Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter Xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, ( NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa

Đứng trước tiềm năng và nhu cầu ấy chúng tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: :°Tuyễn chon ching vi khuẩn Acetobacter xylinum cho mang day, nghién cứu ảnh hưởng etanol, axit axet

Khoá luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA : SINH HỌC

NGUYEN THI QUANG - K29A

“TUYEN CHON CHUNG VI KHUAN ACETOBACTER XYLINUM CHO

MANG DAY, NGHIEN CUU ANH HUONG CUA ETANOL, AXIT AXETIC,

(NH,);SO,, pH,ỨNG DỤNG LÀM THẠCH DỪA ”

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Vi sinh vật

Người hướng dẫn : Thạc sĩ: Nguyễn Khắc Thanh

Hà Nội: 2007

Hà Nội, tháng 05 năm 2007 Sinh viên: Nguyễn thị Quang

Khoá luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành đưới sự hướng dẫn tận tình của

thạc sĩ Nguyễn Khắc Thanh Em xin cam đoan rằng:

Đây là kết quá nghiên cứu của riêng em

Kết quả này không trùng với kết quả của bất kì tác giả nào đã công bố

Nêu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Sinh viên: Nguyễn Thị Quang

TOM TAT CONG TRINH

Thạch dừa là sản phẩm được tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi sinh Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa chuyên hoá thành

Hemixenluoza, qua chế biến và xử lý cùng với một số nguyên liệu thành thạch dừa Đây là món ăn cổ truyền của một số nước Đông Nam Á: Philipin,

Malaixia Việt Nam cũng là một trong những xử sở của dừa Bên cạnh các món

ăn được chế biến từ dừa như cơm dừa, kẹo dừa, bánh đa Thì thạch dừa cũng

được khá nhiều người ưa thích Thạch dừa với thành phần chính là

Hemixenluloza, có tác dụng giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn, dưỡng da, chống lão hoá, giảm cholesterol trong máu và phòng ngừa một số bệnh ung thư Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng vi khuânAcetobacter xylinum và sản xuất

thạch đừa rất ít, xuất hiên một vai cơ sở sản xuất thạch dừa (Thành phố Hồ Chí

Minh) nhưng sản lượng ít trong khi nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày càng tăng, hơn nữa nguồn nguyên liệu lại khá dồi dào Đứng trước nhu cầu và tiềm năng đó cũng như việc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum dén viéc ứng dụng tạo nguồn thức ăn từ nguyên liệu sẵn có là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn và lý

luận sâu sắc, vì vậy tôi đã chọn và nghiên cứu đề tai:”Tuyén chon chúng vi

khuẩn 4cefobacfer xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hướng etanol, axit axefic, (NH¿);SO¿, pH, ứng dụng làm thạch dừa”

Trong đề tài này, từ các nguồn nguyên liệu sẵn có ở trong nước tôi đã phân lập được 60 mẫu, tuyén chon duge 02 ching vi khuan Acetobacter xylinum cho màng dày hơn cả làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo Nghiên cứu khả năng tao mang chon ra hai ching vi khuan Acetobacter xylinum 1a A; va Ag cho mang day nhat

Nghiên cứu tiếp theo là quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang

học

Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng trên

Nghiên cứư ảnh hưởng của etanol, axit axetic, (NH¿)zSO¿x pH tới quá trình tạo màng của hai chủng này

Ứng dụng hai chủng đó vào làm thạch dừa trong phạm vi phòng thí

nghiệm

Khoá luận tốt nghiệp

xuất vào đời sống như: Làm tương, muối dưa, làm bánh mì, sản xuất bia

rượu mà chưa hiểu hết bản chất của quá trình lên men Cho đến gần đây khi

trên thị trường đã xuất hiện một loại thực phẩm mới đó là thạch dừa Đây là một

loại thực phẩm được khá nhiều người ưu thích và bổ đưỡng: Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn, dưỡng da, giảm cholesterol trong máu, chống lão hoá, ngăn ngừa một số bệnh ung thư Tuy nhiên trong nước mới chỉ một vài cơ sở sản xuất, trong khi nhu cầu sử dụng thạch đừa ngày càng cao, hơn nữa nguồn nguyên liệu thô để sản xuất lại khá đồi đào và cũng rất khó dé bảo quản nước dừa Đứng trước tiềm năng và nhu cầu ấy chúng tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài:

:°Tuyễn chon ching vi khuẩn Acetobacter xylinum cho mang day, nghién

cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH,);SO„, pH, ứng dụng làm thạch dừa” 1.2.Mục tiêu của đề tài

Từ các nguồn nguyên liệu: Bia, rượu vang, hoa quả, giấm tiến hành phân lập tuyển chọn các chủng cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men

1.3.Nhiệm vụ

Phân lập tuyển chon cac ching vi khuan Acetobacter xylinum cho mang day, tir

đó chọn ra hai chủng cho màng dày nhất làm đối tượng nghiên cứu

Tìm hàm lượng của etanol, axit axetic, (NH¿);SO¿, pH thích hợp cho sự phát

triển của hai ching Acetobacter xylinum tuyển chọn được

1.4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của các

chung Acetobacter xylinum co khả năng cho màng dày

Góp phần tìm hiểu quá trình sản xuất thạch dừa và nâng cao hiệu qua sản xuất

Phần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Lược sử nghiên cứu và phân loai vi khuan Acetobacter xylinum

(A.xylinum)

2.1.1.Lược sử nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum

Người ta thường gọi quá trình chuyên hoá rượu thành axit axetic là quá trình lên men axetic, nhưng thực chất đấy là một quá trình oxi hoá, vi khuẩn gây ra quá trình này là vi khuẩn axetic thuộc giống 4cefobacter Trước đây con người mới chỉ ứng dụng quá trình này để làm giấm từ rượu vang hỏng một cách thụ động

mà chưa hề biết đến cơ chế và bản chat cud no Tuy vay tới những năm đầu của

thế kỉ 19 con người đã điều chế được axit axetic đậm đặc, biết giấm là sản phẩm

lên men của nhóm vi sinh vật mà ngày nay chúng ta goi la Acetobacter hay vi

khuẩn axetic Từ đó đến nay đã có rất nhiều khoa học nghiên cứu về loại vi

Nam (1862-1868) L.pasteur là người đầu tiên khám phá ra cơ chế của quá trình

lên men axetie, đó là một quá trình oxI hoá rượu etylic Ông đã chứng minh sự

đúng đắn trong nhận xét của Kittzing & Hansen, khẳng định bản chất của quá

trình lên men axetic Với việc sử dụng kính hiển vi bởi Lơvenhuc thì nhận thức

về sự tồn tại của thế giới vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, nhờ đó Pasteur đã xem

xét sự xuất hiện màng trên bia và rượu vang một cách kỹ lưỡng Cuối cùng ông

kết luận màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn (màng là tập hợp những

tế bào trực khuẩn) và ông cũng gọi là Mycoderma aceti

Những nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích cải tiến quá trình lên men axetic Trên cơ sở đó đã có rất nhiều quan điểm phân loại khác nhau ra đời

Khoá luận tốt nghiệp

2.1.2.Phân loại vỉ khuẩn Acetobacter

Từ trước tới nay đã có rất nhiều tac gia dé cập đến vấn đề này trong đó đáng chú

ý nhất là khoá phân loại của Beijerinck Ông phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu

hiệu

Một là: Kha nang str dung dam amoni để thực hiện sự sinh trưởng và phát triển

Hai là: Có hay không có giai đoạn di động trong quá trình phát triển

Năm 1962 Heneberg đã chia tất cả các vi khuẩn axetic thành 4 nhóm theo nơi sống đặc trưng của chúng

Nhóm I: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa Hublon độc với chúng

Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên bia

Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang

Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giắm theo phương pháp nhanh

Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, các vị khuẩn

axetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ

nên đã kết hợp vào họ Nitrobacteriaceae Tir do vi khuân giấm giữ tên là

Acefobacter Năm 1848 Vanght công bố kết quả của mình khi ông quan sát thay

được sự di động của nhiều loai Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum,

Acetobacter oxydans, Acetobacter malanogenum

Vanght đã giải thích rang các loài trên cùng một loại có đơn mao ở cực và đã xác

nhận vị trí của vi khuẩn axetic trong ho Pseudomonadaceae

Ngày nay theo khoá phân loại của Bergeys và nhiều tác giá khác đã xếp vi

khuan Acetobacter va Gluconobacter vao ho Acetobacter iaceae

Nam 1914 Bergeys phan loai cac loai trong giéng Acetobacter thanh hai loai

- Loai 1: Oxi hoa axit axetic thành CO; và H;O

+ Loại này sử dung muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất, đại diện là vi khuân

Acetobacter aceti

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nito duy nhất

Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhày có chứa xenluloza, điển hình là acetobacter xylinum

Trên bề mặt môi trường dịch thé không tao mang nhay chita xenluloza, dàng

dién hinh 1a Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianum

_ Loại 2: Vi khuẩn không oxi hoá axit axetic

+Tạo thành sắc tố trên môi trường glucoza

Sắc tố nâu tới đen nhạt : Acetobacter malanogenus

Sắc tố hồng: Acefobacter zancens

+ Không tạo thành sắc tố

Nhiệt độ thích hợp nhất là 30-35°C: Acetobacter suboxydans

Nhiệt độ thích hợp giưa 18-21°C :Acetobacter oxydans

Năm 1960 Shiwel và Car nghiên cứu về đặc trưng nuôi cấy sinh hoá của vi

khuan Acetobacter va dua ra két luan khong thê có sự đồng nhất các vi khuẩn Acetobacter Tư những nghiên cứu về 4cefobacter người ta đã không ngừng phát huy vai trò của nó trong đời sống con người Nhu cầu của con người vè sử dụng Acetobacter ngay càng đa dạng và chúng được sử dụng nhiều trong các công trình khoa học phục vụ nhu cầu hàng ngày như: lên men giám, chế biến thức ăn,

sản xuất vitaminC, Bị, Ba, By, sản xuất tơ nhân tạo

2.2 Đặc điểm chung về vi khuẩn 4cefobacfer|2]

Ngày nay người ta đã biết vi khuân 4cefobacter là tác nhân chính của quá trình lên men axetic Chúng thuộc vào 2 giống vi khuẩn Acetobacter chu mao hoặc không bà Giwconobacter đơn mao Đây là 2 giống vi khuan axeticquan trọng nhất trong họ Acetobaccter iaceae Ching phé bién trongty nhiên, có trên

bề mặt lá, hoa quả chúng tạo ra axIx axetic từ rượu etylic

Trong té bao Gluconobacter không có chu trình tricacboxylic hoạt động nên nó không thê oxi hoá axetat nhưng có một chu trình khác thay thế( chu trình glyoxylat)

Khong oxi hoa axit axetic

Khi so sánh vi khuẩn này với những vi khuẩn thuộc giồng pseudomonas

thấy có đặc điểm tương tự Chúng chỉ khác pseudomonas ở chỗ chịu được độ

axit cao hơn, khă năng chuyên hoá pepton yếu ít di động và không sinh sắc

tố.Nhiều loại vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu dễ làm biến đổi hình thái thành dạng có hình

thái đặc biệt

Vi khuan Acetobacter 6 dạng hình que, có thé có tiêm mao, di động,

không sinh bào tử,gram âm, hiếu khí bắt buộc

Khoá luận tốt nghiệp

Trên cơ sở dựa vào tính chất đặc trưng của vi khuẩn 4ceobacer mà người

ta xếp chúng vào nhóm độc lập là khả năng oxi hoá rượu etylic thành axit axetic, pH=4,5 Ngoài ra chúng còn thực hiện quá trình oxi hoá không hoàn toàn các

hợp chất hữu cơ khác để tạo thành các hợp chất xeton,

Vi khuan Acetobacter chỉ phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ

thích hợp từ25-30°C, pH thích hợp 5,4-6,8 hoá dị dưỡng hữu cơ [10,15]

Đặc điểm phan biét Acetobacter va Gluconobacter So sanh với

Pseudomonas Dac diém so sanh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas

¬ Đơn mao ở cực hoặc Chu mao hoặc Chu mao ở

Về hình dạng tế bao, vi khuan Acetobacter la những trực khuẩn hình que,

kích thước trung bình từ 0,6-0,8um Các tế bào đứng tách riêng hoặc xếp thành chuỗi, loại đặc biệt có tế bào hình cầu tuỳ thuộc vào điều kiện pH môi trường

„nhiệt độ nuôi cấy [2J.Vi khuẩn Acefobacfer không có khả năng sinh bào tử, tạo

màng nhày, một số có khả năng di động nhờ tiêm mao,một số không có khả năng

này

Khi nghiên cứu về khuẩn lạc và mang vi khuan Acetobacter trén méi

trường cấy cho thay vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nắm men:glucoza, rượu etylic, hoặc manitol Trên môi trường đặc chúng phát triển những khuẩn lạc tròn đều đặn đường kính trung bình là 3mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khguẩn lạc nôi lén day va sam hơn các phần xung quanh Một số loại có khuẩn lạc lớn(đ=4-5mm) bề mặt trơn bóng không có màu, mỏng như hạt sương nhỏ đễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi truường

Trên môi trường lỏng vi khuẩn axetic phát triển tạo thành lớp màng Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt Khi nghiên cứu lớp màng này người ta thấy có sợi xenluloza giống như ở trong sọi bông

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuân axetic đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất sinh trưởng rất đa đạng Chúng sử đụng đường, rượu etylic, axit hữu cơ làm nguồn cacbon, muối amoni làm nguồn nitơ Trong quá trình phát triển chúng có nhu cầu đối với một số axit amin, chất kích thích sinh trưởng

Một số loài vi khuẩn có khả năng tông hợp các chất cao phân tử:xenluloza, tỉnh bột .Con người đã ứng dụng điều này trong sản xuất công nghiệp

Vi khuẩn axetic có khả năng oxi hoá gluxit theo mấy hướng sau:

-Hướng 1: Không có sự photphoril hoá cơ chất với sự tham gia của enzym đặc hiệu

-Hướng 2: Oxxi hoá các cơ chất đã được photphoril hoá trong con đường pentozo photphat

-Hướng 3: Theo sơ đồ của Entenr-Doudoroff

-Hướng 4: Theo chu trình Krebs hoặc Glyoxylat

2.3.Một số loại vi khuẩn Acetobacter[10,15]

2.3.1.Acetobacter xylinum

Là những trực khuẩn hình que (2um), đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,

không di động các tế bào được bao bọc bởi chất dầy, tạo váng nhanh khá dày, bắt

màu xanh với thuốc nhuộm lốt và H;SO¿

2.3.2 Acetobacter aceti

Khoá luận tốt nghiệp

Trực khuẩn hình que không di động, bắt màu gram âm màu vàng với

thuốc nhuộm lốt Chúng tạo khuẩn lạc sám trên gelatin với dịch lên men chứa

10% đương xacaroza thường phát triên trên bia

Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo thành chuỗi, đôi khi bắt gặp các tế bao phinh

to như hình cầu Trên các môi trường lỏng, váng vi khuẩn có màu vàng nâu, nhớt

2.3.8.Acetobacter subxydans

Dạng hình que, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi ngắn, khong cé kha năng đi động, tạo thành những màng mỏng dễ tan vỡ

2.3.9.Acetobacter hoshiakii

trực khuẩn, thường xếp riêng rẽ, không di động Khuẩn lạc trên thạch với

chất chiết rút đậu nành nhỏ, tròn, ở dạng hạt sáng, sau đó chuyên màu nâu

Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên mem tròn, màu trắng sữa, về sau ở giữa hoá

nâu, phần ngoài màu vàng nhạt

2.3.10.Acetobacter ascendens

Truc khuan không di động, các khuẩn lạc trên Glucoza, gelatin khô, trắng,

với vùng sáng chói trên các môi trường lỏng tạo màng dày, chắc

2.3.11.Acetobacter oxydans

Trực khuẩn, các tế bào rời nhau, có khả năng di động, khuẩn lạc trên

gelatin tròn, sau đó thành những dạng không phân nhánh đặc trưng

2.3.12.Acetobacter pÏlicatum

Trên vài môi trường chúng được nhộm màu như nhau Ở 28->30°C tạo

thành những khuẩn lạc phông to kéo dài, khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn,

hơi nhô lên, âm ướt

2.3.13 4cefobacter orleanense

Trực khuẩn dài trung bình, gặp nhiệt độ cao có thê sinh ra dị hình kéo đài,

hoặc phình to ra, váng vi khuẩn tạo ra rất dày ở trên môi trường lỏng Tích luỹ được 4,5% axit axetic, thường dùng để sản xuất rượu vang

Tóm lại

Các loại Acefobacrer thường phát triển tốt ở nhiệt độ 25-> 30°C Một số

loại có khả năng tổng hợp vitamin B,, Bo, một số loại có khả năng chuyên hoá

rượu socbit thành đường socboza Chúng được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm sản xuất vitamin C, có khả năng oxi hoá rượu thành axit axetic

Dựa vào đặc điểm trên người ta ứng dụng sản xuất đối với từng chủng nhưng trong sản xuất để quá trình lên men đạt hiệu quả cao không dùng hỗn hợp nhiều loại vì trong hỗn hợp có thê gặp loại oxi hoá axit axetic trong khi môi trường vẫn còn rượu etylic

2.4.Cơ sở khoa học của sự lên men axetic

Người ta gọi quá trình chuyên hoá rượu thành axit axetic là quá trình lên men axetic hay lên men giấm [5.6] Nhưng thực ra đây là quá trình oxi hoá khử

nhờ một nhóm vi khuẩn thuộc chỉ 4cefobacfer chúng thuộc hai giống

Acetobacter chu mao hoac khéng và gluconobacter don mao

Bản chất sinh học của quá trình chuyên hoá rượu etylic thành axit axetic

được Kiittzing nêu lên đầu tiên vào năm 1838, đến năm 1868 Pasteur đã xác

nhận sự đúng đắn của nó Ông cho rằng sự oxy hoá rượu etylic thành axit axetic

có liên quan mật thiết đến việc hấp thụ một lượng lớn oxy Liebig (1851), người đầu tiên xác định sự có mặt của axêtaldehit như một sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá rượu thành axit axetic Henegerg (1898) xác định phản ứng xảy ra theo hai giai đoạn:

Khố luận tốt nghiệp

Giai đoạn 1: Rượu etanol được chuyên thành axetaldehit

Giai đoạn 2: Axetaldehit được hydrat hố thành axit axetic

Tiếp theo đĩ cĩ nhiều tác giả nghiên cứu về cơ chế quá trình này

Trên cơ sở đĩ các tác giả đã xây dựng được một sơ đồ chung cho quá trình oxy hố này

Rượu etylic dưới tác dụng của enzym oxi hố khử bị oxi hố đến

axetaldehit, axetaldehit tiếp tục bị các alhidròenaza oxi hố đến axit axetic

Trong quá trình này các điện tử được giải phĩng đều được chuyền đến các

coenzym của các enzym này như: NADP-> NADPH; Phương trình tổng quát của quá trình lên men như sau

CH;CH;OH + O; -> CH;COOH + HO + 494.4 (KJ) hoặc 117 Kcal

Acetobacter 1a vi khuan hiếu khí cĩ khả năng oxy hố các cơ chất trong

điều kiện hiếu khí nhưng lại tạo ra các sản phẩm chưa được oxy hố hồn tồn

như axit axetic, giống như sản phâm lên men kị khí nên người ta gọi là quá trình oxy hố khơng hồn tồn [15]

2.5.Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men axetic

2.5.1.Nhiệt độ

Vi khuẩn axetic thuộc nhĩm ưu 4m nhiệt độ thích hợp là 25 -> 30°C Néu

nhiệt độ quá thấp sẽ làm quá trình lên men diễn ra chậm, cong khi nhiệt độ cao

sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và đến một mức nào đĩ thì quá trình sinh sản

của vi khuẩn sẽ bi đình chỉ làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [10,15] 2.5.2 Ảnh hướng của các hợp chất vơ cơ và hữu cơ

2.5.2.1 Sự axit hố dịch lên men

Trong quá trình sản xuất giẫm người ta thường đưa vào cơ chất ban đầu một lượng giấm nhất định để axit hố mơi trường nhằm mục đích: Ngăn cản sự

phát triển của vi sinh vật cĩ hại và đưa vào dịch lên men một lượng vi khuẩn

nhất định

Độ axit ban đầu cĩ thể dao động từ 2->6% Theo nghiên cứu của Eapen và

Rao 1979 thì hiệu xuất cao nhất đạt được ở độ axit ban đầu của cơ chất là 2%

Nhưng nếu lượng axit cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, làm giảm khả năng lên men Nodes cho rằng lượng axit axetic cần hoạt hĩa là 2->2.5%[10]

2.5.2.2 Hàm lượng etylic trong dung dịch lên men

Rượu etylic được sử dụng như một cơ chất, hàm lượng có thể thay đổi từ 2

-> 10 %, nếu hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men

Dé tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục axit axetic thành CO› và HạO cần một lượng rượu sót trong sản phẩm từ 0.2-> 0.5% Lượng rượu này có tác duụng

ức chế tổng hợp enzym oxi hoá axit axetic và muối axetat [10]

2.5.2.3 Ảnh hưởng của các hợp chất chứa C, N, P

Để quá trình lên men xảy ra nhanh trong dung địch lên men, ngoài

glucoza, rượu etylic, đung dịch lên men cần được bổ sung một số muối khoáng

như: (NH¿);SO¿, (NH¿);HPO¿, KH;PO¿, MgSO¿7HO, CaHPO¿ tuỳ theo nhu

cầu cụ thể của từng loại Ngoài ra can bé sung thêm vitamin và chất kích thích

sinh trưởng như pepton, cao nắm mem, cao thịt [7, 8, 9, 10]

2.5.2.4 Ảnh hưởng của oxy

Theo cơ chế của quá trình lên men dé oxy hoá một mol rượu cần một mol

Oz.Trong thực tế nhiều tác giả cho thấy lượng oxy cần thiết phái lớn hơn gấp đôi lượng oxy lý thuyết Thực tế cho thấy, càng thoáng khí, năng suất cảng cao Vi vậy quá trình lên men kéo dài 3 ->5 tuần, nồng độ giắm thu được 3 -> 7 % axit axetic Trong khi đó phương pháp tuần hoàn nhờ tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn lên quá trình rút xuống 5 ->7h Ở phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3->4 ngày

[10]

2.6.Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

2.6.1 Địa điểm nơi phân lập

2.6.2 Đặc điểm hình thái

Quan sát hình dạng và cách sắp xếp té bao, sự hình thành vỏ nhay, tiém

mao, khả năng di động, màu sắc tế bào khi nhuộm gram, khả năng sinh bào tử

2.6.3 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuan Acetobacter 6 trén các môi trường khác nhau thi phát triển khác nhau Trên môi trường đặc cần lưu ý quan sát trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc, màu sắc Trên môi trường thạch đĩa cần lưu ý hình dạng kích thước khuẩn lạc [3,14]

Khoá luận tốt nghiệp

2.6.4 Đặc điểm sinh lý

Bao gồm quan hệ của vi khuẩn với nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng

hình thành sắc tố, kị khí hay hiếu khí, khả năng lên men Cần đi sâu nghiên cứu một số đặc điểm sinh hoá, phương pháp hiện nay đang được là tính và so sánh ty

A+T G+X

lệ hoặc trong tế bào hoặc nhân [3]

G+X T

PHẢN 3 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đó là các chủng vi khuẩn zcefobacfer xyÏinum thuần khiết được phaâ lập từ

màng giấm, nước đừa và dịch hoa quả

3.2.Hoá chất và môi trường

© Hoa chat

Cac loai duong; Glucoza, Xacaroza, Fructoza

Một số chất vô cơ như: KạHPO¿, KH2PO4, MgSO,7H,0, (NH4)2SO4,

(NH¿);HPO¿, CaCO;, NaOH

Một số chất hữu cơ như: Rượu etylic, axit axetic, pepton, agar

Dụng cụ và thiết bị: Hộp lồng, ống nghiệm, pipec, bàn trang thuỷ tinh, que

cấy, đèn cồn, các loại bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, tủ sấy, buồng vô

trùng, cân phân tích, kính hiển vi

Khoá luận tốt nghiệp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập các chúng vi khudn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski

Để có các chủng vi khuẩn 4cefobacfer chúng tôi tiễn hành phân lập chúng từ

các dịch lên men như: giấm, nước hoa quá, bia, nước dừa Nguồn nguyên liệu

này được pha loãng trên môi trường 3 Xác định hàm lượng đường, rượu

etylic, axit axetic trên cơ sở đó chuẩn bị môi trường có thành phần thích hợp,

có đủ dinh dưỡng, nguồn cacbon, nitơ, rượu etylic tạo điều kiện cho chúng

phát triển tốt Môi trường lên men được pha chế, phân vào các bình tam giác hoặc bình cầu, khử trùng trong nồi hấp 6 0,5 at, dé nguội, bổ sung rượu etylic đưa vào tủ âm có nhiệt độ 28-30°C trong 7-15 ngày Vi khuẩn axetic là loại hiểu khí vì vậy trên môi trường lỏng bao giờ cũng tạo thành màng, màng đó

chính là tập hợp tế bào vi khuân axetic Tiếp đó chúng tôi thu nhậnvi khuẩn

axetic Sau khi đã có dịch lên men, để có được các chung vi khuẩn thuần

khiết, đầu tiên sử dụng phương pháp pha loãng pasteur, Việc pha loãng được thực hiện với dung dịch NaCL 0,5% vô trùng hoặc nước cất, pipet vô trùng,

ống nghiệm vô trùng(I0 ống) Cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, dùng

pipet hut Iml dich len men cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9ml nước cất trên, lắc đều ta được dung dịch pha loãng 10” Từ Ống nghiệm này lại hút Iml dịch cho vào ống nghiệm có sẵn 9ml nước cất thứ 2, khuấy đều được dung