Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của dung dịch hoạt hóa điện hóa và hạt

Chạy đua cùng với sự gia tăng nhanh chóng của số người mắc bệnh ung thư, các nhà khoa học ở các phòng thí nghiệm khắp nơi trên thế giới cũng đang gấp rút tìm ra phương pháp chữa trị ung thư mới không những có hiệu quả cao mà còn ít gây hại đối với cơ thể. Ngoài các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ động vật và thảo dược được chú trọng tìm kiếm, khai thác và tách chiết và chế biến làm thuốc chữa ung thư, các nhà khoa học còn quan tâm đến một số vật liệu khác được chế tạo bằng công nghệ hóa lý có các hoạt tính sinh học. Trong số đó có một số chất như Cis – Platin đã trở thành thuốc có hiệu lực chữa ung thư cao. Ngày nay một số vật liệu khác đang được thế giới quan tâm về khả năng ứng dụng trong ung thư như dung dịch HHĐH (4) (6) (25) (31), các vật liệu từ có kích thước nano hay vẫn được gọi là chất lỏng từ (15) (18).

MỞ ĐẦU

Ung thư hiện đang là mối đe dọa trên toàn cầu, thách thức hệ thống y tế của mọi quốc gia với hàng chục triệu trường hợp mắc bệnh, khoảng 7 triệu người chết mỗi năm Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo rằng đây là bệnh có khả năng gây tử vong hàng đầu thế giới trong thế kỷ XXI

Chạy đua cùng với sự gia tăng nhanh chóng của số người mắc bệnh ung thư, các nhà khoa học ở các phòng thí nghiệm khắp nơi trên thế giới cũng đang gấp rút tìm ra phương pháp chữa trị ung thư mới không những có hiệu quả cao mà còn ít gây hại đối với cơ thể Ngoài các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ động vật và thảo dược được chú trọng tìm kiếm, khai thác và tách chiết và chế biến làm thuốc chữa ung thư, các nhà khoa học còn quan tâm đến một số vật liệu khác được chế tạo bằng công nghệ hóa lý có các hoạt tính sinh học Trong số đó có một số chất như Cis – Platin đã trở thành thuốc có hiệu lực chữa ung thư cao Ngày nay một số vật liệu khác đang được thế giới quan tâm về khả năng ứng dụng trong ung thư như dung dịch HHĐH (4) (6) (25) (31), các vật liệu từ có kích thước nano hay vẫn được gọi là chất lỏng từ (15) (18)

Dung dịch HHĐH (Electrochemical Activated Water) đã và đang được các nhà khoa học Viện Khoa học Công nghệ Môi trường nghiên cứu và đã thành công

về quy trình chế tạo và đưa vào ứng dụng trong một số bệnh viên để sát khuẩn, khử trùng Dung dịch HHĐH cũng đã được một số tài liệu trong nước công bố là có tác dụng ức chế khối u, công trình đã chỉ ra rằng dung dịch này có khả năng làm giảm

tỷ lệ phát sinh khối u thực nghiệm trên chuột (8)

Công nghệ sinh học nano là sự giao thoa giữa công nghệ sinh học và công nghệ nano Theo tổ chức NIH (thuộc tổ chức chăm sóc sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ) định nghĩa: công nghệ sinh học nano là việc áp dụng các hệ thống có kích thước nano vào các thuốc sinh học và sử dụng hệ thống sinh học làm khuôn mẫu để phát triển các vật liệu mới với kích cỡ nano Các nguyên liệu nano, có kích thước 1-

1000nm, cho phép tương tác duy nhất với hệ thống sinh học ở mức độ phân tử đã tạo ra những thúc đẩy, những tiến bộ quan trọng trong xác định, chuẩn đoán và điều trị ung thư ở người và hình thành những phương pháp mới của u bướu học nano

Các hạt nano đang được phát triển cho việc chuẩn đoán bằng hình ảnh khối u in vivo nhờ sự định hình sinh học phân tử của các bio marker nano hay những đặc

điểm từ tính, phát màu của vật liệu nano, sự phân phối thuốc có đích để chuẩn đoán

và điều trị nhiều bệnh ác tính

Hạt nano từ đang được các nhà khoa học thuộc viện Khoa học Vật liệu thuộc viện Khoa học Công nghệ Việt Nam chế tạo để ứng dụng vào điều trị ung thư bằng phương pháp gia nhiệt (hyperthermotherapy) Hạt nano từ được làm từ Fe3O4 và thường được bọc bằng một số vật liệu như dextran, carboxydextran, tinh bột (starch), chitosan… để làm tăng sự phân bố đồng đều trong chất lỏng từ và tăng tính tương hợp sinh học khi đưa vào cơ thể sống Khi hạt nano từ được tập trung tại một vùng nào đó trong cơ thể, dưới tác động của một từ trường bên ngoài có thể làm tăng nhiệt độ của vùng đó lên đến 50oC, đó chính là cơ sơ của liệu pháp nhiệt trị ung thư

Để góp phần đưa một số vật liệu mới như dung dịch HHĐH, hạt nano từ được sản xuất tại Việt Nam vào ứng dụng trong điều trị ung thư, chúng tôi nhận đề

tài: Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của dung dịch hoạt hóa điện hóa và hạt

nano từ” làm đề tài luận văn cao học nhằm thực hiện một số nhiệm vụ cơ bản sau:

1 Thử tác dụng kháng u báng trên chuột của dung dịch HHĐH

2 Thử áp dụng liệu pháp nhiệt trị ung thư ex vivo

3 Nghiên cứu phương pháp đưa một số vật liệu nano từ vào khối u thực

nghiệm in vitro

Kết quả của đề tài là cơ sở để góp phần đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụng phương pháp sử dụng hạt nano từ trong nhiệt trị ung thư Đồng thời kiểm chứng lại những nghiên cứu trước đó về khả năng ức chế sự hình thành u báng của dung dịch hoạt hóa điện hóa trên chuột nhắt trắng Swiss mang tế bào ung thư Sarcoma 180

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 DUNG DỊCH HHĐH VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y SINH

1.1.1 Đặc điểm của dung dịch hoạt hóa điện hóa

a) Các thông số kỹ thuật của dung dịch HHĐH

Dung dịch hoạt hóa điện hóa gồm hai loại: dung dịch Anolyte và dung dịch Katholyte Các chỉ tiêu quyết định đặc tính, tác dụng của dung dịch HHĐH là chỉ số

pH và chỉ số ORP (Oxidation-Reduction Potential) :

 pH là đại lượng thường dùng để đánh giá nồng độ ion hydro

trong dung dịch và nó có thể dao động trong khoảng từ 0 đến 14 Giá trị pH đạt từ 0 - 7 dung dịch mang tính axit, còn khi đạt từ 7

- 14 thì dung dịch mang tính kiềm

 ORP là chỉ số ôxi hóa khử: là công chuyển điện tử từ chất ôxi

hóa tới chất khử hay từ chất khử sang chất ôxi hóa Nước tự nhiên trung tính có độ pH xấp xỉ 7,0 còn ORP=(+)100 - (+)400mV Khi được hoạt hóa thì pH của dung dịch Katholyte tăng đạt 8-12 và ORP nhận giá trị âm; trong khi đó dung dịch Anolyte có pH giảm xuống đến 2,5-6 còn ORP có thể tăng lên đén (+)1000mV

b) Đặc tính của dung dịch Anolyte và dung dịch Katholyte

* Đặc tính của dung dịch Anolyte được đảm bảo bởi các thông số vật lý và hóa học sau:

- Các thông số vật lý của dung dịch Anolyte: chất lỏng trong suốt, không màu, có mùi axit, và hơi chua

- Các thông số hóa học chủ yếu: pH=2,5-6,5; thế ôxi hóa khử đạt tới +1000mV, hàm lượng các chất ôxi hóa quy đổi ra Clo hoạt tính = 250-300 (mg/l);

các hợp chất ôxi hóa chính của dung dịch Anolyte: HO*, HO2-, H2O2, O3, HClO, ClO-,…

* Dung dịch Katholyte là chất lỏng có màu xám đục, sau một thời gian thì các loại muối lắng xuống đáy và dung dịch trở nên trong Các thông số chính của dung dịch Katholyte: giá trị pH đạt 7,5-13; giá trị ORP ở mức âm <(-) 350mV; hàm lượng các chất ôxi hóa quy đổi ra Clo hoạt tính là rất nhỏ

Dung dịch Katholyte rất mềm, không có mùi, các cấu trúc trong dung dịch tồn tại ở dạng đám nhỏ nên nước trở nên linh hoạt hơn Dung dịch Katholyte có tác dụng thúc đẩy các quá trình sinh học, đồng thời nó cũng có tác dụng chống các tác nhân ôxi hóa gây bệnh trong cơ thể động vật, nâng cao sức chịu đựng với tia xạ ion hóa, củng cố hệ thống miễn dịch và tăng sức kháng nhiễm trùng (5) (7)

1.1.2 Ứng dụng của dung dịch hoạt hóa điện hóa trong y sinh

a) Điều trị vết bỏng và rửa vết thương trên da

Da là một hệ thống bảo vệ cơ thể con người khỏi những tác nhân gây bệnh từ bên ngoài Khi da bị bỏng đồng nghĩa với việc cơ thể mở toang cửa đối với những tác nhân gây bệnh Vì thế, bệnh nhân bỏng rất dễ nhiễm các loại vi khuẩn từ bên

ngoài

Nhiễm khuẩn là một trong những triệu chứng nặng hay gặp ở những bệnh nhân bỏng Trong môi trường sống bình thường đã có rất nhiều loại vi khuẩn nhưng trong môi trường bệnh viện các vi khuẩn này còn nhiều và nguy hiểm hơn vì chúng

là những vi khuẩn gây bệnh và đa số chúng đã kháng thuốc Mặt khác bản thân vết bỏng là một môi trường rất thuận lợi cho vi trùng phát triển với các tế bào hoại tử

đã thối rữa, và các chất dịch Do đó vết bỏng càng lớn thì nguy cơ nhiễm trùng càng cao và điều này sẽ dẫn đến hậu quả nghiêm trọng với các biến chứng: viêm phổi, viêm đường tiết niệu, nặng hơn có thể là nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn toàn thân

và đe doạ nghiêm trọng đến tính mạng bệnh nhân

Tại nhiều nước trên thế giới (Nhật Bản, Nga ) dung dịch HHĐH đã được ứng dụng trong việc điều trị bỏng ở các khâu như sát khuẩn vết bỏng chống nhiễm trùng, kích thích sự tăng sinh của da

Nhiều nghiên cứu tương tự đã được tiến hành và khẳng định dung dịch Anolyte có tác dụng chống nhiễm trùng vết bỏng cao : Tại phân khoa bỏng Viện cấp cứu Skliphocovski N V - Liên bang Nga đã sử dụng dung dịch HHĐH để áp lên bề mặt vết bỏng Nếu vết bỏng là bỏng độ 2 hoặc 3a thì sau khi áp khoảng 5 đến

12 ngày thì thấy vùng bỏng bớt sưng tấy và xuất hiện màng da lành mạnh Đối với trường hợp bỏng 3b, sau khi áp dung dịch HHĐH 5 đến 7 ngày đã thấy có rất nhiều phế chất hóa học và giải phẫu bị thải ra ngoài Người bị bệnh điều trị bằng dung dịch HHĐH thấy dịu cảm giác đau, giảm hiện tượng rỉ máu ở vết thương, bớt khó chịu và giảm hẳn các phản ứng dị ứng Ưu điểm của việc điều trị vết bỏng bằng dung dịch HHĐH là đơn giản, dễ thực hiện, tác dụng tốt mà hiệu quả kinh tế lại cao

Bệnh viện đa khoa Tosei - Nhật Bản cũng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch Anolyte đối với các vết thương trên da, vết thương sau phẫu thuật và

đã đưa đến kết luận là dung dịch Anolyte có tác dụng tránh nhiễm trùng, làm giảm lượng nội độc tố trong máu bệnh nhân rất có hiệu quả, các vết thương trên da chóng lành (29)

Tác dụng của dung dịch HHĐH trong việc điều trị vết bỏng cũng giống như đối với vết thương có mủ, được dự liệu là kết hợp hiệu quả diệt khuẩn với làm sạch khối mủ - hoại thư ra khỏi vết thương, từ đó giúp vết thương chóng lành hơn Các nghiên cứu đã khẳng định khả năng làm lành vết thương của dung dịch HHĐH do vậy có thể ứng dụng dung dịch HHĐH vào việc điều trị vết thương, bỏng trong lĩnh vực y tế (31)

b) Ứng dụng dung dịch HHĐH để khử khuẩn bệnh viện và dụng cụ y tế

Bệnh viện là môi trường có chứa nhiều loại vi khuẩn đặc biệt đa số chúng là những loại vi khuẩn đã kháng thuốc, điều này có ảnh hưởng nghiêm trọng tới các bệnh nhân Vi khuẩn có thể tồn tại trong không khí, sàn nhà, bề mặt giường tủ, hay

cả những dụng cụ trực tiếp thăm khám cho bệnh nhân Việc khử trùng những dụng

cụ này, đặc biệt đối với những dụng cụ phức tạp, đắt tiền, phải dùng lại cho nhiều bệnh nhân, bộ máy lọc máu, kính nội soi dạ dày cần những hóa chất chuyên dụng để tẩy trùng và đảm bảo cho sức khoẻ bệnh nhân là rất cần thiết Tuy nhiên việc này cũng gặp phải một số khó khăn như sự thiếu hiểu biết về thiết bị, thuốc khử trùng, kinh phí Dung dịch HHĐH đã và đang được nhiều nước ứng dụng rộng rãi trong việc khử trùng ở bệnh viện

Đại học Minnesota - Mỹ, Đại học Quốc gia Sao Paulo - Brazil cũng đã tiến hành thử nghiệm khả năng tẩy trùng của dung dịch Anolyte trên dụng cụ y tế: kính nội soi ruột, dạ dày và cho kết quả là dung dịch Anolyte có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gram (-), Gram (+) và tế bào nấm men

Tại phân viện MZ (Liên Xô) hay khoa lọc máu của bệnh viện Vologodski cùng nhiều bệnh viện khác của Nga đã sử dụng dung dịch HHĐH (Anolyte) để tiệt trùng các dụng cụ y tế: bộ lọc máu, làm sạch các dụng cụ chuyên cho việc điều trị vết bỏng, tẩy rửa các cặn hữu cơ, tẩm vào băng gạc, tẩy sàn

Việc dùng dung dịch HHĐH để khử trùng có nhiều ưu việt hơn so với các chất khử trùng truyền thống: Tác dụng diệt khuẩn cao - diệt được nhiều loại vi khuẩn, vi trùng gây bệnh, kể các những loài có sức đề kháng cao như bào tử, thời gian diệt khuẩn ngắn hơn nhiều so với các loại hóa chất khác, không bị hiện tượng nhờn thuốc như các loại hóa chất khác, không độc hại, an toàn cho người sử dụng thường xuyên tiếp xúc với dung dịch HHĐH Nguyên nhân là do lượng khoáng thấp

và nồng độ các chất trong dung dịch Anolyte khá nhỏ, dung dịch Anolyte có chứa nhiều chất sát khuẩn nên có khả năng sát khuẩn cao, có khả năng tiêu diệt được hầu hết vi khuẩn Gram (+), Gram (-), bào tử, virut, nấm mốc, xạ khuẩn Hơn nữa dung dịch HHĐH có khả năng kết hợp được với các hóa chất tẩy rửa khác làm tăng hiệu quả khử trùng Mặt khác với cùng hiệu quả sử dụng so với các hóa chất khác thì việc dùng Anolyte để khử trùng lại có hiệu quả kinh tế cao do được sản xuất tại chỗ

bằng thiết bị đơn giản, rẻ tiền, người vận hành không cần chuyên môn cao, không cần dự trữ và bảo quản dung dịch sử dụng, giá thành rẻ hơn nhiều lần

Khoa vi sinh và khoa chống nhiễm khuẩn thuộc bệnh viện Bạch Mai đã tiến hành lấy mẫu và thực hiện hơn 800 xét nghiệm để đánh giá tác dụng sát khuẩn các

bề mặt trong bệnh viện và kết quả cho thấy dung dịch HHĐH có khả năng tiêu diệt

được hơn 10 loại vi khuẩn phổ biến trong bệnh viện: Stafilococus aureus, Pseudomonas aeruginore, Shigela, Bacilus subtilis, Candida albicans

Với những đặc tính ưu việt trên, nhiều bệnh viện và trung tâm y tế cũng đã đưa dung dịch HHĐH vào sử dụng: BV Bạch Mai, BV Đống Đa, BV Quân Y 108,

BV Quân Y 103, Viện Bỏng Quốc gia, BV Đa khoa Thái Bình, Viện Vệ sinh Dịch

tễ Trung ương, Viện Y học Lâm sàng các bệnh nhiệt đới, và nhiều trung tâm y tế tại các tỉnh thành, địa phương trong cả nước (8)

c) Ứng dụng trong điều trị một số bệnh và những nghiên cứu trong lĩnh vực ung thư

Dung dịch HHĐH cũng được ứng dụng để điều trị một số bệnh liên quan đến đường tiêu hóa (tiêu chảy), loét dạ dày và tá tràng, viêm gan, viêm ruột kết, bệnh ngoài da (Eczema), viêm đại tràng, bệnh phì tuyến tiền liệt, bệnh khối u Kết quả thu được là rất khả quan Để điều trị các bệnh này các nhà khoa học đã dùng kết hợp cả dung dịch Anolyte và dung dịch Katholyte với mục đích: dùng Anolyte để chặn đứng các tác nhân, vi khuẩn gây bệnh, oxi hóa các sản phẩm chưa oxi hóa hết (trong điều trị loét dạ dày)… tiếp đó dùng Katholyte để làm chất kích thích sinh học, nâng cao khả năng miễn dịch, phục hồi mô, vùng bị tổn thương (4)

Trong việc điều trị ung thư cũng bước đầu có những thử nghiệm Nhà sáng chế Krotov D L đã dùng dung dịch HHĐH để điều trị cho gần 50 người bệnh, trong

đó có cả bệnh khối u, ông nhận thấy Katholyte có tác dụng nâng cao khả năng miễn dịch, điều hoà chức năng gan (6)

Tiến sỹ Hyun-Won KIM cũng đã nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển khối u của dung dịch HHĐH khi tiến hành truyền tế bào ung thư hắc tố B16 để gây

u cho chuột C57BL/6 Kết quả thật đáng quan tâm: Kích thước khối u ở ngày thứ 10

là 0,.27 cm3 với nhóm được uống nước Katholyte trong khi của nhóm uống nước lọc là 0,48 cm3 Kích thước khối u ở ngày thứ 19 là 3,32 cm3 với nhóm được uống nước dung dịch Katholyte, trong khi nhóm đối chứng là 6,02 cm3, cho thấy tỷ lệ ức chế là 54% Thời gian sống của chuột đối chứng là 36 ngày trong khi chuột được uống dung dịch Katholyte là 44 ngày Ông cũng khảo sát việc ức chế sự di căn của các tế bào ung thư B16 của dung dịch Katholyte và nhận thấy rằng số sự ức chế di căn đạt 44% so với nhóm đối chứng (25)

Và theo nghiên cứu của chúng tôi trước đây về tác dụng của dung dịch HHĐH trên chuột mang u báng Sarcoma 180 lên tỷ số phát triển u và thời gian sống thêm của chuột cũng cho thây kết quả tương tự

Đó là những tiền đề chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong việc ứng dụng dung dịch HHĐH với ung thư Và một phần nội dung của luận văn này là phần kiểm chứng lại tác dụng chống ung thư của dung dịch HHĐH trên chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180

1.2 NHỮNG KHÁI NHIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y SINH

1.2.1 Một số khái niệm cơ bản

a) Vật liệu nano

Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước nanomet

Về hình dáng vật liệu, người ta phân chia thành các loại sau:

 Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano, không còn chiều tự do nào cho điện tử), ví dụ như đám nano, hạt nano…

 Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước hạt nano, điện tử được tự do trên một chiều (hai chiều cầm tù), ví dụ như dây nano, ống nano…

 Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, hai chiều tự do, ví dụ như màng mỏng…

 Ngoài ra còn có vật liệu cấu trúc nano hay nanocomposite, trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nano, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

Bất cứ vật liệu kim loại nào cũng có sự hưởng ứng với từ trường ngoài (H), thể hiện bằng độ từ hoá (từ độ, M) Tỷ số c = M/H được gọi là độ cảm từ Tuỳ thuộc vào giá trị, độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau

Vật liệu có c << 0 (~ -10 -6) được gọi là vật liệu nghịch từ

Vật liệu có c > 0 (~ 10 -6) được gọi là vật liệu thuận từ

Vật liệu có c >> 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu sắt từ

Ngoài độ cảm từ, một số thông số khác cũng rất quan trọng trong việc xác định tính chất của vật liệu, ví dụ như: từ độ bão hoà (từ độ đạt cực đại tại từ trường lớn), từ dư (từ độ còn dư sau khi ngừng tác động của từ trường ngoài), lực kháng từ (từ trường ngoài cần thiết để một hệ, sau khi đạt trạng thái bão hoà từ, bị khử từ) Nếu kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó (thông thường từ vài đến vài chục nanomet, phụ thuộc vào từng vật liệu cụ thể), tính sắt từ biến mất, chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ Đối với vật liệu siêu thuận từ, từ dư và lực kháng từ bằng không Điều đó có nghĩa là, khi ngừng tác động của từ trường ngoài, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa Đây là một đặc điểm rất quan trọng khi dùng vật liệu này cho các ứng dụng y sinh học (2)

b) Hạt nano từ

Hạt nano từ dùng trong y sinh học phải thoả mãn điều kiện là có tính đồng nhất cao về kích thước của các hạt từ, từ độ bão hoà lớn và vật liệu có tính tương hợp sinh học tốt

Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hoà lớn nhất tại nhiệt độ phòng Ngoài ra sắt còn không độc đối với cơ thể người và có tính ổn định khi làm việc

trong môi trường không khí nên các vật liệu như oxit sắt được nghiên cứu rất nhiều

để làm hạt nano từ

Hạt nano từ dùng trong y sinh học thường ở dạng dung dịch từ hay còn gọi là chất lỏng từ Một dung dịch từ gồm ba thành phần: hạt nano từ, chất hoạt hoá bề mặt và dung môi

Hạt nano từ là thành phần duy nhất quyết định đến tính chất từ của dung dịch

từ Chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano phân tán trong dung môi, tránh các hạt kết tụ lại với nhau ngay cả khi có mặt của từ trường ngoài, ngoài ra nó còn có tác dụng “che phủ” hạt nano khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch của

cơ thể và tạo các mối liên kết hoá học với các phân tử khác Dung môi là chất lỏng mang toàn bộ hệ (2)

c) Quy trình chế tạo hạt nano từ

Hạt nano từ có thể được chế tạo theo hai nguyên tắc: vật liệu khối được nghiền nhỏ đến kích thước nano và hình thành hạt nano từ các nguyên tử Phương pháp thứ nhất gồm các phương pháp nghiền và biến dạng như nghiền quay và nghiền rung Phương pháp thứ hai được phân thành hai loại là phương pháp vật lý

và phương pháp hoá học Phần dưới đây chỉ xin trình bày một số phương pháp phổ biến nhất (2)

Phương pháp nghiền

Phương pháp nghiền được phát triển từ rất sớm để chế tạo dung dịch nano từ, dùng cho các ứng dụng vật lý Trong các nghiên cứu đầu tiên về dung dịch nano từ, vật liệu từ tính oxyt sắt Fe3O4 được nghiền cùng với chất hoạt hoá bề mặt (axit oleic) và dung môi (dầu, hexan) Chất hoạt hoá bề mặt giúp cho quá trình nghiền được dễ dàng và đồng thời tránh các hạt kết tụ với nhau Sau khi nghiền, sản phẩm phải trải qua một quá trình phân tách hạt rất phức tạp để có được các hạt tương đối đồng nhất

Phương pháp nghiền có ưu điểm là đơn giản và chế tạo được với khối lượng lớn Việc thay đổi chất hoạt hoá bề mặt và dung môi không có ảnh hưởng nhiều tới quá trình chế tạo Nhược điểm của phương pháp này là tính đồng nhất của các hạt nano từ không cao vì khó có thể khống chế quá trình hình thành hạt nano

Dung dịch nano từ chế tạo bằng phương pháp này thường được dùng cho các ứng dụng vật lý (2)

Phương pháp hoá học

Phương pháp hoá học chế tạo các hạt nano từ cũng được phát triển từ lâu Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra các hạt nano với độ đồng nhất khá cao, rất thích hợp cho những ứng dụng trong sinh học

Nguyên tắc tạo hạt nano từ bằng phương pháp hoá học là kết tủa từ một dung dịch đồng nhất dưới các điều kiện nhất định hoặc phát triển hạt từ thể hơi khi một hoá chất ban đầu bị phân rã

Trong phương pháp kết tủa từ dung dịch, khi nồng độ của chất đạt đến nồng

độ bão hoà tới hạn, trong dung dịch sẽ xuất hiện đột ngột những mầm kết tụ Các mầm kết tụ đó sẽ phát triển thông qua quá trình khuếch tán của vật chất từ dung dịch lên bề mặt của các mầm cho đến khi mầm trở thành hạt nano

Phương pháp tạo hạt từ thể hơi: Sự nhiệt phân bụi hơi chất lỏng và laser là những kỹ thuật rất tốt để tạo ra trực tiếp và liên tục các hạt nano từ tính Sự khác biệt giữa nhiệt phân bụi hơi chất lỏng và laser là ở trạng thái cuối cùng của vật liệu

ở phương pháp nhiệt phân bụi hơi, hạt nano thường kết tụ thành từng đám và kết quả thu được là chất rắn xốp Còn ở phương pháp nhiệt phân laser, các hạt nano được tạo ra có kích thước rất nhỏ, độ đồng nhất cao và không bị kết tụ (2)

1.2.2 Một số ứng dụng của hạt nano từ trong sinh y học

Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng trong cơ thể

và ứng dụng ngoài cơ thể Sau đây chúng tôi chỉ xin trình bày một số ứng dụng tiêu biểu nhất đã và đang được nghiên cứu Phân tách và chọn tế lọc tế bào là ứng dụng

ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi những tế bào khác Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, tăng thân nhiệt cục bộ, tăng độ tương phản trong chụp ảnh cộng hưởng từ (33)

a) Phân tách và chọn lọc tế bào

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ là một trong những phương pháp thường được sử dụng

Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn:

 Đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu

 Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ Hạt nano từ thường dùng là hạt oxyt sắt Các hạt này được bao phủ bởi một loại hoá chất có tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl alcohol Hoá chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano từ phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của dung dịch từ (28) Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc hiệu trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hormon, acid folic tìm thấy và hình thành liên kết giống như liên kết giữa kháng thể với kháng nguyên Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt từ được bao phủ bởi các chất hoạt hoá tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt nano từ đôi khi cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nanomet (2) (7) (28)

Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài Từ trường ngoài tạo ra một lực hút các hạt từ có mang tế bào được đánh dấu Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài

b) Dẫn truyền thuốc

Một trong những nhược điểm của hoá trị liệu đó là tính không đặc hiệu Khi cho vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các tế bào mạnh khoẻ cũng bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc Chính vì thế việc dùng các hạt nano từ như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970 Những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính

Dẫn truyền thuốc bằng hạt nano từ có hai lợi ích cơ bản là:

 Thu hẹp phạm vi phân bố của thuốc trong cơ thể nên ít ảnh hưởng đến

tế bào lành, làm giảm tác dụng phụ của thuốc

 Giảm lượng thuốc điều trị

Hình 1.1: Cấu tạo hạt nano ứng dụng trong y sinh

Hạt nano từ sử dụng để dẫn truyền thuốc thường được bọc hai lớp: Lớp bảo

vệ hạt nano từ và lớp mang chức năng Lớp bảo vệ hạt nano thông thường là polymer, silica, carbon Lớp mang chức năng có thể là các nhóm chức, kháng nguyên, kháng thể, các phân tử thuốc Hai lớp này có khả năng khắc phục nhược điểm mà các hạt nano không được bao bọc không thể có đó là tăng tính tương hợp của hạt với cơ thể, chống tác nhân môi trường làm ảnh hưởng đến tính chất của hạt như ôxi hóa, tăng khả năng phân tán của hạt trong dung dịch, giảm độc tính của hạt Việc tạo ra các lớp bao bọc bằng polymer có thể theo nguyên tắc polymer hóa các

Lớp chức năng Lớp bảo vệ

monomer như methacrylic acid và hydroxyethyl methacrylate với sự có mặt của hạt nano Fe3O4 hoặc theo nguyên tắc “cross-linking” các polymer albumin, chitosan, cùng với sự có mặt của các hạt nanô được đã phân tán trong dung dịch Ngoài ra bằng phương pháp này người ta còn tạo ra các tiểu cầu rỗng có thể dùng để mang thuốc hoặc các hạt nano (1) (30)

Hạt nano từ có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị có tác dụng như một hạt mang Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một dung dịch từ và đi vào cơ thể qua hệ tuần hoàn Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể

Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc

có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt

c) Tăng thân nhiệt cục bộ

Phương pháp tăng thân nhiệt cục bộ các tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt nano từ Hiện nay bên cạnh các phương pháp chữa trị ung thư truyền thống như phẫu thuật, hoá trị và xạ trị, liệu pháp nhiệt trị đang được đánh giá rất triển vọng và được đặc biệt quan tâm nghiên cứu (15) Cơ sở điều trị của liệu pháp này dựa trên tác dụng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư khi nhiệt độ của chúng được đẩy lên trên 420C Tác dụng của nhiệt độ đối với tế bào cho tới nay vẫn đang là vấn

đề được tranh luận và nghiên cứu, tuy nhiên người ta vẫn phân loại liệu pháp dựa vào hai vùng nhiệt độ điều trị chính (4):

 Nhiệt trị: điều trị trong vùng nhiệt độ 42-450C trong vài giờ Để đạt được hiệu quả cao, liệu pháp này cần được kết hợp với các phương pháp điều trị khác như xạ trị hoặc hoá trị

 Nhiệt huỷ: là phương thức điều trị với mục đích tiêu diệt tất cả các tế bào ung thư bằng nhiệt Do đó nhiệt độ tối thiểu phải được tạo ra vùng khối u là trên 500C

Ngoài ra tuỳ vào kích thước, hình dạng và vị trí của khối u, các phương pháp nhiệt trị có thể ứng dụng theo ba dạng: (i) Nhiệt trị toàn thân: có tác dụng nhiệt trên toàn cơ thể (ii) Nhiệt trị vùng: được sử dụng để chữa trị các khối u có kích thước lớn (iii) Nhiệt trị cục bộ có tác dụng nhiệt trên vùng diện tích nhỏ, như các khối u đơn lẻ (4)

Để tránh việc các tế bào khoẻ mạnh bị đốt quá nhiệt, nhiệt lượng cục bộ phải được tập trung vào vùng khối u, đồng thời nhiệt độ đốt cũng phải được điều khiển một cách chính xác Năm 1957, Gilchrist đã đưa ra ý tưởng sử dụng các hạt từ đặt trong từ trường xoay chiều như các tác nhân tạo nhiệt Một khi các hạt từ kích thước

đủ nhỏ này (đã được tương hợp sinh học bằng các polymer) được gắn xung quanh khối u ung thư, nhiệt năng toả ra từ chúng sẽ tác dụng trực tiếp lên khối u và chỉ ảnh hưởng tới một lớp mỏng tế bào khoẻ mạnh xung quanh

Kể từ các thành công ban đầu này, nhiệt - từ trị sử dụng hạt từ đã được coi như một trong những phương pháp triển vọng nhất trong cuộc chiến chống lại ung thư Phương pháp này sau đó được phát triển theo ba hướng, phân loại bởi các cách đưa hạt từ vào vùng khối u:

 Nhiệt trị theo đường động mạch: cơ sở của phương pháp này dựa vào đặc điểm là các khối u gan được nuôi bởi hệ động mạch gan, trong khi các mô tế bào gan bình thường lại nhận được nguồn cung cấp máu từ

hệ tĩnh mạch chủ Khi tiêm các hạt từ vào đường động mạch gan, người ta thấy rằng chúng tập trung ở vùng khối u với nồng độ cao hơn hẳn những vùng khác Phương pháp này rất phù hợp với việc chữa trị ung thư gan ác tính và cũng là cơ sở của một số phương pháp được sử dụng hiện nay như xạ trị lựa chọn, hoá trị động mạch gan và hoá trị liên động mạch

 Nhiệt trị tiêm trực tiếp: đây là phương pháp tiêm trực tiếp dung dịch của các hạt sắt từ có kích thước tương đối lớn vào vùng khối u, sau đó

sử dụng từ trường xoay chiều để đốt nóng chúng Ngược lại với nhiệt trị động mạch, trong đó nhiệt bắt nguồn từ các hạt sắt từ trong mạch máu, nhiệt tạo ra ở nhiệt trị tiêm trực tiếp xuất phát từ các hạt tập trung ở ngoài tế bào

 Nhiệt trị nội tế bào: đây là phương pháp nhiệt - từ trị sử dụng các hạt

từ phức tạp hơn Các hạt có thể được bọc với các kháng thể đặc hiệu

và được đưa đến khối u qua đường động mạch hoặc tiêm trực tiếp Một số nghiên cứu cho thấy các hạt từ này sau đó có thể chui vào tế bào ung thư nên người ta thường gọi đây là phương pháp nhiệt trị nội

tế bào Ngoài ra các hạt từ vẫn được tập trung ở bên ngoài tế bào và đóng góp vào quá trình đốt nóng khối u cũng như những vùng xung quanh khối u

Hướng nghiên cứu ứng dụng chất lòng siêu thuận từ này đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Một số hãng thiết bị y tế của Mỹ, Australia và đặc biệt là Đức đã quan tâm và phát triển các thiết bị chiếu từ để thử nghiệm cho chữa trị lâm sàng Hãng NanoMagforce của Jordan cùng với Đại học Y

ở Berlin đến nay đã tiến hành chữa trị thử nghiệm lâm sàng cho gần 100 bệnh nhân ung thư khác nhau và cho kết quả rất khả quan Tuy nhiên việc nghiên cứu để tìm ra các vật liệu nano từ bọc các chất tương hợp sinh học thích hợp vẫn đang là vấn đề nghiên cứu rất quan trọng

d) Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ

Chụp cộng hưởng từ, hay đầy đủ là chụp cộng hưởng từ hạt nhân, là một phương pháp thu hình ảnh của các cơ quan trong cơ thể sống và quan sát lượng nước bên trong các cấu trúc của các cơ quan Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên một hiện tượng vật lý là hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân

Chụp cộng hưởng từ hạt nhân bắt đầu được dùng để chẩn đoán bệnh từ năm

1982 Hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân bắt đầu được 2 tác giả Bloch và Purcell phát hiện năm 1952 Sự khác nhau cơ bản giữa chụp cộng hưởng từ và chụp X quang là năng lượng dùng trong chụp X - quang là năng lượng phóng xạ tia X còn trong chụp cộng hưởng từ là năng lượng vô tuyến điện Do đó chụp ảnh cộng hưởng

từ hạt nhân sẽ ít gây hậu quả lâu dài cho bệnh nhân hơn là chụp X – quang

 Mỗi hạt nhân trong môi trường vật chất đều có một mômen từ tạo ra bởi spin (xoay) nội tại của nó

 Các hạt nhân đều sắp xếp một cách ngẫu nhiên và từ trường của chúng triệt tiêu lẫn nhau do đó không có từ trường dư ra để ghi nhận được

 Khi có một từ trường mạnh tác động từ bên ngoài các mômen từ của hạt nhân sẽ sắp hàng song song cùng hướng hoặc ngược hướng của từ trường, ngoài ra chúng còn chuyển động dần chung quanh hướng của từ trường bên ngoài nó

 Các vec tơ từ hạt nhân sắp hàng song song cùng chiều với hướng từ trường bên ngoài có số lượng lớn hơn các vectơ từ hạt nhân sắp nhân sắp hàng ngược chiều và chúng không thể triệt tiêu cho nhau hết, do đó có mạng lưới từ hoá theo hướng của từ trường bên ngoài

 Các vectơ tạo ra hiện tượng từ hoá chủ yếu theo hướng của từ trường bên ngoài; đó là trạng thái cân bằng

 Trong trạng thái cân bằng không có một tín hiệu nào có thể được ghi nhận Khi trạng thái cân bằng đó bị xáo trộn sẽ có tín hiệu được hình thành

và có thể ghi lại hình ảnh (32)

Các hạt nano siêu thuận từ tạo thành từ oxit sắt thường được sử dụng như tác nhân làm tăng độ tương phản trong chụp cộng hưởng từ Sự có mặt của chúng làm nhiễu loạn từ trường địa phương nên làm thay đổi giá trị từ trường đi rất nhiều Dựa trên đặc tính của từng mô trong cơ thể mà độ hấp thụ hạt nano mạnh hay yếu Ví dụ, hạt nano có kích thước 30nm được bao phủ dextran có thể nhanh chóng đi vào gan

và lá lách trong khi ở các cơ quan khác thì chậm hơn Như vậy, mật độ hạt nano ở

các cơ quan là khác nhau dẫn đến sự nhiễu loạn từ trường địa phương cũng khác nhau làm tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ (7)

1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA KHỐI U TRONG CƠ THỂ

1.3.1 Đặc điểm về cấu trúc

Hình 1.2: Cấu trúc của khối u in vivo (11)

Khối u trong cơ thể không chỉ chứa các tế bào ung thư mà chúng là một phần trong mạng lưới phức tạp các loại tế bào khác nhau cấu trúc nên khối u bao gồm tế bào nội mô, nguyên bào sợi và các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch Tế bào nội mô tạo nên mạch máu cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của khối u và là con đường để tế bào ung thư thâm nhập vào vòng tuần hoàn tạo nên sự di căn của khối

u Các nguyên bào sợi tạo nên cấu trúc vật lý của khối u tham gia tiết các chất nền ngoại bào (ECM- extracellular matrix) Các tế bào miễn dịch tạo nên cấu trúc của

khối u gồm các bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit, tương bào, bạch cầu lympho

và đại thực bào trong đó đại thực bào là thành phần chủ yếu nhất Một khối u trong

cơ thể khi đạt đến kích thước nhất định sẽ phân thành 3 vùng tế bào: Phần bên ngoài chứa các tế bào ung thư có khả năng phân chia tạo nên sự tăng kích thước của khối

u Phần ở giữa chủ yếu gồm các tế bào ít phân chia do thiếu hụt dưỡng chất không lấy được từ môi trường Phần trong cùng gồm chủ yếu các tế bào đã bị hoại tử do tình trạng thiếu hụt nghiêm trọng ôxi và dưỡng chất, hình thành lõi hoại tử ở trung tâm khối u (hình 1.2)

để hình thành cứ điểm mới, gây nên sự di căn ung thư

Nguyên bào sợi tạo nên cấu trúc vật lý của khối u và tham gia tiết các chất nền ngoại bào (ECM) Chất nền ngoại bào này rất dễ bị điều biến bởi các nhân tố tăng trưởng được tiết ra bởi chính các tế bào trong khối u Sự biến đổi của ECM có vai trò quan trọng trong sự chết của tế bào và sự di căn của ung thư do nó hoạt động như một barrie vật lý ngăn cản sự tăng sinh mạch máu và sự rò rỉ của các tế bào miễn dịch

Các tế bào trong khối u cũng tiết ra các chất đóng vai trò kích thích quá trình tăng sinh mạch máu, thu hút các tế bào miễn dịch như MCP-1, M-CSF, G-CSF, VEGF Các tế bào miễn dịch được gắn với khối u bởi một loạt các nhân tố vật lý và

nhân tố môi trường như sự giảm oxi huyết và các nhân tố hóa ứng động Sự liên kết giữa các tế bào miễn dịch với khối u tương tự như quá trình hàn gắn vết thương trong cơ thể Các tế bào miễn dịch liên quan bị làm lệch hướng khỏi quá trình hàn gắn vết thương bởi khối u Điều đó tạo ra sự liên tưởng đến việc nghiên cứu về khối

u như “vết thương không bao giờ lành” (26) Các tế bào miễn dịch bị thu hút bởi khối u phần lớn là bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit, tương bào, bạch cầu lympho và đại thực bào Chúng được thu hút vào khối u để dọn dẹp các tế bào hoại

tử, làm sạch môi trường quanh khối u

1.4 ĐẠI THỰC BÀO – PHƯƠNG TIỆN VẬN CHUYỂN VẬT LIỆU NANO TỪ VÀO TRONG KHỐI U

1.4.1 Nguồn gốc của đại thực bào

Đại thực bào là loại tế bào biệt hóa cuối cùng của hệ thống thực bào đơn nhân (monocyte) Monocyte có nguồn gốc từ tủy xương, từ một tế bào khởi nguyên gọi là đơn vị tạo dòng bạch cầu hạt và đại thực bào (CFU_GM) - các bạch cầu đa tiềm năng này có thể khởi động hai con đường: hoặc tạo ra bạch cầu trung tính hoặc đại thực bào Con đường tạo thành đại thực bào được tiến hành ngay sau lần phân chia đầu tiên của CFU_GM để tạo thành nguyên bạch cầu đơn nhân (monoblast), chúng phân chia để tao thành tiền bạch cầu đơn nhân (pro-monocyte), dạng này sẽ phân chia để tạo ra bạch cầu đơn nhân (monocyte), monocyte di cư ra khỏi tủy xương vào trong dòng máu nơi chúng có chu kỳ sống khoảng 24 giờ Bạch cầu đơn nhân từ máu tuần hoàn này sau đó sẽ rời khỏi mạch máu đi vào trong mô, nơi đó chúng biệt hóa thành đại thực bào, đôi khi chúng vào trong các mô một cách ngẫu nhiên và biệt hóa thành đại thực bào cư trú cố định ở các mô Đại thực bào cố định

có những đặc điểm hình thái và chức năng đặc trưng phụ thuộc vào cơ quan mà nó khu trú: các tế bào Kupfer ở gan, các ổ đại thực bào ở phổi Ngoài việc ngẫu nhiên

đi vào trong mô ĐTB cũng có thể đi vào các mô bị viêm nhiễm một cách có định hướng nhờ các tín hiệu thương tổn được phát ra từ chính mô đó Hiện tượng này là

tính chất của quá trình hàn gắn vết thương và sự thấm vào vị trí viêm quan sát trong ung thư vú và các ung thư khác

Đại thực bào chỉ hình thành những chức năng đặc biệt khi chúng được hoạt hóa một cách hợp lý nhờ các kích thích, các tín hiệu hoạt hóa này rất phức tạp bao gồm sự giảm oxi, pH, lipit, cytokine như nhân tố kích thích tạo dòng đại thực bào (M-CSF), tác nhân hoại khối u TNF-α, và interferon-γ (23) (26)

1.4.2 Chức năng của đại thực bào

Đại thực bào có khả năng bắt giữ và tiêu diệt các vật lạ hay là các tác nhân bệnh lý với có thể Do vậy một trong những vai trò quan trọng nhất của đại thực bào

là loại bỏ các thành phần hoại tử và bụi trong phổi, loại bỏ các tế bào chết đóng vai trò rất quan trọng trong hiện tượng viêm Trong giai đoạn sớm của hiện tượng viêm thành phần tế bào tham gia phản ứng miễn dịch chống viêm chủ yếu là các tế bào bạch cầu trung tính (bạch cầu đa nhân trung tính), các tế bào này sau khi thực hiện nhiệm vụ thực bào hoặc sẽ bị chết hoặc già đi và trở thành tế bào mủ Các tế bào già cỗi và tổn thương này sẽ được thực bào bởi các đại thực bào bào để làm sạch các tổ chức mô và cơ quan trong cơ thể Việc loại bỏ bụi cũng như các tổ chức hoại tử được thực hiện một cách hiệu quả nhờ các đại thực bào cố định ở tổ chức mô và cơ quan Chúng cư trú tại các vị trí chiến lược như phổi, gan, thần kinh, xương, lách và

tổ chức liên kết nhờ đó chúng có thể nhanh chóng bắt giữ các vật lạ như bụi và các tác nhân gây bệnh đồng thời cũng có thể kịp thời phát tín hiệu kêu gọi sự hỗ trợ của các đại thực bào di động khác

Đại thực bào bắt giữ các tác nhân gây bệnh, đưa chúng vào các bóng không bào, các bóng khhông bào này sau đó sẽ hòa màng với lysosome để tạo thành thể thực bào phagolysosome Bên trong các tiêu thể, các enzyme cũng như các gốc ôxy

tự do độc sẽ tiêu hủy tác nhân xâm nhập này Tuy nhiên, một số vi khuẩn như trực khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis có khả năng đề kháng với sự tiêu hóa trong tiêu thể Trong trường hợp này, chính đại thực bào lại trở thành nơi trú ẩn của vi khuẩn gây bệnh Cùng với các tế bào giết tự nhiên (natural killer cell) và các tế bào

T hay độc tế bào, đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch qua trung gian tế bào Đại thực bào đi vào trong khối u nhờ kích thích hóa học được tạo ra bởi chính khối u Kích thích này có thể được khởi đầu bằng sự thiếu hụt oxi, các sản phẩm đe dọa nội bào hoặc các sản phẩm tiết của các oncogene (gene sinh ung thư) Tùy thuộc vào trạng thái hoạt động, đại thực bào gắn kết khối u có khả năng ảnh hưởng đến các quá trình như sự hình thành mạch, hình thành các yếu tố phân bào mới, sự trình diện kháng nguyên, thoái hóa chất nền và gây độc

1.4.3 Sự hấp dẫn đại thực bào đi vào các khối u

Một dãy các tác nhân được tạo ra bởi tế bào ung thư trong khối u được biết là

có hóa tính với đại thực bào Ở ung thư vú những tác nhân được nghiên cứu nhiều nhất là MCP-1, M-CSF, G-CSF, VEGF Bên cạnh tế bào ung thư, các nguyên bào sợi và các tế bào cơ trơn cũng tạo ra tạo ra các chất có hóa tính với đại thực bào này Sự biểu hiện của MCP-1 đã được chứng minh ở các dòng tế bào ung thư vú ở người, nó cũng được liên hệ với sự tăng mật độ của đại thực bào ở các bệnh nhân ung thư vú

M-CSF và G-CSF thường được tạo ra trong nhiều loại khối u chúng là chất kích thích của nhiều loại tế bào liên quan đến phản ứng miễn dịch trong đó có đại thực bào CSF-1 là chất điều hòa sự sinh sản, sự biệt hóa, khả năng sống sót của đại thực bào (14) VEGF là chất thúc đẩy mạnh sự tạo mạch được tạo ra bởi tế bào ung thư vú ở người Nó cũng là tác nhân đồng tương tác thu hút sự đi vào khối u của đại thực bào

Sự chết hoại tử là đặc điểm thông thường của ung thư do hậu quả là chứng thiếu máu cục bộ và sự giảm oxi ở khối u, chính tín hiệu này lại có khả năng kích thích tạo mạch và thu hút đại thực bào đến dọn dẹp làm sạch khối u Điều này rất đáng chú ý bởi phần lớn các tế bào ung thư ác tính cũng có khả năng kích thích tạo mạch cao, những khối u có sự giảm oxi huyết có mức tập trung các đại thực bào đi vào nhiều Kết quả nghiên cứu này gợi ý chúng ta rằng sự hiện diện của các đại thực bào trong khối u được điều chỉnh bởi chính sự thiếu oxi ở phía trong khối u

Thông thường tập tính đại thực bào trong ung thư vú có thể là thúc đẩy hoặc chống lại khối u Vì có nhiều các con đường hoạt hóa khác nhau nên dường như có một hỗn hợp phức tạp các hiệu ứng sẽ xảy ra thông qua nhiều phân tử tham gia, với

sự chọn lọc tự nhiên trong vi môi trường của khối u đã chọn ra các dòng có nhiều hoạt tính khi có mặt của đại thực bào tiền thân Do sự thiếu oxi trong lõi của khối u khiến cho nhiều loại tế bào sản xuất ra các cytokine hình thành mạch máu và các enzyme phân giải, đồng thời làm giảm quá trình chết theo chương trình là nhân tố thu hút sự tập trung của đại thực bào vào khối u Tương tự, sự hoạt hóa cuối cùng của các đại thực bào liên kết khối u sẽ phụ thuộc vào bản chất tự nhiên của khối u

và có thể là tác nhân trong sự chọn lọc của một vài kiểu hình của khối u (23)

- Hoạt động chống lại khối u của các đại thực bào liên kết với khối u

Đại thực bào có một vài cơ chế tiềm năng kháng ung thư Đầu tiên chúng là thành phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch như interferon, interleukin,các nhân tố hủy hoại khối u TNF-a Một trong những chức năng miễn dịch của quá trình chống ung thư là sự có mặt của kháng nguyên để cơ thể vật chủ có thể hình thành phản ứng miễn dịch trung gian tế bào chống lại tác nhân “lạ” thông qua tế bào

T, một kháng thể đặc hiệu phải được biểu hiện trong quần thể tế bào T để chúng có thể nhận ra và giết tế bào ung thư

Khối u thường biểu hiện dạng đột biến của các protein thông thường do đó

có thể bị nhận ra bởi các tế bào T nhờ sự trình diện các kháng nguyên lạ của các đại thực bào cho tế bào T thông qua các phân tử MHC lớp II Từ đó các tế bào T nhận

ra và giết chết các chết các tế bào ung thư Trong quá trình này tế bào TCD4 tương tác với tế bào TCD8 nhắm đến các tế bào ung thư biểu hiện protein đột biến trên bề mặt của chúng khi tương tác với MHC lớp I Khối u mà có khả năng lẩn tránh khỏi

hệ thống này sẽ được chọn lựa đại thực bào trong suốt quá trình phát triển của khối

u một phần của hệ thống miễn dịch (23)

- Hoạt động thúc đẩy sự phát triển khối u của các đại thực bào liên kết với khôi u

Các đại thực bào có thể trực tiếp kích thích sự phát triển của khối u bằng việc tiết ra các cytokine kích thích sự phân bào và chúng có thể ức chế phản ứng miễn dịch tác động lên khối u Chúng có thể kích thích trực tiếp sự hình thành mạch bằng việc tiết ra cytokine tạo mạch và gián tiếp thông qua nhân tố điều biến chất nền ngoại bào qua đó hoạt hóa sự hình thành mạch và di căn (23, 26)

1.4.4 Ứng dụng của đại thực bào trong liệu pháp chống ung thư

Do đại thực bào có chức năng là thực bào các tác nhân lạ, xâm nhập vào các

tổ chức cơ quan khu trú, đồng thời có tính thấm cao vào các khối u do đó rất nhiều con đường lợi dụng ĐTB được sử dụng làm cái đích của các liệu pháp chống ung thư Khả năng thấm của đại thực bào vào khối u mở ra khả năng lợi dụng ĐTB liên

hệ với khối u như một thành phần, phương tiện điều trị hay như hệ thống phân phối thuốc vào khối u Ví dụ, đại thực bào vật chủ được chuyển gen với gen điều trị được hoạt hóa bởi sự giảm oxi trong lõi khối u, hay có thể được đánh dấu với các thuốc điều trị hay các thuốc sinh học (9) (12) (19) (23) Chúng cũng có thể được sử dụng

để vận chuyển các hạt nano ứng dụng trong điều trị ung thư vào trong khối u

1.5 KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ (Multicellular tumor Spheroid)– MỘT MÔ

HÌNH UNG THƯ IN VITRO

1.5.1 Khối cầu đa bào và lịch sử nghiên cứu

Trong những năm gần đây và cả trong tương lai, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào trong thử nghiệm và phát triển các thuốc chống ung thư chiếm một

vị trí quan trọng trong kỹ thuật sàng lọc hiệu năng cao Kỹ thuật này được coi là bước tiên phong trong việc tìm kiếm và phát triển thuốc, bởi nó cho phép thử nhanh, với một số lượng lớn các chế phẩm khác nhau mà mỗi chế phẩm chỉ tốn một

ít mẫu, chi phí rẻ do có thể bán tự động hóa nhờ các thiết bị chuyên dụng Ngoài ra

nó còn cho phép phát hiện nhanh các ảnh hưởng đặc hiệu, đa mục tiêu của thuốc lên

tế bào: (i) đáp ứng của tế bào đến các kích thích bên ngoài làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phân chia, sức sống và độc đối với tế bào; (ii) nghiên cứu các con

đường truyền tín hiệu trong tế bào thông qua các thụ thể, các kênh vận chuyển vật chất, các chất truyền tin thứ cấp, sự hoạt hóa các kinase; (iii) nghiên cứu đáp ứng của tế bào qua các mức độ phiên mã, dịch mã (5)

Mặc dù hệ thống nuôi cấy tế bào đơn lớp (mô hình 2D) có những ưu điểm trên nhưng nó vẫn có những yếu điểm như: (i) không thể hiện được đặc điểm chức năng thực tế của mô 3D (mô 3 chiều thực tế trong cơ thể) do nó thiếu mối tương tác giữa tế bào – tế bào, tế bào – chât nền như là điều kiện đánh dấu sự khác biệt về quá trình khuếch tán và vận chuyển Các tế bào nuôi cấy tiếp xúc trực tiếp với môi trường xung quanh, khác với việc hấp thụ thuốc rồi thông qua nhiều con đường thuốc được dẫn đến khối u nên hạn chế việc tiên đoán hiệu quả tác động của thuốc trong việc chữa trị Chính vì thế thử độc tính trên mô hình nuôi cấy 2 chiều sẽ không phản ánh được chính xác các ảnh hưởng thực tế của chế phẩm như thử trên

mô hình nuôi cấy 3D (22) (ii) Rất nhiều tế bào, cả tế bào bình thường lẫn tế bào ung thư khi nuôi cấy đơn lớp hay trôi nổi dần dần mất đi một số đặc tính: mất khả năng tạo lập và duy trì các khối mô hay mất khả năng giao tiếp và tương tác với nhau Đê khắc phục những nhược điểm của hệ thống nuôi cấy đơn lớp (2D), mô hình nuôi cấy tế bào 3D tạo khối cầu đa bào (Spheroid) đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng ứng dụng cao trong thực tế

Khối cầu đa bào ung thư (Multicellular tumor Spheroid) là một tập hợp các

tế bào được nuôi cấy phát triển theo dạng liên kết với nhau để tạo thành một khối cầu nhỏ, khối cầu này sinh trưởng bằng sự nhân lên của các tế bào thành phần Nó

là biểu hiện những đặc tính trung gian của mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp với mô

hình in vivo

Hệ thống nuôi cấy 3D (hình thành Spheroid) này lần đầu tiên được mô tả bởi Harrison vào những năm đầu của thế kỷ 20, sau đó đến năm 1912 được khẳng định lại bởi Carrel Năm 1944 Holfreter nuôi cấy thành công với các tế bào phôi, sau đó

là Moscona nghiên cứu về khả năng tụ tập thành khối của các tế bào ung thư (13)

Bằng kỹ thuật này McAllister và cộng sự chỉ ra rằng: tập tính của các tế bào trong khối Spheroid rất gần với khối u in vivo gây tạo trên chuột và các khối u tự nhiên ở người Nuôi cấy các tế bào không phải tế bào ung thư tạo Spheroid cũng giữ được hình thái như mô ban đầu Kiểu nuôi cấy tạo khối Spheroid này cũng được các tác giả gọi là “nuôi cấy mô”, “nuôi cấy u nhỏ” hay “nuôi cấy giả cơ quan” Nghiên cứu đầu tiên sử dụng Spheroid để đánh giá ảnh hưởng của một phương pháp điều trị ung thư được công bố năm 1970 Đường cong đáp ứng liều thu được khi sử dụng Spheroid làm đối tượng nghiên cứu tương tự với đường cong đáp ứng liều khi thí

nghiệm trên khối u rắn, kể từ đó Spheroid được đánh giá là một mô hình tạo u in vitro có giá trị, tương tự các đặc tính của khối u in vivo (13)

1.5.2 Cấu trúc và khả năng ứng dụng của Spheroid

Cấu trúc của nó khá tương đồng với khối u nhỏ thực tế hoặc khối u di căn

nhỏ in vivo cả về cấu trúc lẫn chức năng Mô hình này cũng được sử dụng rộng rãi

trong nghiên cứu ung thư thực nghiệm Khắc phục những nhược điểm Chúng được

sử dụng để sàng lọc thuốc vì cho phép phân tích các ảnh hưởng của mối liên hệ 3

chiều với hoạt tính thuốc ở mô hình thực nghiệm in vitro, không khó khăn như việc

nuôi cấy cơ quan Mô hình sinh trưởng của Spheroid được mô tả là có vành ngoài là vùng các tế bào tăng sinh, vùng bên trong gồm các tế bào yên lặng và cũng giống với khối u thực tế thì vùng trong cùng của Spheroid là vùng gồm các tế bào đã chết (24, 27)

Hình 1.3: Cấu trúc khối u in vitro

Vùng tăng sinh Vùng yên lặng Vùng lõi hoại tử

Về mặt chức năng cũng có sự tương đồng của khối cầu đa bào Spheroid với khối u in vivo, bởi vì nghiên cứu cho thấy sự kháng nhiều loại thuốc và chống chịu với bức xạ cũng có thể đạt được ở mô hình nuôi cấy 3 chiều Sự thực rằng khả năng chống chịu bị mất đi khi nuôi cấy tế bào đơn lớp nhưng lại được tái thiết lập lại ở Spheroid, điều này đã gợi ý rằng nuôi cấy tế bào 3 chiều có ảnh hưởng cơ bản đến tập tính của tế bào Những nguyên nhân của hiện tượng đó có thể do là do: áp lực thiếu oxy (hypoxic stress) của các tế bào phía trong của Spheroid, thứ hai là hình dạng nhân đặc hiệu và cách đóng gói ADN trong tế bào, ba là sự liên hệ tế bào – tế bào, và bốn là tương tác tế bào – môi trường Tất cả 4 nguyên nhân trên đã gây ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen của tế bào nuôi cấy

Mặc dù giống với các khối u in vivo hơn so với nuôi cấy lớp đơn, nhưng sự đại diện đến mức độ nào cho các đặc điểm khối u in vivo thì cần phải được thể hiện

đối với mỗi hệ thống Spheroid riêng lẻ Khả năng ứng dụng của các kết quả còn tùy thuộc vào từng dòng tế bào do chúng liên quan sự hình thành Spheroid của các dòng

tế bào khác nhau, với một dãy các nhân tố và điều kiện sinh trưởng cho các thí nghiệm Mặc dù còn một số hạn chế, Spheroid thể hiện như một mô hình khối u có giá trị cao cho phép có được sự mô tả đặc điểm của các liệu pháp điều trị gây độc tế bào dưới những điều kiện mà một phần giả lập được vi môi trường của khối u thực

sự Các kết quả thu được khi sử dụng Spheroid để nghiên cứu có thể được kiểm nghiệm trên các mô hình động vật thí nghiệm và mẫu bệnh tình nguyện (17)

Với những đặc tính tương tự khôi u in vivo như vậy nên Spheroid được chúng tôi chọn làm trong thí nghiệm này nhằm kiểm tra khả năng thu hút đại thực bào đi vào bên trong của khối u

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng dòng Swiss 4 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20g và chuột từ 7 - 12 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 40 g được Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ổn định 25 – 27oC, được cung cấp thức ăn và nước uống đầy đủ, đảm bảo khỏe mạnh khi bắt đầu thí nghiệm Chuột Swiss được sử dụng để tách lấy đại thực bào dùng trong thí nghiệm

2.1.2 Máu ngoại vi người khỏe mạnh

Máu ngoại vi của người khỏe mạnh, không nhiễm các bệnh truyền nhiễm, được cung cấp bởi viện Huyết học Truyền máu Trung ương Chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này để tách bạch cầu đơn nhân, sau đó kích thích tạo dòng thành đại thực bào

2.1.3 Tế bào ung thư MCF7 nuôi cấy in vitro

Tế bào ung thư MCF7 là dòng tế bào ung thư biểu mô vú của người, thời gian nhân đôi của các tế bào này là 29h, được cung cấp bởi Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm thuộc bộ môn Tế bào –Mô- Phôi và Lý sinh thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Tế bào được sử

dụng để tạo mô hình khối u thực nghiệm in vitro (Spheroid)

2.1.4 Dung dịch HHĐH

Dung dịch HHĐH do Trung tâm phát triển Công nghệ cao thuộc Viện khoa học Môi trường -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp ở hai dạng:

- Anolyte với thế oxi hóa khử +900mV, pH trung bình từ 7,1 – 7,4

- Dung dịch Katholyte với thế oxy hóa khử – 800mV; pH = 11  13

2.1.5 Dung dịch hạt nano từ

Chúng tôi sử dụng bốn loại dung dịch hạt nano từ đó là hạt nano từ bọc Starch (Fe3O4 – St), hạt nano từ bọc Chitosan (Fe3O4 – Cs), hạt nano từ bọc Chitosan có gắn Curcumin (Fe3O4– Cs ~ Cur) và hạt nano từ bọc axit Oleic có gắn Curcumin (Fe3O4 – Ol~ Cur) Cả bốn loại hạt nano từ này đều được cung cấp bởi Viện Khoa học Vật liệu, thuộc Viện Khoa học Việt Nam:

 Fe3O4 – St: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 10 mg/ml

 Fe3O4 – Cs: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 10 mg/ml

 Fe3O4 – Cs ~ Cur: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 8 mg/ml

 Fe3O4 – Ol~ Cur: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 8 mg/ml

2.2 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Gibco BRL (Mỹ)

 Môi trường nuôi cấy DMEM của Gibco BRL (Mỹ)

2.2.2 Hoá chất

 FBS: Invitrogen, Mỹ

 PBS: Invitrogen, Mỹ

 Trypsine: của Gibco BRL (Mỹ)

 Trypan Blue 0,4% của Merk

 Nước cất và nước khử ion đã được khử trùng

 hGM_CSF: (Granulocyte Macrophage colony stimulating fator, human, recombinant) Nhân tố kích thích tạo dòng đại thực bào của người (Mpbio, Mỹ)

 Penicillin-streptomycine 100 IU/ml của Invitrogen, Mỹ

 Agarose: 2% trong PBS

 Hoechst 33342 100ng, Invitrogen, Mỹ

 BSA: Invitrogen, Mỹ

 Paraformaldehyde

 Texas Red®-X Phalloidin, Invitrogen, Mỹ

 Anti - human CD14 antibodies, Invitrogen, Mỹ

 Triton X - 100®

 Fluoresence mounting medium, Dako, Mỹ

 Ficoll Histopaque 1,077, Sigma

2.2.3 Máy móc thiết bị

 Tủ hood của Esco, Mỹ

 Tủ ấm CO2 của Shell Lab, Mỹ

 Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40CFL của Zeiss, Thụy Sỹ

 Kính hiển vi quang học của Zeiss, Thụy Sỹ

 Kính hiển vi laser quét Confocal LSM 510 của Zeiss, Thụy Sỹ

 Pipette aid của Gilson

 Pipette man 1ml, 200µl, 100µl, 10µl của Gilson

 Máy li tâm Universal 320

 Bình ổn nhiệt Gra Operation SS40-1, Đức

 Máy lọc khí IQAir Cleanroom, Thụy sỹ

 Nồi hấp ALP,Ltd, Nhật, Model CL-32L

 Tủ sấy Kottermann, Đức

2.2.4 Vật tư tiêu hao

 Chai nuôi T25, T75, đĩa pettri các cỡ, đĩa 24 và 96 giếng của Corning (Mỹ)

RPMI 1640

(Invitrogen)

DMEM 11185 (Invitrogen)

PBS 10x (Invitrogen)

Fetal Bovine Serum

(Invitrogen) Penicilin - Streptomicin

Ficoll

Mẫu Fe 3 O 4 – Cs Mẫu Fe 3 O 4 – Cs ~ Cur Mẫu Fe 3 O 4 – Ole ~ Cur

Tủ sấy Kottermann, Đức Bình ổn nhiệt Gra

Operation SS40-1, Đức

Tủ ấm CO2 của Shell Lab (Mỹ)

Máy gia nhiệt

Pipetman và Pipet-aid

(Gilson)

Đĩa nuôi cấy multiplates Đĩa nuôi cấy 100mm,

35mm

Hình 2.1: Hóa chất, trang thiết bị và đồ dùng tiêu hao

Kính hiển vi soi ngược

Axiovert 40CFL của Zeiss

(Thuỵ Sỹ)

Kính hiển vi laser quét Confocal LSM 510 của Zeiss (Thuỵ Sỹ)

Máy li tâm Universal 320

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm và phương thức tác động của dung dịch HHĐH

Phương pháp gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp thường quy của phòng Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm:

Trích báng chuột (đã giữ giống 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồi đem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm Thomas dưới kính hiển vi quang học Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106TB/ml Tiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào xoang bụng mỗi chuột tương đương 1 x 106TBUT/con Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u báng gây tạo (7)

Dung dịch Anolyte đã được điều chỉnh tạo thế oxy hóa khử khác nhau: +900mV với pH trung tính được thử nghiệm trên chuột theo phương thức tiêm vào xoang bụng chuột (i.p – intra peritoneal)

Dung dịch Katholyte được đưa vào chuột thử nghiệm theo phương thức cho chuột uống– xông thẳng thực quản (per.osophagus)

2.3.2 Xác định tỷ lệ chết của tế bào ung thư sau khi gia nhiệt ex vivo

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng dòng TB Sarcoma 180 Quy trình tiến hành như sau:

 Trích báng chuột đã được giữ giống 10 ngày bằng kim tiêm 18G

 Ly tâm tế bào 1200v/p trong 5 phút, rửa tế bào bằng PBS 3 lần

 Đếm tế bào, chia tế bào vào các ống ly tâm 1,5 ml với mật độ 1 triệu TB/ml

 Bổ sung hạt nano từ bọc Starch vào các ống tế bào

 Gia nhiệt khảo sát ở hai điều kiện là khác nhau về nồng độ hạt nano từ

và thời gian gia nhiệt các ống tế bào trên Thí nghiệm gia nhiệt được thực hiện tại phòng Vật liệu Siêu dẫn, viện Khoa học Vật liệu

 Sau khi gia nhiệt, nhuộm TB bằng Blue trypan 0,4% theo tỷ lệ 1:1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, tiến hành đếm và xác định tỷ lệ sống chết của tế bào

2.3.3 Xác định tỷ số phát triển u (GR%) và tỷ số ức chế u (IR%), và thời gian sống kéo dài thêm (ILS%)

Chúng tôi sử dụng 40 chuột Swiss đã được cấy truyền 106 tê bào Sarcoma

180 trong thí nghiệm này Chuột được phân lô thí nghiệm như sau:

Bảng 2.1 Phân lô thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của dung dịch HHĐH

Lô Mục đích

ĐCUT (20 chuột)

Anolyte +900mV (20 chuột)

Mổ sau 10 ngày cấy

Theo dõi thời gian sống

Ngày thứ 10 sau khi cấy truyền TBUT chúng tôi mổ một nửa số chuột ở mỗi

lô để xác định số lượng tế bào ung thư có trong xoang bụng chuột nhằm xác định tỷ

số phát triển u và tỷ số ức chế u của dung dịch HHĐH Số chuột còn lại tiếp tục được chăm sóc theo dõi để xác định thời gian sống kéo dài thêm của chuột

Phương pháp xác định GR% và IR% và ILS % của chuột thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thường quy tại phòng thí nghiệm thuộc nhóm Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào Mô Phôi và Lý sinh (8)

2.3.4 Phân lập đại thực bào

a) Phân lập đại thực bào từ chuột Swiss

- Chuột Swiss 20 tuần tuổi (chuột già) được sử dụng cho thí nghiệm này do

đại thực bào tách ra từ chuột già đã trưởng thành, được biệt hóa hoàn toàn và có khả năng thực hiện chức năng thực bào tốt nhất

- Dung dịch PBS có bổ sung 5% FBS được chuẩn bị để làm dung dịch tách đại thực bào Sau khi mổ và tách da bụng chuột ra nhằm bộc lộ màng bao xoang bụng của chuột, dùng bơm tiêm 5ml hút dung dịch PBS có bổ sung 5 % FBS tiêm vào xoang bụng chuột thí nghiệm, lắc nhẹ chuột để dung dịch có thể lan đều xoang bụng Hút dung dịch này ra khỏi xoang bụng, cho vào ống ly tâm 15ml, ly tâm 1000v/p, thu lấy tủa tế bào nuôi trong môi trường DMEM 1.1 Glucose có bổ sung thêm 5% FBS nuôi ổn định ở tủ ấm 37 o C, nồng độ CO2 là 5%

b) Phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, kích thích chúng phát triển thành đại thực bào

Quy trình tách bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, sau đó kích thích các bạch cầu đơn nhân này phát triển thành đại thực bào được tiến hành như sau:

 Chuẩn bị 5ml Ficoll (tỷ trọng 1,077mg/ml) cho vào ống Falcon 15ml

 Pha loãng máu ngoại vi với tỷ lệ 1: 5 trong PBS 1x, sau đó để 30 phút ở nhiệt

độ phòng Ly tâm với tốc độ 1000g/20p ở nhiệt độ phòng

 Loại bỏ phẩn dịch nổi, thu phần tế bào phân cách giữa hai pha (màu trắng đục)

 Pha loãng phần tế bào vừa thu được trong PBS tỷ lệ 1: 10

 Hút 10ml phần dịch này nhỏ nhẹ nhàng vào ống Falcon 15 có chứa 5ml Ficoll đã chuẩn bị trước

 Ly tâm ở 800g trong 20 phút ở nhiệt độ phòng

 Nhẹ nhàng lấy ống tế bào ra khỏi máy ly tâm

 Hút phần dịch trắng ở sát bề mặt Ficoll (~ 2ml) cho vào ống Falcon 50, bổ sung PBS 1x đến 20ml Ly tâm ở 400g trong 25 phút ở nhiệt độ phòng

 Thu lấy tủa tế bào (phần tế bào này chứa phần lớn là bạch cầu đơn nhân), đánh tan phần tế bào này trong môi trường RPMI 10%FBS có bổ sung hGM_CSF tạo huyền phù tế bào Chia huyền phù tế bào này vào các đĩa nuôi cấy, đặt trong tủ ấm (37oC, 5% CO2) (9) (2(10)

2.3.5 Xác định khả năng nhập bào của đại thực bào

a) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi quang học

Do hạt nano từ bọc Chitosan không có khả năng phát màu khi được chiếu ánh sáng kích thích nên để xác định hoạt tính của đại thực bào chúng tôi phải tiến hành quan sát chuyển động của đại thực bào cũng như sự biến đổi màu sắc của đại thực bào sau khi được ủ với hạt nano từ

Đối với đại thực bào của chuột, quy trình tiến hành như sau:

 Nạp đại thực bào tách được từ chuột vào đĩa nuôi cấy

 Bổ sung môi trường DMEM 5% FBS nuôi qua 24h để tế bào ổn định

và bám đều trên mặt đĩa nuôi cấy

 Ủ hạt nano từ vào đĩa chứa đại thực bào

 Quan sát ở các thời điểm: ngay sau khi ủ, sau khi ủ 30 phút, sau khi ủ 1h, sau khi ủ 2h

 Chụp ảnh và ghi lại chuyển động của đại thực bào

Đối với đại thực bào của người, do đại thực bào này được kích thích tạo nên

từ bạch cầu đơn nhân, do đó cần có thời gian hoạt hóa lâu hơn Sau khi tách bạch cầu đơn nhân và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích hGM_CSF

20 ngày chúng tôi mới tiến hành khảo sát hoạt tính của chúng Quy trình khảo sát cũng tương tự như đối với đại thực bào của chuột

b) Xác định sự có mặt của hạt nano từ trong đại thực bào bằng tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua

Để khẳng định chắc chắn hạt nano từ bọc Chitosan đã được đưa vào bên trong đại thực bào của chuột chúng tôi cũng tiến hành làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua đối với đại thực bào chuột sau khi đã được ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs

 Ly tâm tế bào, thu lấy tủa tế bào cố định ở Glutaraldehyde 2% trong đệm PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC

 Sau đó cố dịnh với osmium tetroxide 1% trong PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC

 Loại nước bằng dãy cồn ethanol

 Ngâm trong nhựa thông Epon 812

 Sử dụng máy cắt lát mỏng Ultracut-E (Reichert-Jung) để cắt mẫu thành các lát cắt rất mỏng

 Nhuộm với uranyl acetate and lead citrate

 Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (21)

c) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi LSM 510

Do Curcumin có khả năng phát màu xanh khi có ánh sáng kích thích ở bước sóng ~488nm chiếu qua, do đó chúng tôi lợi dụng điều này để làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang LSM 510, nhằm chứng minh đại thực bào có khả năng đưa các hạt nano từ vào bên trong tế bào (hay khả năng nuốt các hạt nano từ)

Để thực hiện được điều này chúng tôi làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang

Đại thực bào tách ra từ chuột được chuyển lên nuôi cấy ở các Coverslip (lam kính tròn) nuôi ổn định trong điều kiện nuôi cấy cho đại thực bào bám dính chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy

 Ủ đại thực bào với hạt nano từ Fe3O4– Cs ~ Cur và Fe3O4– Ole ~ Cur

 Cố định tế bào trên lam kính bằng paraformaldehyde 4% trong vòng

10 phút

 Rửa loại bỏ paraformaldehyte bằng PBS 1x

 Tạo tính thấm cho tế bào vừa cố định bằng Triton X-100 0,5% trong

 Ủ tiếp 10 phút với thuốc nhuộm nhân tế bào Hoechst 33342

 Rửa mẫu bằng PBS 1x sau đó lật ngược Coverslip gắn lên lam kính bằng Fluorescence Mounting Medium

 Quan sát và chụp hình dưới kính hiển vi laser quét LSM 510

d) Đo từ độ định lượng từ tính của đại thực bào khi ủ với Fe 3 O 4 – Ole ~ Cur

 Đại thực bào tách từ chuột được ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur trong đĩa 24 giếng với hàm lượng 0.5mg/triệu tế bào

 Dừng ủ ở các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ Rửa sạch tế bào bằng PBS

 Ly tâm thu lấy tế bào, đánh tan trong PBS sau đó cho vào các mao quản bẳng thủy tinh với mật độ 104 tế bào/10µl PBS

 Đem đo từ độ tại phòng thí nghiệm Vật liệu Siêu dẫn, Viện Khoa học Vật liệu