Nghiên cứu sản xuất kháng sinh VANCOMYCIN từ xạ khuẩn STREPTOMYCES ORIENTALIS

Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Khoa Công Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường BÀI TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES OR

Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm

Khoa Công Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường

BÀI TIỂU LUẬN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ

XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS

GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai

Danh sách thành viên :

Lê Hồ Thảo Nguyên 2008100132

Tháng 12 -2011

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ T V N ẤN ĐỀ ĐỀ 2

II N I DUNG ỘI DUNG

1 Khái quát v Streptomyces orientalis ề Streptomyces orientalis 3

1.1 Streptomyces 3

1.2 Streptomyces orientalis 3

1.3 ng d ng trong s n xu t kháng sinh Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh ụng trong sản xuất kháng sinh ản xuất kháng sinh ất kháng sinh 4

2 Khái quát v Vancomycin ề Streptomyces orientalis 4

2.1 Sinh t ng h p ổng hợp ợp 5

2.2 D ượp c và hóa h c ọc 6

2.3 C ch tác d ng ơ chế tác dụng ế tác dụng ụng trong sản xuất kháng sinh 7

3 Quy trình công ngh s n xu t kháng sinh vancomycin t ệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ ản xuất kháng sinh ất kháng sinh ừ

x khu n Streptomyces orientalis ạ khuẩn Streptomyces orientalis ẩn Streptomyces orientalis 8

3.1 Ch ng gi ng vi sinh v t ủng giống vi sinh vật ống vi sinh vật ật 7

3.2 L a ch n m i tr ựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh ọc ơ chế tác dụng ường điều kiện lên men sinh kháng sinh ng i u ki n lên men sinh kháng sinh điều kiện lên men sinh kháng sinh ề Streptomyces orientalis ệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ

c a ch ng ủng giống vi sinh vật ủng giống vi sinh vật

S orientalis 4912 8

3.3 Nâng cao ho t tính kháng sinh c a ch ng S orientalis 4912 ạ khuẩn Streptomyces orientalis ủng giống vi sinh vật ủng giống vi sinh vật 9 3.4 L a ch n môi tr ựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh ọc ường điều kiện lên men sinh kháng sinh ng và i u ki n lên men vancomycin c a điều kiện lên men sinh kháng sinh ề Streptomyces orientalis ệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ ủng giống vi sinh vật

ch ng ủng giống vi sinh vật điều kiện lên men sinh kháng sinhột biến t bi n ế tác dụng 9

3.5 Tách chi t và tinh ch vancomycin t d ch lên men ế tác dụng ế tác dụng ừ ịch lên men 11

4 M t s ng d ng khác c a Streptomyces ột biến ống vi sinh vật ứng dụng khác của Streptomyces ụng trong sản xuất kháng sinh ủng giống vi sinh vật 12

4.1 Các ch t kháng sinh có ngu n g c x khu n trong phòng tr ất kháng sinh ồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ ống vi sinh vật ạ khuẩn Streptomyces orientalis ẩn Streptomyces orientalis ừ

n m gây b nh th c v t ất kháng sinh ệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ ựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh ật 12

4.2 Khu n l c c a Streptomyces sp trên môi tr ẩn Streptomyces orientalis ạ khuẩn Streptomyces orientalis ủng giống vi sinh vật ường điều kiện lên men sinh kháng sinh ng agar 13 4.3 Streptomyces nh m t v t ch cho vi c ti t ra các protein ư ột biến ật ủng giống vi sinh vật ệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ ế tác dụng

d ịch lên men điều kiện lên men sinh kháng sinhể sản xuất dược sinh học ản xuất kháng sinh s n xu t d ất kháng sinh ượp c sinh h c ọc 13

4.4 Vi sinh v t phân gi i PhotPho (P) ật ản xuất kháng sinh 13

I K T LU N ẾT LUẬN ẬN 14

TÀI LI U THAM KH O ỆU THAM KHẢO ẢO 15

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới Và trong đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các loại hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như những lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống và nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của mình Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn có khoảng 8.000 chất là do kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn 60% Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc trúc và đặc điểm kháng khuẩn Đặc biệt trong số đó có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều ứng dụng trong thực tiễn đời sống hiện nay

Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế những nhà khoa học cũng như những y bác sĩ không ngừng học hỏi tìm tòi để có thể tìm được ra những phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được nhóm tâm đắc nhất và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp ở đề tài này

+ Mục tiêu :

Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 phù hợp với nguyên liệu và điều kiện

môi trường khí hậu Việt Nam.

+ Nội dung nghiên cứu :

- Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống

- Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất

- Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nhỏ

- Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912

- Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na

II NỘI DUNG

1 Khái quát về Streptomyces orientalis

1.1 Streptomyces

- Streptomyces là lớn nhất chi của Actinobacteria và

chi nhập của gia đình streptomycetaceae Hơn 500 loài

Streptomyces vi khuẩn đã được mô tả Cũng như với các

Actinobacteria khác, Streptomyces là Gram dương, và có

bộ gen với cao GC được tìm thấy chủ yếu trong đất và

thảm thực vật mục nát, nhất Streptomyces sản xuất bào tử,

và được ghi nhận về mùi của họ mà kết quả từ sản xuất của

một biến động chất chuyển hóa, geosmin Streptomyces

được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất

là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces) Streptomyces thường

sống ở đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

1.2 Streptomyces orientalis

Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là Streptomyces orientalis ,

nay được gọi là orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu được tìm

thấy trong đất và thảm thực vật mục nát Streptomyces orientalis ban đầu được tìm

thấy trong đất Ấn Độ và Indonesia Nó được phát triển trên môi trường thạch men một chiết xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C

Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, được sử dụng để

phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là khuẩn tụ cầu Nó hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Trong khi Vancomycin có thể hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, nó cũng có thể gây ra vấn đề Nó đã được báo cáo là gây độc cho thận, và trong vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt là các dây thần kinh thính giác Do đó, Vancomycin thường được sử dụng như một loại thuốc cuối cùng, chỉ được sử dụng khi không có gì khác

Hình 1.1 Streptomyces

1.3 Ứng dụng trong sản xuaát kháng sinh

Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp

- Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin

- Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml

- Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta còn có thể sử dụng một số biện pháp kĩ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh này cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại

2 Khái quát về Vancomycin

Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm

glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng

được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều

trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi

sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhiễm

β-lactam) gây nên Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh

từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng

sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một

mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại

các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng

Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được

quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả

Một số loại thuốc kháng sinh

Hình 2.1

chữa bệnh cao Hơn nữa nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế đề ra Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phối hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xâây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

2.1 Sinh tổng hợp

Vancomycin sinh tổng hợp xảy ra thông qua tổng hợp protein khác nhau nonribosomal (NRPSs) Enzyme xác định trình tự axit amin trong quá trình lắp ráp đến 7 mô-đun Trước khi Vancomycin được lắp ráp thông qua NRPS, các axit amin đầu tiên được sửa đổi L-tyrosine được sửa đổi để trở thành β hydroxychlorotyrosine (β-hTyr) và 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng Mặt khác, acetate được sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5-DPG)

Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy ra thông qua phân biệt các mô-đun có thể tải và mở rộng các protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide tại địa điểm liên kết của các phạm vi hoạt động Mỗi module thường bao gồm một adenylation (A) tên miền, một chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền và tên miền ngưng tụ (C) hoặc kéo dài Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể được kích hoạt bằng cách chuyển đổi thành một phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với một đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine bởi thioesterification phức tạp sau đó được chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP Trong sinh tổng hợp các Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn như các epimerization (E) miền, được sử dụng isomerizes axit amin từ một lập thể khác, và một tên miền thioesterase (TE) được sử dụng như một chất xúc tác cho tạo vòng và vận hành của phân tử thông qua một thioesterase phân cắt

Một tập hợp các multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, và CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp các heptapeptide (Hình 2) Các tổ chức của CEPA, CepB, và CEP C chặt chẽ tương tự như tổng hợp peptide khác như những chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, và SrfA3) và gramicidin (GrsA và GrsB) Mỗi enzym tổng hợp peptide kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt từng lĩnh vực CEPA mã hóa cho mô-đun 1, 2, và 3 CepB mã hóa cho các mơ-đun 4, 5, và 6 và CepC mã hóa cho mơ-đun 7 Sau khi phân tử heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin đã phải trải qua thay đổi hơn nữa, chẳng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl hóa

Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8,

9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 được sử dụng Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là những enzym

P450 Và ORF 9 và 14 được xác định là enzym thủy phân giả định Với sự gíup đỡ của các enzym này, các nhóm β-hydroxyl được giới thiệu trên tyrosine dư lượng 2 và 6, và khớp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2 Ngồi ra, haloperoxidase được sử dụng để gắn các nguyên tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một quá trình oxy hóa

Hình 2.2

2.2 Dược và hóa học

Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa được sản xuất bởi quá trình lên men của các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước đây là chỉ định Nocardia orientalis )

Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác biệt rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết Các hình thái hiện diện trong thuốc là các mặt nhiệt động ổn định hơn conformer và do đó có hoạt động mạnh hơn

2.3 Cơ chế tác dụng

Vancomycin hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Do cơ chế khác nhau mà theo đó các vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (ngoại trừ một số loài do lậu cầu của Neisseria)

Các phân tử ưa nước lớn có thể hình thành liên kết hydro tương tác với các thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties các NAM / NAG- peptide Trong những trường hợp bình thường, đây là một sự tương tác năm điểm Điều này ràng buộc của vancomycin D-Ala-D-Ala ngăn chặn tổng hợp thành tế bào trong hai cách: + Ngăn chặn sự tổng hợp của polyme dài của N-acetylmuramic acid (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) đã hình thành sợi xương sống của các tế bào vi khuẩn + Ngăn cản các polyme xương sống để kìm chế sự hình thành, liên kết với nhau

3 Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis

Hình 2.5

Cơ chế tác dụng của Vancomycin

3.1 Chủng giống vi sinh vật

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2, các hóa chất dung để phân tích, định lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48

Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912

A Hình dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C bào tử

3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh

Hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S orientalis 4912 là

Hình 3.1

Hình 3.2

280C và pH từ 6 đến 8 Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6

- 8% so với môi trường lên men

Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác

3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912

Tr c h t, các nhà khoa h c Vi n Công ngh sinh h c áp d ng ph ngư ết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ọc Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ện Công nghệ sinh học áp dụng phương ện Công nghệ sinh học áp dụng phương ọc Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ụng phương ương pháp gây ch ng đ t bi n b ng tia UV K t qu nghiên c u kh n ng s ng sót c aột biến bằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của ết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của ết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ả nghiên cứu khả năng sống sót của ứu khả năng sống sót của ả nghiên cứu khả năng sống sót của ăng sống sót của ống sót của

t bào tr n và bào t ch ng S orientalis 4912 sau khi x lý UV đ s ng sót tết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ ử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ ở độ sống sót từ ột biến bằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của ống sót của ừ 1-10%, ki m tra ho t tính kháng sinh theo ph ng pháp c c th ch cho th y, khạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả ương ụng phương ạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả ấy, khả ả nghiên cứu khả năng sống sót của

n ng sinh t ng h p kháng sinh c a ch ng này t ng lên t 8-30,3% đ i v i x lýăng sống sót của ăng sống sót của ừ ống sót của ử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ bào tử và 66,33% đ i v i x lý tế bào trống sót của ử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ n.

Khả năng sống sót của

tế bào trần và bào tử chủng

S orientalis 4912 sau khi xử

lý UV và MNNG

Hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc chủng

S orientalis 4912 xác định bằng phương pháp cục thạch (A) và đục lỗ (B)

Sau đó các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây chủng đột biến bằng MNNG Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian

xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng của hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 % Kết quả nhận được biến chủng S orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml)

3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến

Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/ l; CuSO4 10 mg/l

Hình 3.3