Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55 3.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 56 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ

SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG

QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NGÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ

SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG

QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

MÃ SỐ: 62.62.01.10

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, hình ảnh, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng

để bảo vệ một học vị nào trước đây

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy giáo, cô giáo, cán bộ công nhân viên của Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã sẻ chia kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Di truyền

và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Ban Quản lý đào tạo, Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ về mặt học vấn cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Cao đẳng Cộng đồng Hải Phòng đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để học tập và thực hiện luận án

Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, động viên chân tình của các thành viên trong gia đình, các bạn bè, đồng nghiệp, Tôi xin được trân trọng ghi nhớ và cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 7

1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 9 1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới 9

1.2.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam 11

1.3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây

1.4 Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo

1.5 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong

1.5.1 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 24

1.5.2 Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 25

1.6 Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng 30

2.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 41

2.2.2 Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây

2.2.3 Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh

giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi 41

2.2.4 Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị

của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 42 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 47

2.3.4 Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55

3.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 56

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 63

3.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro

3.2.1 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy

3.2.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy

3.2.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây

3.3 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in

3.3.1 Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm

3.3.2 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro

cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh 86 3.3.3 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro

cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 88 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh

biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 89 3.4.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm

3.4.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng

3.4.3 Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của

cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96

3.4.4 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý

3.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng

3.5.2 Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi 104

3.5.3 Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi 115

3.5.4 Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 117

3.5.5 Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm

3.6 Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn 121

3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu 122

3.6.2 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột

3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn

3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 126

Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

AFLP Amplicon fragment length polymorphism

FAO Food and Agriculture Organization

IAA 3-Indoleacetic acid

IAEA International Atomic Energy Agency

IBA α-Indol butyric acid

LD50 Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm

RAPD Random amplified polymorphic DNA

RFLP Restriction fragment length polymorphisms

SSR Simple sequence repeats

α NAA α-Napthaleneaxetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm 2000 10 1.3 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến ở

2.1 Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 55 3.2 Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh

3.3 Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh

3.4 Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới

3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm

3.6 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây

3.7 Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy 69 3.8 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

3.9 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

3.10 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

3.11 Ảnh hưởng của liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co đến khả năng

3.12 Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy 76

3.14 Ảnh hưởng của liều lượng xử lý EMS và tia gamma nguồn 60Co đến

3.15 Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi in vitro sau xử lý kết hợp EMS

3.16 Khả năng ra rễ của chồi in vitro sau xử lý 85 3.17 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong

3.18 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong

3.19 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau

3.20 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng

3.21 Tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ

3.22 Tỷ lệ biến dị của các dạng chồi cẩm chướng sau xử lý giai đoạn

3.23 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý

3.24 Thống kê số băng DNA thu được của các mẫu giống cẩm chướng 104

3.26 Tỷ lệ dị hợp tử của dòng, giống cẩm chướng 117 3.27 Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng 118 3.28 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 123 3.29 Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân

3.30 Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng H6 và H7 126 3.31 Ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây

1.3 Số giống cây trồng được tạo ra theo phương pháp gây tạo đột biến

1.4 Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2008 22 1.5 Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ 27

3.1 Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA với nộng độ khác nhau 59

3.2 Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin với nộng độ

3.4 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ chết của chồi in vitro

3.5 Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý EMS với thời gian xử lý 2 giờ 70

3.7 Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co 77 3.8 Các dạng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co 79 3.9 Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co 83 3.10 Một số dạng biến dị về hình thái thân lá 90 3.11 Hình ảnh một số dạng biến dị về màu sắc hoa 91 3.12 Cấu trúc một số dạng biến dị về màu sắc hoa 102

3.19 Kết quả phân tích với mồi CB018a 108

3.34 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng 118 3.35 Mẫu dòng đột biến được lựa chọn nghiên cứu nhân giống in vitro 122

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong nông nghiệp cùng với việc phát triển các cây lương thực, thực phẩm cây hoa cũng đã trở thành một lĩnh vực thu hút được sự quan tâm và đầu tư bởi sản xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế

Trong những loài hoa cắt cành, cẩm chướng ngày càng được biết đến và ưa chuộng bởi màu sắc đẹp, phong phú, kiểu dáng hoa đa dạng, hoa tươi lâu, dễ vận chuyển, bảo quản… Cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu của Việt Nam Ở nước ta hiện nay, chủ yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) do đó không chủ động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở rộng sản xuất và xuất khẩu bởi không có bản quyền giống Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng hoa mà còn phải tạo ra được những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái

và có bản quyền của Việt Nam

Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo giống có màu sắc mới Điều này được thực hiện thông qua con đường lai xa, đa bội hóa và gây tạo đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn thụ tinh rất khó Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con đường gây tạo đột biến Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng Theo báo cáo của

Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có 3.200 giống cây

sản xuất (IAEA, 2013) Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và thời gian chọn tạo giống cây trồng mới Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro

đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế

ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013) Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng

phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ Phương pháp này được đánh giá

là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997)

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như

Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma để gây đột biến in vitro cho nhiều

loại cây trồng được nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công

tác chọn tạo giống cây trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004; Luan và cs., 2007; Shin et al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a, 2009b, 2011b,…) Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên cứu xử lý đột biến in vitro trong

chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng còn nhiều hạn chế Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến

in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” phục vụ cho

công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng ở nước ta

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được

phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới

3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in

vitro bằng tác nhân gây đột biến

- Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao:

+ Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro

cây hoa cẩm chướng

+ Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Cothích hợp cho chồi nhân

in vitro cây hoa cẩm chướng

+ Xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Cocho

chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng

- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro

- Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống đối với cây cẩm chướng bao

gồm các nội dung nhân giống vô tính in vitro, tạo vật liệu di truyền mới bằng phương pháp gây tạo đột biến bởi tác nhân hóa học, vật lý kết hợp nuôi cấy in vitro, ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định thể đột biến và xây dựng quy trình nhân giống vô tính in vitro cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển

chọn

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị

biến in vitro của cây hoa cẩm chướng Đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc

nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng

Các kết quả của đề tài là cơ sở để tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu tạo dòng đột biến mới làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống bằng

xử lý đột biến in vitro không chỉ đối với cây cẩm chướng mà còn có thể mở rộng

với nhiều đối tượng cây trồng khác

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng,

giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong thực tiễn về nhân giống hiện nay

Đề tài đã ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa

cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co

Đã tạo được các vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng

5 Đóng góp mới của luận án

Các kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma nguồn 60Cocho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng có thể làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới

Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến mới về màu sắc hoa trong điều kiện tự nhiên Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ (không xử lý đột biến)

Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến

có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến được tạo ra, phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Theo Jawaharlal et al (2005), cẩm chướng có tên tiếng Anh: Carnation; tên khoa học: Dianthus caryophyllus L Hoa cẩm chướng thuộc:

Theo Jurgens et al (2003), Jawaharlal et al (2005) họ cẩm chướng có 80

chi và trên 2.000 loài, phân bố chủ yếu ở Bắc bán cầu, tập trung nhiều ở vùng Địa Trung Hải, một số ít ở Nam bán cầu và miền núi nhiệt đới Ở Việt Nam gặp trên

10 chi với 25 loài (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2006; Trung tâm Dữ liệu thực vật Việt Nam, 2007)

Loài D caryophyllus: dựa trên hình dạng, kích thước hoa và hình thái cây

loài này được chia thành các nhóm: hoa chuẩn - Standards (sims), hoa chùm - Sprays (miniatures) Hoa chuẩn là dạng hoa một bông to trên một cành Hoa chùm

là dạng có một số lượng lớn hoa nhỏ trên cành, có thể sinh ra cành hoa có nhiều nhánh nhỏ với rất nhiều hoa (Galbally and Galbally, 1997) Thông thường, cẩm chướng là cây lưỡng bội, tuy nhiên các thể tứ bội cũng đã được tìm thấy Phần lớn

các giống cây trồng hiện nay là các thể lưỡng bội (Sato et al., 2000)

Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng

để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm Năm 1846, họ

đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ Sau

đó hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới đã được tạo ra, trong đó các giống như North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu Từ các giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005)

Trong sản xuất hiện nay ngoài các giống thuộc loài D caryophyllus được sử dụng chủ yếu dưới dạng hoa cắt còn có các giống thuộc hai loài, D barbatus và D chinensis được trồng dưới dạng hoa thảm và hoa chậu (Jawaharlal et al., 2005; Lê

Đức Thảo, 2010)

Loài D barbatus: Thân cứng cáp, nhẵn, cao 25 - 50 cm Lá dẹp, màu xanh

nhạt hay xanh đậm, dài 3 - 7 cm Hoa mọc thành chùm khít nhau, rộng 1 - 2 cm, màu trắng, hồng đỏ, tím hay hai màu giữa các lá bắc khá to, mùi thơm nhẹ Một số giống thuộc loài này như giống Wee Willie và Summer Beauty thường trồng bằng

hạt vào đầu mùa xuân và ra hoa vào đầu mùa hè (Jawaharlal et al., 2005; Lê Đức

Thảo, 2010)

Loài D chinensis: Thân thảo lâu năm, có chiều cao 30 - 50 cm, thân cây

trưởng thành thường có các rãnh, lá phẳng, rộng, màu xanh nhạt đến xanh đậm, chiều dài lá 3 - 5 cm, chiều rộng 2 - 4 mm Hoa có nhiều màu sắc khác nhau, đường

kính hoa 3 - 4 cm, cánh hoa thường có lông Loài D chinensis tập trung chủ yếu ở vùng ôn đới Có 2 giống phổ biến thuộc loài này là Hồng Nhật Bản (D chinensis var Heddewigii) và Hồng tua (D chinensis var Lacinatus) (Jawaharlal et al., 2005)

Dianthus chinensis Dianthus barbatus Dianthus caryophyllus

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài hoa cẩm chướng phổ biến

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

- Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập

trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm (Lê Đức Thảo, 2010; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012)

- Thân: Thân thuộc dạng thân thảo, nhỏ và mảnh, phân nhánh nhiều, và nửa

hóa gỗ Thân rất dễ gẫy ở đốt Các đốt thân thường gẫy khúc Thân thường có màu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh Cẩm chướng loại thấp cây cao

30 - 50 cm, thường mọc thành bụi, các đốt thân dài 2 - 3 cm Loại cao cây 50 - 80

cm, đốt dài 4 - 6 cm (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012)

- Lá: Lá mọc đối từ các đốt thân, gốc lá ôm lấy thân, phiến lá dày, hình lưỡi

mác, mép lá trơn, mặt lá nhẵn, không có độ bóng Trên mặt lá phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn, lớp phấn này có tác dụng làm giảm sự bốc hơi nước (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012)

- Hoa: Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn Hoa nằm trên đầu

cành và có nhiều màu sắc khác nhau Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3 màu khác nhau Hoa đẹp, có mùi thơm nhẹ Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm Khi hoa nở hoàn toàn có đường kính 6 - 8 cm Chiều cao bông hoa khoảng 4 - 7,5 cm (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012)

- Hạt: Hạt cẩm chướng nhỏ Mỗi quả thường có từ 300 - 600 hạt (Nguyễn

Thị Kim Lý và cs., 2012)

1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

- Ánh sáng: Theo Jawaharlal et al (2005) cẩm chướng là cây ưa sáng và

thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt Theo Nguyễn Thị Kim Lý và cs (2009) cường độ ánh sáng thích hợp là 1.500 - 3.000 lux, tối thích là 2.000 - 2.500 lux Trong quá trình phát triển, cường độ ánh sáng cao (trên 3.000 lux) cây sẽ ra hoa sớm, cường độ ánh sáng thấp (dưới 1.000 lux) quá trình ra hoa sẽ muộn Nhìn chung độ dài chiếu sáng trong ngày thích hợp với cây hoa cẩm

- Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát mẻ Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 220C Theo Jawaharlal et al (2005) nhiệt độ

ban đêm có ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển của hoa cẩm chướng, nhiệt độ ban đêm thích hợp là 10 - 110C vào mùa đông, 13 - 15,50C vào mùa hè Chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa Nhìn chung chênh lệch nhiệt nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất (Jawaharlal et al.,

2005; Gharge, 2009; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012)

- Nước: Ẩm độ thích hợp 60 - 70%, ẩm độ tối thích 65% (Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012) Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho cây hút chất dinh dưỡng và muối khoáng, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao

- Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ và thông thoáng Theo

Jawaharlal et al (2005) khi trồng trong nhà kính với nhiệt độ 14 - 150C nên duy trì nồng độ CO2 ở mức 500 - 750 ppm Trong điều kiện thuận lợi nếu phun bổ sung

CO2 có thể làm tăng năng suất hoa từ 10 - 30%

- Đất đai: Yêu cầu đất có kết cấu tơi xốp Độ pH thích hợp từ 6,0 - 6,5 Theo Nguyễn Thị Kim Lý và cs (2012) mức EC từ 1,2- 1,5 là phù hợp với cây cẩm chướng Đất trồng hoa cẩm chướng tốt nhất là đất cát pha sét, giầu hàm lượng

hữu cơ, có khả năng thoát nước tốt (Jawaharlal et al., 2005)

1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng

Theo Nguyễn Thị Kim Lý và cs (2012) chất lượng và sản lượng hoa phụ thuộc rất lớn vào dinh dưỡng Mức dinh dưỡng không thích hợp sẽ làm cây chóng tàn hoa, hoa nhỏ Thông thường 1 m2 đất trồng trong một năm cây cẩm chướng sẽ hấp thu lượng từ 3 - 5 g đạm, 2 - 3 g lân, 7 - 12 g kali

Từ đặc điểm, nguồn gốc và yêu cầu ngoại cảnh của cây cẩm chướng cho thấy, cây cẩm chướng thích hợp với khí hậu mát mẻ Vì vậy, ở các nước, cẩm chướng thường được phát triển mạnh ở các vùng núi cao như Côn Minh (Trung Quốc) hay thung lũng Rift (Kenya) có độ cao từ 1.000 - 1.800 m so với mực nước biển Ngoài ra, các vùng này cũng phù hợp với quá trình thụ phấn của cẩm chướng nên thuận lợi cho việc lai tạo, tạo vật liệu khởi đầu và các dòng, giống

Ở Việt Nam, một số vùng có đặc điểm khí hậu rất phù hợp với cây cẩm chướng như Đà Lạt, Sapa (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012) Hiện nay cây cẩm chướng cũng được trồng rộng rãi ở một số vùng như Hà Nội, Hải Phòng, Thành phố Hồ Chí Minh,… (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2009)

1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại châu Âu, châu Á, châu Phi và châu Mỹ

Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng nhiều nhất, năm 2001 sản lượng hoa cắt nước này đạt 3.200 triệu cành Ở Hà Lan, tuy diện tích trồng hoa cẩm chướng không bằng diện tích trồng hoa tuylip nhưng sản lượng cũng đạt trên 2.500 triệu cành/năm, đứng thứ 2 trên thế giới và có xuất khẩu sang châu Âu, Bắc

Mỹ và Nhật Bản Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm nước này sản xuất được khoảng 600 triệu cành, đứng thứ 3 trên thế giới (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012)

Hoa cẩm chướng đã được trồng thương mại ở Australia từ năm 1954, đến năm 2005 Australia có khoảng trên 100 ha tập trung tại tiểu bang Victoria, Nam

Úc, Tây Úc với sản lượng khoảng 140 triệu bông hoa cắt mỗi năm (Office of Gene Technology Regulator, 2005)

Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất trên thế giới và được coi là thiên đường của hoa cẩm chướng Với điều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây cẩm chướng đã phát triển trên 35 năm Trong tổng số 4.200 ha hoa cắt thì cẩm chướng chiếm 45,8% tổng lượng hoa xuất khẩu của nước này (Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012) Năm 2000 diện tích trồng hoa cẩm chướng đạt 1.868 ha với sản lượng 591 triệu cành/ năm (Thiranjan, 2005)

Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya Năm 2000, Kenya

có khoảng 115 ha với sản lượng 303 triệu cành/ năm (Thiranjan, 2005) Diện tích trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở vùng Ritf Valley Cây cẩm chướng được trồng làm cảnh ngoài đồng ở độ cao khoảng 1.800 m và trồng trong

nhà plastic ở độ cao 2.700 m so với mực nước biển (Cox et al., 1987)

Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng được trồng với diện tích lớn chiếm 21% (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009) Diện tích trồng hoa cẩm chướng tại Thổ Nhĩ Kỳ phát triển rất nhanh năm 2000 có 3.365 ha đến năm 2005 đã có 8.160 ha, Trong 5 loài hoa xuất khẩu, hoa cẩm chướng luôn là loại hoa xuất khẩu hàng đầu ở nước này Năm 2005, xuất khẩu đạt 21.386.821 USD trong tổng số 24.356.565 USD xuất khẩu từ 5 loại hoa (hoa hồng, cẩm chướng, hoa lan, cúc, đồng tiền) (Gulay, 2009)

Tại Israel tỷ lệ diện tích trồng hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm doanh thu xuất khẩu đạt 119 triệu USD (Nguyễn Thị Kim Lý

và cs., 2012)

Bảng 1.1 Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm 2000

Tên quốc gia Diện tích

(ha)

Sản lượng (triệu cành)

Tên quốc gia

Diện tích (ha)

Sản lượng (triệu cành)

Kinh và Côn Minh (Yang et al., 1998) Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim

ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao Theo thống kê tháng 11 năm 2006 đạt 10,4 triệu USD với sản lượng 4,3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong

3 loại hoa xuất khẩu chủ lực (Khuyết danh, 2007)

1.2.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Sapa (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009) Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, Thành phố Hồ Chí Minh Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu - Từ Liêm, Phú Thượng - Tây Hồ (Hà Nội) Với lợi thế về điều kiện khí hậu cẩm chướng đã được trồng cả ở mùa hè

ở Đà Lạt, Sapa và đang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước (Lê Đức Thảo, 2010)

Theo số liệu thống kê, xuất khẩu tháng 3/2010, xuất khẩu hoa cẩm chướng đạt 1,23 triệu cành, giá trị xuất khẩu đạt 0,26 triệu USD Trong đó thị trường Nhật Bản chiếm số lượng lớn với 0,94 triệu cành, trị giá 0,19 triệu USD (Khuyết danh, 2010) Hàng năm Đà Lạt cung cấp khoảng 0,3 - 0,5 triệu cành hoa cẩm chướng các loại Từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng hoa cẩm chướng trong nhà kính ở Lạc Dương và Đà Lạt tăng từ gần 214 ha lên hơn 290 ha Trong năm 2013, các hộ nông dân tại Đà Lạt đã liên kết với Công ty DaLat Hasfarm trong việc trồng hoa xuất khẩu, xây dựng 50 ha nhà kính trồng hoa, trong đó 20% trồng hoa cúc, 80% trồng hoa cẩm chướng Ước giá trị lợi nhuận trong 6 tháng đầu năm 2013 với sản xuất xuất khẩu hoa cẩm chướng cũng đạt tương đương với hoa cúc, trung bình trên dưới 10 triệu đồng/1.000m2/tháng (Huy Hoàng, 2013)

Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một trong những loài hoa được trồng từ rất lâu và phổ biến ở châu Âu, châu Á và châu Mỹ Đây là loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung Tuy nhiên việc phát triển cây hoa cẩm chướng ở nước ta còn nhiều hạn chế, sản lượng và chất lượng hoa cẩm chướng còn thấp chưa đáp ứng được yêu cầu của người tiêu dùng Vì vậy việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật, đặc biệt là khâu chọn tạo giống hoa cầm chướng ở nước ta là rất cần thiết

1.3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây hoa cẩm chướng

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

Cơ sở lý luận của phương pháp đó là dựa trên cơ sở tính toàn năng và đặc tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật

Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó chính là tính toàn năng của tế bào

Quá trình phân hóa tế bào là quá trình tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt Sau đó từ các tế bào phôi sinh chúng tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào Quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào là con đường để

có thể tái sinh được cơ thể thực vật nguyên vẹn từ các tế bào, mô chuyên hóa khi

nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ nhiều mục đích khác nhau Trong lĩnh vực giống cây trồng nó được ứng dụng để làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn tạo giống, nhân nhanh và duy trì những giống và các thể

có ý nghĩa khoa học, làm sạch bệnh vi rút, phục tráng những giống thoái hoá, Trong đó, ứng dụng nhân giống vô tính cây trồng là lĩnh vực được quan tâm hơn

cả Vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống bằng nuôi cấy mô là lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

Ưu thế của phương pháp nhân giống vô tính in vitro so với các phương

pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, là có

hệ số nhân cao, có thể đạt tới 103 - 1012 lần/năm Ngoài ra, phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm Đây là phương pháp đặc biệt ưu việt với các loại cây khó nhân giống bằng con đường nhân giống hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà

lại cần nhân nhanh Phương pháp nhân giống in vitro có thể tạo ra một quần thể

đồng nhất với số lượng lớn, cây giống khoẻ mạnh, sạch bệnh, có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, có thể trao đổi quốc tế nguồn gen

và lưu giữ, bảo quản dưới dạng cây con in vitro Nó đã được ứng dụng rất có hiệu

quả cho rất nhiều loại cây trồng như cây hoa, cây lương thực, cây ăn quả, cây công nghiệp và cây dược liệu,… (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005)

Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã mang lại những thành công hết sức to lớn trên hầu hết các loại cây trồng

Theo thống kê, Trung Quốc đã có đến 700 chủng loại thực vật đã được nhân giống

bằng cách nuôi cấy mô Ở nước ta kỹ thuật nhân giống in vitro đã được ứng dụng

thành công ở nhiều loài cây hoa như hoa hồng, hoa tường anh, hoa trà, hoa cúc, hoa loa kèn, hoa lan, và rất nhiều loài cây ăn quả, cây thuốc

Ứng dụng nhân giống in vitro đối với cây hoa cẩm chướng cũng đã được rất

nhiều tác giả trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu Các kết quả nghiên cứu cho thấy:

Nhân giống in vitro đối với cây cẩm chướng có thể bằng nhiều phương thức

khác nhau như: Nuôi cấy thông qua tái sinh tạo mô sẹo, phương thức này có thể sử dụng nguồn vật liệu từ các bộ phận của cây nhưng phổ biến là sử dụng tái sinh từ lá

(Archana and Kothari, 2002; Mehta et al., 2007), tái sinh từ rễ (Seo et al., 2007);

Nuôi cấy tạo chồi trực tiếp từ các bộ phận, phương thức này được áp dụng phổ biến

trong nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng nói riêng và các loài thực vật nói

chung Nguồn vật liệu nuôi cấy có thể sử dụng nhiều cơ quan khác nhau sử dụng

chóp rễ, chồi nách, chồi đỉnh, lá, nụ hoa (Archana and Kothari, 2002; Meena et al., 2006; Bora et al., 2007) Tuy nhiên, chồi đỉnh, chồi nách được sử dụng phổ biến vì

hệ số nhân chồi cao hơn so với các bộ phận khác (Bora et al., 2007)

Để khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy có thể sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau như hypochlorite calcium (9,0 - 10%) trong 5 - 30 phút, hypochlorite sodium (0,5 - 5,0%) trong 5 - 50 phút, oxy già (3,0 - 12%) trong 5 -

15 phút, chlorua thủy ngân (0,1 - 1,0%) trong 2 - 10 phút, nitrate bạc (1,0%) trong thời gian 5 - 30 phút, … (Gamborg and Philips, 1995) Các kết quả nghiên cứu trên một số giống cẩm chướng cho thấy, đối với cây hoa cẩm chướng sử dụng chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút cho hiệu quả hơn cả (Lê Đức Thảo, 2010)

Môi trường nuôi cấy là cơ sở và là điều kiện cần thiết để đảm bảo cho sự nuôi cấy thành công các tế bào, mô thực vật tách rời Tùy từng bộ phận, giai đoạn

và mục đích nuôi cấy khác nhau mà các môi trường có thành phần khác nhau Các kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với các giống khác nhau, các bộ phận nuôi cấy

khác nhau thì môi trường nuôi cấy tối ưu có sự khác nhau (Meena et al., 2006; Esmaiel et al., 2013)

Các nghiên cứu về môi trường tái sinh mô sẹo từ lá cây cẩm chướng cho thấy tùy từng giống khác nhau có thể sử dụng môi trường MS bổ sung 0,5 - 2,0 mg/l α-NAA và 0,5 - 3,0 mg/l BAP hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin sẽ cho hiệu quả

cao (Archana and Kothari, 2002; Mosquera et al., 2009; Mehta et al., 2007; Sayeed et al., 2011; Esmaiel et al., 2013) Theo Archana and Kothari (2002) khi

sử dụng môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-AA hoặc 3,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l α-NAA chồi có khả năng hình thành trực tiếp từ mô lá mà không hình thành mô sẹo Đối với việc tái sinh mô sẹo từ rễ thì việc bổ sung 1,0 mg/l

Thidiazuron (TDZ) và 1,0 mg/l α-NAA sẽ cho hiệu quả cao (Seo et al., 2007)

Môi trường tạo chồi thích hợp đối với cây cẩm chướng là MS bổ sung 0,25

- 0,5 mg/l α-NAA + 0,5 - 1,0 mg/l BA hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin (Aparna et al., 2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al., 2011; Esmaiel et al., 2013) Tuy nhiên việc bổ sung BA hoặc kinetin nồng độ cao trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng tỷ lệ chồi bị thủy tinh hóa (Mahdiyeh et al.,

Môi trường tạo rễ thích hợp là MS bổ sung 0,5 - 1,0 mg/l IBA; 1,0 mg/l

α-NAA hoặc IAA có thể kết hợp với 0,25 - 0,5 g/l than hoạt tính (Aparna et al., 2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al., 2011; Esmaiel et al., 2013) Casanova et al (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của

lượng agar trong môi trường nuôi cấy cẩm chướng cho thấy khi bổ sung agar trong môi trường nuôi cấy từ 0 - 12 g/l làm giảm dần khả năng sử dụng nước, làm giảm khả năng tái sinh chồi của mẫu Các chỉ tiêu hàm lượng nước trong chồi, khối lượng tươi, số lượng, kích cỡ của các tế bào và số lượng chồi tái sinh cũng giảm Do đó, độ ẩm tương đối và nước có sẵn trong môi trường nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đến hình thái mẫu mà còn ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý của chồi

Có thể sử dụng nhiều loại giá thể để thích ứng cây cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm như: đất (Bora et al., 2007), cát, cát + đất và cát + trấu hun

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 1996); cát + đất + phân hữu cơ (1:1:1) (Omid, 2011); trấu hun và hạt perlite (7:3) (Lê Đức Thảo và cs., 2009); cát + phân hữu cơ (1:1) (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012) Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng

công nghệ khí canh để thích ứng cây cẩm chướng in vitro trong điều kiện tự nhiên

cũng đã thu được kết quả khả quan (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010)

Qua các nghiên cứu nêu trên về nhân giống in vitro cây cẩm chướng có thể

kết luận như sau:

- Về bộ phận nuôi cấy: có thể nuôi cấy từ nhiều bộ phận khác nhau: rễ, đỉnh sinh trưởng, đoạn thân, lá Tuy nhiên mẫu nuôi cấy từ chồi nách phát triển tốt hơn

- Về phương pháp khử trùng mẫu: Có thể sử dụng nhiều loại hóa chất khử trùng khác nhau, nhưng sử dụng chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút cho hiệu quả cao

- Về môi trường nuôi cấy: môi trường cơ bản MS với hàm lượng đường từ

2 - 3% được sử dụng phổ biến Môi trường này sẽ được bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng thực vật thông dụng như: BA, kinetin, α-NAA và IBA với nồng

độ thấp (0,2 - 2 mg/l) ở dạng riêng rẽ hay tổ hợp tùy thuộc vào từng giai đoạn

- Về giá thể trồng cây in vitro tại vườn ươm: có thể sử dụng nhiều loại giá

thể khác nhau, tuy nhiên cây phát triển tốt hơn khi sử dụng giá thể thoáng khí

1.4 Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng

1.4.1 Đột biến tạo biến dị di truyền

Đột biến (mutation) là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống Có những đột biến lặn, nhưng cũng có những đột biến trội Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành

Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các loại đột biến khác nhau như: đột biến gen: Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn DNA, thường liên quan đến 1 hay 1 cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: tái sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn, Các đột biến này còn có thể gọi là sai hình nhiễm sắc thể (Phạm Thành Hổ, 2010)

Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên) Do tác động của tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học,…) có trong môi trường sống, và do những biến loạn về trao đổi chất trong tế bào gây ra những biến đổi cấu trúc gen dẫn tới xuất hiện những thể đột biến mới Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến như các tác nhân vật lý (tia

X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…), các tác nhân hoá học (các chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid, )

Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến thường rất thấp (khoảng 10-6) và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Ngày nay các nhà chọn giống không chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát Vì vậy, việc gây đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần xuất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới

1.4.2 Các tác nhân gây đột biến

Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố sinh học, hoá học và vật lý Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần Các loại tác nhân thường dùng bao gồm:

- Tác nhân hóa học: bao gồm các chất như DES, EMS, EI, NEU, NMU, NaM3, 1,4- Biadiazo - acetyl Butane,

- Tác nhân vật lý: tia X (từ đèn UV), phóng xạ điện từ (tia X từ máy X - quang, tia gamma từ nguồn 60Co và 137Cs, phóng xạ hạt (chùm neutron nóng hoặc chậm từ lò phản ứng, chùm neutron nhanh từ lò phản ứng, các hạt beta phóng ra

từ 32P và 35S), ion beam và electron beam

Theo thống kê của tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) năm

2008, tại Nhật Bản nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác nhân đột biến khác nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7% Trong đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo giống đột biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng nuôi

cấy in vitro đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5% Tác nhân hóa học mặc

dù được sử dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia

Trên thế giới năm 2009, tỷ lệ đóng góp của tác nhân vật lý chiếm 87%, tác nhân hóa học chiếm 13% (FAO và IAEA, 2009)

Hình 1.2 Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng

tại Nhật Bản năm 2008

(Nguồn: Nakagawa, 2008) Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hoá học có hiệu quả hơn tác nhân vật lý Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu xạ ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10

- 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hoá học cho phép thu nhận

từ 30 - 60% Hơn nữa tác nhân gây đột biến hoá học thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn (Đào Thị Thanh Bằng và cs.,1997)

1.4.2.1 EMS và ứng dụng EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng

EMS - Methylethane sulphonate, công thức hoá học: CH3SO2OC2H5, khối lượng phân tử 124,16 gmol-1, tỷ trọng 1,1452 (220C), Điểm nóng chảy < 250C, Điểm sôi 213 - 213,50C

EMS có thể gây đột biến ít nhất bằng 3 cách: thêm nhóm methyl (- CH3) hay ethyl (- C2H5) vào guanine tạo base đồng đẳng của adenine dẫn đến bắt cặp bổ sung sai; làm mất guanine do đã bị alkyl hoá (mất purine) tạo lỗ hổng trên DNA, khi sao chép có thể làm đứt mạch; liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các

Tia ion 5,80% Tia X 9,50%

Tác nhân hóa học 6,60%

Nuôi cấy

in vitro

15,70%

Tia gamma 60,30%

Tia bức xạ khác2,10%

phân tử DNA khác nhau làm mất nucleotide

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hoá học, EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Dung dịch hoá chất gây đột biến này phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc Tốc độ thuỷ phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian (hafl life) Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ thuỷ phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ 200C, hafl life của EMS là 93 giờ, ở 300C là 26 giờ và ở 370C là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2007) Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ trong bóng tối trong suốt thời gian xử lý (Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997)

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang

có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của EMS Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 - 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hoá chất EMS trên các bộ phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển Tuy nhiên, đối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại giảm xuống Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể đem lại hiệu quả gây đột biến di truyền cao

1.4.2.2 Đột biến phóng xạ và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Tia gamma và tia X là 2 tác nhân chiếu xạ cơ bản trong gây tạo đột biến thực nghiệm Được dùng phổ biến nhất là tia gamma với nguồn 60Co và 137Cs do

có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không

bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn

Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ

ra các phản ứng oxi hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới

- Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học, là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống Tức là các biến đổi hoá học gây nên

do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn như làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào

Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như trên gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào, gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp DNA và tổng hợp protit trong tế bào sống, đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc DNA, làm phát sinh đột biến di truyền (Phạm Thành Hổ, 2010)

Quá trình phát sinh đột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý học của loại tia phóng xạ; liều lượng, cường độ phóng xạ; sự phục hồi các biến dị tiềm năng và các yếu tố khác như: dưỡng khí, nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý

Để tạo ra các giống cây đột biến bằng công nghệ này, tùy theo từng đối tượng cây trồng người ta có thể chiếu xạ trực tiếp các bộ phận của cây như mầm, chồi, hạt phấn, nhụy, hạt giống hay toàn bộ cây ở những giai đoạn khác nhau Bên cạnh đó có thể kết hợp chiếu xạ với phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để tạo callus, PLB, sau đó chiếu xạ (Chakrabarty and Datta, 2010) Tùy vào liều lượng và thời gian xử lý chiếu xạ sẽ tạo ra những đứt gẫy nhiễm thể hoặc những thay đổi về cấu trúc gene Những mẫu sau khi chiếu xạ có thể được gieo trồng trực

tiếp hoặc được nhân lên và tái sinh cây in vitro Sau đó trồng ra ngoài đồng ruộng

và đánh giá, chọn lọc qua nhiều thế hệ Những dòng, giống ưu việt sẽ được nhân

1.4.3 Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6 - 10 thế hệ Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm) chỉ cần 3 - 6 thế hệ (Đào Thị Thanh Bằng

và cs., 1997) Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề

mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của giống (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005) Với phương pháp đột biến thực nghiệm,

sử dụng các tác nhân lý, hoá gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Việc xử lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọt đáng kể Do đó có thể tạo ra giống mới khác xa giống cũ

Hình 1.3 Số giống cây trồng được tạo ra theo phương pháp gây tạo đột biến

trên thế giới qua các năm

Với các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người đã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học (tác nhân hoá học) như colchicine, EMS, trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được nhiều thành tựu

Hình 1.4 Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2008

(Nguồn: FAO/IAEA, 2008) Theo Ban Di truyền và Chọn giống thực vật của tổ chức Nông nghiệp Quốc

tế và Tổ chức Năng lượng nguyên tử Quốc tế, tính đến năm 1996, số lượng các giống đột biến thu được là 1.737 giống từ hơn 50 nước trên thế giới Các giống đột biến này được tạo ra từ 154 loài thực vật Trong đó có 187 giống hoa cúc, 35 giống cây cảnh, 34 giống hoa phong lan, 30 giống xương rồng và rất nhiều loài khác (Đào Thị Thanh Bằng và cs.,1997) Trong 70 năm qua, hơn 2.543 giống đột biến từ 175 loài thực vật bao gồm cây cảnh, ngũ cốc, hạt có dầu, đậu, rau, trái cây

và các loại cây lấy sợi đã được tạo ra từ 50 quốc gia trên khắp thế giới

(Maluszynski et al., 2000; Chopra, 2005) Đến năm 2009 đã có 3.100 giống mới

của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công bố bởi hơn 60 quốc gia khác nhau và trên các vùng châu lục khác nhau Trong năm 2010 bổ sung thêm 12 giống đột biến và năm 2013 bổ sung thêm 4 giống (trong đó Việt Nam bổ sung thêm 3 giống hoa cúc) nâng tổng số giống lên đến 3.212 giống đột biến trên

Châu Mỹ La tinh 1,56% Bắc mỹ 6,23% Châu Phi

toàn thế giới (FAO và IAEA, 2009, 2010, 2013) Từ những kết quả thu được chứng tỏ đây là một trong những phương pháp có hiệu quả để tạo ra giống mới Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá, một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm

Tỷ lệ các giống đột biến được tạo ra ở các châu lục cũng khác nhau trong

đó nhiều nhất là châu Á (chiếm 60,31%) và thấp nhất là châu Úc (0,31%) Bên cạnh đó, các giống đột biến phần lớn tập trung ở các giống cây ngũ cốc (chiếm 70%), sau đó là các cây họ đậu (18%), cây có dầu (4%) và những loại khác

Bảng 1.3 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến

ở một số quốc gia tính đến năm 2007

TT Quốc gia Tổng số giống

1.5 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng

1.5.1 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp kết hợp giữa

kỹ thuật nuôi cấy mô với phương pháp gây tạo đột biến Sự kết hợp này sẽ làm tăng tần số biến dị di truyền lên nhiều lần so với phương pháp thông thường, rút ngắn thời gian trong công tác chọn tạo giống mới mang lại khả năng tạo biến dị rất cao Phương pháp này còn có khả năng tạo đột biến ở giai đoạn sớm của quá trình hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc callus) Nhờ vậy, tần số đột biến cao

và khả năng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen trở nên dễ dàng

hơn Nuôi cấy in vitro không những là công cụ hữu hiệu để lưu giữ, duy trì và

nhân những thể đột biến lạ, quý hiếm mà còn là phương pháp phân lập và làm

thuần những dòng đột biến nào đó Trong nhiều trường hợp, nuôi cấy in vitro là

cách có hiệu quả nhất để duy trì và bảo quản những biến dị di truyền, đặc biệt là những thể đột biến khảm, nhờ đó khắc phục được sự đào thải của những tế bào quý hiếm do tính cạnh trạnh trong mô (Lê Đức Thảo, 2010)

Sự phát triển của phương pháp nuôi cấy in vitro đã tạo điều kiện cho việc

sử dụng các kỹ thuật đột biến để cải thiện cải giống cây trồng Kỹ thuật này là phương pháp hiệu quả nhất để cải thiện giống cây trồng (Mohan, 2010) Gây tạo

đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm như, thuận tiện trong xử lý số

lượng lớn các cây con do kích thước nhỏ, hiệu quả sử dụng chất gây đột biến hóa học cao và liều lượng xử lý thấp hơn Phương pháp có tiềm năng rất lớn đối với chọn tạo giống hoa cây cảnh Ưu điểm chính của phương pháp là khả năng cải thiện một hoặc một vài tính trạng quan trọng của một giống mà về cơ bản ít có thay đổi kiểu gen còn lại (Ibrahim and Debergh, 1998)

Nguyễn Tiến Thịnh và Lê Văn Thức (2007) cho rằng, mẫu vật truyền thống trong chiếu xạ đột biến ở cây trồng nhân giống bằng hình thức sinh dưỡng như hom, cành giâm, củ, hành, thân bò,… thường có kích cỡ to và số lượng tế bào lớn nên không thuận tiện trong thao tác chiếu xạ đột biến sử dụng những nguồn bức xạ

khăn trong việc phân lập thể đột biến thuần từ cấu trúc khảm về sau Việc sử dụng

kết hợp tác nhân gây đột biến với kỹ thuật nuôi cấy in vitro giúp giải quyết hiệu

quả các hạn chế và khó khăn trên Ngoài ra, sau xử lý đột biến hiện tượng đột biến không chỉ xảy ra ở các mắt mầm của những mẫu vật trên, mà còn có thể ở bất kỳ những vùng mô nào đó có trên mẫu Các phương pháp trồng trọt và chọn lọc truyền thống không khai thác được tiềm năng đột biến này

Kỹ thuật đột biến kết hợp với nuôi cấy mô tế bào là phương pháp có hiệu quả nhất đối với việc cải thiện giống ở các loài có thể nhân giống bằng phương pháp vô tính như chuối, táo, cọ, khoai tây, cúc, hồng, (Ahloowalia and Maluszynski, 2001) Theo Chahal and Gosal (2002) tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô có những ưu điểm như: nhiều yếu tố có tính chất ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn; sử dụng tế bào trần, tế bào riêng rẽ làm cho cơ hội chọn lọc có tính chất “lưỡng bội” bị giảm thiểu tối đa; có rất ít cơ hội cho sự hình thành thể khảm nếu cây tái sinh có nguồn gốc từ một tế bào; tần suất đột biến thường khá cao bởi mỗi tế bào thường được tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây đột biến; chọn

lọc in vitro đối với nhiều stress sinh học và phi sinh học có thể đạt hiệu quả tốt khi

cho xử lý ở mức độ tế bào trong môi trường nuôi cấy; hàng triệu tế bào (cây tiềm năng) có thể được thanh lọc chỉ trong một hộp petri (Mohan, 2010)

1.5.2 Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

Việc xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có thể theo nhiều cách

khác nhau, tùy thuộc vào tác nhân gây đột biến, loại cây trồng, bộ phận xử lý và mục đích Qua tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả cho thấy việc gây tạo đột biến kết hợp có thể theo các phương thức sau:

- Xử lý trước khi nuôi cấy in vitro: thường áp dụng đối với xử lý bằng tác

nhân vật lý Cây được trồng vào các chậu, lựa chọn cây sinh trưởng phát triển tốt đem xử lý, có thể xử lý từng bộ phận của cây hoặc toàn cây Cây được lựa chọn để

xử lý đột biến thường là những dòng thích nghi tốt với điều kiện địa phương, chỉ thiếu một vài tính trạng cần thiết nào đó (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,

2007) Các bộ phận của cây sau xử lý được tách ra và đưa vào nuôi cấy in vitro

(giai đoạn này có thể nuôi cấy tạo mô sẹo sau đó chọn lọc mô sẹo tái sinh cây hoặc

có thể nuôi cấy không thông qua mô sẹo mà tạo chồi trực tiếp, sau đó chọn lọc các

dạng biến dị) Theo Predieri and Virgilio (2007) các chồi in vitro cần được sàng

lọc và nhân qua ít nhất 3 thế hệ M1V3 sau đó tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng theo dõi, phân lập đánh giá để thu thập các thể đột biến có lợi

Bằng phương pháp này Datta et al (2005) đã nghiên cứu xử lý đột biến in vitro cho cây hoa cúc bằng chiếu xạ gamma với liều 500 rad Tác giả đã xử lý trên bốn giống khác nhau (Flirt, Puja, Maghi và Sunil) sau đó đưa vào nuôi cấy in vitro, chọn lọc các dạng biến dị và tái sinh cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài

đồng ruộng, tác giả đã phân lập được một số dạng đột biến trong đó có 5 dạng biến

đổi về màu sắc, hình thái hoa có triển vọng Barakat et al (2010) đã nghiên cứu

chiếu xạ tia gamma cho cánh hoa cúc với liều 0,5 Gγ và 1,0 Gγ, chồi tái sinh từ

mô sẹo đã tạo ra nhiều dạng màu sắc hoa và dạng cánh hoa khác nhau

- Xử lý trong nuôi cấy in vitro: phương pháp này có thể áp dụng cho cả hai

tác nhân vật lý và hóa học Theo phương pháp này giống cây trồng cần xử lý được lựa chọn bộ phận đưa vào nuôi cấy mô (có thể nuôi cấy tái sinh mô sẹo nếu xử lý

mô sẹo hoặc nuôi cấy tạo chồi nếu xử lý chồi), sau đó xử lý gây tạo đột biến bằng các tác nhân vật lý hoặc hóa học (có thể xử lý riêng rẽ từng tác nhân hoặc xử lý kết hợp cả 2 tác nhân) Bước tiếp theo là phân lập các dạng đột biến sau đó tiến hành nhân qua các thế hệ Ở giai đoạn này nếu mục đích chọn tạo giống chống chịu người ta thường chọn lọc các dạng đột biến bằng phương pháp chọn lọc có áp lực chọn lọc (chọn lọc tính chịu mặn, tính kháng bệnh, tính chịu nhiệt,…) (Jain, 2010) Sau đó sẽ tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh giá thu thập các dạng đột biến, lựa chọn các dòng triển vọng đánh giá sự sai khác ở

mức độ phân tử bằng marker DNA (Joanna et al., 2012)

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp được áp dụng

phổ biến và đã mang lại rất nhiều thành công trên các đối tượng cây trồng khác

nhau (Mohan, 2010) Theo phương pháp này Seetohul et al (2009)đã nghiên cứu

xử lý đột biến in vitro cho cây khoai sọ Chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường

dinh dưỡng, sau đó được xử lý chiếu xạ gamma với liều 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,

20, 40 và 60 Gγ Dựa trên đặc điểm hình thái, tác giả phân lập được 44 dạng đột

biến sau đó sử dụng kỹ thuật RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền của 11 dạng, kết quả cho thấy giữa chúng có sự đa dạng di truyền cao

Hình 1.5 Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ

(Nguồn: Novak and Brunner, 1992) Đào Thị Thanh Bằng và cs (2007) đã chiếu xạ mô sẹo hoa cúc bằng tia gamma (Co60) ở các liều từ 1 - 15 Krad Sau khi cây con tái sinh và cấy chuyển 3 lần, cây con được đưa vào môi trường ra rễ Nhiều thể khảm và đột biến solid đã xuất hiện ở thế hệ M1V4 và đã thu được 3 thể đột biến solid về màu sắc quan trọng

đó là hoa màu hồng, hoa màu vàng và hoa có chóp cánh màu xanh

Suprasanna et al (2009) đã xử dụng lá non cây mía đưa vào nuôi cấy tạo