PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

Kiểm tra vi sinh vật là một trong những công tác cần thiết phải tiến hành khi đánh giá chất lượng các sản phẩm thủy sản đông lạnh, các chỉ tiêu về vi sinh vật của các sản phẩm thủy sản đông lạnh được đề ra 1 cách nghiêm ngặt, buộc các nhà sản xuất và kiểm tra chất lượng sản phải nghiêm chỉnh thực hiện, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản đông lạnh xuất khẩu Bởi vì

vi sinh vật cá khả năng gây độc và gây bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm Các chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm tra đối với sản phẩm thủy sản đông lạnh bao gồm:

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH (không chỉ kiểm tra vi sinh mà còn kiểm tra hóa học, kiểm tra cảm quan)

4.1 Phương pháp lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu kiểm vi sinh

4.1.1 Lấy, vận chuyển và xử lý mẫu

4.1.1.1 Kế hoạch lấy mẫu

4.1.1.1.1 Lấy mẫu kiểm tra lô hàng

Lượng mẫu kiễm tra lô hàng tùy thuộc vào từng sản phẩm cụ thể, nhưng không được ít hơn yêu cầu kiểm nghiệm

Ứng với từng loại thực phẩm kèm theo một lượng xác định sẽ được giới hạn một số lượng vi sinh vật nhất định cho phéptồn tại trong mặt hàng đó Thông thường thì đối với vi sinh vật gây bệnh, yêu cầu đặt ra là “không có” hoặc “không pháthiện” trong một khối lượng thực phẩm xác định

Để nhận biết các mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu, người ta thường thực hiện lấy mẫu và ghi nhận kết quả theo các cấp

độ đã được thiết lập như sau:

Ÿ Cấp 1: cách lấy mẫu cổ điển, trong đó việc đánh giá kết quả kiểm nghiệm chỉ dựa trên một giá trị duy nhất của mẫu

Ÿ Cấp 2: kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm tính vi sinh vật gây bệnh Kết quả được coi là không đạtkhi một trong số tổng số mẫu đã lấy bị phát hiện có vi sinh vật gây bệnh

Ÿ Cấp 3:

s Kết quả đạt yêu cầu khi:

Mật độ vi sinh nhỏ hơn thông số giới hạn dưới (có thêm điều kiện).

Mật độ vi sinh lớn hơn thông số giới hạn dưới và nhỏ hơn thông số giới hạn trên

s Kết quả không chấp nhận khi mật độ vi sinh cao hơn giới hạn trên

Thông thường giới hạn trên cao hơn ít nhất 10 lần so với giới hạn dưới

4.1.1.1.2 Lấy mẫu kiểm tra vệ sinh công nghiệp

Lượng mẫu phải đủ để phân tích, thông thường trọng lượng mẫu tối thiểu được qui định như sau:

Ÿ Dạng rắn (phần thịt): 200 g

Ÿ Dạng lỏng (nước dùng trong chế biến): 500 ml

4.1.1.2 Phương tiện lấy mẫu và dụng cụ chứa mẫu

4.1.1.2.1 Phương tiện lấy mẫu

Để lấy mẫu hoặc khui mở bao bì, cấn thiết phải sử dụng:

Ÿ Phương tiện phù hợp

Ÿ Dụng cụ được chế từ vật liệu dễ làm sạch, dễ khử trùng, không tác động lên mẫu hoặc bị mẫu tác động

Ÿ Với các loại thực phẩm không bao gói, phải dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu

Trong thời gian lấy mẫu, nếu cần thiết dùng đến nhiệt kế, thì phải sử dụng các nhiệt kế chuẩn với biên độ 30 - 100oC cómức chính xác ± 1oC.

4.1.1.2.2 Dụng cụ chứa mẫu

Dụng cụ chứa mẫu phải bảo vệ được mẫu tránh bị nhiễm và tránh các thay đổi do các yếu tố lý học, hoá học, sinh học,…gây ra

Dùng các bình chứa bằng thủy tinh, túi nhựa, hộp nhựa hoặc kim loại chuyên dụng Trường hợp cần thiết, thì các dụng

cụ này phải gắn thêm nhiệt kế để đo nhiệt độ bên trong khi đến phòng thí nghiệm

Với các mẫu thực phẩm mau hư hỏng thì phải dùng những thùng cách li

Dụng cụ chứa mẫu phải khô, sạch, vô trùng và có kích thước đủ lớn để chứa được lượng mẫu đến 200 g

Khi cần thiết dùng băng keo để dán thùng chứa mẫu thì nên dùng băng dính đủ chắc để không làm thay đổi mẫu bêntrong

4.1.1.3 Lấy mẫu

4.1.1.3.1 Lấy mẫu kiểm tra lô hàng

Việc lấy mẫu phải do những người thạo công tác lấy mẫu thực hiện Nhân viên phân tích tại phòng thí nghiệm cũng phải

có những kiến thức cần thiết về kỹ thuật lấy mẫu để có những khuyến cáo phù hợp trong trường hợp việc lấy mẫu được thựchiện bởi những người không chuyên

Khi lấy mẫu cần phải đảm bảo những mẫu lấy mang tính đại diện cho lô hàng hoặc cho hoạt động cần kiểm tra và lượngmẫu lấy đủ để tiến hành việc phân tích.

Thường mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên và bất kỳ

Mẫu kiểm từ thực phẩm không bao gói hoặc mẫu của một lô hàng lớn cần được cân lấy ít nhất 200 g hoặc không lấy íthơn 2 đơn vị sản phẩm

Với sản phẩm bao gói, phải lấy những mẫu bao bì chưa mở

4.1.1.3.2 Lấy mẫu nước

Trước khi lấy mẫu nước cần phải xác định vị trí lấy mẫu

Thực hiện:

Ÿ Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng vòi nước để khử trùng

Ÿ Mở van cho nước chảy khoảng 2 phút, điều chỉnh van sao cho nước chảy đầy miệng vòi, không bắn tung tóe

Ÿ Dùng bình xịt cồn khử trùng tay

Ÿ Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng bình thủy tinh chứa mẫu (bình phải được khử trùng trước khi lấy mẫu)

Ÿ Mở nắp bình, nhanh chóng hứng nước từ vòi, lượng nước vào khoảng 2/3 thể tích bình chứa, không để nước chảy tràn

ra miệng hoặc bắn ra ngoài, vặn kín nắp bình

Ÿ Dùng cồn khử trùng bình đã chứa mẫu rồi cho bình vào túi PE vô trùng Ghi thẻ để nhận diện mẫu và vòi nước, cho thẻvào túi chung với

bình chứa mẫu Buộc kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm bằng kim bấm

Ÿ Cho mẫu vào thùng cách nhiệt có chứa đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu 4.1.1.3.3 Lấy mẫu bán thành phẩm trên dây

chuyền

Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trước khi tiến hành:

1 Tiếp nhận nguyên liệu Nguyên liệu sau khi tiếp nhận từ đại lý,

chưa qua rửa sơ bộ

2 Các công đoạn rửa Sau khi rửa xong, đang để ráo nước

3 Các công đoạn chế biến Lấy mẫu ngay trong khi đang sản xuất

4 Công đoạn xếp khuôn Trong các khuôn đã xếp sản phẩm

5 Các công đoạn có gia nhiệt Trước và / hoặc sau khi gia nhiệt, sau khi

làm nguội

6 Công đoạn chờ đông Trước, trong và / hoặc sau khi chờ đông

Thực hiện:

Ÿ Dùng cồn khử trùng tay nhân viên lấy mẫu.

Ÿ Dùng kẹp vô trùng, lấy một khối lượng mẫu nhất định cho túi PE, không để mẫu chạm vào miệng túi Dùng kim bấmbấm kín miệng túi

Ÿ Ghi tên mẫu và công đoạn lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu

Ÿ Sau đó, cả mẫu và thẻ được cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kimbấm

Ÿ Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu

4.1.1.3.4 Lấy mẫu vệ sinh không khí

Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trước khi tiến hành:

Vị trí: cần chú ý những khu vực có mức độ ô nhiễm cao

Thời điểm lấy mẫu: trước và / hoặc trong khi đang sản xuất

Thực hiện:

Ÿ Dùng cồn khử trùng tay và bề mặt vị trí cần lấy mẫu

Ÿ Đặt đĩa Petri có chứa môi trường thạch thích hợp (đã khử trùng) vào vị trí cần lấy mẫu Để hở hoàn toàn đáy đĩa và gác

gờ nắp lên gờ đáy đĩa Petri

Ÿ Sau khoảng thời gian quy định (15 - 30 phút), đậy nắp lại, cho đĩa vào túi PE vô trùng Dùng kim bấm bấm kín miệngtúi

Ÿ Ghi nhận thời gian và địa điểm lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu

Ÿ Sau đó, cả mẫu và thẻ được cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kimbấm

Ÿ Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu

Ngoài những loại mẫu được lấy như trên, tùy thuộc vào quy định của mỗi xí nghiệp, còn có thể tiến hành lấy những loạimẫu như: tay / găng tay công nhân; bề mặt dụng cụ, thiết bị tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm;…

4.1.1.4 Ghi nhãn và hồ sơ mẫu

4.1.1.4.1 Ghi nhãn trên mẫu

Mẫu cần được ghi nhãn ngay trước hoặc sau khi lấy mẫu

Nhãn phải ghi cho phù hợp với hồ sơ lấy mẫu

Nhãn ghi phải chịu được ánh sáng, không thấm nước

Nhãn đã ghi không được thay đổi và tẩy xoá trong thời gian bốc xếp, bảo quản và vận chuyển

Nhãn phải có kích thước đủ lớn để ghi nhận mọi thông tin cần thiết

4.1.1.4.2 Ghi nhãn trên vật dụng chuyển mẫu

Trên vật dụng chuyển mẫu, nhãn cần được ghi:

Ÿ Tên, địa chỉ, số điện thoại của người nhận Nếu cần gửi lại, tên người gửi cũng phải được ghi trên nhãn

Ÿ Các chú ý cần thiết khác như: dể vỡ, thực phẩm cần trữ lạnh, mẫu kiểm nghiệm, mặt tên,…

4.1.1.4.3 Hồ sơ mẫu

Mỗi mẫu phải được đính kèm theo một hồ sơ mẫu, xác định rõ mẫu phù

hợp với nhãn ghi trên mẫu hoặc thùng chứa mẫu

Hồ sơ mẫu được coi là hợp lệ khi có chữ ký của người lấy mẫu và người chủ lô hàng thực phẩm có mẫu được lấy

Hồ sơ mẫu cần có những thông tin sau:

Ÿ Người yêu cầu phòng thí nghiệm thực hiện lấy mẫu để phân tích: tên, địa chỉ, số điện thoại,

Ÿ Tên, địa chỉ, số điện thoại của người lấy mẫu

Ÿ Địa điểm và thời gian lấy mẫu

Ÿ Thông tin về thực phẩm được lấy mẫu: tính chất thực phẩm, ngày sản xuất, thời hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, dạngbao bì,…

Ÿ Nguyên nhân lấy mẫu: kiểm tra, bị khiếu nại,…

Ÿ Phương pháp lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên trong lô hàng, lấy ngẫu nhiên từ số mẫu có sẵn,…

Ÿ Các chỉ tiêu cần phân tích: E.coli, Salmonella, Shigella,…

Ngoài ra còn có thêm nhiều thông tin khác

4.1.1.5 Vận chuyển và bảo quản mẫu

Mẫu sau khi lấy, cần chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt Khi vận chuyển, bảo quản cần đảm bảo sao chokhông có biến đổi đáng kể nào xảy ra trước khi phân tích Mẫu cần được bảo quản tốt để chống lại sự nhiễm khuẩn vànhững thay đổi trong thành phần vi sinh vật Đồng thời việc vận chuyển mẫu cần thu xếp sao cho mẫu về đến phòng thínghiệm trong vòng 18 giờ và như vậy việc phân tích có thể bắt đầu trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu

Đối với những mẫu thực phẩm mau hư hỏng thì cần được vận chuyển nhanh, bảo quản trong những thùng cách li đóngkín có kèm theo phương tiện làm lạnh hoặc thùng nhựa chứa đá (hoặc băng khô CO2 rắn) để duy trì

nhiệt độ của mẫu (nhiệt độ mẫu càng thấp càng tốt) Tránh để mẫu tiếp xúc

trực tiếp với đá hay băng để không bị đông đá

Đối với các mẫu hàng đông lạnh, cần được đưa vào các bình chứa đã làm lạnh từ trước và giữ trong trong ngăn đá ngaysau khi lấy mẫu Chúng được chuyển đi trong các thùng cách li Nếu thời gian vận chuyển quá lâu làm xảy ra hiện tượng rãđông, cần dùng băng khô làm chất hạ nhiệt

Khi vận chuyển mẫu dạng khô hoặc đồ hộp thì không cần thiết làm lạnh, có thể vận chuyển trong các túi nylon, songtrong thời gian vận chuyển và bảo quản mẫu không được để nhiệt độ vượt quá 45oC và không giữ mẫu trong môi trường có

độ ẩm quá cao

4.1.2 Tiếp nhận mẫu tại phòng thí nghiệm

Người gửi mẫu tới phòng thí nghiệm phải thông báo trước cho phòng thí nghiệm thời điểm mẫu đến Đống thời phòngthí nghiệm cũng cần được thông báo về loại mẫu sẽ kiểm và các phép phân tích cần thực hiện

Khi đến phòng thí nghiệm, mẫu phải được kiểm tra:

Ÿ Nhãn ghi trên mẫu có phù hợp với số của hồ sơ mẫu trong sổ theo dõi không

Ÿ Nhiệt độ và thời gian khi mẫu đến, riêng với nhiệt độ thì:

s Đo nhiệt độ ngay trên mẫu chính: nhúngnhiệt kế vào dung dịch hypochlorine chứa không dưới 100 mg / l chlorinehoạt tính (mục đích để khử trùng) hoặc dung dịch khử trùng chứa halogen có tính sát khuẩn tương đương Sau đó tráng lạinhiệt kế bằng nước vô trùng, lau khô bằng khăn vô trùng trước khi sử dụng

s Đo nhiệt độ trên một mẫu phụ (mẫu phụ được xử lý như mẫu chính)

Ÿ Bình chứa mẫu có rò rỉ không, có được đóng kỹ không, có bị nứt, thủng gây nhiễm vào mẫu không

Ÿ Với mẫu đóng gói dạng chân không, cần kiểm tra kỹ tình trạng chân không trong mẫu: có khí tạo ra trong các bao bìkín không, bao bì có hở,

thủng hoặc nứt không, điều kiện lý tính bên trong có bình thường không,…

Ÿ Nếu bao bì bị hư hỏng cần ghi nhận vào báo cáo phân tích Trong trường hợp nhận thấy bằng cảm quan mẫu đã bị hỏnghoặc bị nhiễm trong thời gian vận chuyển có thể xem xét và từ chối nhận mẫu, trừ khi muốn thẩm tra lại kết quả phân tích

về mặt vi sinh

Ÿ Kiểm tra những mẫu nghi ngờ gây dịch bệnh

Khi chấp nhận mẫu, thì mẫu được bảo quản tránh khỏi các tác nhân hoá, lý, cơ học có thể làm biến đổi mẫu Phòng thínghiệm cần có đầy đủ phương tiện trữ lạnh đủ lớn để chứa mẫu và mẫu lưu

4.1.3 Xử lí mẫu sơ bộ tại phòng thí nghiệm

Do mẫu được lấy về một lượng khá lớn so với lượng đem đi phân tích, đồng thời còn kèm theo nhãn, bao bì,…hoặctrường hợp cần phải rã đông mẫu,…nên mẫu cần được xử lí sơ bộ trước khi tiến hành phân tích

4.1.3.1 Xác định hệ vi sinh vật bên trong các loại thực phẩm rắn

Khử trùng bề mặt sản phẩm bằng bản kim loại đốt nóng hoặc ngọn lửa

Dùng dụng cụ vô trùng gỡ bỏ các nhãn hiệu trên bề mặt

Lấy một lượng mẫu bên trong, ít nhất khoảng 10 g

Chuyển mẫu vào bao, rót dịch pha mẫu và cân, tỷ lệ mẫu : dịch pha mẫu là 1 : 9

Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập

Pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp để tiến hành phân tích ngay.

4.1.3.2 Xác định hệ vi sinh vật bề mặt các loại thực phẩm rắn

Đánh dấu một khu vực bề mặt mẫu bằng khuôn và dao mổ, lấy một lớp mỏng bề mặt dày 1 - 2 mm với diện tích tối thiểu

là 10 cm2

Cho vào bao, pha loãng theo tỉ lệ 1 : 9, 10 g + 90 ml dung dịch pha loãng

Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập

1 ml dịch pha loãng tương đương với số vi sinh vật trên 1 / 100 bề mặt đã chọn (1 ml ứng với 0,1 cm2 khi bề mặt lấymẫu là 10 cm2) và có thể

dùng để cấy vào trong hoặc lên trên các cơ chất tương ứng

4.1.3.3 Xác định hệ vi sinh vật trong các loại thực phẩm lỏng

Trộn mẫu bằng cách đảo ngược chai 10 lần (hoặc theo hướng dẫn cụ thể tuỳ từng phương pháp) Dùng pipetman cấychuyển vào môi trường thích hợp Có thể pha loãng mẫu nếu cần

Sau khi lấy mẫu và xử lý sơ bộ, mẫu cần được phân tích càng sớm càng tốt, thời gian phân tích tối đa trong vòng 24 giờ

kể từ khi lấy mẫu

4.2 Quá trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

Sau đây là một số vi sinh vật thường được kiểm tra trong hàng thủy sản:

4.2.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí

4.2.1.2 Môi trường và hóa chất

Môi trường Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2 Ngoài ra có thể

sử dụng các môi trường khác: Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar

Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water)

4.2.1.3 Qui trình phân tích

4.2.1.3.1 Chẩn bị mẫu trước khi phân tích

Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất mẫu như sau:

Ÿ Đối với mẫu rắn:

s Cân chính xác 10 g mẫu vào trong bao PE, thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch SPW pha loãng

s Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu Thời gian dập mẫu không quá 2,5 phút

s Thực hiện đồng nhất mẫu trong trường hợp không có máy dập mẫu:

Xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng

Cân chính xác 10g mẫu, cho vào bình tam giác Bổ sung vào trong bình 90 ml nước SPW đã được hấp khử trùng Lắcđều trong 2 phút

Ÿ Đối với mẫu dạng lỏng: hút 10ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều Sau khi được làm đồng nhất bằng một trong các phương pháp trên, dung

dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu

Nếu cần, thì tiến hành pha loãng dịch mẫu đến độ pha loãng cần thiết

4.3.1.3.2 Cấy mẫu

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi sinh vật trong 1 ml để cấy lên đĩa Petri Dùng pipet

vô trùng hoặc pipetman với đầu tip vô trùng chuyển 1 ml dung dịch pha loãng đã chọn vào giữa đĩa

Ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2 - 3 đĩa

Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45oC Trộn đều dịch mẫu vớimôi trường bằng cách xoay

tròn đĩa Petri ngay sau khi đổ môi trường Đặt các đĩa trên mặt phẳng

ngang cho thạch đông đặc

Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong 72 giờ

4.3.1.3.3 Cách tính kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ 25 - 250 khuẩn lạc để tính kết quả Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫuđược tính như sau:

A (CFU / g hay CFU / ml) = N / ( n1Vf1 + …+ niVfi)

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân

4.2.2 Nhóm Coliforms và giống Escherichia coli

4.2.2.1 Định nghĩa Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E coli

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí

hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid khi được ủ ở 37oC

trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt

Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với 1 loài duy nhất là E coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.

Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này đựơc thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), VogesProskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi chung là IMViC

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC

trong môi trường canh E

coli medium (EC).

Coliforms phân (E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ 24 giờ ở 44,5oC trong canhTrypton

E coli là Coliforms phân, cho kết quả thử nghiệm IMViC là (+ + - -)

4.2.2.2 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E coli bằng phương pháp MPN

4.2.2.2.1 Nguyên tắc

Phương pháp MPN được dùng trong những thực phẩm có chứa lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân

và E coli với mật độ thấp.

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc:

Ÿ Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân

Ÿ 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa

môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham

Ÿ Lặp lại 3 đến 5 ống với mỗi nồng độ pha loãng

Ÿ Theo dõi và ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính (sinh hơi và đổi màu) ở mỗi nồng độ pha loãng

Ÿ Dựa vào bảng MPN, suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1 g ( hoặc 1 ml) mẫu ban đầu

4.2.2.2.2 Môi trường và hóa chất

Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB ( canh Lauryl Sulphate)

Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)

Môi trường lỏng E coli ( E.coli medium, canh EC).

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược Sau khi khử trùng, chỉ sửdụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham

Canh Tryptone và canh MR-VP

Môi trường rắn Simmon Citrate Agar ( thạch Simmon Citrate)

Dung dịch nước muối pepton SPW ( Saline Pepton Water).

Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, a - napthol

4.2.2.2.3 Qui trình phân tích

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoá hoặc pha loãng mẫu ở độ loãng cần thiết

a Định lượng Coliforms

Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB

Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3

Ủ ở 37oC Ghi nhận số ống có kết quả (+) (có sinh hơi)

Dùng que cấy vòng cấy chuyển ?dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL

Ủ ở 37 ± 1oC trong 48 giờ

Ghi nhận số ống có kết quả (+) ứng với mỗi độ pha loãng

b Định lượng Coliforms chịu nhiệt

Dùng que cấy vòng cấy chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh

LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 ± 3 giờ

Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) ở mỗi độ pha loãng

c Định lượng Coliforms phân

Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ các đĩa này ở 37oCtrong 24 giờ

Chọn khuẩn lạc Coliforms phân hay E.coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím) có đường kính

lớn hơn 1 mm, cấy chuyền vào canh Trypton, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 giờ

Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm đã ủ Phản ứng dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trườngtrong vòng vài phút

Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton

ứng với mỗi độ pha loãng

d Định lượng E coli

Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch EMB Ủ các đĩa này ở 37oC trong

24 giờ

Chọn khuẩn lạc E coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa,có ánh kim tím) có đường kính lớn hơn 1 mm và cấy

vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC