelrod, 1971) Vi khuẩn có thể tồn tại bên ngoài cơ thể cá khỏe (Trust & Sparrow, 1974) Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ độc

của vi khuẩn Giống A hydrophila sống đơn độc trong nước lây truyền với hàm

lượng vi khuẩn thấp trong cá bệnh và mồi câu tôm nước ngọt Một vài chủng vi

khuẩn của A hydrophila có độc tố ngoại lệ đối với cá, không có độc khi vi

khuẩn yếu đi

A hydrophila có thể xâm nhập qua những tổn thương do ký chủ trung gian

Nhiều trường hợp bệnh bộc phát có liên quan đến yếu tố gây sốc, chẳng hạn hàm lượng oxy hoà tan thấp kết hợp với khí ammonia và khí cacbonic cao, làm

tăng áp suất nước và nồng độ nitrat Cá càng trở nên nhạy cảm với A

hydrophila (Pai & ctv, 1995)

2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A hydrophila

Triệu chứng của bệnh này giống triệu chứng của các bệnh xuất huyết do vi khuẩn khác, chỉ khác ở bốn điểm phổ biến: nhạy với độ độc thấp, hình dạng

phù và hình dạng vết loét Biểu hiện bệnh xuất huyết ở cá chép (Cyprinus

carpio) là những đốm đỏ trên thân, ở cá trê lai thì bị phù (Rogers & Burke,

1981)

A hydrophila gây bệnh trên nhiều loài cá: cá lóc (Ophicephalus striatus)

(Bloch), cá trê (Clarias batrachus), cá diếc (Glossogobius giurus) (Hamilton),

cá hồi đốm đen (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum) (Lio-Po & ctv, 1992)

Bệnh phù xảy ra ở cá trê lai cỡ nhỏ Tonguthai & ctv (1993) tìm thấy nguyên nhân của bệnh này là A hydrophila, Vibrio sp, và Pseudomonas sp với các triệu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

chứng lâm sàng: xuất huyết, phù, sưng tấy ở vây ngực, tác nhân quan trọng nhất

là vi khuẩn A hydrophila, gây thiệt hại nhiều cho người nuôi thủy sản

2.3 Cây thảo dược 2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược

Thảo dược là những cây có hương thơm ở chồi, lá, hoa, hạt và rễ được dùng

làm hương liệu, gia vị hoặc làm thuốc theo từng mục đích (Eisenbrand & ctv,

1992) Cây thảo dược là một cây mềm, mộng nước, hầu hết phát triển từ hạt, không phát triển từ thân gỗ, xơ cứng dai Một vài thảo dược như hương liệu làm nước giải khát có thể tìm thấy trong tự nhiên nhưng hầu hết thảo dược được trồng và rất sạch Chúng được sấy khô và dự trữ làm hương liệu cho năm Thảo dược làm thuốc chữa bệnh cả cây hoang dã lẫn cây được trồng đều tốt và được sấy khô hoặc chế biến kỹ

Từ xưa đến nay, trong thủy sản đã sử dụng thuốc từ thực vật (Sivarajan & ctv,

1994) Cách đây hàng ngàn năm khai hóa, từ Ai Cập, Trung Quốc, Ấn Độ, Ả Rập, Ba Tư, các tài liệu đã ghi chép các bằng chứng về sự hiểu biết tinh vi và lý luận truyền thống với việc trồng những cây thảo dược và cây gia vị

Đặc biệt là trong chế biến làm thức ăn, vì chúng giàu dinh dưỡng và có tính sát khuẩn tốt cho sức khỏe Hàng trăm cây thảo dược và gia vị được dùng làm thuốc và mỹ phẩm, dùng trong giặt rửa và tắm gội, hun khói trong nhà và theo

mục đích tín ngưỡng (Eisenbrand & ctv, 1992)

Theo Đỗ Tất Lợi (1991) có trên 600 loài cây thuốc ở Việt Nam, Hà (1993) báo cáo kết quả ban đầu trên cây thuốc là phòng và điều trị được bệnh trên cá và tôm ở Việt Nam Hầu hết chiết suất thảo dược cho kết quả chống lại vi khuẩn ở một vài bệnh cá và tôm nhưng phương thức chiết suất, cô đặc cho điều trị chưa hoàn thiện

2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và công dụng phòng trị bệnh thủy sản

+ Cây đinh hương (Eugenia caryophyllus)

Cây đinh hương được sử dụng làm hương liệu kích thích như là vị cay của ớt, làm gia vị nêm và làm dầu xông hơi Cây đinh hương dùng làm thuốc chữa bệnh Dầu đinh hương dùng trong công nghiệp hương thơm và làm xà phồng, cũng như làm thuốc giảm đau, đặc trị đau răng (Trease & Evans, 1973)

+ Cây xuyên tâm liên (Andrographus panicullata)

Cây xuyên tâm liên có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thủng, ức chế vi khuẩn, tăng cường hiện tượng thực bào của tế bào bạch cầu, dùng trị bệnh viêm ruột cho cá trắm cỏ (Bùi Quang Tề, 2006)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

+ Cây nhọ nồi (Eclipta alba)

Cỏ nhọ nồi có tác dụng cầm máu, không gây tăng huyết áp, không làm giản

mạch ở người, điều trị viêm gan (Dixit & Achar, 1979) Eclipta alba có tác

dụng trong điều trị tổn thương gan và vết bổng (Từ Thanh Dung, 1996)

Kết quả thử tác dụng của cao tách chiết thảo dược cao nhọ nồi có tác dụng với

3 vi khuẩn V harveyi, V alginolyticus và A hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006) + Cây chó đẻ (Phyllathus debilis)

Cây chó đẻ có tác dụng kháng sinh, chữa đinh râu, đau mắt, mụn nhọt… ở

người Đã thử nghiệm tác dụng kháng sinh với vi khuẩn A hydrophila, E tarda

gây bệnh hoại tử ở cá trê, vòng kháng khuẩn 11-20mm (Bùi Quang Tề, 2006)

+ Cây tỏi (Allium sativum)

Kết quả thử cao tách chiết thảo dược từ tỏi có tác dụng với 6 loài vi khuẩn:

Vibrio parahaemolyticus, V harveyi, V alginolyticus, A hydrophila, E tarda, Hafnia alvei) gây bệnh cá nước ngọt, lợ mặn Tỏi tách chiết thành cao dầu phối

chế thành thuốc chữa bệnh tôm cá, có tác dụng phòng trị bệnh xuất huyết, hoại

tử nội tạng (bệnh đốm trắng) do vi khuẩn cho cá tra nuôi Kết quả chế phẩm phối chế từ hoạt chất tách chiết của tỏi và sài đất có tác dụng phòng trị bệnh ăn

mòn vỏ kitin do vi khuẩn Vibrio spp cho tôm nuôi (Bùi Quang Tề, 2006)

2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản

Từ Thanh Dung (1996) đã kiểm tra tính nhạy của 8 loài chiết suất thảo dược

trên 6 chủng vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá trê lai (Clarias batrachus

x C.gariepinus) Kết quả chỉ có 2 loại thảo dược nhạy: Phyllanthus debitis (PD)

và Eugenia caryophyllus (EC) Đồng thời đã xác định nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) của cao bột PD là 10.000µg/l, của chiết dầu EC là 1.000µl/l Căn cứ vào kết quả MIC và nồng độ gây chết LC50, thử nghiệm được tiến hành trên bể nuôi

để đánh giá khả năng ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng huyết do Aeromonas trên cá

trê bằng cách ngâm vào thức ăn hoặc phương pháp tắm Đối với EC, dễ dàng ngâm thuốc vào thức ăn với hàm lượng dưới 10ml/kg thức ăn, vì vậy hàm lượng EC cô đặc trong thức ăn là 1ml/kg thức ăn (khoảng giá trị nồng độ nhỏ nhất MIC) Còn PD, khoảng giá trị MIC trong thức ăn là 10g/kg thức ăn và khoảng MIC trong phương pháp tắm giảm 10 lần chỉ dùng 1.000µg/ml

Theo Goujun Yin và ctv (2005) đã kiểm tra ảnh hưởng của 2 loại thảo dược

Astragalus radix và Scutellaria radix lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu ở

cá rô phi (Oreochromis niloticus) Cả Astragalus radix và Scutellaria radix đều

có khả năng điều chỉnh hệ thống miễn dịch bẩm sinh của cá rô phi Thức ăn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

chứa 0,1% và 0,5% Astragalus radix trong 1 tuần đều làm tăng hoạt động của

lisozyme và kích thích thực bào sau 3 tuần, tuy nhiên hoạt động hô hấp của tế

bào thực bào không tăng Khi cho cá rô phi ăn Scutellaria radix với liều lượng

cao thì hoạt động hô hấp và thực bào bị ức chế, lisozym không hoạt động Kết quả thí nghiệm sai khác không đáng kể giữa 2 loại thức ăn với những nồng độ

khác nhau của cả 2 loại cây thảo dược Liều tốt nhất của Astragalus radix là

0,1% và 0,5% trong 3 tuần Việc cần làm là xác định liều kích thích và thời

gian cho ăn tốt nhất của Scutellaria radix

2.4 Natsol

Natsol là chất chiết suất từ cây tự nhiên, là sản phẩm của công ty BIOFLAVONOIDS Natsol là dung dịch dạng tinh dầu, trong, hơi vàng như mật ong

Natsol có tác dụng ngăn chặn các bệnh khác nhau của vi khuẩn và nấm Natsol được mở rộng sử dụng ở Ấn Độ 3 năm trước và thành công trong bước đầu điều trị bệnh thối chủy, thối mang, cụt phụ bộ Ngoài ra Natsol còn dùng điều trị bệnh vi rút trên tôm cá Thành phần gồm flavonon sinh học và không có chứa kim loại, hóa chất hay độc tố

2.5 Chloramphenicol

Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học hay do con người tổng hợp nên Có tác động một cách riêng biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn, nấm và vi rút (Lê Thị Kim Liên, 2007) Ngoài ra, theo Bùi Thị Tho (2003) cho rằng kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn ngừa vi khuẩn nhân lên bằng tác động ở mức độ phân tử hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

cymbopogon citrates, eupatorium odoratum, garcinia mangostana, hibiscus sabdariffa, houttuynia cordata, lawsonia inermis, lycopersicon esculentum, murdennia lorifomis, psidium guajava, senna alata, senna occidentalis, senna siamea, tagetes erecta) lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch Kết quả cho thấy 13 loại

thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên môi

trường thạch Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất,

với giá trị MIC nhỏ nhất (39ppm) Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược

này trên cả hai loài vi khuẩn thì bằng nhau Kumar & ctv (2007) cũng tiến

hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thảo dược lên hai loài vi

khuẩn Probionibacterium acnes và Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus, eclipta alba, coscinium fenestratum,

curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha piperita, pongamia pinnata, symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale Qua phương pháp thạch có 7 loại thuốc cho kết

quả ức chế sự phát triển của hai loài vi khuẩn này trên môi trường thạch Và

qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium

fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất Giá trị MIC trên

hai loài vi khuẩn là 49ppm

Supayang & ctv (2005) kiểm tra tác dụng của ethyl acetate và n-butanol chiết suất từ vỏ quả Punica granatum lên E coli O157:H7, E coli O26:H11, E coli O111:NM và E coli O22 bằng phương pháp thạch Xác định được giá trị MIC của cả hai chiết suất này lên E coli O157:H7 là nhỏ nhất (50ppm) Giá trị MIC của ethyl acetate chiết suất từ Centaurea lên vi khuẩn Staphylococcus aureus là

62,5ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125ppm), nghĩa là ethyl acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn

Staphylococcus aureus (Kiymet & ctv, 2005)

Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn

baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli, salmonella infantis Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng

giá trị MIC của các chiết suất này từ 165-2640mg/ml B cereus nhạy với hầu hết các chiết suất từ cinnamomum cassia, azadirachta indica, ruta graveolén,

rumex nervosus với khoảng MIC từ 165-660mg/ml Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ có hiệu quả trên vi khuẩn E.coli, S infantis ở giá trị

MIC cao nhất (2640mg/ml) (Mohan & ctv, 2004)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu: Bắt đầu từ tháng 04/2008 đến tháng 05/2008 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học và bệnh thuỷ sản, khoa Thuỷ sản, trường đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Hoá chất và môi ttrường

 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nutrient agar (NA, Merck), nutrient broth (NB, Merck), muller hinton agar (MHA, Merck)

 Các loại hoá chất nhuộm Gram: dd I (ammonium oxalate, crystal violet),

dd II (iodine), dd III (cồn tuyệt đối, ethanol (Merck)), dd IV (safranin)

 Đầu col 5ml, 1ml, 100µl; ống falcon 50ml thanh trùng

 Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy li tâm, máy so màu quang phổ, cuvette 3ml, máy lắc, máy trộn mẫu, máy đếm khuẩn lạc

 Giấy lọc làm đĩa kháng sinh

 Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy, nồi chưng cất (water-bath)

 Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm

Vi khuẩn E coli LMG8223 từ nguồn Đại học Ghent, vương quốc Bỉ

Vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila được phân lập trên cá tra, nguồn cung cấp

từ Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Tất

cả vi khuẩn được trữ ở -800C trong môi trường BHI lỏng + glycerol

Hai chủng vi khuẩn E ictaluri: E.223 và E.3B3 Hai chủng vi khuẩn A hydrophila: CAF2 và CAF133

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu 3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn

Nuôi cấy và phục hồi vi khuẩn

Vi khuẩn trữ được phục hồi bằng cách cho vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10ml dung dịch NB lỏng, ủ trong tủ ấm 28-300C hoặc lắc đều trên máy lắc (200 vòng/phút) 18-24 giờ, rồi cấy sang đĩa môi trường kiểm tra tính thuần (dựa vào các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, kết quả nhuộm gram)

Hai loài vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila được cấy phục hồi và tách ròng

trên môi trường thạch NA, ủ ở 280C trong 24 giờ đối với A hydrophila và 48 giờ đối với E ictaluri Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường

NB lỏng, ủ trong tủ ấm ở 280C hoặc lắc đều trên máy lắc từ 18-24 giờ (Rahman

& Kawai, 2000)

Ly tâm vi khuẩn

Cho vi khuẩn vào ống falcon 50 ml, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút, ly tâm trong 15 phút, sử dụng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) tiệt trùng để rửa vi khuẩn Lặp lại thao tác 2 – 3 lần Sau lần ly tâm cuối cùng cho môi trường NB

vào và trộn đều mẫu

Xác định mật độ vi khuẩn

Ly tâm xong, cho môi trường NB vào đánh tan phần vi khuẩn lắng, rồi tiến hành so màu bằng máy so màu quang phổ Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy

so màu quang phổ ở bước sóng 590nm, với OD=0,1±0,02 tương đương với mật

độ vi khuẩn A hydrophila là 1x108cfu/ml và OD=0,01±0,002 tương đương

vớimật độ vi khuẩn E ictaluri là 1x107cfu/ml (Lương Trần Thục Đoan, 2006)

Sau đó mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường NA để kiểm tra thao tác

kỹ thuật chuẩn bị dung dịch vi khuẩn trước khi thực hiện nghiên cứu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh Natsol: được cung cấp từ công ty BIOFLAVONOIDS của Ấn Độ Chuẩn bị

dung dịch gốc (stock) Natsol như sau: hòa tan 5ml Natsol trong 100ml nước cất được nồng độ 50000µl/l, sau đó pha loãng theo phương pháp pha loãng hai lần (double dilution method) để được các nồng độ 24000; 12000; 6000; 3000; 1500; 750; 375;187,5; 93,75; 46,875 và 26,4375µl/l (Bảng 3.1) Trong đó, các nồng độ 24000ppm và 1500ppm được pha từ nồng độ 50000ppm

Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương

pháp pha loãng hai lần Ống

nghiệm

Nồng độ cần pha (ppm)

Thể tích thuốc kháng sinh natsol

(ml)

Thể tích nước cất (ml)

dung dịch gốc 50000ppm với natsol và ở chloramphenicol thì các nồng độ

512 và 128ppm pha loãng từ dung dịch gốc 1.024ppm (Bảng 3.3)

 Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các nồng độ tiếp theo

 Nồng độ thuốc sẽ giảm đi phân nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào

 Ghi tên thuốc và nồng độ thuốc trước khi bắt đầu thí nghiệm

 Phải lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo Điều cần chú ý là ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng thuốc giảm đi phân nửa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.2 và Bảng 3.4)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc natsol khác nhau (cho 1 chủng

vi khuẩn)

Ống MIC

Nồng độ thật thuốc natsol

(ppm)

Thể tích thuốc natsol (ml)

Thể tích

vi khuẩn (ml)

Bảng 3.3: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn

theo phương pháp pha loãng hai lần

Ống nghiệm

Nồng độ cần pha (ppm)

Thể tích thuốc kháng sinh chloramphenicol (ml)

Thể tích nước muối sinh lý

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc chloramphenicol khác nhau

(cho 1 chủng vi khuẩn) Ống

MIC

Thể tích thật thuốc kháng sinh chloramphenicol (ppm)

Thể tích thuốc kháng sinh (ml)

Thể tích

vi khuẩn (ml)

Chuẩn bị dung dịch gốc chloramphenicol: Pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi

ống 50 ml (là thuốc kháng sinh) (ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm

và ống thứ 2 có hàm lượng thuốc là 256 ppm) Thuốc phải được pha bằng dung môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Pha thuốc với độ pha loãng 2 lần từ 4-1024 ppm trong ống nghiệm 50ml (Bảng 3.2) Hàm lượng thuốc 512 ppm và 256 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024 ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý Hàm lượng thuốc 128, 64,

32, 16, 8 và 4 ppm được pha từ ống gốc thứ 2 (256 ppm)

3.3.2 Thực hiện nghiên cứu 3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò

Tiến hành nghiên cứu thăm dò gồm các bước như sau:

Chuẩn bị dung dịch gốc natsol: thí nghiệm thăm dò nồng độ thuốc natsol trên

vi khuẩn E ictaluri với chủng E.223 được tiến hành từ nồng độ gốc

(50000ppm) pha loãng các nồng độ: 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3000; 2000; 1000; 500; 400; 300; 200; 100; 50; 45; 40; 35; 30; 25; 20; 15 và 10ppm Pha nồng độ 50000ppm theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1) Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xác định MIC bằng phương pháp pha loãng

Cho 2 ml vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml thuốc kháng sinh với các nồng độ 10-10000ppm.Tất cả các ống nghiệm và đĩa cấy kiểm tra ủ với điều kiện nhiệt độ 28-30oC Sau 24 giờ đọc kết quả các ống MIC: so sánh độ đục giữa các ống MIC Kiểm tra khoảng ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng cách kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa petri môi trường thạch Tuỳ theo từng độ đục khác nhau mà ta có thể pha loãng theo nồng độ giảm dần sao cho có thể dễ dàng đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch Chọn nồng độ nào có mật

độ vi khuẩn thấp nhất (giảm 80% so với mật độ vi khuẩn gốc) là nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC) Vì sau 24 giờ chưa đủ thời gian cho vi khuẩn E ictaluri

phát triển trên đĩa môi trường Do đó, ghi nhận kết quả các ống MIC sau 24 giờ rồi ủ lại trong tủ ấm, để đủ 48 giờ đọc kết quả các ống MIC lại cùng với đĩa

môi trường vi khuẩn E ictaluri

3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ

Kiểm tra độ nhạy của natsol lên vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila bằng đĩa

kháng sinh natsol, gồm các bước sau:

Chuẩn bị dung dịch gốc natsol (như 3.3.1.2) Chuẩn bị đĩa kháng sinh thảo dược:

Chuẩn bị đĩa kháng sinh: sử dụng giấy lọc và tạo thành những khoanh giấy tròn nhỏ (sử dụng dụng cụ bấm giấy) có đường kính tương đương với đĩa kháng sinh thương mại (6mm) Dùng giấy nhôm gói những đĩa giấy và mang đi tiệt trùng khoảng 2 giờ ở 1800C

Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh: dùng chai tiệt trùng pha thuốc kháng sinh với nồng độ tương tự đĩa kháng sinh thương mại Lấy khoảng 50 đĩa giấy tiệt trùng cho vào 10ml dung dịch thuốc kháng sinh, ngâm khoảng 24 giờ (hoặc ngâm qua đêm) Sau 24 giờ ngâm đĩa, dùng pel tiệt trùng nhặt từng đĩa thuốc kháng sinh chuyển qua đĩa petri tiệt trùng để đĩa khô ở điều kiện nhiệt độ phòng, sau đó cho vào chai lọ tiệt trùng giữ 4 - 6oC và có thể sử dụng lâu dài

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1) Lập kháng sinh đồ

Dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0.2ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khô Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa