Khảo sát quá trình lên men malolactic rượu vang chanh dây

Rượu vang chanh dây sau quá trình lên men rượu vẫn còn một lượng lớn acid malic làm cho rượu có vị chua gắt. Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic nhằm cải thiện chất lượng cảm quan của rượu. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men malolactic ở rượu vang chanh dây bằng tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni tự do và cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC), kết quả thu được như sau: Xác định được tỉ lệ giống vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp bổ sung cho quá trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu), thời gian lên men malolactic thích hợp đối với rượu chanh dây là 4 ngày. Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni trên chất mang BC bằng hai phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động. Sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định bằng phương pháp bẫy – hấp phụ sau 5 ngày ủ với mật độ là 71 x 109 CFUcm3 để tiến hành lên men. Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế phẩm vi khuẩn Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC để lên men malolactic đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 8 lần tái sử dụng. Đồng thời chúng tôi cũng khảo sát hiệu quả của quá trình lên men khi sử dụng đồng thời 2 chế phẩm cố định trên chất mang BC: nấm men Saccharomyces cerevisiae ứng dụng trong lên men rượu và vi khuẩn Oenococcus oeni ứng dụng trong lên men malolactic thì nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men vẫn ổn định. Điều này được thể hiện thông qua độ cồn và nồng độ acid malic chuyển hóa được. Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu, malolactic và tàng trữ. Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị. Rượu sau quá trình lên men malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của rượu chanh dây. MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC ĐỒ THỊ CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chanh dây 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.1.3 Thành phần hóa học 2.1.4 Ứng dụng 2.2 Lên men rượu vang 2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang 2.2.2 Tác nhân vi sinh vật 2.2.3 Cơ sở hóa sinh 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 2.3 Lên men malolactic 2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic 2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang 2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic 2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic 2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 2.4 Kỹ thuật cố định 2.4.1 Lịch sử phát triển 2.4.2 Định nghĩa 2.4.3 Chất mang 2.4.4 Phương pháp cố định 2.4.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 2.4.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 2.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu 3.1.1 Chanh dây 3.1.2 Giống vi sinh vật 3.1.3 Môi trường nuôi cấy 3.1.4 Vật liệu, hóa chất 3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật 4.1.1 Saccharomyces cerevisiae 4.1.2 Oenococcus oeni 4.1.3 Acetobacter xylinum 4.2 Lên men tạo BC 4.2.1 Lên men thu nhận BC 4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic 4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong lên men malolactic 4.3.3 Khảo sát thời gian lên men malolactic 4.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC 4.4.1 Phương pháp bẫy hấp phụ 4.4.2 Phương pháp nhốt chủ động 4.5 Lên men malolactic sử dụng chế phẩm Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC 4.5.1 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 4.5.2 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 4.6 Kết quả cảm quan 4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

MALOLACTIC RƯỢU VANG CHANH DÂY

CBHD: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : HOÀNG THỊ KIM THOA MSSV:60604391 ĐẶNG MAI HUYỀN ANH MSSV:60604008

TP HỒ CHÍ MINH, 01/2011

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này

Chúng em xin cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu

Xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẻ, động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật đáng nhớ

Chúng con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi

Cám ơn các thành viên của nhóm A&T – những người bạn thân thiết nhất đã cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay

Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2010

Hoàng Thị Kim Thoa Đặng Mai Huyền Anh

TÓM TẮT

Rượu vang chanh dây sau quá trình lên men rượu vẫn còn một lượng lớn acid malic làm cho rượu có vị chua gắt Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic nhằm cải thiện chất lượng cảm quan của rượu Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình lên men malolactic ở rượu vang chanh dây bằng tế bào

vi khuẩn Oenococcus oeni tự do và cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC),

kết quả thu được như sau:

- Xác định được tỉ lệ giống vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp bổ sung cho quá

trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men rượu), thời gian lên men malolactic thích hợp đối với rượu chanh dây là 4 ngày

- Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni trên chất mang BC bằng hai

phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động Sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định bằng phương pháp bẫy – hấp phụ sau 5 ngày ủ với mật độ là 7.1 x 109 CFU/cm3 để tiến hành lên men Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế

phẩm vi khuẩn Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC để lên men

malolactic đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 8 lần tái sử dụng

Đồng thời chúng tôi cũng khảo sát hiệu quả của quá trình lên men khi sử dụng

đồng thời 2 chế phẩm cố định trên chất mang BC: nấm men Saccharomyces

cerevisiae ứng dụng trong lên men rượu và vi khuẩn Oenococcus oeni ứng dụng

trong lên men malolactic thì nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men vẫn ổn định Điều này được thể hiện thông qua độ cồn và nồng độ acid malic chuyển hóa được

- Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu, malolactic và tàng trữ Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị Rượu sau quá trình lên men malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của rượu chanh dây

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ix

DANH MỤC ĐỒ THỊ ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về chanh dây 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Thành phần hóa học 4

2.1.4 Ứng dụng 5

2.2 Lên men rượu vang 6

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang 6

2.2.2 Tác nhân vi sinh vật 7

2.2.3 Cơ sở hóa sinh 8

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 9

2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 10

2.3 Lên men malolactic 11

2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic 11

2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang 14

2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic 14

2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic 18

2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 18

2.4 Kỹ thuật cố định 42

2.4.1 Lịch sử phát triển 42

2.4.2 Định nghĩa 43

2.4.3 Chất mang 43

2.4.4 Phương pháp cố định 58

2.4.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 66

2.4.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 67

2.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 68

2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 69

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 72

3.1 Vật liệu 72

3.1.1 Chanh dây 72

3.1.2 Giống vi sinh vật 72

3.1.3 Môi trường nuôi cấy 72

3.1.4 Vật liệu, hóa chất 74

3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 74

3.2 Phương pháp thí nghiệm 74

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 74

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 76

3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 82

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 86

4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật: 86

4.1.1 Saccharomyces cerevisiae 86

4.1.2 Oenococcus oeni 88

4.1.3 Acetobacter xylinum 90

4.2 Lên men tạo BC 91

4.2.1 Lên men thu nhận BC 91

4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 91

4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do 91

4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic 91

4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong lên men malolactic 95

4.3.3 Khảo sát thời gian lên men malolactic 101

4.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC 104

4.4.1 Phương pháp bẫy- hấp phụ: 104

4.4.2 Phương pháp nhốt chủ động 108

4.5 Lên men malolactic sử dụng chế phẩm Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC… 111

4.5.1 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 111

4.5.2 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định và lên men malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 113

4.6 Kết quả cảm quan 115

4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh 116

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117

5.1 Kết luận 117

5.2 Kiến nghị 118

TÀI LIỆU THAM KHẢO 119

PHỤ LỤC 124

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới 6

Bảng 2 2 Phân loại vi khuẩn Lactobacillus 16

Bảng 2 3 Tốc độ phát triển của vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 28

Bảng 2 4: Thành phần của vang trước và sau khi lên men malolactic 31

Bảng 2 5: Sự thay đổi hàm lượng các acid amin có trong dịch lên men vang Shiraz trước và sau khi lên men malolactic với pH ban đầu là 3.7 34

Bảng 2 6: Hàm lượng acid dễ bay hơi (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 35

Bảng 2 7: Hàm lượng rượu bậc cao (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 37

Bảng 2 8: Hàm lượng các ester (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 39

Bảng 2 9: Hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh và nitơ (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men malolactic 40

Bảng 2 10 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang 46

Bảng 2 11Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật 47

Bảng 2 12 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông dụng 65

Bảng 2 13 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên gel alginate và nấm men cố định trên BC 66

Bảng 3 1 Thành phần môi trường Hansen 72

Bảng 3 2 Thành phần môi trường MLA 73

Bảng 3 3 Thành phần môi trường MT5 73

Bảng 3 4 Thành phần môi trường MT6 74

Bảng 3 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic 77

Bảng 4 1 Kết quả lập đường chuẩn Saccharomyces cerevisiae 87

Bảng 4 2 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 92

Bảng 4 3 Sự biến đổi pH khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và

sau quá trình lên men malolactic 95

Bảng 4 4 Sự thay đổi nồng độ chất khô khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic 96

Bảng 4 5 Sự thay đổi nồng độ acid tổng khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic 97

Bảng 4 6 Sự thay đổi độ rượu khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic 98

Bảng 4 7 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic 100

Bảng 4 8 Sự thay đổi các yếu tố theo thời gian lên men malolactic 101

Bảng 4 9 Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các chất mang BC1, BC2 và BC3 105

Bảng 4 10 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên chất mang BC 107

Bảng 4 11 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt 109

Bảng 4 12 So sánh 2 phương pháp cố định 110

Bảng 4 13 Các thông số của dịch chanh dây thí nghiệm 111

Bảng 4 14 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic

112

Bảng 4 15 Các thông số của chế phẩm cố định Saccharomyces cerevisiae trên BC: 114 Bảng 4 16 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic

……….114

Bảng 4 17: Kết quả kiểm tra vi sinh 116

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Trái chanh dây 4

Hình 2 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae 7

Hình 2 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconosto 14

Hình 2 4 Hình thái vi khuẩn Oenococcus oeni 18

Hình 2 5 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 29

Hình 2 6: Quá trình tạo diaceryl 35

Hình 2 7: Phản ứng giữa SO2 và các hợp chất carbonyl 38

Hình 2 8 Acetobacter xylinum 47

Hình 2 9 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường tĩnh (b) 50

Hình 2 10 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của thực vật (x200) 51

Hình 2 11 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A xylinum 54

Hình 2 12 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài 54

Hình 2 13 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum 55

Hình 2 14 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum 57

Hình 2 15 Các phương pháp cố định vi sinh vật 59

Hình 2 16 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang 59

Hình 2 17 Cố định tế bào trong lòng chất mang 61

Hình 2 18 Liên kết giữa các tế bào 62

Hình 2 19 Cố định tế bào bằng màng membrane 62

Hình 4 1 Hình ảnh đại thể Saccharomyces cerevisiae trên môi trường đặc 86

Hình 4 2 Hình ảnh vi thể Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi 86

Hình 4 3: Hình ảnh vi thể Oenococcus oeni dưới kính hiển vi 88

Hình 4 4 Hình thái khuẩn lạc Acetobacter xylinum trên thạch đĩa và lớp váng vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng 90

Hình 4 5 Hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi 90

Hình 4 6 BC tươi sau khi lên men 91

Hình 4 7 BC sau 30 phút đầu của quá trình hấp phụ 105

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2 1 Cơ chế lên men ethanol 8

Sơ đồ 2 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn malolactic (Wood và Holzapfel 1995) 13

Sơ đồ 2 3: Phân loại vi khuẩn malolactic (Boulton et al 1996) 15

Sơ đồ 2 4: Sơ đồ chuyển hóa p-coumaric acid thành 4-ethylphenol 41

Sơ đồ 2 5 Phân loại chất mang 45

Sơ đồ 3 1 Sơ đồ thu nhận BC 78

Sơ đồ 3 2 Xử lí BC thô 78

DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4 1 Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae 87

Đồ thị 4 2 Đường chuẩn của nấm men Saccharomyces cerevisiae 88

Đồ thị 4 3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Oenococcus oeni 89

Đồ thị 4 4 Đường chuẩn của vi khuẩn Oenococcus oeni 89

Đồ thị 4 5 Sự thay đổi pH sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 92

Đồ thị 4 6 Sự thay đổi nồng độ chất khô sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 93

Đồ thị 4 7 Sự thay đổi nồng độ acid tổng sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 93

Đồ thị 4 8 Sự thay đổi độ rượu sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 94

Đồ thị 4 9 Sự thay đổi nồng độ acid malic và acid lactic sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau 94

Đồ thị 4 10 Sự thay đổi pH trước và sau quá trình lên men malolactic 96

Đồ thị 4 11 Sự thay đổi nồng độ chất khô trước và sau quá trình lên men malolactic 97 Đồ thị 4 12 Sự thay đổi nồng độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic 98 Đồ thị 4 13 Sự thay đổi độ rượu trước và sau quá trình lên men malolactic 99

Đồ thị 4 14 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trước và sau quá trình lên men malolactic 100

Đồ thị 4 15 Sự thay đổi pH theo thời gian lên men malolactic 102

Đồ thị 4 16 Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian lên men malolactic 102

Đồ thị 4 17 Sự thay đổi nồng độ acid tổng theo thời gian lên men malolactic 103

Đồ thị 4 18 Sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men malolactic 103

Đồ thị 4 19 Sự thay đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men malolactic 104 Đồ thị 4 20 Mật độ vi khuẩn sau cố định với các kích thước khác nhau và qua các chế độ khuấy đảo khác nhau 106

Đồ thị 4 21 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn 108

Đồ thị 4 22 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 113

Đồ thị 4 23 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 115

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép nho hoặc một số loại trái cây khác Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm Việc sản xuất rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000) Việc lên men rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men

vào nước trái cây Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces

cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường glucose và fructose

trong nước ép nho (Klingshirn, 2002) [37]

Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính

là vi khuẩn acid lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai hay còn gọi là lên men malolactic Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng acid malic có trong quả Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kết quả là làm giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang (Steinkraus, 1992) [37]

Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát mẻ Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu và Yurdugül, 2000) Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic được

gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc,Pediococcus và Lactobacillus

(Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari, Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic thành acid lactic và CO2nhờ malate carboxylase hay còn gọi là malolactic enzyme (MLE) (Bozoğlu and

Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988;Salema et al., 1996) Quá trình

này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượu hoặc được điều khiển bởi các tác nhân vi sinh vật [37]

Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều chỉ trải qua 2 giai đoạn, đó là giai đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chất lượng rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic Chính điều này cũng đã góp phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối với những loại quả có hàm lượng acid malic cao

Để cải tiến kỹ thuật sản xuất rượu thì một trong những kỹ thuật đang được quan tâm nhiều đó là kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang Ưu điểm lớn nhất của tế bào cố định là có thể chủ động điều khiển được quá trình lên men, đồng thời tế bào sau khi cố định cũng có thể tái sử dụng nhiều lần và không lẫn vào sản phẩm

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về chanh dây

2.1.1 Nguồn gốc

Có khoảng 400 loại chanh dây được trồng ở các nước nhiệt đới, nhưng chỉ có

30 loại ăn được Chanh dây là loại trái cây có hình quả trứng, mọc chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

Loài cây này có nguồn gốc ở Brazil, được nhập vào Việt Nam khoảng đầu thế

kỷ 20, được trồng ở Lâm Đồng, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk… để lấy quả làm nước giải khát, làm cảnh và che bóng mát Đến nay, một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như: Hậu Giang, Cần Thơ, An Giang, Kiên Giang…cũng bắt đầu phát triển trồng chanh dây để lấy quả cung ứng cho nhu cầu thị trường

2.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây chanh dây còn gọi là dây mát, mát mát, dây lạc tiên trứng, dây chùm bao trứng, tên khoa học Passiflora edulis Sims, thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) Chanh dây là một loại dây leo, thân nhỏ, hình trụ có rãnh dọc, nhiều lông thưa Cây mọc leo

có khi dài tới hàng chục mét

Hoa mọc ở kẽ lá, màu trắng hồng, đài 5 cánh màu xanh lục, cánh hoa dài 2 – 2.5 cm; tràng 5 cánh rời nhau, xếp xen kẽ với các lá đài; tràng phụ do 4 – 5 hàng sợi trắng, gốc tím; cuống nhụy dài 1.5cm Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, da trơn hoặc nhăn nhăn nhẹ, rộng 4 – 6 cm, vỏ màu tím đỏ hoặc màu vàng Bên ngoài trái cây chứa nhiều nước vị chua chua ngọt ngọt, thơm nhẹ nhàng, với vô số hạt nhỏ

Hình 2 1 Trái chanh dây [47]

Người ta thường chỉ trồng chanh dây cho trái màu nâu tím, hoặc loại trái màu vàng, chịu được nóng Có thể trồng cây bằng cách gieo hạt, giâm cành hoặc chiết ghép Cây chanh dây rất dễ trồng, ưa đất khô ráo, cần ít nước, thậm chí sống được cả nơi sỏi đá hoặc đất cát Cây đạt độ trưởng thành ở 12 tháng tuổi, có thể vươn dài tới 15

m, cho thu hoạch tốt trong vòng 5 – 6 năm, mỗi năm từ tháng 10 đến tháng 4, nhưng thường sau 4 năm người ta lại thay cây mới

2.1.3 Thành phần hóa học

Chanh dây có hàm lượng đường vừa phải (8.5g glucide/100g), thấp hơn một số loại trái cây thông thường khác (trung bình là 9 – 12g/100g), nhưng phần lớn lượng đường này là fructose có độ ngọt cao (so với đường saccharose), vì vậy chanh dây vẫn

có vị ngọt, mặc dù nó còn chứa các loại axit hữu cơ, chủ yếu là axit citrique (3.9g/100g, ít chua hơn trái chanh) Ngoài ra, trong chanh dây còn có một tỉ lệ chất nhất định proteine, lipide, các chất khoáng và chất vi lượng như sắt, phốtpho, kẽm, magnesium,… nhiều loại vitamin, đặc biệt là vitamin C và nhất là chất xơ (fibre); về

năng lượng cung cấp, chanh dây tương đương với xoài, sơri; về magnesium, tương đương với chuối…

Các acid amin gồm có: prolin, valin, tyrosin, treonin, glycin, leucin, arginin Hạt có chứa nhiều dầu béo ăn được

Thành phần dinh dưỡng trong 100g “thịt” quả:

Ca

(mg)

P (mg)

Fe (mg)

Protein (g)

Glucid (g)

Lipid (g) Hàm

lượng

4-17 35-64 0.4-2.1 700-2410 30-70 0.6-0.8 1.2-2.4 8.5-10 0.2-0.3

[35]

Tỷ lệ đường trong chanh dây:

2.2 Lên men rượu vang

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang

Rượu vang là loại đồ uống có cồn, tạo ra từ quá trình lên men dịch nho tươi Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Đây là một thức uống có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe con người khi dùng một cách điều độ

Ngoài thành phần chủ yếu là nước (chiếm từ 65% đến 85%), rượu nho còn chứa nhiều hợp chất khác: các hợp chất vô cơ, hợp chất hữu cơ gồm rượu (chủ yếu là rượu etylic, rượu glycerol), acid hữu cơ, polyphenol (gồm anthocyane (chất màu thực vật: xanh da trời, tím hoa cà), và chất chát), enzyme, vitamin Hàm lượng đường của rượu biến đổi từ 4.5% đến 16%

Việc làm rượu vang bắt đầu ngay từ khi con người sống gần các cây nho hoang

dã, vào khoảng 4000 năm trước công nguyên, bắt đầu ở Caucase rồi sau đó là Mésopotamie Ngày nay rượu vang được ưa chuộng trên khắp thế giới, đặc biệt là ở các nước Châu Âu

Bảng 2 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới

dự trữ như glycogen, voluten, Trong tế bào còn có ribosome nơi tổng hợp protein và

ty thể nơi xảy ra quá trình oxy hóa khử cung cấp nguồn năng lượng cho tế bào

Hình 2 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae [55][57]

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men:

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy Men ép chứa trung bình 75% nước, 25% chất khô Các chất khô của nấm men bao gồm những thành phần sau: protid 30 – 50%, glucid 24 – 40%, lipid 2 – 5%, khoáng 5 – 11% [36]

Yêu cầu của chủng nấm men trong quá trình lên men này là: phát triển nhanh trong dịch đường lên men, có thể lên men ở môi trường có nồng độ acid cao và độ cồn cao

2.2.3 Cơ sở hóa sinh

Lên men rượu là một quá trình sinh học, dựa trên cơ sở hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của các enzyme của nấm men, trong đó từ cơ chất ban đầu là các dạng đường lên men được sẽ chuyển hóa thành ethanol và khí CO2 thông qua hoạt động trao đổi chất của một số vi sinh vật đặc biệt (nấm men, trực khuẩn) ở điều kiện kị khí Cơ chế của quá trình này có thể được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2 1 Cơ chế lên men ethanol [58]

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp lên men ở nhiệt độ tối ưu là 28 –

320C Nếu lên men ở nhiệt độ thấp 20 – 220C, thời gian lên men sẽ kéo dài Tuy nhiên, nhiệt độ này sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn Ở nhiệt độ 33 – 350C, hoạt tính của nấm men sẽ giảm và điều kiện thuận lợi để vi khuẩn, nấm men hoang dại phát triển mạnh Ở nhiệt độ 300C, nấm men hoang dại phát triển mạnh hơn nấm men

S.cerevisiae 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 380C chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần Mặt khác, khi lên men rượu ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ tạo ra nhiều este, aldehyt,

CO2…Ở 400C, phần lớn nấm men sẽ ngừng sinh trưởng [40]

Ảnh hưởng của pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động trong một trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành ethanol là 4.5 – 5.0 Nếu tăng pH thì rất dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo ra nhiều hơn, do đó sẽ làm giảm hiệu suất lên men Khi pH < 4.2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH ở 4.5 – 5.0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển [40]

Khi nấm men đã phát triển nhanh và đủ mạnh, ta tăng pH đến giá trị tối ưu cho nấm men phát triển về điều kiện tối ưu Lúc này, điều kiện cũng tốt hơn cho các tạp khuẩn phát triển nhưng vì nấm men có lợi thế về số lượng nên lấn át được hơn so với các vi sinh vật tạp khuẩn khác nên không gây hại gì cho quá trình lên men

Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu trong dịch lên men

Thông thường khi hàm lượng chất khô ban đầu quá cao, hiệu suất lên men không cao Khi nồng độ đường trong dịch lên men đạt 30 – 35% thì quá trình lên men dường như bị ngừng lại, còn ở nồng độ 25 – 30% thì nấm men phát triển rất chậm Nồng độ tối thích cho nấm men phát triển là 10 – 18% đường Dung dịch có nồng độ đường cao sẽ gây ra một áp suất thẩm thấu lớn, làm mất cân bằng trạng thái sinh lí bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài nấm men sẽ không sử dụng

hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành nhiều sẽ ức chế hoạt động của nấm men Nhưng nếu lượng đường thấp thì nấm men sẽ phát triển rất chậm vì chúng hoạt động

trong môi trường bị thiếu dinh dưỡng

Ảnh hưởng của nồng độ rượu ethanol

Rượu được tích tụ dần trong quá trình lên men và chính nó lại là chất độc, kìm hãm sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men Ở nồng độ 2 – 5% rượu đã

có khả năng ức chế nấm men, ở 5 – 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản, mặc dù quá trình lên

men vẫn tiếp tục diễn ra Mặt khác, khi lên men rượu sản phẩm tạo thành còn có CO2 Khí CO2 có thể ức chế lên men, nhưng cũng kích thích quá trình lên men vì chúng làm môi trường lên men được khuấy động liên tục, nấm men luôn ở trạng thái lơ lửng, giúp rút ngắn quá trình lên men [40]

2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

Ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2, quá trình lên men còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác Bằng cách phân tích sắc kí khí, các nhà phân tích đã phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyd, rượu cao phân tử

Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic, acid succinic và hai loại acid thường có mặt chính trong rượu vang là acid tartaric, acid malic Hàm lượng của hai acid này có thể lên đến 90% hàm lượng của acid có trong rượu vang và chúng tạo nên vị chua đặc trưng cho dịch rượu vang Hàm lượng acid malic trong dịch khoảng 3 – 4.5 g/l Hầu hết nấm men đều có thể sử dụng acid malic làm cơ chất và mức độ chuyển hóa acid malic còn

tùy thuộc vào từng loài Ví dụ, Saccharomyces cerevisiae chỉ phân giải được 3 – 4.5% lượng acid malic có trong dịch nuôi cấy, trong khi Schizosaccharomyces pombe và Schizosaccharomyces malidevorans có thể chuyển hóa hoàn toàn acid này thành

ethanol và CO2

Rượu cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu cao phân tử Chúng tuy ít nhưng gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm rượu Đó là: propylic, izo butylic, izo amylic, amylic,… Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0.4 – 0.5% so với ethanol nhưng gây cho sản phẩm có mùi khét nên gọi là dầu khét Nguyên nhân là do nấm men sử dụng nitơ của acid amin Phương trình tổng quát quá trình này là:

RCH(NH2)COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2

Sự tạo thành ester

Song song với việc tạo ra acid và rượu, dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau tạo ra những ester tương ứng Có thể viết phương trình phản ứng tổng quát sau:

R1CH2OH + R2COOH R2COO-CH2R1 + H2O

2.3 Lên men malolactic

2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic

Lên men malolactic là một quá trình chuyển hóa L-malic acid (chứa 2 nhóm carboxyl trong phân tử) thành L- hoặc D- lactic acid (chỉ chứa 1 nhóm carboxyl) và

carbon dioxide được thực hiện bởi các giống vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus,

Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus Thực chất đây là một quá trình dị hóa acid

malic, trong đó L-malic được decarboxyl hóa thành L-lactic acid bởi xúc tác là enzyme malate carboxylase Quá trình này xảy ra bên trong tế bào theo phản ứng sau:

Margalit cho rằng đây thực chất chỉ là một phản ứng sinh hóa vì quá trình này đơn giản chỉ có sự tham gia của một enzyme - xúc tác cho phản ứng tách nhóm CO2

của cơ chất là acid malic thành acid lactic Kết quả của phản ứng này là với mỗi gam acid malic sẽ tạo thành được 0.67g acid lactic và 0.33gam CO2 nhưng lại không sinh ra năng lượng dưới dạng ATP mà tế bào có thể sử dụng được

Tuy nhiên, nếu xét về ý nghĩa của biến đổi trên đối với sự trao đổi chất của vi khuẩn lactic thì chúng ta có thể xem đây là một quá trình lên men bởi vì nguyên nhân sau: cũng giống như quá trình lên men thông thường, mục đích của vi sinh vật thực hiện các chuyển hóa cơ chất cũng chỉ phục vụ cho nhu cầu về mặt năng lượng để chúng có thể sinh trưởng và phát triển Quá trình lên men malolactic xảy ra bên trong

tế bào cũng có ý nghĩa tương tự Khi thực hiện phản ứng trên, chất cho điện tử chính là acid malic, còn chất nhận điện tử cũng chính là NAD+ để chuyển thành NADH+H+ và chất này sẽ tham gia vào các chu trình sinh hóa trong cơ thể sinh vật để sản sinh ra năng lượng cung cấp cho tế bào

Ngoài ra, cũng theo Margalit, trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn lactic có thể sử dụng 3 con đường khác nhau để chuyển hóa acid malic Một là con đường chuyển hóa trực tiếp L-acid malic thành L-acid lactic và carbon dioxide nhờ enzyme malate carboxylase Cơ chế này có mặt ở hầu hết vi khuẩn malolactic Con đường thứ hai liên quan đến việc phân giải acid malic nhờ xúc tác của hệ “enzyme malic” thành oxaloacetate và tiếp tục thành acid pyruvic và CO2 L-lactate

dehydrogenase, sau đó, sẽ xúc tác cho phản ứng khử acid pyruvic thành L-acid lactic

Cơ chế này được tìm thấy ở Lactobacillus casei và Lactobacillus faecalis

Acid malic Acid oxaloacetic Acid pyruvic Acid lactic

Con đường thứ ba là được tìm thấy ở Lactobacillus fermentum Vi khuẩn này

có khả năng chuyển hóa L-acid malic thành acid lactic ở cả hai dạng đồng phân L- và D- Ngoài ra còn có một số sản phẩm trao đổi chất trung gian như acetate, succunate

và carbon dioxide

Sơ đồ 2 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn

malolactic (Wood và Holzapfel 1995) [37]

Lên men lactic đồng hình

Con đường phosphoketolase Lên men lactic dị hình Đường phân Con đường Bifidus Con đường 6-P-Gluconate

2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang

Trong sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính Dịch sau lên men rượu được gọi là “vang non” được tiến hành lắng cặn

và được chuyển sang bồn lên men tiếp theo Quá trình này diễn ra rất chậm nhằm phân giải lượng đường cuối cùng, song song với qúa trình này là vi khuẩn lactic sẽ phân giải acid malic thành acid lactic làm cho vang được chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ

dễ chịu, CO2 còn được tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị rượu vang cũng được hoàn thiện Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh, xác nấm men lắng xuống đáy bồn hay nồi lên men Tiếp theo, dịch vang được tiến hành lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến 30 ngày rồi tiếp tục đến quá trình ủ chín

2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic

2.3.3.1 Phân loại và hình thái vi khuẩn malolactic

Thuật ngữ “vi khuẩn malolactic” thường được dùng để chỉ những giống vi khuẩn có khả năng chuyển hóa acid malic trong rượu vang thành acid lactic Tất cả vi khuẩn malolactic đều là vi khuẩn Gram dương, có hình cầu hoặc hình que, không có catalase, thuộc nhóm vi hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện Có 4 giống vi khuẩn lactic rất

quan trọng trong sản xuất rượu vang: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc,

Oenococcus [31][37]

Hình 2 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc [45][53]

Sơ đồ 2 3: Phân loại vi khuẩn malolactic (Boulton et al 1996) [37].

a Lactobaccilus

Các trực khuẩn thuộc giống Lactobacillus đều là vi khuẩn Gram dương Chúng

thường có dạng hình que dài hoặc cũng có thể là ngắn gần như hình cầu Đường kính khoảng 0.5 – 0.7 µm và chiều dài có thể lên đến 8 µm Chúng đứng riêng lẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi

Có nhiều loài trong Lactobacillus được tìm thấy trong vang, được chia thành 2

nhóm: lên men lactic đồng hình và dị hình tùy thuộc vào khả năng lên men đường hexose và pentose Các loài lên men lactic đồng hình được liệt kê trong bảng 1 chỉ tạo

ra được acid lactic từ đường Những loài vi khuẩn lactic dị hình được liệt kê trong bảng đều là những loài dị hình bắt buộc, nghĩa là lên men đường ngoài việc tạo sản phẩm là acid lactic, chúng còn có khả năng tạo ra nhiều sản phẩm khác như acid acetic, acid succinic, ethanol, carbon dioxide…pH hoạt động tối thích cho các trực

khuẩn Lactobacillus là 5.5 – 5.8 Chúng không thể sinh trưởng được trong môi trường

có pH thấp hơn 3.5

Bảng 2 2 Phân loại vi khuẩn Lactobacillus

Lên men đồng hình đường hexose Lên men dị hình đường hexose

[15]

b Pediococcus

Thuộc giống này là các vi khuẩn hình cầu, Gram dương, không sinh bào tử, không chuyển động, đứng riêng lẻ hoặc kết đôi, kết ba, kết bốn hoặc kết thành chùm, đôi khi thành chuỗi Chúng có thể là thể kị khí hoặc vi hiếu khí Tất cả các loài vi khuẩn lactic thuộc giống này đều lên men lactic đồng hình, nghĩa là chúng chỉ có thể lên men đường thành acid lactic Khác với các vi khuẩn Gram dương điển hình, chúng

không chứa acid teichoic trong thành tế bào Có 4 loài Pediococcus có khả năng phát triển ở pH 4.2 hoặc thấp hơn thường gặp trong rượu vang là: P damnosus, P

parvulus, P pentosaceus, P acidilactici

c Leuconostoc

Tất cả các vi khuẩn Leuconostoc đều lên men dị hình, các tế bào thuộc giống

này có hình cầu hay hình trứng dài, đứng riêng lẻ, kết đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn,

có khả năng tạo NH3 từ asparagin và không có enzyme catalase Việc nghiên cứu nuôi cấy giống vi khuẩn này rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy cần vài chất dinh dưỡng đặc biệt như β-D-glucopyranosyl- D-pantothenic, nguồn acid béo sử dụng

là Tween 80 và chất ức chế nấm men cycloheximide Người ta có thể nuôi cấy chúng trong dịch ép cà chua, táo hoặc nho Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chỉ

có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ vang nho, đó là

Leuconostoc oenos

2.3.3.2 Sơ lược về vi khuẩn Oenococcus oeni

Năm 1995 một số nhà phân loại vi sinh vật học đã đề xuất và thống nhất đặt

chủng Leuconostoc oenos với tên mới là Oenococcus oeni Cho đến nay, cách phân loại này được nhiều nhà khoa học chấp nhận và Oenococcus oeni đã trở thành cái tên chính thức cho loài vi khuẩn này Oenococcus oeni có hình cầu dài, nối với nhau thành

chuỗi Loài này có đặc điểm hoàn toàn khác với những loài vi khuẩn khác thuộc nhóm này là chúng có thể phát triển ở nồng độ ethanol cao (>10%) và pH thấp (<4.2) Đối

với Oenococcus oeni, pH tối thích cho sinh trưởng là 4.2 – 4.8 và pH thích hợp để len

men malolactic dao động trong khoảng từ 3.2 – 4.0

Qua rất nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng vi khuẩn Oenococcus oeni là loài

có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chịu đựng và thích nghi tốt nhất trong môi trường rượu vang) Đồng thời chúng còn có khả năng cải thiện hương và vị làm tăng chất lượng cho sản phẩm Các chủng vi khuẩn còn lại tuy vẫn có khả năng chuyển hóa acid malic, làm giảm vị chua cho rượu vang nhưng chúng không có khả năng điều chỉnh hương vị, thậm chí có thể là nguyên nhân gây ra các biến đổi không mong muốn trong giai đoạn tàng trữ và bảo quản sản phẩm Vì thế, trong công nghiệp sản xuất

rượu vang Oenococcus oeni là loài mang lại nhiều đặc tính mong muốn nhất cho chất

lượng rượu vang

Hình 2 4 Hình thái vi khuẩn Oenococcus oeni [45][53]

2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic

Lên men malolactic là một quá trình rất quan trọng trong sản xuất các loại vang

đỏ có độ chua cao được sản xuất từ các giống nho trồng ở các vùng khí hậu lạnh Quá trình này vi khuẩn lactic chỉ sử dụng acid malic là chính mà không tác động gì tới các cấu tử và thành phần khác có trong vang Do đó, mức độ ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang phụ thuộc vào đặc tính của chủng vi khuẩn lactic và đặc điểm của vang

Quá trình lên men malolactic có ba ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang:

- Làm giảm độ acid của dịch vang sau lên men

- Điều chỉnh hương vị đặc trưng của vang

- Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm

2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic

2.3.5.1 Biến đổi sinh học

a Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong

lên men malolactic

Vi khuẩn malolactic có mặt trong tất cả các loại nho và rượu vang Tùy thuộc vào giai đoạn của quá trình làm rượu vang, điều kiện môi trường mà chúng sẽ xác định khả năng sinh sản của chính mình Khi phát triển, chúng chuyển hóa một số lượng lớn các chất.Vì thế mà vi khuẩn malolactic đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất rượu Ảnh hưởng của chúng tới chất lượng rượu vang không chỉ phụ thuộc vào các yếu tố tác động vào môi trường ở cấp độ tế bào mà còn phụ thuộc vào việc lựa

chọn chủng vi khuẩn thích nghi nhất (Alexandre et al.,2004; Ribéreau-Gayon et al.,

2000; Steinkraus, 1992)

Trong giai đoạn lên men chính, vi khuẩn acid lactic chiếm số lượng nhỏ (khoảng hơn 100 tế bào/g), vi khuẩn acetic và nấm men tìm thấy số lượng nhiều hơn

Oenococcus oeni chiếm số lượng nhiều hơn có trong lên men malolactic, xuất hiện

ngay từ đầu trong quá trình lên men rượu vang Pediococcus có thể tìm thấy hầu hết

sau khi quá trình lên men malolactic bắt đầu xảy ra và nhiều nhất khi rượu có pH cao

hơn Rượu vang có pH dưới 3.5 thông thường chỉ có Oenococcus oeni xuất hiện, trong

khi rượu có pH trên 3.5 thì thường có các vi khuẩn khác đặc biệt là các vi khuẩn lactic

- Pha tăng trưởng (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn malolactic

đã thích nghi và sẽ tăng trưởng với tốc độ sinh trưởng cực đại Các tế bào còn sống sẽ bắt đầu nhân lên đến khi sinh khối đạt ổn định và acid malic bắt đầu suy giảm trong pha này, chất dinh dưỡng chủ yếu được sử dụng để xây dựng vật chất tế bào và sinh sản

- Pha cân bằng: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định, acid malic hầu như được phân giải hoàn toàn

- Pha suy vong: các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết tăng lên, xuất hiện hiện tượng tự phân do các enzyme protease nội bào

Đồ thị 2 1: Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính trong lên men rượu [21] Trong những ngày đầu của quá trình lên men rượu, vi khuẩn và nấm men đều sinh sản Sau đó, chúng bắt đầu thích nghi hơn với môi trường và nhanh chóng tăng số lượng Trong suốt thời gian này, vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh sản để tăng số lượng nhưng

bị giới hạn khi mật độ tế bào đạt 104 đến 105 CFU/ml Việc tăng mật độ tế bào phụ thuộc vào pH môi trường Vi khuẩn malolactic đóng vai trò quan trọng trong lên men malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quá trình lên men rượu, khi đó mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml (Lonvaud-Funel, 1999; Osborn et al., 2000; Versari et al., 1999) [37]

Hơn nữa, vi khuẩn malolactic có thể được bổ sung vào các giai đoạn sau của quá trình lên men rượu: đồng thời với việc bổ sung nấm men, trong suốt quá trình lên men rượu, vào khoảng kết thúc quá trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn tất quá trình

lên men rượu (Davis et al., 1985) [37]

Đồ thị 2 2: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và

lên men malolactic [37]

Đồ thị 2 3: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men ethanol [37]

Lên men rượu

Tàng trữ

Bắt đầu lên men malolactic

Kết thúc malolactic

Ngày

Đồ thị 2 4: Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men ethanol [21] Quá trình lên men malolactic bắt đầu khi tế bào đạt đến pha tăng trưởng, tức ngay sau khi mật độ tế bào đạt 107 CFU/ml Quá trình này được tiếp tục và kết thúc trong pha cân bằng hoặc ở giai đoạn đầu của pha suy vong Trong điều kiện thuận lợi với nồng độ giới hạn của acid malic, quá trình lên men malolactic có thể hoàn thành ngay trước khi kết thúc pha tăng trưởng Lúc này mật độ tế bào tối ưu đạt 108 CFU/ml Ngay sau khi sinh khối đã tăng đủ số lượng và đạt đến sự ổn định thì acid malic bắt đầu bị suy giảm Các vi khuẩn malolactic vẫn luôn luôn có mặt nhưng hoạt động của chúng còn tùy thuộc vào các điều kiện khác nhau, đặc biệt là nhiệt độ Việc chuyển hóa 2g acid malic/ml có thể mất thời gian hơn việc chuyển hóa 4g acid malic/ml nếu

mật độ tế bào thấp (Ribéreau-Gayon et al., 2000)

b Sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men

Trong giai đoạn lên men malolactic, tác nhân vi sinh vật chính là vi khuẩn malolactic Sự hiện diện của nấm men không đóng vai trò rõ rệt vì trong giai đoạn này hầu như nấm men không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất yếu và bước vào pha suy vong, nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển Một phần nấm men chết đi có thể bị tự phân Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phần của xác

tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase) của chính bản thân tế bào Trong quá trình này, hầu hết các protein, acid nucleic, lipid và

các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất có phân tử lượng thấp hơn

và hòa tan vào môi trường Điều kiện để hiện tượng tự phân của tế bào xảy ra là tế bào

đã chết nhưng vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzyme hydrolase Trong sản xuất rượu vang truyền thống, người ta có thể tận dụng xác nấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cấn thiết cho vi khuẩn lên men malolactic phát triển

c Tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic

Sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang Bên cạnh việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, ta còn phải nghiên cứu những tương tác có lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường Đã có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988)

Những nghiên cứu trên đều chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kích thích, kìm hãm, trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men

Mức độ của những tương tác này còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sự tương tác của từng tổ hợp chủng nấm men/vi khuẩn malolactic cụ thể, sự hấp thu và giải phóng các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có khả năng kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic (Beelman

và cộng sự, 1982; Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988; Henschke và Jiranek, 1993)

Đồ thị 2 5: Giản đồ biểu diễn các kiểu tương tác khác nhau (kích thích , kìm hãm , không tương tác ) giữa 77 chủng nấm men và 3 chủng vi khuẩn thuộc

loài Oenococcus oeni: CHR, BR16-97 và DBVPG 8903 [34]

Khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường đề cập đến 2 khía cạnh chính:

Nhiều chủng nấm men có khả năng gây nên những tác động kích thích hoặc kìm hãm đến sự sinh trưởng và khả năng lên men vi khuẩn malolactic

 Ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men:

Một vài loài nấm men có khả năng góp phần vào quá trình lên men malolactic, nhưng vai trò này đã bị phủ định bởi chức năng chính của nấm men là chuyển hóa chất dinh dưỡng thành cồn Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế của nấm men đến vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng Tuy nhiên đã có nghiên cứu cho thấy rằng những ảnh hưởng của nấm men lên vi khuẩn là hạn chế sự phát triển và tồn tại do sản phẩm tạo ra hay sự cạnh tranh chất dinh dưỡng của nấm men Những nghiên cứu của Lallemand ở phòng thí nghiệm cho biết nấm men tạo chất kháng

khuẩn làm hạn chế sự phát triển của Oenococcus oeni Chất kháng khuẩn này là các

sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men như ethanol, SO2, các acid béo mạch trung bình và protein Đó là các chất kháng khuẩn tự nhiên

- Ethanol có khả năng ức chế các vi khuẩn nói chung kể cả vi khuẩn malolactic Người ta thấy rằng đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh mẽ lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng lên men malolactic của vi khuẩn này Theo Capucho và San Romao (1994): ở nồng độ 4% (v/v), ethanol đã có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acid malic của

vi khuẩn vày vẫn đạt được 95%

- SO2 sinh ra từ nấm men cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulfhite hóa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vi khuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men Người ta thấy rằng, hầu hết các chủng nấm men có khả năng tổng hợp được SO2 với hàm lượng lên đến 30mg/l, một số ít có thể sinh ra SO2 nhiều hơn, thậm chí hơn 100mg/l (Rankine và Pocock, 1969; Eschenbruch, 1974; Dott và cộng sự, 1976; Suzzi và cộng sự, 1985)

- Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic, octanoic… cũng có khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vi khuẩn lactic, cụ thể: acid decanoic có khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩn malolactic (Edwards và Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel và

cộng sự, 1988) Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và San Ronao(1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12.5mg/l decanoic và 2.5 mg/l dodecanoic) kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại Sự có mặt đồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic có thể gây tác động ức chế đến sinh trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từng loại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988)

- Sự tạo thành các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu Theo nghiên cứu của Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này có bản chất là protein tích điện âm Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và có ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhau trong sản xuất rượu vang (H.Alexandre và cộng sự, 2004)

- Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do sự cạn kiệt

về nguồn chất dinh dưỡng Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn sinh trưởng và lên men ethanol Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitamin hầu như không còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển

 Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men

Tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men ít được nghiên cứu hơn Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Fornachon (1968), sự kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men Khi nấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ gồm các acid amin, peptid, protein và vitamin Ngoài ra những phân tử lớn khác như glucan, mannoprotein cũng được giải phóng trong quá trình tự phân nấm men và kích thích sự phát triển của vi khuẩn Các hợp chất này rất cần thiết cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:

- Các phân đoạn nitơ khác nhau đối với sinh trưởng vi khuẩn malolactic Hiện nay vẫn chưa có một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hóa các loại peptide ở các vi khuẩn malolactic Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong

môi trường vang đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic Các nghiên cứu trên đều cho thấy, khi sử dụng các phân đoạn nitơ khác nhau gồm các phân đoạn

có phân tử lượng lần lượt là <0.5; 0.5 –1.0; 1 – 10; >10 kDa thì các acid amin tự do và đoạn peptide có phân tử lượng <1 kDa có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn rất tốt so với các phân đoạn có phân tử lượng lớn hơn gồm các đại phân tử

>10kDa và các đoạn peptide 1 – 10 kDa (Feuillat và cộng sự, 1977; Guilloux-Benetier

thích hoạt tính các enzyme aminopeptidase ở O.oeni Do vậy, vi khuẩn này có thể

thủy phân được các phân đoạn nitơ cao phân tử có trong vang ở cuối giai đoạn lên men chính Nhờ đó, nó góp phần giúp rút ngắn pha thích nghi và làm tăng tốc độ tổng hợp sinh khối của vi khuẩn malolactic Nghiên cứu của Farias và Manca de Nadra (2000) cũng đã làm sáng tỏ khả năng phân giải các phân đoạn protein ở vi khuẩn

O.oeni có khả năng làm tăng hàm lượng các amino acid và peptide trong dịch lên men

rượu vang

Sự ức chế nấm men bởi vi khuẩn malolactic

Sự có mặt của các chủng vi khuẩn malolactic hoạt động mạnh có thể không ảnh hưởng đến nấm men ở pha sinh trưởng Nhưng đến giai đoạn suy vong, nó làm tăng tốc độ chết của nấm men do hình thành nên các chất ức chế hoặc làm cạn kiệt các chất dinh dưỡng và các yếu tố sinh trưởng cần thiết của nấm men Do vậy, sự ức chế nấm men bởi vi khuẩn malolactic chỉ có thể xảy ra ở giai đoạn cuối trước khi kết thúc quá

trình lên men chính Các nguyên nhân dẫn đến sự ức chế này có thể giải thích theo các

cơ chế sau:

- Cơ chế thứ nhất liên quan đến khả năng ức chế nấm men bởi các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn malolactic như propionate và acetate Ngoài ra sự sinh trưởng của vi khuẩn còn làm tổn thất một lượng đáng kể carbohydrate cần thiết cho nấm men Từ đó làm giảm tốc độ sinh tổng hợp ethanol và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

- Cơ chế thứ hai để giải thích cho khả năng ức chế nấm men của vi khuẩn malolactic là chúng có khả năng phân giải thành tế bào nấm men nhờ enzyme β-1.3-glucanase (Guilloux-Benatier và cộng sự, 2000)

- Cuối cùng, sự hình thành các độc tố bacteriocin của vi khuẩn malolactic cũng được xem là một tác nhân gây ức chế nấm men (Yurdugul và Bozoglu, 2002) Tuy nhiên, khả năng này vẫn chưa được giải thích một cách rõ ràng

d Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men malolactic

Ảnh hưởng của pH

pH có ảnh hưởng rất sâu sắc đến sinh trưởng, phát triển, cũng như khả năng

phân giải acid malic của Oenococcus oeni Đây là yếu tố quyết định đến tiến trình lên

men malolactic, pH tối ưu cho quá trình lên men malolactic tùy thuộc vào chủng và môi trường nuôi cấy Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển cũng như phân giải acid malic của các chủng vi khuẩn là rất khác nhau ngay cả trong cùng một loài Vi khuẩn

Oenococcus oeni có thể phát triển được bắt đầu từ pH=2.9 nhưng pH tối ưu cho sự

phát triển của chủng vi khuẩn này lại là 4.5 – 6.5 Sở dĩ vi khuẩn Oenococcus oeni

chuyển hóa được acid malic thành acid lactic vì trong tế bào của nó có chứa enzyme malolactic Do bản chất của enzyme là protein nên hoạt lực của nó chỉ phù hợp với một số khoảng pH nhất định, nếu không sẽ xảy ra hiện tượng keo tụ hoặc biến tính

protein và sẽ dẫn tới mất hoạt lực enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thông thường nhiệt độ 200C là nhiệt độ tối ưu để lên men malolactic, tuy nhiên trong quá trình lên men chỉ có ở các cơ sở có hệ thống cấp lạnh mới có thể điều chỉnh

được tương đối chính xác nhiệt độ này Chỉ một số ít chủng vi khuẩn có khả năng lên men malolactic ở 150C, còn dưới 150C thì quá trình lên men malolactic rất khó xảy ra

Khi không có mặt SO2 trong rượu thì nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn malolactic là

23 –250C (lượng acid malic sẽ giảm thấp nhất khi nhiệt độ đạt 20 – 250C Gayon và cộng sự, 1975] Tuy nhiên việc giảm lượng acid malic sẽ thích hợp hơn với việc tăng nồng độ SO2 ở 200C

[Ribéreau-Bảng 2 3 Tốc độ phát triển của vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ

Tốc độ phát triển Nhiệt độ Rất chậm (về cơ bản là không có quá trình

decarboxylate acid malic)

Thông thường nếu nồng độ ethanol vượt quá 10%V thì quá trình lên men

malolactic sẽ bị ức chế một cách mạnh mẽ Nhưng Leuconostoc và Pediococcus thì lại

chịu được nồng độ cồn 12 – 14%V Khi nồng độ cồn vượt quá 15%V thì sự phát triển của vi khuẩn không diễn ra nữa, tuy nhiên quá trình lên men malolactic vẫn có thể xảy

ra Như vậy cồn ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mạnh hơn là vào chính quá trình lên men malolactic, so với pH và nhiệt độ thì ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình lên men malolactic là ít sâu sắc hơn

Ảnh hưởng của SO 2

Trong sản xuất rượu vang người ta sử dụng SO2 để chống oxy hóa và kháng khuẩn vì SO2 có tác dụng ức chế một vài loại enzyme oxy hóa khử và ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn lactic hay vi khuẩn acetic bất lợi Một phần SO2 ở dạng

tự do, còn một phần chúng kết hợp với các cấu tử khác có trong rượu vang Trong quá trình lên men cồn, SO2 kết hợp với nhiều chất khác, sau quá trình này ảnh hưởng của

SO2 lên vi khuẩn có giảm đi nhưng vẫn còn có những tác dụng nhất định

Hầu hết các vi khuẩn acid lactic đều rất nhạy cảm khi nồng độ SO2 tự do đạt 20mg/l hoặc cao hơn Thông thường nồng độ SO2 tổng số luôn được giữ ở mức thấp hơn 70mg/l đối với rượu đỏ và 40mg/l đối với rượu trắng Như vậy có thể nói rằng ngoài những tác dụng quan trọng trong quá trình chế biến vang thì SO2 cũng lại là một chất ức chế đáng kể quá trình lên men malolactic sau này Do đó, để quá trình lên men malolactic thực hiện được một cách tốt đẹp thì cần phải sunfit hóa dịch lên men một cách vừa phải để các vi khuẩn có lợi có thể sinh trưởng và phát triển được

10-Hình 2 5: Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic [20]

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ có ảnh hưởng khá nhiều đến sự phát triển của Oenococcus oeni

Tuy nhiên, trong quá trình lên men malolactic thì nguồn dinh dưỡng nitơ trong môi trường rất dồi dào do sau khi kết thúc quá trình lên men rượu, lượng nấm men còn lại trong vang non sẽ tự phân (do trong tế bào của chúng có chứa hệ enzyme thủy phân protein), nguồn nitơ tự phân của nấm men là một nguồn đạm rất lí tưởng cho sự phát

triển của Oenococcus oeni