Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter Xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC trong nước, hợp với lý luận được tìm hiểu ở trên, trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nư

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em đã nhận đợc sự hớng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS Định Thị Kim Nhung, các thầy cô giáo bộ môn Vĩ sinh Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh — KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, anh, chị đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm trờng Đại học S phạm Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình

và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng em xin chân thành đợc cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2009

Sinh viên thực hiên

(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

Trang

MỞ ĐẦU

Chơng 1 Tổng quan tài liệu 4

1.1 Lợc sử nghiên cứu và phân loại vi khuẩn Acefobacter 4 1.2 Dac diém chung cua vi khuan Acetobacter

1.3 Một số đặc điểm của các nhóm vi khuan Acetobacter 11 Chơng 2 Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 26 3.1 Phân lập vi khuẩn axefie từ một số nguồn nguyên liệu 26 3.2 Tuyển chon ching vi khuan A xylinum cho mang mong 31

3.3 Quan sat hinh thai té bao vi khudn Acetobacter xylinum 36

3.4 Khảo sát khả năng tao mang cua ching A xylinum C5 6

3.5 Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A xylinum C5 6

$inh-LOI CAM DOAN

Tôi xin khẳng định đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân tôi, tất

cả những số liệu đều đợc thu thập từ thực nghiệm va qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Tác giả Hoàng Thị Hạnh

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

$inh-Khod luận tốt nghiệp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

DANH MUC BANG VA HINH

Bang 1.1 Những đặc điểm phan biét Acetobacter va Gluconobacter

so sanh v6i Pseudomonas

Bang 3.1 Ham lợng axit axetic của một s6 chung Acetobacter

Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành và đặc điểm

khuẩn lạc của các chủng Acefobacter phân lập đợc

Bang 3.3 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum

Bang 3.4 Khao sat kha nang tao mang vi khuan Acetobacter xylinum

Bảng 3.5 Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trờng khác nhau

Bảng 3.6 Khảo sát khả năng tạo màng ở các thời gian khác nhau

Bảng 3.7 Phiếu nhận xét cho điểm của một số ngời thử nghiệm

dùng màng BC đắp mặt

Hình

Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III 21

Hình 3.2 Mẫu dịch lên men giấm 27

Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn zxeric của 3 mẫu phân lập 28

Hình 3.4 Khả năng phân oxy hoá axetat của vi khuẩn zxefc 30

Hình 3.5 Khuẩn lạc C5 37

Hình 3.6 Vòng phân giải CaCO; của C5 37

Hình 3.7 Màng BC của C5 37

Hình3.8 Tế bào C5 nhuộm Gram 37

Hình 3.9 Khả sát khả năng tạo màng ở các môi trờng lên men 38

Hình 3.10 Khả năng kháng khuẩn của màng BC tẩm mậtong 42

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acerobacter trên bề mặt môi trường lỏng nó

tạo thành một lớp màng có bản chất là hemixenluloza trên bề mặt thoáng của dung dịch còn gọi là màng BC (màng sinh học, bacterial cellulose, BC) Màng này được dùng để làm ra những sợi tơ to khoẻ và có độ đàn hồi cao trong môi trường nước nóng Màng này được xem như một nguyên liệu mới

có tiềm năng ứng dụng đề sản xuất đồ ăn kiêng và đỗ tráng miệng

Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn này được dùng để sản xuất

EM (Effective Micorgamisms) cé tac dung đa hiệu trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi hôi và giảm chỉ phí 10 lần

so với đốt rác Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta đã sử dụng nguyên liệu là màng BC tạo thành trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn giấm Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acefobacter (chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum) được sử dụng để sản xuất thạch dừa - một món ăn giàu dinh dưỡng và khá phổ biến hiện nay

Các nhà khoa học khi nghiên cứu những tính năng đặc biệt như: bám chắc trên bề mặt ngay khi nước bốc hơi, không cho nước thắm qua nhưng lại cho hơi nước di chuyển, có khả năng ngăn cản vi khuẩn, thay thế da tạm thời

Vì vậy, màng BC được coi là nguyên liệu quý trong y học dùng để làm da nhân tạo, màng mạch máu, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ Nó có thé thay thé

da tạm thời cho những bệnh nhân bỏng từ cấp độ 1 đến cấp độ 4 Chỉ riêng

Viện bỏng Quốc gia Hà Nội mỗi năm phải tiếp nhận hơn 4.000 ca bỏng Với

các bệnh nhân bị bỏng nặng thì chi phí cho các tắm màng đắp lên vết bỏng rất cao Ngoài ra, các loại màng dùng đề đắp lên vết thương hở và màng dùng để đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ đều phải nhập ngoại với giá từ 30.000- 45.000 đồng /1 chiếc Trong khi đó màng BC này hoàn toàn có thể sản xuất ở trong nước bằng quá trình lên men nhờ vi khuân Acefobacter xylinum

Xã hội càng phát triển thì nhu cầu làm đẹp càng được quan tâm và mặt

nạ dưỡng da được chế tạo bằng quá trình lên men của vi khuẩn với rất nhiều

ưu điểm là sự lựa chọn của nhiều chị em phụ nữ Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn về nhu cầu sử dụng màng BC trong nước, hợp với lý luận được tìm hiểu ở trên, trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước, đồng thời căn cứ vào điều kiện cơ sở nghiên cứu chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phan lap, tuyén chon vi khuan Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da”

2 Mục tiêu của đề tài

+ Phân lập vi khuẩn zxe/ic từ một số nguồn nguyên liệu

+ Tuyển chọn chủng vi khuan Acetobacter xylinum cho mang mong

+ Xử lý màng BC và bước đầu thử nghiệm làm mặt nạ dưỡng da

3 Nội dung của đề tài

Nội dung của đề tài “ Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da” để tìm hiểu đặc điểm, hình thái của vi khuẩn

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Acetobacter, tit d6 phan lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo hướng chế tạo mặt nạ dưỡng da

4 Ý nghĩa của đề tài

Đề tài cho phép phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum c6 kha năng tạo màng mỏng, từ đó chế tạo mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ

Chuong 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Lược sử nghiên cứu và phân loại vỉ khuẩn giấm

Từ rất lâu trong lịch sử con người đã biết cách làm giấm song chưa nắm được cơ sở khoa học, càng không thể giải thích được bằng cách nào rượu loãng lại có thể biến thành giấm ăn Cho đến dau thé ky XIX, khi khoa học ki thuật phát triển, đặc biệt với sự ra đời của kính hiển vi, thế giới vi sinh vật được khám phá, con người mới biết được giấm là sản phẩm của quá trình lên men nhờ một nhóm vi sinh vật mà ngày nay người ta gọi chúng là vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5]

Nam 1822, Peson đã tiến hành những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu được trên bề mặt các bình sản xuất giấm Ông khẳng định đó là một loại vi sinh vật và gọi là Myeoderma aceti [7]

Năm 1837, Kiizing sau khi loại bỏ hết vi sinh vật trong chum làm giấm

và thấy rằng giấm không được tạo thành nữa Ông đã đưa ra nhận xét: quá trình lên men giấm nhất thiết phải có mặt vi sinh vật nếu không sẽ không diễn

ra chuyển hoá rượu thành giấm Cũng năm 1837, Hansen (người Đan Mạch)

đã tách được từ màng giấm ra hai loại vi khuẩn thuần khiết là Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum

Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi đã chứng minh sự đúng đắn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen và khẳng định bản chất của quá trình lên men giấm Ông nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đi đến kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi trực khuẩn đó là Mycoderma

aceti

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acefobacfer, các nghiên cứu khác cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm tìm hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện qua trình lên men giấm Hiện nay, người ta đang đi vào nghiên cứu những ứng dụng mới của vi khudn Acetobacter bang cách phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hoá của chúng nhằm tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng trên cơ

sở đối chiếu các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra

1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuan Acetobacter

+ Địa điểm nơi phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi trường sống

+ Đặc điểm hình thái: đó là hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng đi động, màu sắc, sự hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc khi nhuộm Gram

+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc,

đặc tính vết mọc (trơn, xu xì ), tính chất vết mọc (đục, trong ), màu sắc vết mọc trên môi trường thạch Trên môi trường lỏng cần lưa ý tình trạng môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay không có mùi)

+ Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố nhiệt độ, pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay

ky khí ), khả năng lên men axetic, khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ và hữu cơ

1.1.2 Phân loại vi khuan Acetobacter

Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Ace/obacrer được thực hiện từ thế kỷ XIX Từ năm 1898 Rothenback đã tiến hành phân loại, tiếp theo là Hoyer (1899), Beijerink đã phân loại vi khuẩn Acefobacter dựa vào hai dấu hiệu [6]:

* Một là: Khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện quá trình sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn Acefobacter

$inh-*- Hai là: Có hay không có giai đoạn đi động trong qua trình phát triển Còn Heneberg (1926) lại chia các vi khuẩn øxeíic thành 4 nhóm dựa vào nơi sống đặc trưng của chúng:

* Nhóm 1: vi khuẩn không phát triển bia vì hoa Hulon độc với chúng

* Nhóm 2: vi khuẩn phát triển trên bia

* Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang

* Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Năm 1934, theo nghiên cứu của các nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi khuẩn axeic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon

và nitơ nên đã kết hợp chúng vào họ N#robacteriaceae Từ đó vi khuẩn axetic được goi la Acetobacter

Nam 1936, Kenyver và Wanniel cùng Staniel đã đề xuất ý kiến ghép vi khuan Acetobacter vao ho Pseudomonas do ching c6 hién tugng ghép cực xoắn ở phần di dong

Năm 1948, Vaught đã công bố những kết quả khi quan sát sự di động cua nhiéu loai vi khuan: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum Ong két luan những loài trên cùng thuộc một loài có đơn mao ở cực và đã xác nhận vi tri của vi khuẩn Acefobacter ở trong họ Pseudomonas

Ngày nay, theo khoá phân loại của Bergeys (1914) và nhiều tác giả khác, vi khuẩn Aceobacter và Gluconbacter - các vì khuẩn axetic được xếp vào một họ riêng là Acefobacteriaceae Trong khoá phân loại của Bergeys, đáng chú ý nhất là khoá phân loại các loài thuộc giống Acefobacfer, ông đã phân giéng Acetobacter thanh hai loai :

Loại 1: Oxy hoá axit axetic thành CO; và H;O Loại này gồm:

+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (dung dịch Hoyer), đại dién 1a vi khudn Acetobacter aceti

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo màng nhầy chứa xenluloza, điển hình vi khuẩn Acetobacter xylinum Trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không tạo màng nhầy có chứa xeluloza, điển hình vi khuẩn: Acetobacter zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneizigianus

Loại 2: Không có khả năng oxy hoá axit axetic

+ Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucoza:

* Sắc tố nâu đến đen nhạt : Acefobacter melanogenus

Những nghiên cứu về đặc điểm, về sự phân loại vi khuẩn Acetobacter

này đã tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, đồng thời tạo thuận lợi cho việc ứng dụng các vi khuẩn đó vào đời sống thực tiễn sau này Hiện nay người

ta đã ứng dụng vi khuẩn giấm một cách rộng rãi trên quy mô công nghiệp tạo

ra rất nhiều sản phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn

1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Acetobacter

Như đã nêu ở trên, tác nhân của quá trình lên men axetic là vi khuẩn Acetobacter Dựa vào đặc điểm đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học thấy rằng chúng thuộc vào hai giống vi khuẩn Acefobacfer có chu mao hoặc không có chu mao va Gluconobacter đơn mao, đó là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acefobacteriaceae (Lapent et al-1989), chúng sống phổ

$inh-biến trong tự nhiên, trên bề mặt lá, hoa quả .có khả năng tạo ra axit axetic từ rượu etylic Trong tế bào Œiuconobacter không có chu trình Tricacbonxylic (ATC) hoạt động nên nó không thể oxy hoá axit axetic song lại có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat), không oxy hoá axit axetic nhưng vẫn có chu trình photphoril hoá Ngược lại trong tế bào Acefobacfer xảy ra quá trình trên Khi so sánh vi khuẩn này với vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy chúng có những đặc điểm tương tự Chúng chỉ khác Pseudomonas ở chỗ chịu được nồng độ axit cao hơn, khả năng chuyển hoá pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố Nhiều loài vi khuẩn Acetobacter khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) dễ bị biến đổi hình thái (tế bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh)

Tuy nhiên, cơ sở để xếp vi khuẩn axefic vào nhóm độc lập là khả năng oxy hoá rượu etylic thành axit axetic ở pH = 4,5 Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy hoá không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng Vi khuẩn axetic chi phat triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí; nhiệt độ thích hợp từ 25°C - 30°C; pH thích hợp từ 4,5 - 6,8; hoá dị dưỡng

hữu cơ

$inh-Khod luận tốt nghiệp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acefobacfer và Gluconbacter

hoặc không không có

2 Phát triển ở pH = 4,5 + + -

Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acefobacrer là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước từ 0,6 - 0,8m Các tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi hoặc có loại tế bào hình cầu, có loại hình chỉ Tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ nuôi cấy một số loại có hình bán nguyệt Vi khuẩn Acetobacter khéng c6 kha nang sinh bào tử, tạo màng nhày, một số có khả

năng di động nhờ tiêm mao, một số không có khả năng nay [1], [2], [3]

Qua nhiều nghiên cứu về khuẩn lạc và màng vi khuẩn Acefobacfer trên môi trường nuôi cấy cho thấy vi khudn Acetobacter phát triển tốt nhất trên môi trường nước bia, môi trường có chứa nấm men, glucoza, rượu etylic hoặc

manitol Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, déu đặn, đường kính trung bình là 3 mm

Một số loai nhu Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lac 16i lén, day va sim hơn các vùng xung quanh Một số loại khác có khuẩn lạc lớn hơn (d = 4-5 mm), không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dàng dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường Có loại tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, khó lấy ra băng que cấy Trên môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter chi phat triển trên bể mặt môi trường tạo thành màng dày nhãn và trơn, khi lắc thì chìm xuống đáy bình và thay vào đó là mội lớp màng mới được tạo thành, dịch dưới màng này thường trong suốt Khi nghiên cứu màng này thấy có sợi xenluloza giống như sợi bông Loại thứ hai màng mỏng như giấy xefan, một số nữa thì tạo thành màng mỏng dễ vỡ, bám trên thành bình và dịch nuôi cấy không trong [8]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi

khuẩn Acerobacter đối với nguồn cacbon, nitơ và các chất kích thích sinh trưởng là rất đa dạng Chúng sử dụng chủ yếu đường glucoza hoặc saccaroza, rượu etylic và các axit hữu cơ khác làm nguồn cacbon; muối amoni làm nguồn nitơ; muối photphat làm nguồn photpho Ngoài ra, trong quá trình phát triển chúng còn có nhu cầu với một số chất kích thích sinh trưởng khác như: para-

aminobenzoic, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin cdc chat nay cé vai trò

quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter [9]

Một số vi khuẩn Acefobacter có khả năng tự tổng hợp polisaccarit phân

tử lớn như: xenluloza, dextran và người ta ứng dụng khả năng này trong công nghiệp Một số ít vi khuẩn Acefobacter có thể tổng hợp được những sợi xenluloza giống như bông, dién hinh nhu 1a Acetobacter xylinum Một số loài tổng hợp được dextran giống nhu Leuconostoc mesenteroides khi môi trường thiếu dextran hoặc xenluloza

(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

Vi khuẩn Acetobacter c6 kha nang oxy hoá gluxit theo 4 hướng sau:

* Hướng thứ nhất: không có sự photphorit hoá cơ chất với sự tham gia của các enzim đặc hiệu

* Hướng thứ hai: oxy hoá các hợp chất đã được photphorit hoá trong con đường Pentose phosphate

* Hướng thứ ba: theo sơ đồ Enter - Doudroff

* Hướng thứ tư: theo chu trình Crep (Krebs) hoặc Glyoxlat

1.3 Một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter

1.3.1 Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 xI-1,2/;m không di động được, xếp thành chuỗi dài, bắt màu hồng khi nhuộm Gram, màu vàng với thuốc

nhuộm iốt Khuẩn lạc to, sáng trên Gelatin với dịch lên men chứa 10% đường

Saccaroza tạo thành màng nhầy, nhắn Chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rươu cao (11%) và có thể tích luỹ đến 6% axit axetic trong môi trường bia với nhiệt độ thích hợp là 30°C

1.3.2 Acetobacter xylinum

Trực khuẩn hình que, kích thước khoang 24m té bao đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày: váng có chứa hemixenluloza nên khi gặp H;SO, thuốc nhuộm ïốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemixenluloza), chúng có thể tích luỹ 4,5% axit axetic trong môi trường Chúng thường sống chung với nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, “hải bảo” hay “vị bảo”- một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nước giải khát trong gia đình, trên

bề mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè đường

$inh-1.3.3 Acetobacter pasteurianum

Có hình dạng tương tu nhu Acetobacter aceri nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iôt, tế bào xếp dời nhau thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng hình chuỳ phồng lên, di động không thường xuyên Khuẩn lạc trên Genlatin nhỏ, tròn Nhiệt độ thích hợp để phát triển là 30°C

1.3.4 Acetobacter acetosum

Trực khuẩn có kích thước 0,4 - 0,8 xI/m Các tế bào xếp riêng rế thành từng chuỗi, không di động được Nhiệt độ thích hợp nhất cho chúng phát triển là 30°C - 36°C

1.3.5 Acetobacter kiitzingianum

Có màng nhâầy, nhắn ở mép va được nâng cao lên theo thành bình Tế bào dạng trực khuẩn, ngắn, to, thô, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men nhớt, nhỏ tạo thành màng xếp nếp to trên môi trường ẩm Thích

hợp phát triển ở 30°C

1.3.6 Acetobacter shiitzenbacchii

Trực khuẩn khá dài, kích thước khoang 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6 um, thudng xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhày và không bên vững Có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% axit axetic do đó thường được sử dụng để chuyển hoá rượu thành giấm theo phương pháp Đức (phương pháp nhanh)

1.3.7 Acetobacter lindreni

Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to như hình cầu, không di động Khuẩn lạc trên Gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, màu vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt Thích hợp phát triển ở25°C

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

1.3.8 Acetobactere orleanense

Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao

có thể sinh ra tế bào đị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo váng vi khuẩn rất dày trên môi trường lỏng Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao (10% - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic Thường được dùng để chuyển hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay phương pháp Orleans) Thích hợp phát triển ở 25°C - 30°C

1.3.9 Acetobacter suboxydans

Có hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ, có khả năng chuyển hoá glucoza thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza-dùng để sản xuất axit ascorbic-vitamin C Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para - aminobenzoic, axit

patoneic, axit nicotinic

1.3.10.Acetobacter hoshigakii

Trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 x 1,5 - 1,8m, thường xếp riêng rẽ không di động Khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút từ đậu nành nhỏ, tròn, dang hạt xám sau đó chuyển thành màu nâu Khuẩn lạc trên thạch với dịch lên men tròn, màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hoá nâu, phía ngoài màu vàng nhạt Có khả năng tạo thành axit gluconic Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là từ 30°C - 35°C

1.3.12.Acetobacter oxydans

Trực khuẩn có kích thước 0,8 - 1,2 x 2,4 - 2,7 um, cdc té bao rời nhau

hoặc xếp thành chuỗi Quan sát trong chuỗi thấy có tế bào phồng to lên, di động Khuẩn lạc trên gelatin tròn sau trở thành dạng không cân đối với sự phân nhánh đặc trưng Nhiệt độ thích hợp từ 18°C - 21°C

1.3.13 Acetobacter plicatum

Truc khuan c6 khich thudc 0,4 - 0,6 x1,4 - 1,64m không di động

Khuẩn lạc trên gelatin rượu vang tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt

Nhiệt độ thích hợp từ 25°C - 30°C [4]

Hầu hết các loài Acerobacter thường phát triển tốt nhất ở 25°C - 30°C đều có khả năng sử dụng muối photphat, đa số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit và trong quá trình sinh trưởng phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có bản chất hemixenluloza trên bề mặt môi trường nuôi cấy Với những nghiên cứu hiện nay cho thấy lớp màng này

có thể được ứng dụng vào rất nhiều ngành quan trọng có ý nghĩa thực tiễn cuộc sống Đồng thời khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục đích sử dụng của từng loại màng

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

Chuong 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật thuần khiết được phân lập ở màng các nguồn nguyên liệu nhờ quá trình lên men giấm: bia, rượu vang, dịch hoa quả, giấm làm theo phương pháp cổ truyền

2.2 Trang thiết bị và hoá chất

+ Các loại đường chuẩn: glucoza, saccaroza, fuctoza, mantoza, manitol + Một số hợp chất hữu cơ: rượu etylic (C;H;OH), axit axetic

(CH,COOH), pepoton, agar-agar, dich chiết nấm men (cao nấm men), axit xucxinic, axit lactic, phenolphtalein

+ Một số hợp chat v6 co: K,HPO,, KH,PO,, MgSO,.7H,O, (NH,),SO,, Na,HPO,.12H;O, CaCO;, NaOH chuẩn

+ Một số loại thuốc nhuộm: tím Gentian, dung dịch Eucshin, dung dịch Lugol, thuốc nhuộm ïốt và H;SO,

$inh-2.3 Môi trường

2.3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn giấm (MT) (g/!)

Thạch Agar: 20g

2.3.2 Môi trường nhân giống co ban (MT2) (g/l)

Nước máy : 1000 ml Rượu etylic: 2%

2.3.3 Các môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng (g/l)

Chú ý: Axit axetic (CH;COOH) và rượu etylic (C,H;OH) bổ sung sau

$inh-(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski

Nguồn nguyên liệu là: bia, dịch hoa quả loãng và rượu vang, chúng tôi tiến hành phân lap vi khuan Acetobacter theo phương pháp của Vinogradski Trước hết, chúng tôi thực hiện lên men giấm trên các vật liệu trên.Vi khuẩn axetic là loại vi khuẩn hiếu khí nên chúng phát triển trên môi trường lông tạo thành lớp màng dai, màu trắng Màng đó bao gồm tập hợp các vi khuẩn axefic, lấy màng đó đưa vào môi trường số 2 Môi trường số 2 được pha chế đầy đủ các thành phần, khử trùng trong nồi hấp Autoclave ở áp xuất 1 atm, trong thời gian 15 phút, để nguội, bổ sung rượu etylic và axit axetic, chia vào các bình cầu hoặc bình tam giác Sau khi thả màng vào giữa trong tủ ấm 28°C - 30°C trong thời gian 4 - 7 ngày (chú ý khi nút bông các bình không qua chặt cũng không quá lỏng) trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màng mới Từ màng này tiến hành phân lập để thu nhận vi khuẩn Acetobacter

Phương pháp pha loãng của Pasteur: Việc pha loãng được thực hiện với dung dịch NaCl 0,5% vô trùng hoặc nước cất vô trùng Chuẩn bị dung dịch pha loãng rồi khử trùng ở latm, ở 121°C, thời gian 15 phút, dùng 10 ống nghiệm định mức I0ml (đậy nút bông, đã khử trùng) Sử dụng pipet v6 trùng chia vào các ống nghiệm vô trùng mỗi ống 9ml dung dịch NaCl hoặc nước cất, sau đó dùng pipet lấy Iml dịch lên men cho vào một ống nghiệm có chữa sắn 9ml] nước cất hoặc dung dịch NaCI trên, đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút sẽ thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10” Dùng pipet lay Iml dung dịch ở ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10” nhỏ vào

$inh-ống nghiệm thứ 2 (cũng có 9 ml nước), đậy nút bông lại rồi lắc đều bằng cách vontex trong 5 phút thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 10” Tiếp tục

pha loãng như vậy đến nồng độ 10''° ta được 10 ống nghiệm chứa dung dịch

lên men với các nồng độ từ 10' đến 10” Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có trong mẫu, chúng tôi chọn mẫu ở mức độ pha loãng 10” đến 107 để tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa

Phương pháp thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 hấp khử trùng ở 121°C

và latm, để nguội, bổ sung rượu và axit, tiếp theo đổ vào hộp peri đã vô trùng,

để nguội khi đó bề mặt thạch sẽ đông lại Dùng pipét vô trùng hút 100 wl dich màng đã chuẩn bị ở trên (có độ pha loãng 10 đến 107) nhỏ vào hộp peri, sau

đó dùng que trang dàn đều trên khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, cất trong tủ ấm ở 28°C - 30°C Sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (các đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép quanh khuẩn lạc), vòng phân giải CaCO, quanh khuẩn lạc

Chú ý: tất cả các dụng cụ thí nghiệm, dung dịch và môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng đều phải hoàn toàn vô trùng, các thao tác thí nghiệm đều được làm trong box cấy vô trùng

2.4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acefobacfer cho màng xenluloza theo phương pháp của Graxinop

Trước khi tuyển chọn cần phải nhân giống các chủng vi khuẩn bằng cách: từ mỗi khuẩn lạc đã chọn trên dùng que cấy đầu tròn (đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn) gợi lấy khuẩn lạc cấy vào một ống nghiệm đã được đổ môi trường thạch (môi trường số 2, đặt nghiêng, để nguội ) theo đường ziczăc Mỗi ống là một ký hiệu riêng Để vào tủ ấm 4 - 6 ngày các vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy Tiếp theo là tuyển chọn các chủng vi khuẩn sẽ phát triển theo đường cấy Sau đó, tuyển chọn các chủng vi khuan Acetobacter trong moi trường oxy hoá (MT2) để kiểm tra khả năng tạo màng Cho I ml nước cất

(Xhoá luận tốt ngiiêp Chuyén aganh Oi sinh vat hoe

khuẩn đưa sang môi trường oxi hoá để thử khả năng tạo màng Dựa vào khả

năng tạo màng của các mẫu vi khuẩn trên môi trường dịch thể tuyển chọn sau

ba lần liên tiếp chọn ra những chủng có khả năng tạo màng dai, mỏng, trong thời gian ngắn

Để giữ giống cần tiến hành cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng này sang ống thạch nghiêng khác với chu kỳ 2 tháng một lần

2.4.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter thuan khiết

2.4.3.1 Phương pháp quan sát tế bào

Sau khi sơ tuyển, chúng tôi đã chọn ra một số chủng, các chủng này tiếp tục được xác định bằng phương pháp quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển

vi quang học để xác định xem chúng có đúng là chủng vi khuẩn cần tìm không Quan sát hình dạng tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram: phương pháp này gồm các bước sau:

+ Rửa sạch lam kính bằng NaOH sau đó rửa bằng HCI hoặc H;SO,

+ Rồi rửa lại bằng cồn, nước cất và lau khô

+ Nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy một ít màng màu trắng hoặc dịch nuôi cấy hoặc giống vi khuẩn hoà vào giọt nước vô trùng đó, hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi (cách ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 cm)

+ Đặt lên trên vết bôi miếng giấy lọc, nhỏ dung dịch tím Gentian giữ trong 1 - 2 phút

$inh-+ Lấy miếng giấy lọc ra, nghiêng cho thuốc nhuộm chảy xuống chậu hứng, nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi, giữ trong vòng 5 phút

+ Rửa tiêu bản bằng nước, rửa bằng cồn (20 giây) sau đó rửa tiếp bằng nước + Nhỏ dung dịch Fucshin lên giữa trong l - 2 phút

+ Rửa lại tiêu bản bằng nước, hong khô tự nhiên

Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn gram

âm (Gr) với vi khuẩn Gram dương (Gr”) Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr Ngược lại nếu bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gr" Khả năng bắt màu của vi khuẩn Gr” và vi khuẩn Gr khác nhau là

do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr* được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tím Gentian và Lugol một phức chất bề khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế

bào của vi khuẩn Gr* bat mau tim Gentian Trong khi đó những vi khuẩn Gr

không có khả năng tạo phức chất bên với thuốc nhuộm Gentian và Lugol nên

dễ bị rửa trôi bởi cồn Do đó, khi nhỏ Fueshin lên tế bào vi khuẩn Gr bắt mau hồng màu cua Fucshin

Cc

Hình 2.1 Tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III

a Hình thái mau sac té bao cua ching Cl

b Hình thái màu sắc tế bào của chủng C2

c Hình thái màu sắc tế bào của chủng C5

Từ những mẫu vi khuẩn axefic thu được ở trên chúng tôi tiến hành tuyển chọn ra những mẫu vi khuẩn Acetobacter thuần khiết và có khả năng tạo màng dai trên môi trường nuôi cấy dịch

2.4.3.2 Kiểm tra đặc tính sinh học của Acefobacfer

* Kiểm tra khả năng oxi hoá ethanol thành axit axetic

Sau khi đã có các chủng vi khudn Acetobacter cho mang xenluloza trên môi trường oxy hoá chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacrer thuần khiết dựa trên những đối chiếu định loại đặc điểm khuẩn lạc trên hai môi trường A và B

Môi trường A: dịch chiết nấm men 3%, CaCO; 2%, Agar-agar 2%, rượu etylic 15% - 2ml Khi nuôi cấy giống vi khuẩn axefic trên môi trường này nếu là Gluceonobacrer thì có một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc, nếu là Acetobacter thì vòng sáng rõ hơn và có một lớp cặn duc ở viền khuẩn lạc

hướng về phía vòng sáng do vi khuẩn sinh trưởng và phát triển sẽ tạo ra axit

axetic — axit này tạo ra sẽ kết hợp với CaCO; làm vòng sáng rộng hơn và tạo

ra lớp cặn đục thấy rõ