Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino)

Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC CÀN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIẾN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHAO SAT ANH HUONG CUA CAO CHIET NAM LINH

CHI (Ganoderma lucidum) LEN TE BAO GOC THAN KINH

PHAN LAP TU NAO PHOI THAI CHUOT NHAT TRANG

(Mus musculus var albino)

ThS TRUONG HAI NHUNG MSSV: 3082584

LOP: CNSH TT K34

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 05/2013

PHAN KY DUYET

Pham Van Phuc Nguyén Thi Mai Dan

Cà ae

Trương Hải Nhung

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐÒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cân Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG

LỜI CẢM TẠ Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:

Tiến sĩ Phạm Văn Phúc và Thạc sĩ Trương Hải Nhung đã định hướng cho tôi

thực hiện đề tài, truyền đạt kiến thức, và tận tình chí bảo cũng như theo dõi tiến trình

thí nghiệm

Chị Đinh Thị Hồng Nhung, bạn Lê Minh Dũng, Nguyễn Thùy Linh, Lâm Thái

Thành, cán bộ Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc - Đại học Khoa học tự nhiên — Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ cho tôi kiến thức và trang thiết bị cần thiết để thực hiện và hoàn thành đề tài

Các anh chị cán bộ và các bạn sinh viên cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc — Đại học Khoa học tự nhiên — Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và động viên tôi

TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 05 năm 2013

Nguyễn Thị Mai Đan

TÓM LƯỢC

Các chứng rồi loạn hoặc các tổn thương thần kinh (Parkinson, Alzheimer, Huntington, chấn thương cột sống ) đã và đang trở thành một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng Các tồn thương này rất khó để chữa trị do hệ than kinh không thể

tạo ra các tế bào thân kinh mới, do đó yêu câu cấp thiết là phải có một liệu pháp hữu

hiệu để điều trị các chứng bệnh này Các nghiên cứu gân đây đã hướng đến sử dụng tế bào gốc, cụ thể là tế bào gốc thân kinh, do các tế bào này có khả năng tự làm mới và tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thân kinh để thay thế các tế bào đã mất đi trong não Tế bào gốc thần kinh được phân lập từ não phôi thai chuột 13.5-

15.5 ngày và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 không huyết thanh có bổ sung

B27, N2, heparin, EGF va FGF o diéu kiện 37C, 5% CO; Các tế bào ứng viên sẽ được chứng mình tính gốc thông qua phương pháp neurosphere, sự biểu hiện marker Soxl, CDI33, Nestin và được đánh giá khả năng biệt hóa thanh astrocyte bằng marker GFAP Sau đó, những tế bào gốc này được khảo sát trong đĩa 96 giếng có chứa cao chiết nắm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) ở các nông độ 100ug/ml, 300ug/ml, 1000ug/ml để đánh giá tác động của dược liệu lên sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào gốc thần kinh Kết quả thu nhận và chứng mình đặc tinh của các tế bào ứng viên cho thấy tỉ lệ nuôi cấy tế bào thành công là 72%, thai ở giai đoạn 13.5-15.5 ngày cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất, các tế bào này đều có khả năng hình thành

neurosphere, biéu hién marker Sox1, CD133, Nestin, có khả năng biệt hóa và biểu

hiện marker GFAP Ngoài ra, kết quả khảo sát ảnh hưởng của dược liệu lên tế bào gốc thần kinh cho thấy cao chiết với nỗng độ 500ug/ml có tác dụng kích thích tế bào tăng sinh mạnh nhất so với các nông độ còn lại

Từ khéa: Ganoderma lucidum, kich thuéc neurosphere, marker tế bào gốc thần kinh phương pháp nuôi cấy neurosphere (neurosphere assay)

1.2 Mục tiêu đề tài ¿25c L2 1221122212122 re 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 22©22222222S£22EE22ESzczxxesrxeez 4 2.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc . -:-22-©2++2++222ESEEESEEErerkrerrrrrrrrerrree 4

2.1.1 TrOnØ RưỚC .- c1 22121121 112 12 12119 111 H1 TH HH HH HH nh 4

VI NT NO 41445) 4 2.2 TẾ bào gỐc : c2 E1 2110212112211211211111 11 T11 T1 11 H1 1n ờy 5

VNĐ) hiicciidầiầđầiaiaiẢỶÝÝ4Ả 5

2.2.2 Ứng dụng của tế bào gốc

2.3 Tế bào gốc thần kinh -: + ©©¿+Sk+E+E9EE22E192E127121101112112112111 21111 11.1.rxe 7 2.3.1 Khái niệm về tế bào gốc thần kinh ¿2-2 5£++k++E+2EE2EEtEEevrxrrrrerree 7

2.3.2 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh -:- 2 +¿+2++2x+2Ex2EEerkezrxrrxrerxee 7

2.3.3 Tế bào gốc thần kinh và sự phát triển của hệ thần kinh trung ương 9 2.3.4 Nguồn tế bào gốc thần kinh - 2 ©++22+++2++SEE+2EEESEEveEErrrrxrerrrrrrxee 10 2.3.4.1 Nguồn tế bào gốc thần kinh nội sinh -2-©2¿©+++cv++zzxz+rsrcee 10

2.3.4.2 Nguồn tế bào gốc thần kinh ngoại sinh

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.3.5 Các yếu tố ảnh hướng đến tính tự làm mới và khả năng biệt hĩa của tế

9x08 8 11 2.3.5.1 Các yếu tố BON NORE ec eecccseessesssesssesssesscssssscssessseasecssesseessesssessecsseeseess 11

2.3.5.2 Céc yeu 6 BEN trON ge eeecscecsssssesssesssesssessecsssssecssesssssseessssseessesseesseesseeseees 12

2.3.6 Marker té bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh trưởng thành 12 2.3.6.1 Các marker tế bào gốc thần kinh -2-©+22++222+r2rxrerrrrsrxrsrrrcee 12

2.3.6.1.1 Nestin

2.3.6.1.2 SoxI and Sox2 9SRY-related HMG-box gene - 13

V5 n9 K< “433D 13

2.3.6.2 Marker tế bào thần kinh trưởng thành 2- ¿+ s+xe+cx+xzsrxezrs 14

2.3.6.2.1 Tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte) . 14

P6 7n v5 ẻ 14 P5 9 ha ẦẦ 14

2.3.6.2.2 Tế bào hình sao (AS[TOCẲ€), HH TH HT HH TH HH rệt 14 2.3.6.2.2.1 GFAP (glial fibrillary acidic protein) - « «+ 14

2.3.6.3.2.2 A2BS aa"nnD 14

P60 on hố 15 2.3.6.2.3.1 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion

IIỌ€CỤ) 7 << c0 0101010111111311111 1111155885 21151111111 e 15 2.3.6.2.3.2 MAP-2 (microtubule-assoeciated protein 2) ‹ 15 2.3.7 Các phương pháp nuơi cấy tế bào gốc thần kinh -¿¿c5sz5c5+2 15 2.3.7.1 Phương pháp nuơi cấy lớp đơn

2.3.7.2 Nuơi cấy neurosphere ¿- ¿+ +x+Ek£EEE9EE2E1221127122112111121e E10, 16 2.3.8 Các phương pháp đánh giá sự tăng sinh NSC ïn vifro .- <~<<<<<<+ 17

2.3.8.1 Đếm tế bào bằng máy đếm tự động . -¿- 52 ©c<ccxcscxccrrsrkerrk 17

2.3.8.2 Đo kích thước neuroSphere ¿- ¿+52 +2 £+E++££vEezsrekrrerrkrree 18 2.3.9 Các phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là NSC - 18 2.3.9.1 Phân tích tính gốc thơng qua sự tạo tập đồn -¿©s++cs+52+ 18

Chuyên ngành Cơng nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học

2.3.9.2 Kha năng biệt hĩa thành các loại tế bào thần kinh - : 19

2.3.9.3 Sự biểu hiện marker của các tế bào gốc thần kinh và tế bào thần

2.4.4 Ảnh hưởng của dịch chiết nắm Linh chỉ lên sự tăng sinh, biệt hĩa của

3.1 Phuong tién nghién COU oo 27

3.1.1 Thời gian và dia Gigm.o c.ccceccccscssssssssssssssesssessesssesssssscssessscsssssseesecssessecsseesees 27

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu ¿- ++S++EE2E19E12E122112112211021.211211 11.11 xe 27

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị, hĩa chất -sc©+e+Sk9E9E122E1221111112110211211 211 E1 c0, 27

3.1.3.1 DUM CU 27

3.1.3.2 THidt Di ooeccecceceecececsscseesseseesscssessesscssesuessessesessueseesusseessessessessesstssesseseeesees 28 3.1.3.3 HĩĨa chất ¿+ tt 2t 21221221211211211121211111111111111111111111 111 ce 28

3.2 Phương pháp nghiÊn CỨU c1 19119119 1 91 vn TH TH ng 31

3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và nuơi cấy tế bào đơn từ não phơi thai chuột

nhat trang (Mus musculus var aÏbii0) 55:55 c25cc2cxcccvevscvrsrsrrrrvesres 32 3.2.1.1 Phương pháp phân lập và thu nhận tế bào đơn từ não phơi thai

lệ Gdidddủ 32 3.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền neurosphere -2- ¿2 +¿+++2x++zxzzs+2 33 3.2.2 Nội dung 2: Chứng minh tế bào ứng viên là NSC 2- 2s ©5+¿ 34 3.2.2.1 Phương pháp 1: Đánh giá dựa trên khả năng tự làm mới của NSC 34 3.2.2.2 Phương pháp 2: Đánh giá sự biểu hiện marker của NSC 35

Chuyên ngành Cơng nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Cơng nghệ Sinh học

3.2.2.2.1 Danh gid sw biéu hién marker Sox] cia NSC bang phương

Phap RT-PCR 20 ceeccceceeeeessesseeseeeceeeneeeeeseeaeeseeeseesesieseeaseesees 35

3.2.2.2.2 Đánh giá sự biểu hiện marker CD133 của NSC bằng phương

pháp flow Cy{OIm€(TV ác cS St SH HH He, 36 3.2.2.2.3 Đánh giá sự biểu hiện marker Nestin của NSC bằng phương

pháp nhuộm hóa mô miễn dịch - ¿2 ¿s5++x+z++x+z++z+zx 37

3.2.2.3 Phương pháp 3: Đánh giá khả năng biệt hóa của NSC thành

astrocyte bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 38 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh tế bào của cao chiết

nấm Linh chỉ cc+++2EE+k++tttt211221112 E21 E1 re 39

3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 2 2£ <SE2EEE2EE9212210212211211 221 21x 2.e2 40 CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THÁO LUẬN .2 -2:©25255222cSzscxxcsrxrcrrs 41

4.1 Kết qua phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 41 4.1.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh ứng viên 41

4.1.2 Kết quả cấy chuyên té Da0 ccccccsssesssesssesssessesssessesssesssessecssessesssessssssesssesseees 44 4.2 Kết quả chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh

4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới thông qua sự hình thành

TI€UTOSDHTC SG 2C 119 1212121121191 01 012 1H Hà TH TH TT HH TH HH Hi 46 4.2.2 Kết quá đánh giá marker của tế bào ứng viên ¿ -: 55:52 2ccscxzczs 48

4.2.2.1 Khả năng biểu hiện marker Sox! của tế bào ứng viên ‹ - 48 4.2.2.2 Khả năng biểu hiện marker CD133 của tế bào ứng viên 49

4.2.2.3 Khả năng biểu hiện marker Nestin của tế bào ứng viên

4.2.2.4 Khả năng biệt hóa thành tế bào và sự biểu hiện marker GFAP 51

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nam Linh chỉ lên sự tăng sinh tế

BAO x0 8n PP .- 53 CHUONG 5 KET LUAN VA KIEN NGHO o0 c.cccsscssscsssssssesssssesseessesssesseessecssees 57

5.1.3 Ảnh hưởng của cao chiết nắm Linh chỉ lên sự tăng sinh của NSC 57

5.2 Kiến nghị, ¿ 6-52 21 21221122122112212112111211011121111121111111112121 1 1x eerrey 57

IV )80)9009:7 9/804: cdàn 59

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các primer dùng cho RT-PCR

Phụ Iuc 2 Kết quả khảo sát sự thay đối đường kính neurosphere sau 72 giờ

Bảng 4.5 Đường kính và tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere ở các nghiệm thức 1000ug/ml, 500ug/ml, 100ug/ml và đối chứng sau 72 giờ

Bảng 4.6 Đường kính của các neurosphere qua 72 giờ ở các nghiệm thức 1000ug/ml, 500ug/ml, 100ug/ml và đối chứng

4 Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của

neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 1000ug/ml so với đối chứng

5 Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 100ug/ml so với đối chứng

Bảng 4.2 Bảng tổng kết tuổi thai 5-5225 SE SE 9E122E19211971221112122212 211211 c0, 41

Bang 4.3 Ty Ié gia tang kich thudéc cua neurosphere sau 72 gid

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

được đánh đấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và FITC khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đáo ngược - - 13 Hình 2.5 Các tế bào astrocyte biểu hiện GFAP khi nhuộm với kháng thể kháng

GFAP được đánh dấu bởi thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và

rhođamine khi quan sát đưới kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược 15 Hình 2.6 Neurosphere - 6s 1k vn TH TH nh TH nh ni HT HH tế 17 Hình 2.7 Khả năng tự làm mới bằng cách hình thành neurosphere, khá năng biệt

hóa thành các loại tế bào thần kinh (neuron, astrocyte, oligodendrocyte) của các tế bào gốc thần kinh và các yếu tố phiên mã (transcription factor) diéu hòa hai đặc tính này -¿©22+222+2cx+2Exxrtrrrsrrrerrrrrrkr 19 Hình 2.8 Ganoderma ÍUCÏCÏHHH «c1 1 1 11 11 1 91 11 11 HH Hàn Hit 21 Hình 3.1 Chuột nhắt trắng (Mus musculus var QIDIN0) .ằàecSẶ S5 S‡S<kssceses 26 Hình 3.2 Quy trình thực hién thi nghi@m wee ec eeeseceeeeneeeteeneeeteeeeeeteeeeeeeeeneeeee 30 Hình 3.3 Các thao tác trong quy trình thu nhận tế bào đơn .: ::5++ 32 Hình 3.4 Chu kì nhiệt của phản ứng RT-PCR .- «(6S SE seekrekeexek 35

Hình 4.1 Tế bào chết và bị nhiễm :2222c++ttEEEkEtrrtrrrrriiirrrree 40

Hình 4.2 Sự hình thành neurosphere từ mẫu nuôi cấy sơ cấp

Hình 4.3 TẾ bào biệt hóa - 2-22 5£ ©5212 SE1921122121122112712112711211211211 211.1 c0, 44 Hình 4.4 Sự hình thành neurosphere sau khi cấy chuyễn -.2 ¿s+c5z5s+ 45

Hình 4.5 Sự hình thành neurosphere trong phương pháp neurosphere - 46 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR - 2-2 +2 £+2E2Ext2EEvExzrxrrreee 48

Hinh 4.7 Dé thi 2D của tế bào biểu hin CD133 csccccsesssesseessesssesseessessessessseesesseees 49 Hình 4.8 Biểu đồ tần số của tế bào biểu hiện CD 133 2-2 2 ++cs+£x+rxerserx 49

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 4.9 Kết quả nhuộm nestin - 2-22 2£ S22 2EE+EE£2EEtEEEEEE22EEEEE22Ee2Eeerkerex 50 Hình 4.10 Kết quả nhuộm GFAP - 22 ©25¿ S222 2EE2EE22EE92EEEEX222122122212212221exe 52

Hình 4.11 Tỉ lệ gia tăng kích thước neurosphere sau 72 giờ ở các nghiệm thức

100ug/mI, 500ug/mL và 1000ug/ml so với nghiệm thức đối chứng 54 Hình 4.12 Tốc độ gia tăng kích thước neurosphere ở các nghiệm thức sau mỗi 24

Hình 4.13 Neurosphere sau 72 giờ và 96 giờ nuôi cấy trong môi trường không có

và có bố sung cao chiết ở các nồng độ khác nhau -.: :+ 56

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CNE: ciliary neutrophic factor

CNS: central nervous system

CREB: cAMP response element-binding protein

DMEM: Dulbecco’s modified eagle medium

EGF: epidermal growth factor

ERK: extracellular receptor kinase

F3: fucose-containing polysaccharide fraction

FBS: fetal bonvine serum

FGF-2: fibroblast growth factor 2

GalC: galactosylceramidase

GFAP: glial fibrillary acidic protein

GLPG: Ganoderma lucidum proteoglycan

GLPP: Ganoderma lucidum protein-bound polysaccharide

HMG box: high mobility group box

HSC: hematopoietic stem cell

IL-1: interleukin 1B

IL-2: interleukin 2

IL-6: interleukin 6

iPSC: induced pluripotent stem cell

JAK: Janus associated tyrosine kinase

LIF: leukemia inhibitor factor

MAP-2: microtubule-associated protein 2

MAPK: mitogen activated protein kinase

MBP: Myelin basic protein

mES: mouse embryonic stem cell

NCSC: neural crest stem cell

NGF: nerve growth factor

NSC: neural stem cell

OSM: oncostatin M

PI3K: phosphoinositide-3 kinase

PSA-NCAM: polysialylayed neural cell adhesion molecule

RMS: rostral migratory stream

SDF-1a1: stromal cell-derived factor lal

SEZ: subendymal zone

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

8 BERR ko

1.1 Đặt vấn đề

Các bệnh về thần kinh là những rối loạn xảy ra ở não bộ, cột sống cũng như các

dây thần kinh trong cơ thể, gây ảnh hưởng đến khả năng vận động, nói, nhai nuốt, hít

thở, điều hòa cảm xúc, ghi nhớ và học tập của con người

Theo thống kê năm 2007 của WHO (World Health Organization), trên thế giới có khoảng 1 tỉ người mắc phải các chứng rối loạn liên quan đến thần kinh, trong đó có khoảng 50 triệu người mắc bệnh động kinh và 24 triệu bệnh nhân Alzheimer cũng như các chứng mắt trí khác, và có khoảng 6.8 triệu ca tử vong mỗi năm được ghi nhận Vì vậy, các bệnh rồi loạn về thần kinh ngày nay được xem như một thách thức đối với sức khỏe cộng đồng Theo Rita Levi-Montalcini, một nhà thần kinh học người Ý đã đoạt giải Nobel y khoa năm 1986, đã khẳng định rằng: “Các chứng rối loạn thần kinh đang trở thành một gánh nặng đáng kế đối với nhiều quốc gia với tỉ lệ dân số mắc các căn bệnh này đang trên đà gia tăng trong vòng 65 năm qua” Hiện nay, có hơn 600 chứng rối loạn thần kinh ghi nhận, trong đó Parkinson (Parkinson's disease) và Alzheimer (Alzheimer’s disease) 14 m6t trong nhig bệnh thần kinh được biết đến phổ biến nhất Alzheimer là một chứng bệnh liên quan đến sự thoái hóa não bộ, bao gồm Sự suy giảm có tiến triển về khả năng ghi nhớ, suy nghĩ, nhận thức, tính toán, ngôn ngữ, học tập và phán đoán Theo thống kê của WHO (2001) thì có khoảng 37 triệu người trên thế giới mắc chứng mắt trí nhớ mà nguyên nhân chủ yếu là Alzheimer, trong đó bao gồm 5% nam giới và 6% nữ giới ở độ tuổi trên 60 Con số này được ước tính là sẽ gia tăng nhanh chóng trong vòng 20 năm tới

Tương tự, Parkinson cũng là một dạng thoái hóa của hệ thần kinh trung ương, thường gặp ở người lớn tuổi, có thể gây tàn phế và làm giảm chất lượng cuộc sống Tuổi thọ trung bình của người Việt Nam ngày càng được cải thiện do đó Parkinson cũng trở thành một vấn đề sức khỏe đáng được lưu ý nhiều hơn Theo thống kê, hiện nay trên thế giới có 6 triệu người mắc bệnh Parkinson, trong đó có khoảng 1 triệu trường hợp được ghi nhận tại Mỹ và 130 nghìn trường hợp tại Anh Tuy nhiên, vẫn chưa có con số thống kê cụ thể nào về Parkinson tại Việt Nam Bệnh Parkinson

thường gặp phô biến ở người cao tuổi, chủ yếu là ở độ tuổi từ 50 trở lên, tuy nhiên gần

đây, nhiều trường hợp mắc bệnh Parkinson trong độ tuổi 20-40 và đưới 20 cũng được ghi nhận Trước đây, các nhà y học sử đụng thuốc trong điều trị các chứng bệnh này nhằm kìm hãm các triệu chứng của bệnh, nhưng việc sử dụng thuốc có thể gây ra một

số tác dụng phụ không mong muốn Ngoài ra, một số phương pháp phẫu thuật cũng

được sử dụng nhưng không điều trị được tận gốc và bệnh nhân phải được tái phẫu

thuật nhiều lần

Nhiều nghiên cứu gần đây đã hướng đến việc sử dụng liệu pháp tế bào gốc trong

điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh, đáng lưu ý là Parkinson, do hiệu quả cao

trong việc điều trị Trong phương pháp này, các tế bào gốc sẽ được biệt hóa thành tế bào thần kinh có khả năng sản sinh chất dẫn truyền thần kinh dopamine và chúng sẽ được cấy ghép vào não bộ của bệnh nhân Tuy nhiên, các tế bào gốc này hiện diện rất

ít ở các mô và cơ quan trưởng thành, đo đó việc sử dụng các tế bào gốc phôi thai được quan tâm nhiều hơn Các tế bào gốc có nguồn gốc từ thai có tính đa năng cao hơn nên khả năng tăng sinh mạnh hơn so với các tế bào gốc trưởng thành Ngoài ra, chúng còn

có thể sinh trưởng và biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau dễ dàng trong quá trình nuôi cay in vitro nên có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc cấy ghép cũng như điều trị các căn bệnh liên quan đến rối loạn thần kinh Nhiều nghiên cứu đã và đang xác định

các điều kiện nuôi cấy in viro nhằm kích thích sự biệt hóa các tế bào gốc này thành

kiểu tế bào mong muốn Một số nghiên cứu gần đây cho rằng nguồn NSC nội sinh thụ động trong việc di cư đến các khu vực riêng biệt trong não bộ, vì vậy mà việc sử dụng các yếu tố ngoại sinh để biệt hóa tế bào có thể giúp khắc phục các hạn chế của nguồn NSC nội sinh, đồng thời kích thích khả năng tái tạo của các tế bào gốc này bằng các tín hiệu thích hợp (Reimers et al., 2008) Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh

hưởng của cao chiết nắm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) lên tế bào gốc phân lập từ

não phôi thai chuột nhat trang (Mus musculus var albino)’ được thực hiện nham lam

rõ tác dụng được liệu của nắm Linh chỉ lên sự sinh trưởng và phát triển của tế bào gốc

ở mức độ lâm sàng và làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn trong điều trị các bệnh rối loạn thần kinh, đặc biệt là Parkinson và Alzheimer

1.2 Mục tiêu đề tài

- Phân lập và nuôi cấy được tế bào gốc thần kinh từ não phôi thai chuột nhất

trắng (Mus musculus var albino)

- Xác định được nồng độ cao chiết nấm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) có tác

động tốt nhất lên sự tăng sinh của tế bào gốc thần kinh trong điều kién in vitro

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

8 BERR ko

2.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc

2.1.1 Trong nước

Theo tài liệu của Bộ Y tế, những nghiên cứu đầu tiên về tế bào gốc tại Việt Nam

được tiến hành khá sớm, cách đây khoảng 20 năm Năm 1995, Bệnh viện Truyền máu

- Huyết học TP.HCM đã tiến hành ca ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên để điều trị cho

bệnh nhân bị bệnh máu

Ngoài ra còn có các nghiên cứu về nuôi cấy tinh tử, tế bào sợi và tế bào sừng ứng dụng trong điều trị các bệnh nan y, nghiên cứu về tế bảo gốc và nhân bản vô tính trên động vật (sao la, bò, chuột nhất) Theo báo cáo về hiện trạng nghiên cứu, ứng dụng

tế bào gốc tại Việt Nam của hai tác giả Phạm Mạnh Hùng và Lê Văn Đông: “Nghiên cứu tế bào gốc tại Việt Nam hình thành 3 máng lớn là: tạo nguồn tế bào gốc (phân lập

và lưu trữ), biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào chuyên biệt và ứng dụng tế bào gốc”

Theo tiến sĩ Lê Văn Đông, biệt hóa tế bào gốc thành một số loại tế bào giống như

tế bào cơ tim, tế bào thần kinh, tế bao da, té bao xương, sụn, mỡ tại Việt Nam được coi là hướng nghiên cứu song hành với các nước trên thế giới, nhưng các kết quả chúng ta đạt được còn tương đối khiêm tốn

Mặc dù vậy, những nghiên cứu về tế bào gốc tại Việt Nam, theo đánh giá của một số chuyên gia trong lĩnh vực này, vẫn còn khá tản mác và chưa có tính liên thông cao Nước ta hiện cũng đang tiến hành một số nghiên cứu về tế bào gốc có tính quan trọng cho việc giúp đỡ các bệnh nhân - phục vụ nghiên cứu y học như, tách tế bào gốc

từ màng dây rốn, tế bào góc biệt hóa thành tế bào cơ tim, tế bào gốc điều trị bệnh đái

tháo đường; tế bào gốc nuôi thành tế bào gan, tế bào gốc điều trị bỏng - tái tạo răng, giác mạc từ tế bào góc

2.1.2 Thế giới

Việc nghiên cứu tế bào gốc trong Y học đã được tiến hành từ những năm 1960 trên thế giới, nhất là các nước phát với các nghiên cứu về tế bào gốc trưởng thành và tế bào gốc tạo máu Những thành công đầu tiên trong lĩnh vực này là việc cấy ghép tế bào gốc tạo máu được tiền hành vào những năm 80 của thế kỷ XX ở hầu hết các nước

tiên tiến Nguồn tế bào gốc cho ghép được lấy từ xương, từ máu ngoại vi, gần đây là từ máu cuống rốn và màng lót cuống rốn Việc cấy ghép tế bào gốc là một phương pháp được ứng dụng trong điều trị các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyén, u lympho va cho

hiệu quá cao nhất ở bệnh nhân trẻ và trẻ em Gần đây, việc nghiên cứu và ứng dụng tế

bào gốc trong y học không chỉ dừng lại ở việc ghép tế bào gốc tạo máu mà còn được nghiên cứu và phát triển ở rất nhiều chuyên khoa khác như: mắt, tim mạch, bỏng, da

Gần đây nhất là giải Nobel Y học 2012 về phát hiện khả năng tái lập trình tế bao

trưởng thành thành tế bào giống tế bào gốc phôi, gọi là tế bảo gốc vạn năng nuôi cay

(IPSC), được xem là bước đột phá của con người với hy vọng “cải lão hoàn đồng” của John Gurdon (sinh năm 1933, người Anh) và Shinya Yamanaka (sinh năm 1962, người

điều kiện im vivo hoặc in viro, mỗi tế bào gốc có thể trải qua phân bào nguyên nhiễm

thông qua tính tự làm mới để tạo ra nhiều tế bào gốc mới hoặc biệt hóa thành nhiều

loại tế bào khác nhau, vì vậy một tế bào gốc đòi hỏi phải ít nhất phải có hai đặc tính như sau:

e Khả năng tự làm mới: tế bào có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân

bào nguyên nhiễm mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa

e Khả năng biệt hóa : tế bào có khá năng biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng

có nhiêu dự đoán về tiêm năng sử dụng của các tê bào này, bao gôm:

Tế bảo gốc Tế bào gốc thần kinh Tể bào gốc

phôi từ các mô khác

phôi thai Tủy xương Cuống rốn

Tiên biệt hóa và/hoặc biến đổi di truyền

nội sinh

Hình 2.1 Ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị rối loạn thần kinh Các tế

bào gốc được phân lập và cấy ghép vào não hoặc cột sống của bệnh nhân bằng phương pháp tiền biệt hóa hoặc biến đối di truyền trong điều kiện nuôi cAy in vitro để tạo thành các neuron và các loại tế bào thần kinh đệm (Lindvall và

Kokaia, 2006)

e Nghiên cứu về sự phân chia bất thường của tế bào: Trong một số các trường hợp như ung thư, khiếm khuyết bẩm sinh đều có liên quan đến sự phân chia không bình thường của tế bào hoặc các rối loạn trong điều hòa trạng thái hoạt động của tế bào Vì vậy, việc hiểu rõ bản chất tế bào góc, cơ chế điều hòa của chúng ở cấp độ di truyền và phân tử sẽ giúp cho việc điều trị bệnh được hiệu quả hơn

e Thử nghiệm thuốc: các tế bào gốc cũng được sử dụng trong thử nghiệm các loại

thuốc mới bằng cách biệt hóa chúng thành các loại tế bào đích đặc trưng mà thuốc có

thể tác dụng lên Các tế bào biệt hóa này là được các nhà khoa học sử dụng như mô

hình thử nghiệm thuốc in vitro, nho d6 co thé rút ngắn thời gian tìm ra các hóa chất thích hợp đề điều trị bệnh

e Liệu pháp tế bào: ngoài những ứng dụng nêu trên, tế bào gốc còn được sử dụng trong các liệu pháp tế bào bằng cấy ghép tế bào gốc vào cơ thê bệnh nhân, sau đó kích thích chúng biệt hóa in vivo để thay thế các mô bệnh hoặc tổn thương hoặc biệt hóa chúng thành tế bào mong muốn rồi mới cấy ghép

Nằm trong phạm vi ứng dụng này, các tế bào gốc thần kinh được sử dụng như một nguồn tế bào dồi dào dé thay thế hoặc bảo vệ thần kinh trong điều trị một số rối loạn ảnh hưởng đến não bộ và cột sống như Parkinson, Alzheimer, Huntington, đột quy, chắn thương cột sống (Lindvall và Kokaia, 2006)

2.3 Tế bào gốc thần kinh

2.3.1 Khái niệm về tế bào góc thần kinh

Tế bào gốc thần kinh (NSC) là những tế bào đa năng có khả năng tăng sinh và tự

làm mới được phân lập từ não và tủy sống mà không liên quan đến các giai đoạn phát

triển, có thể là thời kỳ phôi thai, bào thai hoặc thời kỳ trưởng thành và có thé biệt hóa

thành các thành phần của hệ thần kinh, bao gồm neuron, tế bào hình sao và tế bào thần kinh đệm ít nhánh (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2009)

2.3.2 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh

Trong não của động vật có vú trưởng thành, NSC (hay các tế bào giống NSC)

tham gia vào quá trình phát triển của hệ thần kinh dưới các điều kiện sinh lí tại một số

vùng đặc biệt như vùng SVZ (subventricular zone) của não thất bên, vùng SGZ (subgranular zone) của vùng hồi hải mã NSC còn được tìm thấy ở nếp nhăn vỏ não, mau khitu giác, vùng chất xám, vùng chất đen và tủy sống Chúng không chỉ hiện diện

ở hệ thần kinh của động vật có vú ở giai đoạn đang phát triển mà cả ở những động vật

đã trưởng thành, bao gồm cả con người Chúng cũng có thể bắt nguồn từ những tế bào gốc nguyên thủy ở phôi Ngoài ra, NSC cũng tham gia vào quá trình sửa chữa hư hại cho hệ thần kinh trung ương Do các neuron của hệ thần kinh không có khả năng phân chia nên NSC được sử dụng để biệt hóa và thay thế các neuron bị mất đi hoặc các neuron bị tổn thương và trong một số trường hợp thì chúng cũng có thể được biệt hóa

thành tế bào hình sao Quá trình biệt hóa của các NSC có thể được kích thích bởi các

tín hiệu bên ngoài từ vi môi trường Một số tế bào khi được kích thích sé di chuyển từ

vùng SVZ đọc theo các dòng di cư rostral (RMS) trong não bộ, và vùng này bao gồm các cấu trúc tương tự tủy xương với các tế bào màng não thất và tế bào hình sao Các

tế bào màng não thất và tế bào hình sao này sẽ hình thành nên các ống thần kinh đệm Trong ống thần kinh đệm, các tế bào hình sao sẽ cung cấp sự chống đỡ cho các nguyên bào thần kinh cũng như đóng vai trò trong việc cách ly các tín hiệu điện và hóa học từ các tế bào lân cận Ngoài ra, các tế bào hình sao còn là tiền chất cơ bản cho sự khuếch đại nhanh chóng của neuron Các nguyên bào thần kinh có thể liên kết thành các chuỗi chặt chẽ và di chuyên đến các vùng bị tổn thương để sửa chữa hoặc thay thế các tế bào

thần kinh bị tồn hại

Não thất (màu xanh) Gian tế bào gốc \

Mặt trước (màu đỏ)

Mặt trước của lớp cắt

Giai đoạn phôi Giai đoạn trưởng thành -

Ở chuột, các tế bào NSC bắt đầu tồn tại ở trạng thái tự làm mới kế từ khi phôi

được 8.5 ngày tuổi đến khi trưởng thành Chu kì nguyên phân của các tế bào này phụ thuộc vào từng giai đoạn phát triển của sinh vật, có thể là từ 7-10 giờ ở giai đoạn thai,

18 giờ trong thời kì thai muộn và vài ngày ở cơ thể trưởng thành

2.3.3 Tế bào gốc thần kinh và sự phát triển của hệ thần kinh trung ương

Trong quá trình phát triển của phôi thì quá trình biệt hóa của các NSC là một sự

kiện trung tâm Sự phát sinh hình thái, quá trình tổ chức các tế bào và mô là yếu tố đầu

tiên cần cho sự biệt hóa của các tế bào Sự kiện trung tâm ở giai đoạn phôi vị là sắp

xếp lại các phôi bào đề hình thành nên ngoại bì, trung bì và nội bì Một phần ngoại bì

vùng lưng được biệt hóa thành tế bào thần kinh, vùng này của phôi được gọi là tắm

thần kinh Quá trình hình thành phôi thần kinh sẽ tạo nên ống thần kinh và ở giai đoạn

này, phôi sẽ được gọi là phôi thần kinh Ong thần kinh sau đó sẽ phát triển thành não

và tủy sống

Sự phát sinh thần kinh trong não thai bắt đầu bằng sự cảm ứng các tế bào biểu

mô thần kinh, hình thành các tắm mô thần kinh ở phôi chuột bảy ngày rưỡi, sau đó chúng sẽ gấp lại hình thành nên các ống thần kinh (Gotz và Huttner, 2005) Hai đầu ống thần kinh sẽ tiếp xúc với mặt trên cùng của não thất Ban đầu, các tế bào biểu mô thần kinh phân chia đồng đều tại bề mặt của não thất để tăng sinh quan thé tế bào gốc

Tuy nhiên, tại một thời điểm nhất định thì các tế bào này bắt đầu phân chia không

đồng đều nữa, tạo ra một tế bào gốc vẫn được giữ nguyên ở vùng não thất và một tế bào khác di chuyển tỏa tia hướng ra ngoài (Haubensak et al., 2004) Các tế bào này

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

chịu trách nhiệm cho sự phát sinh thần kinh trong ống thần kinh và sau đó chúng hình

thành nên các tế bào thần kinh đệm tỏa tia Các tế bào thần kinh đệm tỏa tia này được

hình thành ở phôi chuột khoảng chín ngày rưỡi

2.3.4 Nguồn tế bào gốc thần kinh

2.3.4.1 Nguồn tế bào gốc thần kinh nội sinh

Nguồn sản sinh các tế bào gốc thần kinh nội sinh ở vùng SVZ rất thích hợp cho việc cấy ghép trên não động vật (Alvarez-Buylla và Gareia-Verdugo, 2002; Alvarez- Buylla và Lim, 2004), tuy nhiên việc sử dụng các tế bảo nảy trong điều trị các bệnh về thần kinh gặp nhiều trở ngại về số lượng tế bào sẵn có và khoáng cách chúng phải di chuyển đến các vùng bị tổn thương Hơn nữa, nếu các chứng rối loạn thần kinh là đo

di truyền thì các tính trạng này sẽ được di truyền cho các tế bào gốc thần kinh nội sinh

và làm cho các liệu pháp chữa trị không còn chính xác nữa

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các neuron mới sẽ được sản sinh ở vùng SVZ sau các cơn đột quy (Arvidsson et al., 2002; Kuge et al., 2009), và các tế bào mới này di chuyển, xâm nhập vào các mô bị tôn thương Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác chứng minh quá trình phát sinh thần kinh sẽ có xu hướng gia tăng sau các cơn đột quy do thiếu máu (Parent et al., 2002; Yagita et al., 2001; Zhang et al., 2009) Các nghiên cứ này đưa ra nhiều chứng cứ về khả năng tái tạo của não bộ sau tổn thương, tuy nhiên tiềm năng này chưa được điều hòa một cách có hiệu quả

Việc điều khiến sự phát sinh thần kinh nội sinh và sự di chuyên của các tế bào gốc đến các vùng tồn thương là rất quan trọng trong các liệu pháp tế bào gốc Các yếu

tố hóa học và thể dịch được sản sinh ra ở các vùng ton thuong cua co thé sinh vat bénh đóng vai trò như các tín hiệu thu hút NSC (Ekdahl et al., 2009) Một ví dụ điển hình là HGF và SDF-Iơl là các tín hiệu hóa học mạnh mẽ có khả năng thu hút và ảnh hưởng đến sự tăng sinh của NSC (Lan et al., 2008; Takeuchi et al., 2007)

2.3.4.2 Nguồn tế bào gốc thần kinh ngoại sinh

Các tế bào gốc thần kinh ngoại sinh có thể được thu nhận từ các nguồn đa mô, ví

dụ như da (Joannides et al., 2004; Toma et al., 2001; Valenzuela et al., 2008), té bao gốc thần kinh phôi (Zhang et al., 2009), tế bào gốc phôi (Erceg et al., 2008), tủy xương

và tế bào gốc trung mô (Fu et al., 2008), các tế bào gốc đa năng được cảm ứng (Amabile va Messner, 2009; Chambers et al., 2009), o hé than kinh phôi thai cũng như

hệ thần kinh ở cơ thể trưởng thành (Alvarez-Buylla và Garcia-Verdugo, 2002; Alvarez-Buylla va Lim,2004; Feldmann va Mattern, 2006; Sanai et al 2004) Tuy nhiên, những nguồn tế bào nói trên cần phải được nghiên cứu sâu hơn để có thể ứng dụng trong điều trị các bệnh thoái hóa và rối loạn thần kinh

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tự làm mới và khả năng biệt hóa của tế bào

gốc thần kinh

Một trong những đặc tính quan trọng của tế bào gốc vạn năng ở động vật có vú là tính tự làm mới và tính vạn năng Các yếu tố điều khiển sự duy trì trạng thái không biệt hóa của các tế bào gốc phôi được xếp và hai nhóm chính là các yếu tố bên ngoài

và các yếu tố bên trong (Phan Kim Ngọc và Pham Văn Phúc, 2007)

2.3.5.1 Các yếu tố bên ngoài

EGF và FGF-2 được cho là ứng viên mitogen cua NSC do chúng có khả năng kích thích sự tự làm mới của NSC và duy trì đặc tính có thể cấy chuyền liên tuc in vitro cua cdc té bao này trong thời gian dài

Gần đây, người ta thay rang sy hoat héa cdc IGF-1 receptor boi EGF va FGF-2

cần cho sự phân chia tế bào gốc Tuy nhiên, chu kỳ nguyên phân của NSC rất chậm (trung bình là 15 ngày ở vùng thể vân), hoặc ngừng trệ Qua đó, không thể giải thích rằng sự tăng sinh hoàn toàn chỉ bởi các mitogen, những nhân tố khác cũng rất cần để duy trì NSC trưởng thành ở trạng thái không biệt hóa

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng LIF (Leukimia inhibitor factor — nhân tố

ức chế bạch cầu) là một protein thuộc họ cytokine kiểu Interleukin 6 (IL-6) có khả năng kích thích tế bào thông qua cdc receptor gp130, gp130 sẽ kết hợp với receptor đặc hiệu (LIF-R) ở dang heterodimer Ngoai LIF, con hai nhan tố khác là oncostatin M (OSM) va ciliary neutrophic factor (CNF) có thể sử dụng trong CM

Sự hoạt hóa gp130 dẫn đến sự hoạt hóa của JAK (Janus associated tyrosine kinase), cdc protein tín hiệu và hoạt hóa phiên mã STAT (signal transducer and activator of transcription protein), cũng như sự chuyển vị của chúng đến nhân, gắn vào DNA và sau đó hoạt hóa phiên mã Khả năng LIF ngăn cản sự biệt hóa của các mES phụ thuộc vào sự hoạt hóa STAT4, đồng thời sự hoạt hóa của STAT3 (ngay ca khi LIF vắng mặt) cũng có khả năng làm tế bào tăng sinh

Hơn nữa, ngoài việc hoạt hóa STAT3, LIF cũng cảm ứng các tín hiệu khác như làm hoạt hóa ERK (extracellular receptor kinase) Khi ERK hoạt hóa sẽ kích thích sự biệt hóa, do đó sự cân bằng giữ trạng thái hoạt hóa STAT3 và ERK sẽ quyết định số phận của tế bào: hoặc phân chia bình thường, hoặc biệt hóa Rõ ràng, các tín hiệu kiểm soát sự hoạt hóa ERK có vai trò quan trọng nhằm duy trì trạng thái không biệt hóa Sự

ức chế PI3K (phosphoinositide-3 kinase) đã dẫn đến sự biệt hóa của tế bào mES Con

đường tín hiệu PI3K cũng được cảm ứng bởi LIF và sự biệt hóa như là kết quả của sự gia tăng các ERK hoạt hóa

Ngoài vai trò duy trì tế bào mES khỏi trạng thái không biệt hóa, LIF cũng cần thiết cho sự phát triển của hệ thần kinh trung ương (CNS - central nervous system),

đặc biệt là sự sống sót của các tế bào thần kinh chuyên biệt (như các tế bào thần kinh

vận động, các tế bào thần kinh đệm ít nhánh và sự biệt hóa thành tế bào thần kinh hình

Sao)

2.3.5.2 Các yếu tố bên trong

Ngoài các nhân tố bên ngoài, các nhân tố nội sinh cũng liên quan đến sự tự làm mới của các NSC Các tế bào gốc ở nhiều mô khác nhau (như HSC và NSC) có chung một vài cơ chế tự 1am mdi, chang hạn như các NSC, các tế bào gốc biểu gia tăng tự làm mới của tế bào gốc, duy trì trạng thái không biệt hóa Bằng cách phân tích các tín hiệu biểu hiện tăng, liên quan đến sự điều hòa biểu hiện Musashi1, người ta hy vọng sẽ làm sáng tỏ cơ chế sự tự làm mới của các tế bào gốc này

Ngoài ra, nhân tố ức chế phiên mã nhóm polycomb #zi/ cần thiết cho sự duy trì các tế bào gốc sau khi sinh, cũng như sự tự làm mới của các NSC và tế bào gốc mào thần kinh (neural erest stem cell - NCSC) Đó có thể là cơ chế chung điều hòa sự tự làm mới và duy trì kiểu tế bào gốc Hơn nữa, các phân tích tạo dòng chỉ tiết cho thấy, Bmil cần cho sự tự làm mới của NSC, NCSC và không cần cho sự tăng sinh của tế

bào tiền thân thần kinh từ dạ dày, ruột và não trước Bmil có thể tồn tại độc lập với

các cơ chế làm mới và tăng sinh của tế bào thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và

hệ thần kinh ngoại vi

2.3.6 Marker tế bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh trưởng thành

2.3.6.1 Các marker tế bào gốc thần kinh

2.3.6.1.1 Nestin

Nestin là một dạng sợi trung gian với domain xoắn alpha, hiện diện trong khung xương của tế bào Nestin biểu hiện trong các tế bào gốc hay tiền thân của hệ thần kinh trung ương, khi các tế bào thần kinh đã biệt hóa dần, gene này được điều hòa giảm và

có thể được thay thế bởi các protein khác Dường như tất cả các tế bào gốc thần kinh

tăng sinh sẽ biểu hiện nestin Trong điều kién in vitro va in vivo có thể sử đụng kháng

thé đơn dòng và đa dòng dé đánh đấu nestin rất hiệu quả

Hình 2.4 Neurosphere biểu hiện nestin khi nhuộm với kháng thể kháng

nestin được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 va FITC

khi quan sát dưới kính hién vi huỳnh quang đảo ngược (Nguồn: hup-/vww.uni-kiel.de

13/12/2012)

2.3.6.1.2 Sox1 and Sox2 9SRY-related HMG-box gene

Yếu tố Sox1 và Sox2 có domain gắn vào DNA gọi là HMG box (High mobility

group box) Chúng gắn vào DNA thông qua các gốc lớn của DNA một cách chuyên biệt nRNA của Sox1 và Sox2 biểu hiện trong các tế bào ở giai đoạn sớm nhất của quá trình hình thành thần kinh Ngoài ra, hai protein này là các marker quan trọng được sử

dụng chuyên biệt để phân loại các tế bào tiền thân thần kinh

2.3.6.1.3 CD133

CDI33 là một marker khá pho bién trong việc nhận diện các tế bào gốc từ nhiều loại mô khác nhau trong cơ thể, bao gồm cả các tế bào cơ và tế bào tạo máu Sự biểu hiện của CD133 cũng đã được chứng minh trên các tế bào gốc thần kinh có nguồn gốc

từ phôi thai cũng như các tế bào biểu mô thần kinh Ngoài ra, các tế bào ung thư như nguyên u bào võng mạc, tế bào bạch cầu và u bào não cũng biểu hiện CD133, vi vay

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

mà nó được sử dụng để nhận diện nhiều quần thể tế bào sốc khác nhau (CosKun et al.,

2007)

2.3.6.2 Marker tế bào thần kinh trưởng thành

2.3.6.2.1 Tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte)

2.3.6.2.1.1 A2B5

Kháng nguyên A2B5 là một loại ganglioside epitope được biểu hiện trong các tế bào biểu mô tuyến ức, tế bào tiền thân oligodendrocyte và các tế bào thần kinh nội sinh Ngoài ra, A2B5 cũng được biểu hiện trội trong các mô ở phôi và động vật sơ sinh, tuy nhiên chúng cũng được tìm thấy ở vùng SVZ trong não trưởng thành, vì vậy kháng nguyên này được sử dụng như marker để phát hiện các tế bào oligodendrocyte

2.3.6.2.1.2 O4

Tương tự như A2B5, O4 là một loại kháng nguyên bề mặt được biểu hiện ở các

tế bào tiền thân oligodendrocyte Day là loại marker chuyên biệt đầu tiên được sử dụng trong việc nhận diện cdc dong tế bào oligodendrocyte của hệ thần kinh trung ương Ngoài ra, GalC (galactosylceramidase) và MBP (myelin basic protein) là hai loại marker cũng được sử dụng để nhận diện pre-myelinating oligodendroctye và myelinating oligodendrocyte

2.3.6.2.2 Té bao hinh sao (astrocyte)

2.3.6.2.2.1 GFAP (glial fibrillary acidic protein)

GFAP là một loại sợi trung gian được biểu hiện trong nhiều loại tế bào của hệ thần kinh trung ương, bao gồm cả astrocyte và các tế bào biểu mô thần kinh Protein này có vai trò trong việc duy trì cấu trúc, hình dạng và chức năng của khung xương astrocyte Ngoài ra, GFAP còn liên quan đến quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào cũng như việc thực hiện chức năng của hàng rào máu-não GFAP được chứng minh là

có vai trò quan trọng trong quá trình nguyên phân của tế bào bằng cách điều hòa hệ vi sợi của tế bào, vì vậy mà hàm lượng GFAP đã được phosphoryl hóa tăng lên đáng kể khi các tế bào trải qua giai đoạn phân chia

2.3.6.3.2.2 A2B5

Ngoai cdc té bao oligodendrocyte, sự hiện diện của kháng thể A2B5 còn được ghi nhận trên các tế bào astrocyte Tuy nhiên, chỉ có các tế bào astrocyte kiểu 2 mới biểu

hiện A2B5, trong khi astrocyte kiểu một lại không có loại kháng thể này trên bề mặt tế bào

Hình 2.5 Các tế bào astrocyte biểu hiện GEAP khi nhuộm với kháng thế

kháng GFAP được đánh dấu bởi thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và rhodamine khi quan sát dưới kính hiến vi huỳnh quang đảo ngược

(Nguon: http:/a.abcam.com, 13/12/2012)

2.3.6.2.3 Neuron

2.3.6.2.3.1 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule) PSA-NCAM là một loại glycoprotein được biểu hiện trội ở não đang phát triển, đóng vai trò quan trọng trong sự liên kết giữa các tế bào, sự phát triển của sợi trục, duy trì tính linh hoạt của các synapse Vì vậy, PSA-NCAM được sử dụng như marker để nhận biết sự phát triển và đi cư của các neuron cũng như quá trình hình thành synapse

ở não động vật có xương sống

2.3.6.2.3.2 MAP-2 (microtubule-associated protein 2)

MAP-2 là một loại protein hiện diện trong bộ khung xương của neuron, giúp duy trì hình dạng và rất cần thiết cho sự phát triển của các neuron Protein này giúp 6n định

hệ thống các vi sợi của tế bào bằng cách tạo liên kết giữa các vi sợi và sợi trung gian

Trong neuron, MAP-2 tồn tại ở 3 dạng đồng phân: MAP-2a, MAP-2b, MAP-2c và tất

cả các dạng protein này đều do cùng một gene mã hóa

2.3.7 Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh

Trong nuôi cấy tế bào gốc thần kinh, việc sử dụng môi trường DMEM/FI2 sẽ hiệu quả hơn so với khi sử dụng DMEM Môi trường căn bản DMEM/F12 được phát

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

triển ở nồng độ tối ưu các thành phần còn thiếu trong môi trường DMEM, bao gồm: alanine, asparagine, cysteine, glutamate, proline va B12 Do té bào gốc thần kinh cần một nồng độ đường cao dé phat triển nên cần bổ sung thêm một số hóa chất cho quá trình chuyển hóa như putrescin, progesterone, transferring, insulin, muối selenium và

được gọi chung là yếu tố bỗổ sung N2 Môi trường DMEM/FI12 két hop FGF, EGF,

B27 và N2 có tác dụng lên sự phát triển và tăng sinh của các tế bào thần kinh sau khi

nguyên phân Tuy nhiên, sự kết hợp B27 với DMEM/FI2 còn tồn tại nhiều vấn đề như

làm giảm đáng kể dưỡng chất từ môi trường để cung cấp cho tế bào gốc thần kinh và sinh ra nhóm chất gây tổn thương thần kinh (excytotoxin) trong môi trường Excytotoxin là các amino acid phản ứng với các thụ thể chuyên biệt trong não gây kích thích quá mức dẫn truyền thần kinh trong não, dẫn đến sự chết của các tế bào thần kinh

2.3.7.1 Phương pháp nuôi cấy lớp đơn

Trong phương pháp nuôi cấy lớp đơn, poly-L-lysine hoặc poly-L-lysine kết hợp laminin, fibronectin hoặc polyornithine được sử dụng như các co chat dé phủ lên dụng

cụ nuôi cấy Đây là phương pháp nhằm tạo ra điều kiện vi môi trường tương tự như trong não đề chúng có thê sóng và phát triển và các protein dùng bao phủ đĩa nuôi cấy thường là các protein chuyên biệt cho sự bám dính của các tế bào tại vi môi trường não Khi bám dính vào dụng cụ nuôi cấy, sự hiện diện của các mitogen (EGF, FGF) sẽ làm cho các NSC duy trì trạng thái tăng sinh mà không biệt hóa Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì hạn chế của phương pháp này là khó giữ cho tế bào không biệt hóa khi nuôi cấy trong thời gian dài

2.3.7.2 Nuôi cấy neurosphere

Để có thể phân lập và tăng sinh các tế bào NSC, Reynolds và Weiss (1992) đã

phát triển kỹ thuật neurosphere Neurosphere là có cấu trúc khối cầu bao gồm nhiều tế bào và ở trạng thái lơ lửng, xuất phát từ một tế bào NSC đơn (Reynolds và Rietze, 2005) Khi nuôi cấy tế bào bằng phương pháp này thì các tế bào sẽ không bám vào dụng cụ nuôi nhằm tránh sự biệt hóa của các tế bào NSC Khi chuyển các neurosphere sang môi trường có huyết thanh và loại bỏ các mitogen thì chúng nhanh chóng biệt hóa thành các loại tế bào thần kinh Các neurosphere này nếu được nuôi cấy trong thời gian dài thì chúng sẽ to dần lên, chạm đến bề mặt bình nuôi cấy và sẽ bám vào bình,

khi đó các tế bào ở lớp ngoài của neurosphere sẽ bắt đầu biệt hóa Kỹ thuật này cho phép hình thành các neurosphere thứ cấp từ sự phân tách của các neurosphere ban đầu, kiểm tra và đánh giá khả năng tự làm mới lâu đài và biệt hóa của các tế bào thành ba dạng tế bào thần kinh chủ yếu (Gritti et al., 1995, 1996; Marshall et al., 2007; Reynolds va Weiss, 1996; Reynolds et al., 1992) Nhung đối với các nhóm tế bào khác nhau, điều kiện nuôi cấy cũng phải khác nhau, do đó kỹ thuật này đòi hỏi phải có sự đồng nhất về điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy (Chaichana et al., 2006) Ngoài ra, các nhóm tê bào khác nhau sẽ có các marker kiêu hình khác nhau

(a) (b)

Hình 2.6 Neurosphere (a) Neurosphere 6 trang thai lo lirng va c6 dang tròn

đều, rắn chắc (b) Neurosphere có các tế bào ở lớp ngoài cùng đã bắt đầu biệt hóa (Nguôn: htup:/jcssdb.jp, 21/12/2012 và htIp:/awww.nrc-cnrc.ge.ca,, 21/12/2012)

2.3.8 Các phương pháp đánh giá sự tăng sinh NSC in vitro

Để biết được tế bào có tăng sinh trong diều kiện nuôi cay in vitro hay khong,

nhiều phương pháp được sử dụng để xác định số lượng tế bào qua từng thời kì nuôi

cấy Trong đa số phương pháp, các tế bào cần được tách thành tế bào đơn đề có kết quả chính xác

2.3.8.1 Đếm tế bào bằng máy đếm tự động

Để tránh các sai số do thao tác của người thực hiện, các máy đếm tế bào tự động

đã được chế tạo Mẫu chứa tế bào được cho vào dung dịch nạp mẫu, sau đó đặt vào buồng đếm của máy Trong buồng đếm, dung dịch điện phân yếu chứa tế bào được cho

đi qua một lỗ nhỏ Một dòng điện sẽ chạy qua lỗ và các điện cực đặt ở hai phía lỗ sẽ đo

điện trở của dòng điện Do tế bào không có tính dẫn điện hoặc dẫn điện yếu hơn dung

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

dịch điện phân nên khi tế bào đi qua lỗ thì điện trở lại tăng lên (hoặc độ dẫn điện giảm)

va té bao duoc đếm và hiển thị trên máy

2.3.8.2 Đo kích thước neurosphere

Đây là phương pháp xác định số lượng tế bào chỉ áp dụng cho các tế bào được nuôi cấy bằng phương pháp neurosphere Với một khối neurosphere hình cầu, số lượng tế bào có trong neurosphere tỉ lệ với thể tích sphere Bằng cách xác định kích

thước đường kính của sphere dưới kính hiển vi có thể tính được số lượng tế bào trong sphere thông qua kích thước của nó Kích thước của neurosphere ảnh hưởng quan

trọng đến khá năng sống của tế bào và sự chuyển hóa của NSC như vận chuyển chất

dinh dưỡng từ từ giảm dần cùng với sự gia tăng kích thước của sphere, do đó có thé

dẫn tới việc hình thành các tế bào chết bên trong neurosphere Kích thước của sphere

là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của tế bào bên trong sphere

Theo một nghiên cứu của Schumacher (2003), số lượng tế bào có thể được tính từ kích thước tương ứng của đường kính neurosphere bằng công thức (1), trong đó R là bán kính neurosphere và r(C1) và r(C2) là hai bán kính của tế bào và r(C2) > r(CT)

, #x.(R@œ))”

Số lượng tế bào — = 2 (RS)

3

eee) ạ0

2.3.9 Các phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là NSC

2.3.9.1 Phân tích tính gốc thông qua sự tạo tập đoàn

Phương pháp này được xem như tiêu chuẩn để xác định tính gốc của tế bào gốc nói chung và tế bào gốc thần kinh nói riêng Phương pháp này dựa trên khả năng phát triển thành tập đoàn của các tế bào gốc, trong khi đó các tế bào đã biệt hóa lại không

có khả năng này Một nhóm tế bào trong đó bao gồm cả tế bào gốc thần kinh sẽ được

nuôi trong môi trường lỏng không huyết thanh cé bé sung EGF, FGF-2, B27, N2,

insulin, transferring, serin và progesteron Trong môi trường chọn lọc này, chỉ có các

tế bào gốc thần kinh mới phát triển tốt và hình thành các khối tế bào từ các tế bào đơn

gọi là neurosphere, trong khi đó các tế bào không phải là tế bào gốc thần kinh sẽ chết

đi Trong điều kiện nuôi cấy và khoảng thời gian nhất định, một tế bào đơn sẽ hình thành một tập đoàn, tập đoàn có kích thước càng lớn thì tính gốc ban đầu của nó càng cao, do vậy có thé tach té bao gốc ra khỏi quân thé ban dau

Các tế bào gốc thần kinh được thu nhận từ các neurosphere khi được nuôi trên môi trường DMEM/F12 có bổ sung B27, N2, heparin, insulin, FBS 10% (Fetal bonvine serum) và loại bỏ các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF trong bình Roux có tráng poly-L-lysine thì chúng sẽ bám và biệt hóa thành tat ca các loại tế bào của hệ thần kinh như neuron, tế bào hình sao (astrocyte) và tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte)

2.3.9.2 Kha nang biét hóa thành các loại tế bào thần kinh

Các tế bào gốc thần kinh được thu nhận từ các neurosphere khi được nuôi trên môi trường DMEM/FI2 có bổ sung B27, N2, heparin, insulin, FBS 10% (Fetal bonvine serum) và loại bỏ các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF trong bình Roux có tráng

poly-L-lysine thì chúng sẽ bám và biệt hóa thành tất cả các loại tế bào của hệ thần kinh

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học