tinh sạch sản phẩm PCR .PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện cácbệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng,tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Trang 1I Giới thiệu chung về PCR
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA
mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền , nhận dạng, chẩn đoán
những bệnh nhiễm trùng , tách dòng gene , và xác định huyết thống.
nguyên liệu: Các thành phần phản ửng của PCR:
Theo Too H P (2001) các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:
- Khuôn mẫu (template): ADN đích
- Primer
- Bốn dNTP (2’– deoxynucleoside – 5’ – triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP
- Taq polymerase
- Dung dịch đệm
- Mg2+
- Chất phụ trợ (additive): được sử dụng để tăng hiệu quả khuếch đại
Thông thường sau khi chạy PCR, trong trường hợp tốt nhất là chỉ có 1 sản phẩm duy nhất (đặc hiệu) thì mẫu vẫn còn bị lẫn tạp với 1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase
II TINH SẠCH
1 nguyên lý chung của tinh sạch
Trong quá trình tinh sạch có sử dụng dung dịch đệm rửa giải phải đúng yêu cầu và liều lượng
Cột tinh sạch phải được điều chỉnh mức chinh xác
Thao tác đúng trình tự và cẩn thận trong quá trình thực hiện
2 các phương pháp tinh sạch
Phương pháp Sepharose CL-6B
Phương pháp Sephacryỉ S-3Q0/S-500
Phương pháp Sephadex 74
Phương pháp Sephadex G-50
Phương pháp Micron- ỉ 00
Phương pháp guanidine-HCỈ
Phương pháp điện đi agarose
Phương pháp SPRIR
Phương pháp kết tủa
Trang 2Trong đó ta chọn phương pháp điện di agarose
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di
Bước 1: Gel sau khi chạy điện di, được đưa lên hệ thống uv
Bước 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần được tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml (đã cân trọng lượng trước)
Bước 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ lOmg gel ~ 10|il capture buffer
Bước 4: Đậy nắp lại ủ ở 60°c cho đến khi agarose tan hết (5-15 phút)
Bước 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tương ứng với số mẩu cần tinh sạch Bước 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf
Bước 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút
Bước 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 4°c
Quá trình li tâm nhanh này sẽ làm cho mẫu được tinh sạch nhanh hơn,các tạp chất sẽ được loại bỏ,giữ nhiệt độ ở 4oC là tốt nhất để không ảnh hưởng đến mẫu cần phân tích
Bước 9: Cho thêm vào cột lượng wash buffer tương ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm
10000 vòng/phút trong 30 giây ở 4°c
Sau khi mẫu được li tâm cũng đẫ khá sạch tạp chất,để tăng thêm độ tinh sạch người ta bổ sung vào côti tinh sạch một lượng đệm wash buffer có chức năng rửa giải mẫu.với tỉ lệ 1:5 ta tiến hành li tâm để rửa giải thành phầm không mong muốn vẫn giữ nguyên nhiệt độ là 4oC để không ảnh hưởng đến mẫu phân tích
Bước 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới
Lấy cột trong mẫu đang cần tinh sạch ra khỏi mẫu và đặt vào một eppendoft khác có thể tích 1,5ml mới đây là mẫu kiểm chứng để đối chứng với mẫu cần phân tích
Bước 11: Hút 50|xl elution buffer nhỏ vào cột GFX
Hút 50xl dung dịch đệm elution buffer để nhỏ vào cột GFX mà ta mới cho vào eppendof mơi là mẫu kiểm chứng mục đích là để rửa giải mẫu và chuẩn bị đem đi li tâm
Bước 12: ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút
Sau khi được trộn với dung dịch đệm ta nên ủ ở nhiệt độ phòng để ổn định dung dịch,không ảnh hưởng đến tính chất của mẫu kiểm chứng
Trang 3Bước 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 4°c, lấy cột ra, đậy nắp lại
Tiến hành ly tâm trong 1 phút để làm sạch mẫu và vẫn giữ nguyên ở nhiệt độ 4oC để đảm bảo cho mẫu không không bị nhiễm
Bước 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chưa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch
Sau khi li tâm cả 2 mẫu phân tích và kiểm chứng ta tiến hành điện di trên gel agarose để xem kết quả độ tinh sạch giữa mẫu kiểm chứng và mẫu phân tích
Kết luận
Điện di agarose là phương pháp dễ làm và cho kết quả như mong muốn
Quá trình tinh sạch sẽ đem lại sản phẩm sạch tối ưu sử dụng cho tạo dòng
Sản phẩm sau khi được tinh sạch không còn lẫn tạp chất