Chiết xuất polyphenol từ vỏ cam dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Trong tài liệu này, chúng tôi muốn trình bài một phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ sóng siêu âm UAE các polyphenols flavanone glycosides từ vỏ cam, một nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền

2.3.8 Hàm lượng phenolic toàn phần (TPC) - 2-22 22222 s££Et2EEeEEEevxerrxcrrr 21 2.3.9 Xác định hiệu suất ©ts E1 111122112111 1111112112111 11111111 22 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN . -2< e2 seCSeE+se€E+eeErseeEvaevrseerraecrsserrsee 22 3.1 Ảnh hưởng của kích thước hạt 2-22 5£©®+S££ x£+E++EE++ExE+E+ezxeersrrrerrxee 22 3.2 _ Thiết kế thử nghiệm Box-Wilson 2-¿++++2+++2E+t22E12732221122712 212cc 23

Trang 1 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

3.3 _ Điều kiện tối ưu - 2< St k9 E12E112112711211111 11111111211 11E 1111011 1e ke 24 3.4 _ So sánh giữa UAE và SE -.- Tnhh TH HT Hàng HH re 25

Tài liệu tham khảo chínhh 5 5-5 << =<=<s< 5s S4 S54 EsEs E4 SESEsESEEeEeeenesrsesrsrse 28

Trang 2 của 28

tân/ha so với 10.5 tắn/ha [2]

Trái cây và dịch ép trong chỉ Citrus cũng là nguồn tài nguyên quan trọng chứa các hợp chất

tự nhiên chống oxi hóa như acid ascorbic, flavonoids, hợp chất phenolic và pectin Flavanon, flavon and flavonol là ba loại flavonoid chinh trong chi Citrus và cụ thể hơn là các thành phần như: hesperidine, narirutin, naringin and eriocitrin Chúng ngày càng được quan tâm và chú ý nhiều hơn không chỉ liên quan đến khả năng chống oxy hóa của chúng mà còn là khả năng chống tác nhân gây ung thư và viêm nhiễm nhờ khả năng chống peoxyd hóa chất béo [1]

Trong tài liệu này, chúng tôi muốn trình bài một phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) các polyphenols (flavanone glycosides) từ vỏ cam, một nguyên liệu đơn giản

và rẻ tiền, dễ tìm ở Việt Nam Phương pháp này hứa hẹn nhiều tiềm năng ở quy mô công nghiệp trong lĩnh vực chiết xuất các hoạt chất tự nhiêncó khả năng chống oxi hóa thay thé cho các chất chống oxi hóa tổng hợp từ phòng thí nghiệm

Trang 3 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

kỹ thuật định vị, 20 - 40 KHz sử dụng đề tây sạch (nha, kim hoàn)

Medical ard Destructive

Lowbass notes Animalsand Chemistry] Diagnostic and NDE

Siêu âm làm dung môi (tại các hốc ở bề mặt tiếp xúc) bị sui bot, day tạp chất ra khỏi

bề mặt mẫu Bản chất sóng siêu âm khác với sóng điện từ

1.1.2 Nguyên tắc, cơ chế hoạt động của siêu âm

Khi xuyên qua cơ thể, chỉ một lượng rất nhỏ của sóng siêu âm bị các mô hắp thụ và chuyển thành nhiệt năng Sự tỏa nhiệt này không kéo dài, không làm tăng bề mặt nhiệt độ tại chỗ

Phần lớn năng lượng của sóng siêu âm chuyên thành cơ năng (làm rung) Sự rung kéo dai sẽ làm vỡ các bọt khí tại chỗ, gây tổn thương tại chỗ, đôi khi nghiêm trọng

Dưới tác dụng của siêu âm: dung môi tại các hốc nhỏ/dược liệu bị sủi bọt, đây chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi (chiết xuất)

1.1.3 Ưu điểm:

- Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền

- Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng

-Lượng mẫu: có thể lên đến hàng trăm gam

- Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng đề chiết cho các hoạt chất không bền với nhiệt

Trang 4 của 28

- Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó

là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly

- Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dai, vi vay sẽ tốn nhiều dung môi, làm mắt một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bản

- Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết

1.1.5 Phạm vi ứng dụng của siêu âm

Phạm vi ứng dụng của siêu âm là khá rộng

e_ Chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ nhiều dược liệu khác nhau đặt biệt là những chat dùng cho thực phâm

e Làm sạch bề mặt

Trang 5 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

Tiến trình nghiền mịn Al(OH); dưới kính hiển vi

Các bọt khí (nếu có) trong dung môi (HPLC) cũng bị phá vỡ (ứng dụng để chuẩn bị dung môi cho HPLC)

1.2 Tổng quan thành phần về hóa học của Cam

1.2.1 Sơ lược về cây cam:

Tên khoa học: Citrus sinensis (L) Osbeck Họ Rutaceae

Cây nhỡ, cao đến khoảng 10 m, ít hoặc không có gai Lá

thường xanh dài khoảng 4-10 cm, mọc so le, cuống lá có

cánh nhỏ Hoa màu trắng, mọc thành chùm từ 6-8 hoa ở

kẽ lá Quả hình cầu, khi chín có màu vàng da cam Loài

cam là một cây lai được trồng từ xưa, có thể lai giống

gitta loai budi (Citrus maxima) va quit (Citrus reticulata)

Cam bắt nguồn từ Đông Nam Á, có thể từ Ấn Độ, Việt

Nam hay miền nam Trung Quốc

Trên thế giới, cam được trồng ở các nước vùng Địa Trung

Hải, Bắc Phi, Mỹ, Nam Mỹ, Trung Quốc và các nước

Đông Nam Á Bang Florida (Hoa Kỳ) và Brazin là vùng

sản xuất Cam lớn nhất thế giới Lượng sản xuất cam tính

theo tan (trong năm 2004): Brazin 18.256.500, Hoa Kỳ

11.729.900 96% sản lượng được chế biến thành nước

quả, bã còn lại chế biến thức ăn gia súc Vỏ quả được ép lay tinh dau, chế biến pectin và các hợp chất flavonoid

Trang 7 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

Trong thanh phần ăn được của quả có nước (80-90%), protid (1.3%), lipid (0.1-0.3%), đường (12-12.7%), vitamin C (45-61 mg%), acid citric (0.5-2%)

Hoa cam có chứa tỉnh dầu Thành phần chính của tỉnh dầu hoa cam là limonene, linalool, methylanthranilat(0.3%)

Hạt có dầu béo, coumarin, limonin Dầu béo chứa acid palmitic, acid stearic, acid oleic, beta- sitosterol Cac coumarin bao gdm imperatorin, bergapten, aurapten, 7-geranyl oxycoumarin, 6-methoxyaurapten deacetylnimilin, xanthotoxol, aloimperatorin, isopimpinelin, prangenin, prangenin hydrat

Các flavonoid thuộc chỉ Citrus phần lớn thuộc nhóm flavanon:

Hesperidin (7-Rutinosid Hesperitin)

Naringin (Naringenin-7-neohesperidosid)

Eriodictiosid (Eriodictyol-7-rhamnosid)

Eriocitrin (Eriodictyol-7-rutinosid)

Trang 8 của 28

Thành phần của flavonoid trong nước ép cam, quýt 1.2.4 Thành phần hóa học chính trong vỏ quả là Flavonoid

Hoạt chất chính : bao gồm chủ yếu là naringin, hesperidin, narirutin,và neohesperidin

1.2.5 Cấu trúc, tính chất lý hóa của nhóm polyphenol (flavanone) Flavonoid là nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Rau quả thường dùng (hơn 1⁄2)

chứa flavonoid Có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc

Seminar Dugc Liéu III Polyphenol — Vo cam - UAE

Phân loại Flavonoid theo khung genin: gồm 3 loại: Eu-Flavonoid, Iso-Flavonoid, Neo- Flavonoid

Sự phân loại flavonoid phụ thuộc vào :

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

Flavanone không màu vì cấu trúc có ít nhóm —OH, không mùi, vị đắng

Độ tan khác nhau: dạng glycosid dễ tan trong nước và các dung môi phân cực, dạng aglycon tan được trong dung môi hữu cơ, khó tan trong nước Nếu mạch dài thì có thé tan trong nước nóng

Có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, thường phát quang màu vàng

Cực đại hấp thu/UV flavanon : band II 1a 275-295nm va band I 1a 300-330 nm

Phổ UV của Hesperidin

Trang 12 của 28

Phổ UV của Naringin: band II là 282 nm, band I 1a 326

Figure 1 UV-VIS spectra of naringin and complex 1

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

Hesperitin và Naringenin thể hiện các tính chất của flavonoid:

- Tinh chất của nhóm -OH phenol: có tính acid yếu nên có khả năng:

Tạo glycosid với đường hoặc dẫn xuất của đường

Tạo muối: với kiềm loãng tạo ra muối phenolat kém bền và tao sulfat-glycosid (-OH thành —

OSO3K)

Tạo phức với kim loại (AI3+, Fe3+, Mg2+, Pb2+, Zn2+, Zr2+)

- Vong ” -pyron:

+ Tinh kiém yéu

tác dụng với acid tạo muối kém bền

nhóm -OH ở C-5,7,4' làm tăng tính kiềm của vòng C

Trang 14 của 28

Trang 15 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

2 PHẦN THỰC NGHIỆM

2.1 Vị trí - mục đích của nghiên cứu này

Cho đến nay - tháng 2, 2009 - từ các báo cáo công bố, các kỹ thuật chiết xuất phenols từ vỏ cam đã được tiên hành như:

e _ Chiết bằng dung môi hữu cơ (Anagnostopoulou et al., 2006; Jeong et al., 2004; Li et

al., 2006a; Manthey & Grohmann, 1996; Xu, Ye, Chen, & Liu, 2007; Zia-ur-Rehman,

2006)

Chiết bằng nước nóng (Xuet al., 2008)

Chiết bằng kiềm (Bocco et al., 1998: Curto, Tripodo, Leuzzi, Giuffrè, & Vaccarino,

1992)

e_ Chiết xuất dựa trên resin (Calvarano, Postorino, Gionfriddo, Calvarano, & Bovalo, 1996; Kim, Kim, Lee, & Kim, 2007)

© _ Chiết xuất dưới sự hỗ trợ của enzyme (Li et al., 2006b)

e Chiết xuất dựa trên chùm electron va bite xa y (Kim, Lee, Lee, Nam, & Lee, 2008; Oufedjikh, Mahrouz, Amiot, & Lacroix, 2000)

e Và chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Giannuzzo, Boggetti, Nazareno, & Mishima, 2003)

Các kỹ thuật chiết xuất này có thể gặp hạn chế hoặc là làm giảm hoạt tính hay biến tính chất cần chiết do nhiệt độ cao và thời gian chiết kéo dài như khi chiết bằng dung môi, hoặc là các

vân đề về an toàn đôi với sức khỏe trong quá trình chiếu xạ

Đối với kỹ thuật chiết với sự hỗ trợ của enzyme, thì còn gặp hạn chế do vấn đề biến tính của

enzyme

Những năm gần đây, cùng với sự phát triển các quan niệm về "Hóa Học Xanh", người ta càng quan tâm hơn đến các kỹ thuật thân thiện với môi trường thì việc chiết xuất các hoạt chất có hoạt tính sinh học dưới sự hồ trợ của sóng siêu âm (20 -100 kHz) 1a một kỹ thuật tiềm năng trong thời gian tới Kỹ thuật này cho độ lập lại cao, thời gian chiết xuất ngắn, vận hành đơn giản, giảm nhiệt độ, giảm tiêu thụ dung môi chiết, và năng lượng

Các báo cáo dùng kỹ thuật chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE) đối với các phenolic gần đây:

e _ Chiết xuất hesperidin tử vỏ quýt (Penggan - Citrus reticulata) (Ma, Chen, Liu, & Ye, 2008a)

e Chiét xudt phenolic acids và flavanone glycosides từ vỏ quýt Satsuma (Satsuma Mandarin - Citrus unshiu Marc) Ma, Chen, Liu, & Ye, 2009; Ma et al., 2008b) e_ Chiết xuat phenolic toàn phần từ vỏ Quyt (Penggan - Citrus reticulata) (Ma, Chen, Liu, & Ye, 2008a)

Trong các nghiên cứu này, methanol tỏ ra làm một dung môi chiết thích hợp, cho kết quả tốt đối với các phenolic đã dé cập Tuy nhiên, các dung môi hữu không độc cấp thực phẩm (non- toxic food grade solvent) và thân thiện hơn với môi trường như cthanol, n-butanol và iso propanol thì được khuyến cáo bởi FDA cho mục đích chiết xuất (Bartnick, Mohler, & Houlihan, 2006)

Trang 16 của 28

với sự hô trợ của enzyme (2009)

Phenolics- Thời gian chiêt từ 60 min | Hromádková,

Triticum aestivum heteroxylan thuong) xudng con 5 min | Ebringerova

i

So với chiết bing Soxhlet,

Quyt - Penggan " lượng hesperidin thu được

C reticulata Hesperidin gan nhau nhung hesperidin Ma ct al (2008)

ít bị biên tính hơn ở UAE

So với phương pháp ngắm

Quyt > Satsuma acids va kiệ, UAE tang lượng

mandarin flavanone polyphenol thu duge va ca | Ma et al (2008b)

C unshiu Mare glycosides vê hoat tinh chong oxy hóa

ctia dich chiét

TPC tang khi tang thời gian chiêt

C reticulata phan (TPC) irradiation time and Ma et al (2008a)

temperature

Cây chỉ suôt Flavonol Khi scan bang kinh hién vi

Winged bush burning rutin Non va điện tử, UAE ching minh | Yang and Zhang pha mang té bao rat nhanh | (2008) ¬ bps ok

Nghiên cứu này khảo sát tiềm năng của việc ứng dụng UAE đề chiết xuất làm giàu các polyphenols (đặc biệt flavanone glycosides) từ vỏ cam với dung môi câp thực phâm

Trang 17 của 28

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

2.3 Chiết xuất các polyphenol từ vỏ cam với sự hổ trợ sóng siêu âm

2.3.1 Nguyên liệu:

Dùng khoảng 10 kg vỏ cam Thu thập xong chúng được lưu giữ trong tủ đông ở nhiệt độ -20

°C

2.3.2 Hóa chat

Dung môi phân tích (công ty VWR International , Darmstadt, Đức)

Flavanone glycosides (naringin, hesperidin) ( hãng Extrasynthese , Genay, Pháp) Caffeic acid ( hang Sigma-Aldrich, Steinhaus, Dirc)

Trolox (hang Acros Organics Slangerup, Dan Mach)

DPPH (2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl) (hang Alfa Aesar , Karlsruhe, Dirc)

AAPH ((2,20-azobis (2-methyl) propionamidine-dihydrochloride) (hang Sigma- Aldrich, Steinhaus, Đức)

Fluoresceine (hang Acros Organics , Morris Plains, Hoa Ky)

2.3.3 Thiết bị siêu âm:

Sự chiết xuất có hỗ trợ bằng siêu âm (UAE) được thực hiện bằng máy Sonifier PEX 3 (R.E.U.S, Contes, France) bao gồm một bình inox có kích thước 23 x 13.7cm, dung

tích tối đa là 3 lít, và một bộ biến năng, bình được hoạt động với tần số 25 kHz, với cường độ siêu âm đầu vào tối đa là 150 W

Các lớp vỏ che kép của hệ thống làm mát/sưởi ấm đi kèm giúp kiểm soát nhiệt độ trung bình Cường độ siêu âm đầu ra của máy siêu âm là 150W trong khi cường độ siêu âm hao phí trung

bình khoảng 60W, điều này được đo bằng phép đo nhiệt lượng Xem sơ đồ chỉ tiết ở Hình I

Agitation probe

—_

3 13:7em Water out 23em Heating/Cooling Stainless mantel = Stil tank

ah

a

9 a Water in mi b› bp

Seminar Dược Liệu III Polyphenol — Vỏ cam - UAE

2.3.4 Phân tích HPLC

Sử dụng hệ thống HPLC Waters bao gồm:

- 1 bom 600E Waters

- _ 1 bơm mẫu tự động Water 717

- _ Đầu dò màng quang diot Waters 2996

Hệ thống bơm HPLC, bơm mẫu tự động, nhiệt độ cột và hệ thống màng quang diot được theo đõi và kiểm soát béi phan mém Data Chromatography Waters Empower 2

Sử dụng bước sóng 280nm đẻ định lượng flavanones glycosides với đầu đò diot

Các cột được sử dụng:

- _ Cột phân tích: Purospher Star RP— I8e ( 250 x 4mm I.D, 5 um)

- Tién c6t: RP— 18 (4x 4mm LD, 5 ym)

Cả 2 cột được giữ ở nhiệt độ 37oC, tốc độ dòng I mL/phút

Pha động gồm acid acetic 0.5% (A) và acetonitrile 100% (B) Tỉ lệ thể tích của 2 dung môi thay đổi theo thời gian: 10 — 30% (B) trong 20 phút, sau đó tỉ lệ (B) tăng đến 35% ở phút 25

Trang 20 của 28