nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh thái bình và chế tạo thử nghiệm auto - vaccine phòng bệnh

Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được .... Xuất phát từ tình hình thực tiễn sản xuất của nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình, căn cứ và

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

- -

TRẦN THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH PHÙ ĐẦU

Ở LỢN SAU CAI SỮA TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI BÌNH VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM AUTO - VACCINE PHÒNG BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thái Nguyên - 2011

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

- -

TRẦN THỊ HUỆ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH PHÙ ĐẦU

Ở LỢN SAU CAI SỮA TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI BÌNH VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM AUTO - VACCINE PHÒNG BỆNH

CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y

Mã Số : 60 62 50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Xuân Bình

Thái Nguyên- 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ

Tác giả

Trần Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã hoàn thành Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn và

cảm ơn chân thành tới thầy giáo hướng dẫn TS Đặng Xuân Bình đã tận tình

chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới cán bộ, công nhân viên Bộ môn Công nghệ vi sinh – Viện Khoa học và sự sống - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sau Đại học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Thái Bình, cán bộ trạm thú y và các trang trại, gia trại chăn nuôi lợn tại các huyện Hưng

Hà, Kiến Xương,Thái Thụy tỉnh Thái Bình đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Trong quá trình thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự quan tâm, động viên sâu sắc của gia đình bạn bè và đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành trước mọi sự giúp đỡ quý báu đó

Thái Bình, tháng 9 năm 2011

Tác giả

Trần Thị Huệ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm bệnh phù đầu lợn 3

1.2 Vai trò của vi khuẩn E coli trong bệnh phù đầu lợn 4

1.2.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli 4

1.2.2 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli 8

1.2.3 Biện pháp phòng trị bệnh phù đầu lợn 15

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 16

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 19

Chương 2: NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 22

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1 Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình 22

2.2.2 Phân lập vi khuẩn E coli từ những lợn mắc bệnh phù đầu 22

2.2.3 Chế tạo auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn 23

2.3 Vật liệu nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 23

2.4.2 Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn 25

2.4.3 Xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được 27

2.4.4 Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 28

2.4.5 Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập trên chuột bạch 31

2.4.6 Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được 32

2.4.7 Chế tạo auto - vaccine 32

2.4.8 Phương pháp tiêm phòng: 35

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn nuôi trên địa bàn tỉnh Thái Bình 36

3.1.1 Tình hình bệnh phù đầu lợn trong các năm 2008, 2009, 2010 36

3.1.2 Tình hình bệnh phù đầu theo địa điểm 37

3.1.3 Điều tra tình hình lợn chết do mắc bệnh phù đầu 41

3.1.4 Điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo mùa 44

3.1.5 Điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo lứa tuổi 46

3.2 Phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh phù đầu 48

3.3 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của chủng vi khuẩn E coli

phân lập được 50

3.4 Xác định một số serotype kháng nguyên O của các chủng phân lập 51

3.5 Xác định yếu tố bám dính của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 53

3.6 Xác định khả năng gây dung huyết của chủng vi khuẩn E coli phân lập được 54

3.7 Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được 55

3.8 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập 57

3.9 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn E coli phân lập được 58

3.10 Chế tạo và kiểm nghiệm auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn 61

3.10.1 Bồi dưỡng kháng nguyên phục vụ chế auto - vaccine 61

3.10.2 Kiểm tra đánh giá chất lượng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm 62

3.11 Thử nghiệm an toàn auto - vaccine trên lợn thí nghiệm 63

3.12 Khảo sát đáp ứng miễn dịch của lợn thí nghiệm sử dụng auto - vaccine 64

3.13 Thử nghiệm khả năng bảo hộ lợn thí nghiệm của auto - vaccine với chủng E coli phân lập 65

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Đề nghị 68

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

Bảng 3.9 Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E coli

E coli phân lập được 54

Bảng 3.13 Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của chủng vi khuẩn E

coli phân lập được 56

Bảng 3.14 Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn E coli phân lập 57

Bảng 3.15 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn

E coli phân lập được 59

Bảng 3.16 Kết quả bồi dưỡng kháng nguyên E coli chế tạo auto - vaccine tại Thái Bình 61Bảng 3.17 Kết quả kiểm nghiệm chất lượng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm 62Bảng 3.18 Kết quả thử an toàn auto - vaccine ở lợn thí nghiệm 63Bảng 3.19 Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm

auto – vaccine 64Bảng 3.20 Kết quả bảo hộ lợn thí nghiệm bằng auto – vaccine 65

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chế gây bệnh phù đầu lợn của E coli (Bertschinger H U,

Nielsen N O, 1992) 9

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập giám định vi khuẩn E coli 26

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc xin trên thực địa 35

Hình 3.1 Biểu đồ vể tỷ lệ mắc bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa tại 03 huyện của tỉnh Thái Bình 39

Hình 3.2 Biểu đồ về tỷ lệ lợn chết do mắc bệnh phù đầu ở 03 huyện của tỉnh Thái Bình 42

Hình 3.3 Biểu đồ về tỷ lệ mắc bệnh phù đầu lợn theo mùa vụ 45

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ mắc bệnh phù đầu theo lứa tuổi lợn 47

Hình 3.5 Biểu đồ về tỷ lệ phân lập vi khuẩn E coli từ lợn mắc bệnh phù đầu 49

Hình 3.6 Biểu đồ về tỷ lệ đề kháng của E coli với từng loại kháng sinh 61

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Với phương thức đa dạng hóa vật nuôi tại các địa phương trên phạm vi

cả nước, ngành chăn nuôi lợn của nước ta đã liên tục phát triển Các sản phẩm

từ chăn nuôi lợn đã đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng nội địa và xuất khẩu Theo thông báo của Cục chăn nuôi [67], tính đến 1/4/2010 đàn lợn của

cả nước có 27,3 triệu con, tăng 3,06% so với cùng kỳ năm 2009 Sản lượng thịt lợn hơi 6 tháng đầu năm 2010 đạt 1,77 triệu tấn Các vùng có số đầu lợn nhiều là đồng bằng sông Hồng (7,2 triệu con); Khu vực Đông Bắc 4,6 triệu con); đồng bằng sông Cửu Long (3,6 triệu con); Bắc Trung Bộ (3,4 triệu con); miền Đông Nam Bộ (2,4 triệu con) Các tỉnh, thành phố có số đầu lợn lớn trên

1 triệu con là Hà Nội, Đồng Nai, Nghệ An, Bắc Giang và Thái Bình

Bên cạnh những kết quả đạt được, lợn nuôi tại Thái Bình thường xuyên mắc một số bệnh truyền nhiễm và ký sinh trùng, đặc biệt là bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa Bệnh xảy ra gây thiệt hại kinh tế đáng kể do tỷ lệ chết khá cao, từ 40 - 100%, tập trung ở những lợn béo, khỏe ăn tốt nhất đàn Lợn bệnh

bị sốt 1 - 2 ngày sau đó thân nhiệt hạ, có khi dưới mức bình thường Lợn bệnh

bị sưng đầu, mí mắt Do sưng hầu nên lợn bệnh giảm kêu, khó thở, có triệu chứng thần kinh như đi xoay vòng theo một chiều nhất định, yếu hai chân sau, nằm co giật, bốn chân giãy liên tục hoặc thẳng cứng trước khi chết Mổ khám bệnh tích thấy ở tá tràng, ruột non có những đoạn tụ máu, xung huyết

Xuất phát từ tình hình thực tiễn sản xuất của nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm và năng lực nghiên cứu khoa học của Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học Sự sống

- Đại học Thái Nguyên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc

điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh Thái Bình và chế tạo thử nghiệm auto - vaccine phòng bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn tại tỉnh Thái Bình

- Chế tạo và thử nghiệm vắc xin tại chỗ (auto - vaccine) phòng bệnh phù đầu lợn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh Thái Bình, đặc tính sinh vật học và yếu tố gây bệnh

của vi khuẩn E coli gây bệnh; kết quả chế tạo và thử nghiệm auto - vaccine

phòng bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa sử dụng auto - vaccine

- Sử dụng auto - vaccine phòng bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa, tăng hiệu quả kinh tế chăn nuôi, góp phần phát triển bền vững nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm bệnh phù đầu lợn

Căn cứ các tài liệu nghiên cứu, bệnh phù đầu ở lợn con cai sữa được mô

tả lần đầu tiên vào năm 1938 ở Châu Âu (Bertschinger H U, Nielsen N O, 1992) [39] Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào cuối thập niên 60 của thế

kỷ 20 và ngày càng gia tăng với sự phát triển của hình thức chăn nuôi công nghiệp tập trung (Đào Trọng Đạt và cs, 1996) [4]

Vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường

tiêu hóa của lợn với một số lượng rất nhỏ Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi với sức đề kháng cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể

E coli gây bệnh sẽ phát triển nhanh đến mức tạo ra một lượng lớn EDP

(Edema Disease Principle) gây tổn thương thành mạch quản, làm thay đổi áp suất thẩm thấu dẫn đến phát sinh phù

Bệnh phù đầu thường xảy ra sau khi cai sữa 1 - 2 tuần và tuổi lợn con mắc bệnh thường gặp từ 4 - 12 tuần tuổi Đôi khi bệnh phù đầu xuất hiện rất sớm có khi 4 ngày tuổi hoặc rất muộn ở lợn con Bệnh phù đầu thường thấy xuất hiện ở những lợn con phát triển nhanh khỏe mạnh và thông thường những lợn con béo tốt nhất trong đàn mắc bệnh đầu tiên Diễn biến của bệnh trong vòng 4 - 14 ngày Tỷ lệ mắc bệnh trung bình khoảng 15% đàn lợn con

và 30 - 40% số ổ lợn, tỷ lệ chết nằm trong khoảng 50 - 90% Sức đề kháng đối với bệnh tật khác nhau phụ thuộc vào đặc tính di truyền của lợn Những lợn

dễ mẫn cảm với bệnh E coli gây bệnh lưu trú và phát triển ở ruột non, sản

sinh EDP (Edema Disease Principle) hấp thu vào máu gây tổn thương thành mạch quản (Bertschinger H U, Nielsen N.O, 1992) [39]

Các yếu tố stress tạo điều kiện cho bệnh phù đầu bùng phát sau khi cai sữa lợn con có thể là:

- Tiêm chủng vắc xin

- Vận chuyển mua bán lợn con

- Sắp xếp lại đàn

- Thay đổi thức ăn đột ngột

- Biến động thời tiết làm cho lợn con bị lạnh Bị lạnh đột ngột dẫn đến

giảm nhu động ruột sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho E coli gây bệnh và phát

triển ở ruột non tới mức có thể gây bệnh Đây là một yếu tố stress thường gặp cần được lưu ý đề phòng Sự thừa dinh dưỡng cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển ở ruột non Vì vậy cần có chế độ chăm sóc nuôi dưỡng hợp

lý đối với lợn con cai sữa

1.2 Vai trò của vi khuẩn E coli trong bệnh phù đầu lợn

1.2.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E coli

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1974) [22], trực khuẩn ruột già E coli còn

có tên gọi Bacterium coli commune, thuộc họ trực khuẩn đường ruột

(Enterobacteriaceace), loại vi khuẩn thường trú trong ruột già của động vật

máu nóng, được Escherich phân lập từ phân trẻ em vào năm 1885 E coli

thường xuất hiện rất sớm ở phần ruột sau của người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2h), ít khi ở dạ dày hoặc ruột non

Theo Quinn P/J el al (1994) [63], E coli là trực khuẩn hình gậy

ngắn, di động được do có lông, vi khuẩn không sinh nha bào, có giáp mô Đường kính chiều ngang vi khuẩn dưới 1µm, chiều dài thay đổi, kích thước trung bình của tế bào vi khuẩn từ 0,3 - 0,6 x 2 - 3µm Vi khuẩn bắt màu Gram âm (Gram negative)

- Đặc tính nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường,

có thể sinh trưởng, phát triển được từ 5 - 450C, pH từ 5,5 - 8, thích hợp ở

Môi trường thạch MacConkey: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh sen (do lên men đường lactoza, sinh hơi), (trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella có màu trắng đục)

- Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh (trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella màu đỏ)

- Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh

(trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella màu đỏ)

- Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc M (11 - 25%), có thể dung huyết hoặc không Nếu nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày sẽ thấy giáp

mô của vi khuẩn

- Môi trường thạch Deoxycholate citrat: Vi khuẩn E coli không mọc do

không sử dụng được nguồn cacbon từ citrat

- Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): Vi khuẩn phát triển nhưng không sản sinh H2S, không làm đen môi trường (vi khuẩn Salmonella sinh

- Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, ngoài 3 loại

kháng nguyên thông thường, còn có thêm kháng nguyên bám dính F Các độc

tố Shiga E coli sản xuất liên quan đến bệnh phù đầu nhất thường thuộc về 4

type huyết thanh đặc biệt: O138: K81: NM, O139: K12: H1, O141: K85ab: H4, và O141: K85ac: H4

- Kháng nguyên O (somatic)

Có bản chất lipopolysaccharide, là thành phần cấu trúc của vách tế bào

vi khuẩn Khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Do vậy, kháng nguyên O (poly O) luôn được sử dụng để giám định đối

với các chủng vi khuẩn E coli sau khi phân lập

- Kháng nguyên K (capsule)

Có bản chất polysaccharide, là giáp mô của vi khuẩn Tỷ lệ số chủng E

coli tạo khuẩn lạc nhày (dạng M) chiếm 11 - 25% Kháng nguyên K được coi

là một trong các yếu tố độc lực của E coli, có tác dụng kháng đại thực bào,

bảo vệ sự toàn vẹn của vi khuẩn Kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường

ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox: Ky như E coli O139: K88,

Kháng nguyên H của vi khuẩn E coli không có vai trò bám dính,

không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng

vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn

Phương pháp chế kháng nguyên lông (H): Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường flagellum broth (2% nước peptone, 1% cao thịt bò, 0,5%

C trong 1h, loại bỏ dịch nổi, sau đó tiếp tục ly tâm, rửa cặn 3 lần bằng dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline), chắt bỏ dung dịch rửa và thu cặn vi khuẩn Lông của vi khuẩn được tách bằng máy đồng

Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến

dị của từng serotype Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh

bệnh của E coli Hầu hết các chủng E coli gây bệnh đều sản sinh ra một

hoặc nhiều kháng nguyên bám dính như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41, F18, trong đó yếu tố bám dính F4 & F18 có vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở lợn con Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính

Cho đến nay, đã xác định có ít nhất 170 serotype kháng nguyên O, 70 serotype kháng nguyên K, 56 serotype kháng nguyên H và sự phát triển một cách nhanh chóng các kháng nguyên F

- Kháng nguyên độc tố

Các chủng E coli gây bệnh ở lợn con theo mẹ thường sản sinh độc tố

đường ruột (Enterotoxin) Độc tố đường ruột có bản chất là protein ngoại bào (Exotoxin), có tác động gây độc trực tiếp trên tế bào biểu mô của ruột non (Nagy B, Fekete Pzx, 1999) [61] Có hai loại độc tố, loại không chịu nhiệt (heat labile toxins, viết tắt là LT), bị vô hoạt ở 600C sau 15 phút và loại độc tố chịu nhiệt (heat stable toxins, viết tắt là ST), chịu được 1000

C trong 15 phút

1.2.2 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli có sẵn trong ruột của động vật, bình thường vi khuẩn

không gây tác hại trên ký chủ (103

CFU/g phân) Khi mật số tăng lên cao (106- 109 CFU/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh, bệnh thường xảy ra dưới ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Dinh dưỡng, sự thiếu hụt kháng thể sữa đầu, khí hậu thời tiết, nhiệt độ, ẩm độ, trạng thái stress, loạn khuẩn đường ruột, sự có

mặt của chủng E coli mang yếu tố gây bệnh vv…

Sự lây nhiễm chủ yếu là đường tiêu hóa thông qua thức ăn, nước

uống Thông thường môi trường axit của dạ dày là chất diệt khuẩn đối với E

coli , sự tăng lên của pH trong dạ dày được tìm thấy ở lợn con đã cai sữa ở

giai đoạn 5 - 6 tuần tuổi so với những con lợn đang bú sữa có thể là nguyên

nhân làm tăng số lượng E coli tồn tại trong môi trường axit của dạ dày và đi

vào ruột Đây là một nhân tố quan trọng làm cho lợn sau cai sữa mẫn cảm

đặc biệt với vi khuẩn E coli

Sự lây nhiễm trong ruột non phụ thuộc vào khả năng chống lại các tác dụng tẩy sạch của chất tiết và nhu động Các nghiên cứu về hình thái học cho

rằng E coli chiếm bề mặt niêm mạc của ruột non, đặc biệt là khoảng giữa hồi

tràng và không tràng Các nhân tố xác định sự tạo thành dịch ruột và dưỡng chấp, số lượng và các loại dinh dưỡng được hấp thụ và các cơ chế về tiêu hóa,

thấm hút của đường tiêu hóa có liên quan đến sự chiếm giữ vi khuẩn E coli

Sự tạo thành dịch ruột và dưỡng chấp có ảnh hưởng lớn đến loại và mật độ các vi khuẩn đường ruột Sự dư thừa dinh dưỡng có thể là một yếu tố hỗ trợ

cho sự chiếm giữ của E coli

Các type E coli gây bệnh phù đầu cho lợn thường tập trung vào một số

type kháng nguyên O, như O138, O139 và O141, có khả năng gây dung huyết, sản sinh yếu tố bám dính F4, F5, F6, F18, F107, sản sinh độc tố đường ruột ST, LT và độc tố VT

Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E coli thực hiện quá trình cố

định vào tế bào nhung mao ruột bằng nhiều yếu tố bám dính Sau đó nhờ khả năng xâm nhập, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột Sản sinh VT gây tổn thương thành mạch, thay đổi áp suất thẩm thấu làm dịch thoát ra và tích tụ lại tổ chức cơ thể gây phù Phù thũng thấy chủ yếu ở vùng đầu như mí mắt, vùng hầu làm thay đổi tiếng kêu của con vật; não bị phù thũng và chèn ép gây nhũn não, dẫn đến những triệu chứng thần kinh: những cơn co giật, 2 chân sau liệt, sau đó có những biểu hiện thần kinh nhẹ hay đâm đầu vào tường, đi lại không định hướng

Hình 1.1 Cơ chế gây bệnh phù đầu lợn của E coli

(Bertschinger H U, Nielsen N O, 1992) [39]

Các yếu tố gây bệnh của E coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu

tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố dung huyết và khả năng sản xuất

độc tố Các chủng vi khuẩn E coli không có các yếu tố trên thì không có

khả năng gây bệnh

Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E

coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteropathogenic E coli (EPEC), Adherence Enterotoxigenic E coli (AEEC) và Verotoxingenic

E coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) [26]

* Yếu tố kháng khuẩn:

Nhiều chủng vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn

có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác gọi là Colicin Vì

vậy, yếu tố này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E

coli gây bệnh (Smith H W và cs, 1967) [65] Trong điều kiện bình thường,

các chủng E coli không độc tạo Colicin ức chế sự phát triển của các chủng E

coli gây bệnh; ngược lại Colicin của các chủng E coli độc lực cao lại ức chế

sự phát triển của các chủng E coli khác Quá trình tạo Colicin là một đặc tính

di truyền ổn định của các chủng E coli Đặng Xuân Bình và cs (2008) [2] đã xác định yếu tố cạnh tranh Colicin ở các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh

phân trắng lợn con tại Thái Nguyên, Hà Tây cũ (Hà Nội), Cao Bằng, Bắc Ninh chiếm tỷ lệ chung 26,5%

* Yếu tố bám dính:

Để gây bệnh, các chủng VTEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non Hầu hết các chủng VTEC đều mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính như F4, F5, F6, F107.… Ở lợn sau cai sữa mắc bệnh phù đầu thường mang các yếu tố bám dính sau:

- F4: Hay còn gọi là K88, là một kháng nguyên không chịu nhiệt Bằng

các phương pháp huyết thanh học cho thấy có ít nhất 3 loại biến thể khác nhau của F4 là F4ab, F4ac và F4ad (Orkov và cs (1964) [62] và Guinee và

Jansen, (1979) [49] Biến thể F4ac được cho là biến thể chủ yếu của kháng nguyên F4 ở các chủng vi khuẩn gây bệnh (Nagy và Fekete, 1999) [61]; Francis, 2002) Kháng nguyên bám dính F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó

vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non

- F18: Yếu tố bám dính F18 có 2 biến thể kháng nguyên là F18ab và

F18ac Hai biến thể kháng nguyên này khác nhau về mặt sinh học (Nagy và

cs, 1996) [60] F18ab có khả năng sản sinh độc tố shiga biến thể 2e (Stx2e)

mang đặc tính của chủng E coli gây hiện tượng phù và F18ac thường sản sinh

độc tố đường ruột gây nên triệu chứng tiêu chảy (Imberecht và cs, 1994) [51] Hai biến thể kháng nguyên bám dính F18 này đều được xác định ở vi khuẩn

E coli gây bệnh phù đầu và bệnh tiêu chảy ở lợn con nhưng chiếm tỷ lệ khác

nhau Điều này cũng phù hợp với kết quả phân lập các chủng E coli từ lợn

mắc bệnh tiêu chảy ở một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên: tỷ lệ các

chủng vi khuẩn E coli mang kháng nguyên bám dính F18 biến thể F18ac là

- F5 (K99): Kháng nguyên bám dính F5 được tìm thấy ở các chủng

ETEC và VTEC Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc độ sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên AND của plasmid (Isaacson, 1977) [54]

- F6 (987p): Các nhà khoa học đã xác định được kháng nguyên bám

dính F6 ở lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa và lợn bị tiêu chảy Tuy nhiên kháng nguyên bám dính này lại có vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của

ETEC, chúng có thể giúp vi khuẩn E coli bám vào cả các thụ thể cấu tạo bởi

glycoprotein và glycolipid trên riềm chải của các tế bào biểu mô ruột (Dean

và cs, 1989) [42], 1994) [43], bám dính ở màng nhầy để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ

- F107: Kháng nguyên bám dính F107 có vai trò quan trọng trong các

chủng E coli ở lợn mắc bệnh phù đầu và tiêu chảy Yếu tố bám dính F107 có

2 biến thể kháng nguyên F107ab và F107ac Bằng cách sử dụng Oligonucleotide để xác định sự phổ biến của kháng nguyên bám dính F107 tại

Australia Các nhà khoa học đã phân tích 480 chủng E coli gây dung huyết ở

lợn sau cai sữa xác định yếu tố bám dính F107 chiếm 62% F107 được phát hiện ở các serotype O141, O138, O8, O45, O139, O157 và O98 nhưng không

phát hiện ở chủng có các kháng nguyên O149 và O147 81% của các chủng E

coli không sản xuất các yếu tố bám dính (F4 (K88), F6 (987P), F5 (K99) hoặc

K41) xác định được F107; 5% chủng E coli có yếu tố bám dính F4 & F107

Đồng thời cũng xác định được biến thể F107ac ở các serotype O141, O138, O8, O45 và O157 Biến thể F107ab được tìm thấy trên O139 (Imberechts H

và cs, 1994) [52]

* Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E coli

Là quá trình vi khuẩn E coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng

nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1976) [48]

hưởng của độc tố đường ruột của vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột

(ETEC) Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ được sử dụng trước đây Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga

(Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này Stx sản sinh bởi E coli bao gồm 2

nhóm chính: Shiga toxin 1 (Stx1) và Shiga toxin 2 (Stx2)

Cho đến nay có 3 loại biến thể của nhóm Shiga toxin 1 đã được mô tả

là Stx1, Stx1c, Stx1d Nhóm Stx2 bao gồm rất nhiều loại biến thể, trong đó các loại biến thể thường gặp là Stx2, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2g Trong số các loại biến thể trên, Stx2e thường được phân lập từ lợn, Stx2f phân lập từ chim

và Stx2g phân lập từ bò (Vũ Khắc Hùng và cs, 2007) [11] Stx2e kém độc hơn, nhưng gây độc mạnh cho tế bào Vero Ngoài khả năng sản sinh độc tố

Shiga, các chủng E coli gây bệnh cho người (nhóm STEC) còn mang một

yếu tố độc lực khác cũng đóng vai trò quan trọng, đó là intimin - một loại protein màng ngoài (OMP) giúp vi khuẩn bám dính và xâm nhập vào các tế bào biểu mô (A/E) (Hanna, 1997) [50]

Imberechts H và cs (1994) [52] đã tiến hành xác định sự phổ biến

của độc tố SLT II từ hơn 350 chủng E coli gây dung huyết phân lập được

từ lợn tại Australia cho biết có 29% chủng mang gen này Độc tố SLT II đã được tìm thấy ở các serotype O141, O138, O149, O98, O45, O8 và O157 nhưng không có trong O139 25% trong số các chủng trên đều cho yếu tố bám dính F107 và SLT II

* Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên:

Vi khuẩn E coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó có loại tạo miễn

dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ Các kháng nguyên tham gia vào quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F

* Yếu tố dung huyết:

Để phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E coli cần được cung cấp sắt Để chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn E coli tiết men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải phóng sắt trong nhân HEM Do vậy, hầu hết những chủng E

coli gây bệnh thường có khả năng gây dung huyết

Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E coli là: α - haemolyzin, β -

haemolyzin, γ- haemolyzin, ε - haemolyzin, nhưng quan trọng nhất là kiểu α -

haemolyzin và β - haemolyzin (Ketyle và cs, 1975) [57]

* Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E coli

Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli đang ngày một tăng,

làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn

Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn

E coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố nằm trong

Plasmid R (Resistance) Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975) [46] Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Tạo (1993) [24] khi xác định khả năng

kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phân trắng lợn con bằng kháng sinh đồ đã kết luận: vi khuẩn E coli có

được khả năng này là do nhận được bằng di truyền dọc và di truyền ngang qua plasmid

Bùi Xuân Đồng (2002) [5] đã tiến hành thử kháng sinh đồ với các

chủng E coli phân lập được từ Hải Phòng cho biết các chủng E coli phân lập

được mẫn cảm với các loại kháng sinh Choramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin; còn với các chủng tại Tiền Giang thì Bùi Trung Trực và cs (2004) [36] cho rằng chúng vẫn mẫn cảm mạnh với Norfloxacin và Colistin

Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [14] khi xác định khả năng kháng

kháng sinh của các chủng E coli phân lập được từ lợn mắc bệnh phù đầu tại Thái Nguyên và Bắc Giang cho biết vi khuẩn E coli phân lập được rất mẫn

cảm với kháng sinh Amikacin, kém hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime

Như vậy, có thể thấy, qua thời gian và ở các địa điểm khác nhau, tính

kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli gây bệnh cũng khác nhau

1.2.3 Biện pháp phòng trị bệnh phù đầu lợn

Để phòng bệnh phù đầu lợn có hiệu quả phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp với phương châm tăng cường khả năng miễn dịch cho lợn con và giảm thiểu khả năng tiếp xúc với vi khuẩn

Theo Bertschinger H.U, N (1992) [39], Nagy B, Fekete Pzx (1999) [61] để hạn chế bệnh phù đầu lợn sau cai sữa cần thực hiện các biện pháp sau:

Phòng bệnh phù đầu hiệu quả cao hay thấp phụ thuộc rất nhiều vào chăm sóc tăng cường sức đề kháng cho lợn Chăm sóc tốt sẽ hạn chế sự xâm

nhập ban đầu của các chủng E coli gây bệnh vào trong đàn lợn

Cần tập cho lợn con cai sữa ăn sớm và cho ăn từ từ, ăn nhiều bữa (3 - 4 bữa trong ngày) để tạo khả năng thích nghi cao nhất về mặt sinh lý với thức

ăn (Bùi Xuân Đồng, 2002) [5] Tăng khẩu phần thức ăn xơ để ngăn chặn bệnh tiêu chảy trong thời kỳ cai sữa Tổng lượng thức lợn con ăn vào phải được giới hạn ở thời điểm cai sữa và tăng dần lên đến mức bình thường sau 2 - 3 tuần Lượng thức ăn hạn chế và lượng chất xơ cao có tác dụng làm giảm mật

độ E coli trong đường tiêu hóa của lợn

Phải làm giảm thiểu các yếu tố stress từ môi trường và quá trình chăm sóc nuôi dưỡng như làm mát đột ngột, vận chuyển, di chuyển chuồng hoặc sự trộn lẫn không cần thiết giữa các lứa đẻ Định kỳ tiêu độc khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi nhằm giảm số lượng mầm bệnh

Thực hiện phòng bệnh bằng cách tạo miễn dịch để ngăn ngừa sự chiếm giữ ruột non một mức độ lớn về lâm sàng hay trung hòa các tác động của

EDP Miễn dịch đối với bệnh E coli gây ra thường dựa trên tác dụng bảo vệ

của kháng thể, ngăn cản hiện tượng bám dính vào tế bào thượng bì niêm mạc ruột non đồng thời trung hòa độc tố do vi khuẩn tiết ra hay kháng thể từ sữa của lợn mẹ đã được tiêm phòng bệnh Chính vì vậy sử dụng vắc xin tại chỗ

chế tạo từ các chủng E coli gây bệnh phân lập được là phương pháp phòng

bệnh có hiệu quả nhất

Theo Markku Johansen và cs (1997) [58], Lê Văn Tạo (2006) [27], sử dụng vắc xin và chế phẩm sinh học là biện pháp quan trọng để khống chế bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa

Theo Trần Thị Hạnh, Đặng Xuân Bình và cs (2004) [8], các liệu pháp kháng sinh nên áp dụng sớm, ngay sau khi phát hiện bệnh sẽ làm giảm số lượng vi khuẩn, từ đó làm giảm lượng độc tố, sẽ cho hiệu quả điều trị cao Mặt khác điều trị kịp thời và triệt để cũng là biện pháp hạn chế mầm bệnh bài xuất tránh lây lan Để có hiệu quả điều trị cao nên xác định tính mẫn cảm của

vi khuẩn E coli thông qua phương pháp thử kháng sinh đồ

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Bệnh phù đầu do vi khuẩn E coli thường xảy ra ở giai đoạn lợn sau

cai sữa, trên những lợn ăn khỏe, nhiều và xảy ra rất đột ngột Nguyên nhân của hiện tượng trên là do ở giai đoạn này, lợn vừa chuyển sang giai đoạn phát triển mới, hệ tiêu hóa của lợn chưa hoàn toàn thích ứng với điều kiện dinh dưỡng mới Khi lợn ăn quá nhiều, không kịp tiêu hóa sẽ tạo điều kiện

cho vi khuẩn cơ hội ở đường ruột phát triển mạnh, nhất là E coli gây bệnh

Theo Morris (1985) [59], Imberechts và cs (1992) [51], (1994) [52],

đã phân lập được vi khuẩn E coli phân lập từ các mẫu hạch màng treo ruột

và đoạn không tràng của lợn mắc bệnh phù đầu Kết quả này cũng phù hợp

với nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hải (2001) [6] khi phân lập vi khẩn E coli từ

hạch màng treo ruột của lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa Kết quả này cho

phép khẳng định được rằng khi lợn mắc bệnh phù đầu do E coli, vi khuẩn

này sẽ di chuyển lên phần trên của ruột non (phần không tràng) hoặc theo mạch máu vào trong hạch màng treo ruột, trong đó 68,75% mẫu hạch màng treo ruột và 59,09% mẫu ruột đoạn không tràng cho kết quả dương tính với

E coli mang 2 gen VT2e và F18

Theo Bùi Lưu Ly và cs (2007) [16] lợn ở giai đoạn sau cai sữa về mặt

mô học xuất hiện cấu trúc thụ thể tương ứng với yếu tố bám dính của vi

khuẩn E coli gây bệnh, vì vậy vi khuẩn này có cơ hội phát triển và gây

bệnh Bằng phương pháp PCR cho thấy có sự kết hợp chặt chẽ giữa 2 gen F18 và VT2e

Phạm Ngọc Thạch, Lương Thị Mai Lan (2006) [30] khi nghiên cứu về những đặc điểm bệnh lý bệnh phù đầu ở lợn gây bệnh thực nghiệm cho thấy thân nhiệt ở lợn mắc bệnh chỉ tăng ở khoảng 24 - 36h sau khi gây bệnh, nhưng sau đó thân nhiệt lại bình thường, cuối thời kỳ bệnh thân nhiệt lại giảm

so với lợn khỏe Tần số hô hấp và tần số tim mạch lại tăng so với lợn trước khi gây bệnh từ 25,74 lần/phút và 92,34 lần/phút (lợn trước khi gây bệnh), tăng cao nhất đến 72h sau khi gây bệnh

Theo Lê Văn Lãnh và cs, (2008) [15] thông qua việc xác định gen mã hóa yếu tố độc lực là verotoxin, đã thiết lập được phản ứng PCR để giám định

E coli dung huyết gây phù đầu lợn Trong các điều kiện bước đầu, phương

pháp PCR được ứng dụng trong giám định E coli gây dung huyết phù đầu ở

các mẫu thu thập ngẫu nhiên với tỷ lệ dương tính tới 64,29%

Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2002) [12] bệnh phù đầu ở lợn con sau cai

sữa gây ra bởi các chủng E coli O138, O139, O141 sản sinh độc tố VT2e với

tỷ lệ chết lên tới 61,44%

Võ Thành Thìn và cs (2011) [33] đã sử dụng phương pháp điện di xung điện trường (Pulsed - Field Gel Electrophoresis - PFGE) Phương pháp PFGE

có thể ứng dụng để phân tích đặc điểm dịch tễ và lựa chọn chủng vi khuẩn để

nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh tiêu chảy do E coli gây ra ở lợn Kết quả phân lập 18 chủng vi khuẩn E coli tại Nam Trung Bộ - Tây Nguyên, 5

chủng phân lập tại một số tỉnh miền Bắc, 3 chủng phân lập tại Miền Nam cho thấy 8/15 chủng vi khuẩn mang kháng nguyên F4 có mức độ tương đồng ở trên mức 85% Như vậy, sự sai khác về genome giữa các chủng mang kháng nguyên F4 để vắc xin toàn khuẩn có thể đảm bảo được tính tương đồng kháng nguyên cao giữa chủng vi khuẩn có trong vắc xin và chủng vi khuẩn gây bệnh

thực địa Đối với các chủng vi khuẩn E coli mang kháng nguyên F18, chỉ có

4/11 chủng có mức độ tương đồng trên 85% (có thể có quan hệ), các chủng còn lại hầu như không có quan hệ với nhau Điều này có nghĩa là tính kháng

nguyên của các chủng vi khuẩn E coli mang kháng nguyên F18 gây bệnh ở

các địa phương khác nhau có thể khác nhau Có thể nói mức độ tương đồng của các chủng mang kháng nguyên F4 cao hơn và có quan hệ gần hơn so với các chủng mang kháng nguyên F18 Tuy nhiên, kết quả phân tích tương đồng

genome của các chủng vi khuẩn E coli tại Việt Nam cũng như các nước khác

trên thế giới đều có mức độ tương đồng thấp và không đồng nhất Những chủng vi khuẩn gây bệnh tại các địa điểm khác nhau có thể mang một số yếu

tố gây bệnh khác nhau hoặc có những biến đổi nhỏ trong genome Điều này sẽ

tạo ra tính đa dạng về kháng nguyên của vi khuẩn E coli gây bệnh Vì vậy,

trong chiến lược nghiên cứu, phát triển vắc xin cần chú ý tìm được chủng vi khuẩn có tính tương đồng cao với các chủng gây bệnh trong cả nước, nhằm

đảm bảo khả năng bảo hộ của vắc xin tại các khu vực chăn nuôi khác nhau Nhưng khi chưa tìm ra được chủng vi khuẩn có tính tương đồng cao với các

chủng E coli gây bệnh phù đầu trong cả nước thì việc sử dụng auto- vaccine

sẽ mang lại hiệu quả phòng bệnh cao nhất

Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo (1996) [20] đã nghiên cứu tình hình bệnh phù đầu lợn trên địa bàn một số tỉnh khu vực đồng bằng sông Cửu Long

Để phòng bệnh, Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo và cs (1999) [21], đã nghiên

cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh từ các chủng E coli phân lập được

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Theo Theo Bertschinger H U, Nielsen N O (1992) [39], bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa với các dấu hiệu điển hình của bệnh là phù mặt và có triệu chứng thần kinh Tỷ lệ lợn bị bệnh chết từ 40 - 100%, những con to béo nhất đàn, ăn no nhất thường bị chết Lợn bệnh bị sốt 1 - 2 ngày đầu nhiễm bệnh sau đó hạ xuống có khi dưới mức bình thường Lợn bệnh bị sưng đầu, mí mắt, nên có con bị lồi mắt ra Bị sưng hầu nên lợn bệnh giảm tiếng kêu, khó thở Lợn bệnh có triệu chứng thần kinh như đi xoay vòng theo một chiều nhất định, yếu hai chân sau nên nằm co giật, bốn chân giãy liên tục hoặc thẳng cứng trước khi chết Khi mổ ra thấy ruột non chứa đầy chất lỏng và khí căng phồng, quan sát từ bên ngoài thấy đoạn thì thâm đen hoặc đỏ đen, đoạn thì trắng bệch Đây là bệnh tích điển hình lợn mắc bệnh sưng phù đầu

Xoang ngực và xoang bao tim có nhiều dịch fibrin, sưng phù ở mức độ khác nhau trên hai lá phổi Tim có xuất huyết ở cơ và màng bao tim Sưng phù ở lớp dưới niêm mạc dạ dày được thể hiện trong vùng viêm ở phần thân

vị Nó có thể khác nhau từ chỗ rất khó thấy cho đến có độ dầy 2cm hoặc lớn hơn Nếu trường hợp nặng thì hiện tượng sưng phù có thể tận tới lớp cơ Sưng phù có thể đánh giá tốt nhất bằng cách kiểm tra thanh mạc và áo cơ ở đường cong lớn Chất dịch sưng phù này thường là huyết thanh đông

Sưng phù túi mật đôi khi có thể thấy, đó là dấu hiệu của nội độc tố tác động Màng treo kết tràng là nơi phổ biến cho bệnh sưng phù, đôi khi một đoạn ruột non hay trực tràng có biểu hiện sưng phù lớp dưới niêm mạc Các trường hợp thực nghiệm, lớp dưới niêm mạc của manh tràng khác nhau ở bề ngoài từ bình thường cho đến sưng, xuất huyết

Bệnh tích vi thể: Bệnh tích vi thể quan trọng nhất là chứng thoái hóa mạch máu ảnh hưởng đến động mạch nhỏ Tổn thương có thể ở nhiều cơ quan

và mô Mạng lưới động mạch bên cạnh màng treo kết tràng, bên cạnh hạch bạch huyết kết tràng luôn bị ảnh hưởng

Tổn thương cấp tính sớm nhất là hoại tử tế bào cơ Một số mạch máu

có thể bị ảnh hưởng với sự thâm nhiễm fibrin Tổn thương mạch máu khó phát hiện ở thể cấp tính, nhưng ở những con còn sống sót thì tổn thương này khá rõ ràng

Lợn đã hồi phục sau bệnh hoặc sống sót vài ngày có dấu hiệu tổn thương ở não, dây thần kinh, tiểu động mạch Những dấu hiệu này là kết quả của tổn thương mạch máu dẫn đến phù và thiếu máu cục bộ Trong các trường hợp bệnh cấp tính có chứng phù mạch màng não, mềm xung quanh mạch máu

Theo Bertschinger H U, Nielsen N O (1992) [39], Markku Johansen et

al (1997) [58], các type E coli O138, O139, O141 gây bệnh phù đầu lợn sau

cai sữa thường sản xuất độc tố Verotoxin (VT) và mang yếu tố bám dính F18

Schierak và cs (2006) [64] cho biết có 68,6% chủng E coli phân lập từ

lợn khỏe mang ít nhất một gen mã hóa độc tố đường ruột chịu nhiệt typ I & II, độc tố đường ruột không chịu nhiệt typ I cũng như độc tố Shiga toxin 2e và yếu tố bám dính F4, F5, F6, F8 và F41

Markku Johansen et al (1997) [58] và Bosworth B T và cs (1996) [40]

đã chọn chủng E coli gây bệnh sản sinh yếu tố VT2e để chế tạo vắc xin tiêm

phòng cho lợn con 1 - 2 tuần tuổi Thí nghiệm được tiến hành trên 2 lô thí nghiệm có sử dụng vắc xin và không sử dụng vắc xin, sau đó gây nhiễm trên

cả 2 lô thí nghiệm (giai đoạn 21 - 28 ngày tuổi) bằng canh khuẩn E coli sản

xuất VT2e Kết quả lô thí nghiệm không sử dụng vắc xin lợn mắc bệnh phù đầu với triệu chứng điển hình: hoại tử mạch máu, giảm tăng trọng, mất thăng bằng, phù mi, chết; lợn được tiêm phòng không gây phản ứng phụ, tỷ lệ mắc bệnh phù đầu giảm, có tác dụng tạo ra kháng thể chống lại bệnh phù đầu

Docic M, Bilkei G (2006) [44] cũng đã chế tạo vắc xin vô hoạt từ các

chủng E coli sản xuất VT2e Thí nghiệm tiến hành tại trại lợn có tỷ lệ lợn

mắc bệnh phù đầu sau cai sữa cao Nhóm 1 (n = 351) sử dụng vắc xin cho lợn con 1 tuần tuổi với liều lượng 12,5 microgram, tiêm nhắc lại lúc 3 tuần tuổi với liều lượng 25 microgram Nhóm 2 (n =350) không sử dụng vắc xin Kết quả thí nghiệm cho thấy:

+ Tỷ lệ tăng trọng trung bình (301 ± 31g/ngày) và 278 ±41g/ngày) + Tỷ lệ tử vong do phù đầu giảm 0,9% so với 6,9%

+ Tăng trọng trong giai đoạn vỗ béo đến 4 tháng tuổi không có sự khác biệt giữa các nhóm: 711 ± 41g so với 708 ± 40g

Chương 2 NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn con sau cai sữa nuôi tại các huyện, của tỉnh Thái Bình

- Vi khuẩn E coli gây bệnh phù đầu ở lợn

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa bàn nghiên cứu : Các trại lợn chăn nuôi theo hình thức công nghiệp tập trung trên địa bàn tỉnh Thái Bình

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2010 - 12/ 2011

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình

2.1.1.1 Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu trong các năm 2008, 2009, 2010 2.1.1.2 Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo địa điểm

2.1.1.3 Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo mùa

2.1.1.3 Tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo tuổi

2.1.1.4 Tình hình lợn chết do mắc bệnh phù đầu

2.2.2 Phân lập vi khuẩn E coli từ những lợn mắc bệnh phù đầu

2.2.2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh

2.2.2.2 Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.3 Xác định yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli phân lập được

+ Xác định type kháng nguyên O

+ Xác định yếu tố bám dính

+ Xác định yếu tố dung huyết

+ Xác định khả năng sản sinh độc tố

2.2.2.4 Thử độc lực của chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.2.5 Thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của chủng vi khuẩn E coli phân lập được

2.2.3 Chế tạo auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn

- Chọn chủng E coli chế tạo vắc xin

- Kiểm tra, đánh giá auto - vaccine trong phòng thí nghiệm

- Thử nghiệm auto - vaccine trên lợn thí nghiệm

- Khảo sát đáp ứng miễn dịch của lợn thí nghiệm sử dụng auto - vaccine

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Môi trường, hóa chất thông dụng đạt tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) của

Merck được chọn lọc để sử dụng phân lập và giám định vi khuẩn E coli, chế

tạo và kiểm nghiệm vắc xin tại chỗ

- Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn phân lập được

- Động vật thí nghiệm

Chuột bạch khỏe 22 - 25gr/con; thỏ khỏe 2,5 - 3 kg/con

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh, 2001) [29]; Nguyễn Văn Thiện, 1997) [31]

- Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn theo Dirk U Pfeiffer (2002) [45]

Phương pháp phân tích dịch tễ:

Để so sánh nguy cơ mắc bệnh phù đầu và chết do bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa theo lứa tuổi, mùa vụ, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR)

Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [29] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các nguy cơ so sánh và được định nghĩa là nguy cơ phát triển một bệnh trong

số các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được

so sánh với nguy cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó

Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng,

số liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:

Khai thác sau khi

chọn

Chủ động chọn vào nghiên cứu

Bệnh trạng

Cộng

Cảm nhiễm khi tiếp

xúc với nguy cơ

c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc

d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc

Nguy cơ tương đối được tính theo công thức:

Trong đó:

Ie là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ

Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ Đánh giá kết qủa:

+ Nếu RR >1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy

cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh

+ RR= 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau + RR <1 nói lên một kết hợp âm tính

Theo công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[]:

χ2

2 (a+b+c+d) (a+b) (c+d) (a+c) (b+d) Tìm giá trị χ2α ứng với độ tự do υ = (l1 -1) (l2 -1) = (2-1) (2-1) =1

Ta tìm được các giá trị χ2

α = 3,8; 6,6; 10,8 với mức α = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cách tra bảng

α tức P <0,05 thì kết luận có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ ở mức α

2.4.2 Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn

* Thu thập mẫu

Lấy mẫu bệnh phẩm, phân lập và giám định vi khuẩn E coli theo

Quinn P J et al, 1994) [63]

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập giám định vi khuẩn E coli

(Theo Quinn P J et al, 1994) [63]

Phương pháp nhuộm Gram:

Các bước nhuộm:

+ Nhỏ một giọt nước sinh lý

+ Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít khuẩn lạc (bằng đầu tăm dàn đều lên phiến kính, rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn (giữ khoảng cách sao cho vi khuẩn không bị cháy thành than)

+ Nhỏ một giọt tím Genxian, để 1 phút sau đó rửa nhẹ bằng nước sau

đó để khô hoặc hơ khô

+ Nhỏ 1 giọt Lugol (gắn màu) để một phút

- Nutrient broth Kiểm tra sản sinh Indole

- TSI agar Kiểm tra sinh hơi, sản sinh H2 S

- Blood agar Kiểm tra khả năng dung huyết

- Nhuộm Gram Kiểm tra hình thái

Mẫu bệnh phẩm (máu tim, gan, não svv…

Brillant Green Bile Agar

+ Soi kính: Dùng dầu xilen lau kính, nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính rồi quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần

2.4.3 Xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được

Vi khuẩn E coli có nhiều serotyp e khác nhau, do vậy bước quan trọng

đầu tiên là xác định được nhóm serotyp e O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với các kháng huyết thanh đơn giá trong

nhóm cần xác đ ịnh Xác định một số serotype kháng nguyên O của vi khuẩn

E coli phân lập được theo Karen W et al (2000) [56]

Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp e gồm:

+ Các chủng E coli cần định type được giữ trên thạch máu

+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá ), dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85%, phiến kính sạch

* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:

Phản ứng được thực hiện trên phiến kính, tiến hành chia phiến kính làm

3 phần Trên một đầu của phiến kính ta nhỏ giọt nước muối sinh lý làm đối chứng âm, phần còn lại chia làm 2, mỗi vị trí nhỏ một giột kháng huyết thanh

nhóm (Poly O) Dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng khuẩn lạc chủng E coli

cần giám định hòa trộn đều với một giọt kháng huyết thanh, làm như vậy đối với giọt nước muối sinh lý Để 1 - 2 phút đọc kết quả phản ứng

+ Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là

vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++ Tùy theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++ (theo Difco Laboratories)

+ Phản ứng âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều tương tự như bên đối chứng

Các chủng có ngưng kết với nhóm kháng nguyên O đa giá, sẽ tiếp tục làm phản ứng ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá có trong nhóm

đa giá đó, cách làm và theo dõi tương tự như phản ứng kháng huyết thanh nhóm Poly O ở trên Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2 rồi tiếp tục làm phản ứng Nhóm serotype kháng huyết thanh nào có phản ứng ngưng kết xảy ra ở độ pha loãng cao nhất với chủng vi khuẩn giám định, chủng vi khuẩn thuộc về serotype đó

2.4.4 Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

E coli phân lập được

2.4.4.1 Xác định khả năng gây dung huyết

Vi khuẩn E coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu

cừu, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ Căn cứ vào mức độ dung huyết để đánh giá kiểu dung huyết:

+ Dung huyết kiểu β: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng + Dung huyết kiểu α: Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết mờ, sau

đó tiếp tục để ở nhiệt độ 370

C trong 18 giờ, thấy có vòng dung huyết sáng sạch

+ Dung huyết kiểu γ: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết hay vi khuẩn không có khả năng gây dung huyết

2.4.4.2 Xác định yếu tố bám dính và độc tố của vi khuẩn E coli phân lập được

Tăng cường sản sinh yếu tố bám dính bằng phương pháp nuôi cấy E coli

trên các môi trường chọn lọc Xác định yếu tố bám dính bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn, tiến hành và đọc kết quả phản ứng theo phương pháp của Difco Laboratories theo Karen W et al, 2000) [56]

- Xác định kháng nguyên bám dính F4 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trực tiếp:

Chuẩn bị hồng cầu gà: Máu gà được lấy vô trùng từ tĩnh mạch cánh, chống đông bằng Citrat Natri 3,8%, rửa hồng cầu bằng cách ly tâm trong dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) ở điều kiện 300 vòng/phút, trong 15 phút, làm liên tục 3 lần rồi chắt bỏ dung dịch rửa còn lại thể tích ban đầu pha thành huyễn dịch 3% với nước muối sinh lý 0,85% để làm phản ứng

Chuẩn bị kháng nguyên: Chủng vi khuẩn E coli cần kiểm tra được nuôi

C/24h Canh trùng được ly tâm 2.000 - 3.000 vòng/phút, trong 30 phút, loại bỏ phẩn nước nổi, lấy cặn đem pha loãng (theo dãy so màu Mc Farland) với nước muối sinh lý

+ Cho vào mỗi giếng ở trên cả 2 bản nhựa 25μl huyễn dịch hồng cầu gà

đã chuẩn bị, lắc kỹ nhẹ nhàng cho các thành phần trộn đều, sau đó cho vào tủ

Phản ứng cho kết quả dương tính khi hồng cầu ngưng kết hình dù ở đáy giếng, mức độ ngưng kết được đánh giá theo 3 cấp: +, ++, +++, ++++ Kết quả âm tính khi hồng cầu lắng thành cục, tròn đều như giếng đối chứng

- Xác định yếu tố bám dính F5, F6, F107 bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo Guinee P A M et al (1976) [49]

C/24h, làm kháng nguyên xác định F5 Cấy trên môi trường Bromthymol blue agar,

kính với kháng huyết thanh F5, F6 và F107 tương tự như phản ứng phát hiện kháng nguyên O

Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn E coli

bằng phản ứng khuếch tán trong da thỏ

Chuẩn bị độc tố:

Chủng vi khuẩn E coli thuần khiết trên môi trường giữ giống được cấy

chuyển sang 30ml môi trường BHI lỏng đựng trong bình tam giác loại 100ml,

cách li tâm canh trùng 10.000 - 20.000 vòng/phút ở điều kiện lạnh, trong 10 phút Bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần:

C trong 10 phút sau đó bảo quản ở điều kiện 40

C, để thử độc tố chịu nhiệt

Chuẩn bị động vật thí nghiệm:

Chọn thỏ khỏe có khối lượng 2,5 - 3 kg, cắt trụi lông ở phần lưng, có thể xoa thêm kem rụng lông để làm sạch hết phần chân lông còn lại, dùng bút

dạ chia mảng da này thành những ô vuông nhỏ có kích thước cạnh 2 x 2cm

Chính giữa mỗi ô vuông, tiêm nội bì 0,1ml dịch độc tố đã được chuẩn

bị ở trên, mỗi mẫu tiêm ở 2 ô ở 2 vị trí xa nhau, đối chứng âm là môi trường BHI lỏng vô trùng Sau khi tiêm 18 giờ với độc tố không chịu nhiệt và sau 2