Bài giảng thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

Bài giảng thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

BỘ GIAO DUC & DAO TAO

TRUONG DAI HQC KY THUAT CONG NGHE TP.HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH

PHAN TICH DANH GIA CHAT LUQNG THUC PHAM

Bién soan: KS PHAM MINH NHUT

ThS BÙI ĐỨC CHÍ THIỆN

GIỚI THIỆU

Trong xã hội ngày nay, đời sống của con người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện Tuy nhiên, cuộc sống của con người càng được nâng cao thì thời gian dành cho việc ăn uống càng giảm xuống Chính vì

thế, những bữa ăn nhanh, những quán cơm vỉa hè là những lựa chọn thích hợp đối với

những con người bận rộn Do đó, việc đánh giá và quản lý nguồn thực phẩm là điều

hết sức cần thiết để có thê hạn chế tối đa khả năng ngộ độc thực phẩm

Đây chính là tiền đề để ra đời môn học Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm, góp phần giúp cho sinh viên có cái nhìn khái quát về những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đồng thời biết được các phương pháp phân tích đánh giá chất lượng của nguồn thực phẩm Và nội dung thực hành của môn học này giúp cho sinh

viên có thể tự tay mình có thể phân tích và đánh giá mức độ vệ sinh an toàn của thực

phẩm đối với một số các chỉ tiêu vi sinh vật và một số các chỉ tiêu hóa lý thực phâm Trong nội dung của môn thực hành này, sinh viên sẽ được làm quen với quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh như quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, coliform tổng sé, Staphylococcus aureus, quy trinh dinh tinh E Coli, Salmonella Cac quy trình phân tích này dựa trên tiêu chuẩn ngành và tiêu chuẩn Việt Nam và các quy trình này cũng được áp đụng rộng rãi ở khá nhiều phòng thí nghiệm vi sinh tại các cơ quan, công ty Thông thường các quy định về vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực

phẩm thông thường cho phép có sự hiện diện của TPC, coliform tổng sé va S aureus với số lượng nhất định do đó phải tiến hành định lượng còn đối voi hai chi tiéu E Coli

và 8alnonella tuyệt đỗi không được phép hiện diện trong thực phẩm nên chỉ cần phân tích định tính

Tôi hy vọng sau môn học thực hành này, sinh viên sẽ tích lũy được ít nhiều kiến thức thực tế về phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm và hy vong nó sẽ trở thành một phần trong hành trang để các bạn bước vào đời

MUC LUC PHAN 1: KIEM NGHIEM VI SINH VAT GAY BENH TRONG THUC PHAM

Bai sé 1: Dinh lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) trong thực phẩm

Bai số 2: Định lượng tống số Coljform trong thực phẫm

Bài số 3: Định tính E Coli trong thực phẩm

Bai số 4: Dinh lwgng Staphylococcus aureus trong thyc phim

Bai s6 5: Dinh tinh Salmonella trong thực phẩm

PHAN II: KIEM NGHIEM HOA LY THUC PHAM

: Phương pháp phát hiện nhanh màu độc và không độc

Bài số 8: Xác định hàm lượng protein trong sữa theo phương pháp kết tủa

Bài số 9: Xác định độ ẫm nguyên liệu

10: Phương pháp phát hiện nhanh hàn the

PHẢNI

KIEM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM

CAC QUY TAC AN TOAN TRONG PHONG KIEM NGHIEM VI SINH Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với sô lượng rất lớn và đậm đặc tế

bào vi sinh vật (ở mức 10° té bao/ml) Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh

nên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác.Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ một số quy tắc an toàn đề đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau:

- _ Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- _ Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật

- Ma§c áo blouse trong thời gian làm việc

-_ Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 70° hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác (Iysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), dé khô Thực hiện tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc

-_ Cần ghi chú tên chủng ngày tháng thí nghiệm lên tat cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cây

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tam chất

diệt khuân lau ky, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc

- _ Cần thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa có

nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Lưu ý tránh đưa tay,

tóc qua ngọn lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài

- Str dung quả bóp cao su khi thao tác Ống hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cần thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ

Vào một túi rác riêng

- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng

-_ Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng

- _ Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau

-_ Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô

Bài số I: XÁC ĐỊNH TONG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC)

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng Sau

đó đỗ môi trường PCA đã được làm nguội đến 45°C

Đọc kết quả các kết quả từ 25 ~ 250 khuẩn lạc

Cân chính xác 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90

ml (hoặc 225 ml) dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2.5 phút Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ

có được dung dịch pha loãng là 10 '

Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng ->

đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 103 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết

1.6.2 Đỗ đĩa

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 30 — 300 tế bào vi sinh vật

Ding micropipette với các đầu tỉp vô trùng dé chuyên ml dịch pha loãng vào giữa đĩa

petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 — 3 đĩa Sau khi cây, đồ vào mỗi đĩa 10 — 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 — 50°C Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ

3 — 5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc

16.3 Ủ

Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 30C trong 72 giờ

1.6.4 Doc két qua

Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiểu khí Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số đểm

từ 30 — 300 tế bao vi sinh vật để tính Mật độ tống vi sinh vật hiều khí trong 1g mẫu

được tính như sau:

N

A(CFU/g) =

n, Vf,+ +n; Vf;

Trong dé: A: số tế bào vi khuẩn (Khuan lac) trong 1g mau

N: Téng sé khuan lac dém duge trén các đĩa đã chọn

n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ ¡

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

{: độ pha loãng tương ứng

Bai sé 2: XAC DINH TONG SO COLIFORMS

2.1 Dinh nghia Coliforms

Coliforms 1a những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc ky khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi 6 37°C trong 24 — 48 giờ Nhóm coljforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật Coliforms được xem là nhóm vi sinh vat chi thị: số Tượng hiện điện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng đề chỉ thị khả năng hiện điện của các vi sinh vật gây bệnh khác

2.2 Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Sau khi ủ 37C + 1°C trong 24 - 48 giờ, đếm số lượng khuan lac Coliforms điển hình Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng

thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhận chỉ thị

nhw neutral red, crystal violet Khăng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi

trường canh chọn lọc như canh BGBL

2.3 Môi trường sử dụng

-_ Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

"Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng Sau đó dé môi

trường TSA đã được làm nguội đến 45°C và chờ trong 30’

11

2.6 Thuyết minh quy trình

2.6.1 Chuẩn bị mẫu

Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phân định lượng tổng số vi sinh vật hiểu khí

Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa

khoảng <100 khuẩn lạc

2.6.2 Cây mẫu

Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất

vào 2 đĩa và chọn 2 nông độ pha loãng liên tiếp dé cay sao cho sau khi mỗi đĩa xuất

hiện từ 10— 100 khuẩn lạc

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội

đến 45°C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và

ngược chiều kim đồng hồ Để ôn định ở nhiệt độ phòng trong 1 — 2 giờ để phục hồi khả năng của Cøfiforms Đỗ thêm 10 ~ 15ml môi trường VRB Chờ môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 1°C trong 24 gid

2.6.3 Doc két qua

Chọn các đĩa có số đếm từ 10 — 100 khuẩn lac Coliforms dé tinh Khuan lạc Coliforms có màu đỏ đến đó đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuân lạc có vùng tủa muối mật

6 37°C trong 24 giờ Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ông Durnham

Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả đương tính với só khan lạc khẳng định

12

nj: 86 dia có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng

v: thể tích cây vào mỗi dia f¡: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận

Kết quá Coliforms được làm tron chin chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ

số thập phân

13

Bài số 3: ĐỊNH TÍNH E.COLT

3.1 Định nghĩa

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc ky khí tùy nghỉ, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hoi 6 37°C trong 24 — 48 giờ Coliforms chiu nhiét 18 coliforms cé khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh hơi ở nhiệt 46 44°C trong 24 — 48 gid

Coliforms phân (feacal Coliform) là coljform nhiệt có thử nghiệm indol trong môi trường tryptom đương tính

E.Coli là coliforms phân có nghiệm pháp IMViC lần lượt là + + - -

-_ Mãi trường TSA

25 g mau + 225 ml SPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây

> độ pha loãng 10”

Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10” cho vào 10 mÏ môi trường BGBL

Chọn các ống sinh hơi cấy chuyén sang môi trường EMB

Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính £ Coli

Khuẩn lạc đặc trưng của E Coli trén EMB: tròn lỗi, đường kính

<0,5mm, có ánh kim tím

Cay chuyén sang TSA > U 6 37°C + 0,5 trong 24 giờ

Cây vào méi trudng 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate

U637°C+0,5 trong 24 giờ

3.6 Thuyết minh quy trình

16

(3): Thử nghiệm Voges — Proskauer (4): Thử nghiệm Citratc

STT | Thirnghiém sinhhéa | Kết quả

3.6.5 Báo cáo két qua

Phat hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10 g (25 g) mau

17

Bai sé 4: DINH LUQNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

4.1 Nguyên tắc

Cay trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc Sau khi

ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và không đặc trưng của S

aureus Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các đặc trưng

khác Kết quá được xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thê tích cấy, nồng độ pha

KL đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, có tâm đen và

có quâng sáng bao quanh

U 637°C va theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ Nếu không có biểu hiện ngưng

kết sẽ ủ tiếp tục đến 24 giờ Xác định tỷ lệ ngưng kết R

4.43 Đọc kết quả

Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc Š areus có đường kính

khoảng 0,5 — 1 mm, lỗi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 — 2 mm bao quanh

Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa có các khuẩn lạc có các đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến

48 giờ Sau 48 gid, các khuẩn lạc S azews có đường kính khoảng | — 1,5 mm, vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm Có một sé dong S aureus khéng tạo các khuẩn lạc có các đặc điểm trên Cần đếm và đánh dấu cả 2 dạng khuẩn lạc

Hình 6: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP

4.4.4 Khẳng định

19

Trên môi trường BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng

từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA Ủ ở 37°C trong 24 giờ Cay sinh khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ Ủ ở 37C Theo dõi phản ứng đông tụ huyết tương trong 2, 4, 6, 8, 24 giờ Tính tỷ lệ khăng định trên các khuẩn

lạc đặc trưng và không đặc trưng

Nt: tong số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng

Số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng ĐITT dương tính

Bai sé 5: DINH TINH SALMONELLA

-_ Môi trường TSA

-_ Môi trường TSI

- Môi trường Mamnitol Phenol Red both

- Môi trường Urea broth

21

Cấy chuyền vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI,

Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC both

5.4 Thuyết minh quy trình

5.4.1 Tiền tăng sinh

Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng Thêm

225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu Thời gian đồng nhất mẫu có thẻ là 15

hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu U 37°C trong 24 giờ

5.4.2 Tăng sinh chọn lọc

Trộn môi trường canh sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 42°C trong thời gian 24 giờ 5.4.3 Phan lép

Dùng que cấy vòng lẫy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh

chọn lọc RV cay ria 1én mdi trong chon loc cho Salmonella nhu: XLD, BPLS, BSA,

HE Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biéu hiện của khuẩn lac

Salmonelia trên từng môi trương khác nhau Để nhận dạng và chọn lọc được tất cả các dong Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:

- Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hằng trong suốt, có hay không có tâm đen Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc Môi trường XLD chuyến sang mầu hồng

Hình 7: Khuẩn lac Salmonella trén méi trường XLD -_ Môi trường BPLS: các khuẩn lac Salmonella có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyên thành đỏ

23