nghiên cứu mức độ lui bệnh và phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu ở bệnh nhân cml được điều trị bằng imatinib

Sự cải thiện nhanh chóng về kết quả điều trịImatinib từ mức độ khiêm tốn là tình trạng lui bệnh về huyết học đế khả nănghiện thực hóa sự lui bệnh về tế bào di truyền và phân tử đã đem lạ

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHI£N CøU MøC §é LUI BÖNH Vµ PH¸T HIÖN BÖNH TåN D¦ TèI THIÓU ë BÖNH NH¢N L¥ X£ MI KINH DßNG B¹CH CÇU H¹T §¦îC §IÒU TRÞ

B»NG IMATINIB

Chuyên ngành: HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU

Mã số: 60.72.25

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS LÊ XUÂN HẢI

HÀ NỘI - 2013

Trong quá trình học tập để hoàn thành luận văn tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đồng nghiệp cùng các cơ quan

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

TS Lê Xuân Hải, trưởng khoa Miễn dịch, Viện huyết học truyền máu TW,

người thầy đã tận tình dìu dắt, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

GS.TS Nguyễn Anh Trí - Phó trưởng bộ môn Huyết học Truyền máu trường Đại

học Y Hà Nội, Viện trưởng Viện huyết học truyền máu TW, PGS.TS Phạm Quang

Vinh - Trưởng Bộ môn Huyết Học Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội, Trưởng

khoa Huyết học Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai, Phó Viện trưởng Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, những người thầy đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất và dìu dắt tôi trong quá trình học tập và công tác cũng như nghiên cứu khoa học.

Tôi biết ơn PGS.TS Nguyễn Hà Thanh và các thầy, các cô Bộ môn Huyết học

- Truyền máu Trường Đại học Y Hà nội đã tận tình truyền thụ các kiến thức trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

TS Phạm Thu Hằng, ThS Nguyễn Thị Bích Hường, khoa Di truyền và sinh

học phân tử, BSCKII Trần Thị Minh Hương, ThS Lê Quang Tường, khoa Khám

bệnh, Viện huyết học truyền máu TW cùng các anh chị cử nhân, kỹ thuật viên trong các khoa đã giúp tôi trong suốt quá trình thu thập số liệu nghiên cứu.

Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học Trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt hai năm học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bệnh nhân đã cung cấp số liệu quý báu cho đề tài nghiên cứu.

Một phần không nhỏ cho sự thành công của luận văn này là sự động viên, giúp đỡ, quan tâm sâu sắc của các bạn đồng nghiệp, khoa H8, cha mẹ, chồng con, anh chị em và những người thân trong gia đình

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi thực hiện Không saochép số liệu của người khác Các số liệu, kết quả nêu lên trong đề tài hoàntoàn chính xác trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ mộtcông trình nào khác Nếu có gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

CML Chronic myeloid leukemia Lơ xê mi kinh dòng bạch

cầu hạt

TKI Tyrosin Kinase Inhibitor Ức chế men TyrosinKinase

MRD Minimal Residual Disease Bệnh tồn dư tối thiểu

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗiBCR-ABL Breakpoint Cluster Region

AbelsonFISH Fluorescence In Situ

RQ-PCR Real time Quantitative

Polymerase Chain Reaction

DNA Deoxiribo Nucleotid Acid

PDGF Platelet-Derived Growth

Factor

Yếu tố tăng trưởng tiểu cầu

EDTA Ethylene Diamin Tetraacetic

AcidCHR Complete Heamatologic

Respone

Đáp ứng lui bệnh hoàn toàn

về huyết họcCCyR Complete Cytogenetic

Respone

Đáp ứng lui bệnh hoàn toàn

về phân tửCMR Complete Molecular Respone Đáp ứng lui bệnh hoàn toàn

về tế bào di truyềnHLA Human Leukocyte Antigen Kháng nguyên hệ bạch cầu

ngườiELN European Leukemia Net Tổ chức ung thư Châu ÂuNCCN National Comprehensive

Cancer Network

Tổ chức ung thư quốc tế

IS International Standard Chỉ số chuẩn quốc tế

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét lịch sử bệnh CML 3

1.2 Dịch tễ học bệnh CML 3

1.3 Cơ chế bệnh sinh bệnh CML 4

1.3.1 Nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph1) 4

1.3.2 Gen hỗn hợp BCR-ABL [1][9] 5

1.3.3 Sản phẩm mã hoá của gen hỗn hợp BCR-ABL 6

1.4 Biểu hiện lâm sàng và huyết học trong các giai đoạn bệnh của CML 8

1.4.1 Giai đoạn mạn tính của CML 8

1.4.2 Giai đoạn tăng tốc của CML 9

1.4.3 Giai đoạn chuyển cấp của CML 10

1.5 Các phương pháp điều trị bệnh CML 10

1.5.1 Hoá trị liệu trong CML [7][15][16] 10

1.5.2 Ghép tuỷ đồng loại trong CML [17][18] 11

1.5.3 Điều trị CML bằng chất ức chế hoạt tính tyrosine kynase 11

1.6 Các xét nghiệm chẩn đoán và theo dõi điều trị 14

1.6.1 Xét nghiệm di truyền tế bào 14

1.6.2 Xét nghiệm sinh học phân tử [21] 15

1.7 Theo dõi đáp ứng điều trị 20

1.7.1 Các mức độ đáp ứng điều trị 20

1.7.2.Độ nhạy của các loại xét nghiệm 21

1.7.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán kháng thuốc Imatinib [36]: 21

1.8 Khái niệm bệnh tồn dư tối thiểu 24

Chương 2 27

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.1 Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 27

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ 27

2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.4 Vật liệu nghiên cứu 30

2.2.5 Các phương pháp chẩn đoán, qui trình kỹ thuật được tiến hành 32

2.2.6 Các chỉ số nghiên cứu 34

2.2.7 Xử lý số liệu 34

2.2.8 Đạo đức nghiên cứu 34

2.2.8 Sơ đồ nghiên cứu 35

Chương 3 36

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 36

3.1.1 Đặc điểm về giới 36

3.1.2 Đặc điểm về tuổi 36

3.1.3 Phân bố các nhóm tuổi 36

3.2 Đặc điểm các mức độ lui bệnh 37

3.2.1 Đặc điểm lui bệnh về mức độ huyết học 37

3.2.2 Đặc điểm lui bệnh về mức độ di truyền 38

3.2.3 Đặc điểm lui bệnh về mức độ phân tử 42

3.2.4 Tỷ lệ bệnh nhân đạt CMR theo thời gian 42

3.2.5 Các mức độ lui bệnh về mặt phân tử 44

3.5 Thời gian đạt lui bệnh tính đến thời điểm nghiên cứu 44

3.5.1 Thời gian đạt CCyR đến thời điểm nghiên cứu 44

3.5.2 Thời gian đạt CMR đến thời điểm nghiên cứu 45

3.6 Phát hiện tình trạng bệnh tồn dư tối thiểu 46

3.6.1 Tỷ lệ bệnh nhân còn bệnh tồn dư tối thiểu 46

3.6.2 Mức độ bệnh tồn dư tối thiểu 47

Chương 4 49

BÀN LUẬN 49

4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 49

4.1.1 Đặc điểm về giới 49

4.1.2 Đặc điểm về tuổi 49

4.2 Đặc điểm các mức độ lui bệnh 50

4.2.1 Đặc điểm lui bệnh về mức độ huyết học 50

4.2.2 Đặc điểm lui bệnh về mức độ di truyền 51

4.2.3 Đặc điểm lui bệnh về mức độ phân tử 55

4.2.4 Thời gian đạt lui bệnh đến thời điểm nghiên cứu 59

4.3 Phát hiện tình trạng bệnh tồn dư tối thiểu ở bệnh nhân CML điều trị bằng IM 60 KẾT LUẬN 64

PHỤ LỤC

Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 36

Bảng 3.2: Thời gian trung bình đạt lui bệnh hoàn toàn về mặt huyết học 38

Bảng 3.3: Thời gian trung bình đạt lui bệnh hoàn toàn về mặt di truyền 39

Bảng 3.4: Tỷ lệ bệnh nhân đạt CCyR theo thời gian 39

Bảng 3.5: Tỷ lệ các mức độ lui bệnh về tế bào di truyền 40

Bảng 3.6: Thời gian trung bình đạt lui bệnh hoàn toàn về mặt phân tử 42

Bảng 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân đạt CMR theo thời gian đạt được 42

Bảng 3.8: Các mức độ lui bệnh về mặt phân tử 44

Bảng 3.9: Thời gian sống sau đạt CCyR 45

Bảng 3.11: Tỷ lệ trung bình BCR-ABL/ G6PDH 47 Bảng 3.12: Đáp ứng điều trị của 4 bệnh nhân còn bệnh tồn dư tối thiểu.48

Biểu đồ 3.1: Đặc điểm bệnh nhân theo giới 36

Biểu đồ 3.2: Biểu đồ phân bố tuổi 37

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân đạt CHR trong vòng 3 tháng 38

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ bệnh nhân đạt CcyR 38

Biểu đồ 3.5: Bệnh nhân đạt CCyR theo thời gian điều trị 40

Biểu đồ 3.6: Các mức độ lui bệnh về tế bào di truyền 41

Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân đạt lui bệnh hoàn toàn về phân tử 42

Biểu đồ 3.8: Bệnh nhân đạt CMR theo thời gian điều trị 43

Biểu đồ 3.9: Các mức độ lui bệnh về mặt phân tử 44

Biểu đồ 3.10:Tỷ lệ bệnh nhân còn bệnh tồn dư tối thiểu 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ-xê-mi kinh dòng bạch cầu hạt (chronic myeloid leukemia – CML)

là một bệnh lý ác tính hệ tạo máu với đặc điểm chính là tăng sinh dòng bạchcầu hạt với cơ chế bệnh sinh khá điển hình.Trong CML có một biến đổinhiễm sắc thể rất đặc trưng – nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph1) NST Ph1

có mặt trên 95% bệnh nhân CML ở giai đoạn mạn tính Bản chất gen củaNST Ph1 là gen tổ hợp BCR-ABL được tạo thành do sự kết hợp của proto-oncogen ABL chuyển từ NST số 9 gắn vào một phần của gen BCR trênnhánh dài của NST số 22 [1]

Chính nhờ sự hiểu biết khá đầy đủ về cơ chế bệnh sinh làm cơ sở cho rađời và ứng dụng điều trị thuốc nhắm đích ức chế hoạt tính tyrosin kinase (TKI)

mà thuốc đang được dùng tại Việt Nam hiện nay là Imatinib Mesylate (IM) haytên thương mại là Gleevec Sự cải thiện nhanh chóng về kết quả điều trịImatinib từ mức độ khiêm tốn là tình trạng lui bệnh về huyết học đế khả nănghiện thực hóa sự lui bệnh về tế bào di truyền và phân tử đã đem lại cách nhìnmới cho các nhà huyết học, đẩy mạnh sự mong muốn kiểm soát được điều trịmột cách tốt nhất, theo dõi phát hiện được tình trạng bệnh tồn dư tối thiểu(Minimal residual disease-MRD) một cách cụ thể nhất nhằm duy trì mức độ luibệnh về tế bào di truyền và phân tử ổn định lâu dài tiến tới khỏi bệnh [2]

Song song với sự phát triển của các phương pháp điều trị, các mức độlui bệnh đạt được càng cao thì các kỹ thuật phát hiện theo dõi điều trị cũngngày càng tinh vi và đặc hiệu hơn Hiện nay có nhiều kỹ thuật để phát hiệnnhiễm sắc thể Ph1 và tổ hợp gen BCR-ABL như công thức nhiễm sắc thể, laighép huỳnh quang tại chỗ (FISH), PCR định tính, PCR định lượng và đó cũng

là một trong những tiêu chuẩn để đánh giá được các mức độ lui bệnh khác nhau

về mặt tế bào, di truyền, phân tử…Trong đó PCR định lượng (RQ-PCR) đượccoi là phương pháp phát hiện và theo dõi sự lui bệnh về mức độ phân tử và tình

trạng bệnh tồn dư tối thiểu tốt nhất hiện nay do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao(cho phép phát hiện 1 tế bào ác tính trong 106 tế bào bình thường) [3].

Hiện nay đáp ứng điều trị Imatinib vào khoảng 70%, tỷ lệ còn lại làkháng Imatinib do xuất hiện đột biến mới hoặc không dung nạp thuốc [4] Do

đó rất cần thiết phải có các xét nghiệm độ đặc hiệu cao (RQ-PCR) để theo dõiđiều trị và có thái độ xử trí phù hợp với từng bệnh nhân như chuyển thuốc TKIthế hệ 2 hoặc ghép tủy đồng loại sớm để bệnh nhân nhận được điều trị tốt nhất.Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về các thuốc TKI cũng như kếtquả điều trị theo dõi điều trị cũng như kiểm soát bệnh tồn dư tối thiểu trongđiều trị bệnh CML, nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều tài liệu nghiên cứu vềđáp ứng điều trị và phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu ở bệnh nhân CML điều trị

bằng Imatinib Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu mức độ lui bệnh và phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu ở bệnh nhân CML được điều trị bằng Imatinib” nhằm hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu các mức độ lui bệnh của bệnh nhân CML điều trị bằng Imatinib.

2 Phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu của bệnh nhân CML điều trị bằng Imatinib.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Vài nét lịch sử bệnh CML

CML được John Hughes Bennet (Scotland) mô tả lần đầu tiên vàonăm 1845 trên một bệnh nhân có triệu chứng lách rất to và nhiều bạch cầuhạt trong máu Năm 1960, Peter Nowell và David Hunggerford phát hiệnNST Ph1 trên các bệnh nhân CML Năm 1973, Janet Rowley dùng kỹ thuậtnhuộm băng NST xác định cấu trúc NST Ph1 là kết quả của chuyện đoạnnhánh dài từ NST số 9 sang NST số 22 Năm 1983, người ta chứng minhđược rằng chuyển đoạn tạo nên NST Ph1 dẫn đến việc hình thành gen hỗnhợp BCR-ABL và sản phẩm mã hoá của gen này là protein P210 có hoạttính tyrosine kinase cao.[5]

Về phương diện điều trị, có một số mốc quan trọng trong trị liệu CML

Xạ trị liệu với Radium được sử dụng từ năm 1902 Năm 1953, hoá trị liệuBusulfan được áp dụng Năm 1960, Hydroxyurea bắt đầu được dùng trongđiều trị CML Ghép tuỷ xương đồng loại trong CML (1979) đánh dấu mộtmốc mới trong điều trị với khả năng chữa khỏi bệnh Interferon - alpha được

sử dụng trong điều trị CML từ năm 1983 Gần đây nhất, năm 2002 việc đưavào sử dụng thuốc ức chế hoạt tính tyrosin kynase có tên là Imatinib Mesylate(Gleevec) đánh dấu một bước tiến mới trong điều trị CML dựa vào nhữnghiểu biết về cơ chế bệnh sinh của bệnh.[5][6]

1.2 Dịch tễ học bệnh CML

CML chiếm khoảng 2% tổng số các bệnh lơ xê mi với tỷ lệ bệnh nhânmới phát hiện hàng năm khoảng 1 - 1,5/100.000 dân số Nam giới mắc bệnh

nhiều hơn nữ (tỷ lệ nam 1 nữ = 1,4/1) Theo các tác giả nước ngoài, bệnh có

thể gặp ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ mắc bệnh cao ở những người trên 50 tuổi

Tại Việt Nam CML chưa có số liệu chung nào được công bố Theotác giả Nguyễn Hà Thanh, thì CML chiếm khoảng từ 5-6% bệnh máu và cơquan tạo máu, tuổi mắc bệnh nhiều nhất là 30-50 tuổi, tỷ lệ nam/nữ là 2,2/1 [7].Theo Trần Văn Bé, CML chiếm tỷ lệ 5,73% tổng số bệnh về máu và chiếm82,63% các rối loạn tăng sinh tủy, tuổi thường gặp nhất là 31 - 45 tuổi [8]

Ph1 Vị trí các điểm gãy được xác định là băng q34 trên NST 9 và băng q11trên NST 22 Do đó NST Ph1 cổ điển là t(9;22) (q34:q11)

1.3.1.2 Các dạng không điển hình của NST Ph 1 [5].

Ngoài NST Ph1 điển hình như mô tả ở trên (gặp trên 90% bệnh nhânCML), người ta còn tìm thấy một số dạng khác của NST Ph1 (gặp trên khoảng5% bệnh nhân) Tuy nhiên người ta cho đây là kết quả của sự tổ hợp các đứtgãy NST ngẫu nhiên hơn là các đứt gãy tuần tự theo giai đoạn Ba dạng khôngđiển hình thường gặp nhất của NST Ph1 là:

• Chuyển đoạn giữa nhánh dài của NST số 9 với một NST khác vàdường như không có sự tham gia của NST số 22

• Chuyển đoạn phức hợp với sự tham gia của NST số 9, số 22 và mộtNST khác

• Chuyển đoạn phức hợp trong đó NST số 22 nhận thêm các chuyểnđoạn từ NST số 9 và NST khác Trường hợp này gọi là NST Ph1 ẩn

1.3.1.3 Thời điểm đột biến tạo ra NST Ph1

Người ta cho rằng sự tạo thành NST Ph1 diễn ra trong giai đoạn sớmcủa quá trình sinh máu ở một tế bào gốc vạn năng Có hai cơ sở cho giả thiếtnày là: (1) NST Ph1 được tìm thấy trong tế bào máu thuộc tất cả các dòng tếbào chứ không chỉ riêng dòng bạch cầu hạt: (2) Chỉ còn thấy một dạngenzyme G6PD trong các tế bào máu có NST Ph1 dương tính của các bệnhnhân nữ bị bệnh CML (phụ nữ bình thường phải có cả hai dạng của enzymeG6PD là dạng A và B)

1.3.2 Gen hỗn hợp BCR-ABL [1][9].

Trong CML, gen hỗn hợp BCR-ABL được tạo thành do kết quả chuyểnđoạn t(9;22)(q34;q11) - chuyển đoạn tạo nên NST Ph1 Sự hình thành gen hỗnhợp BCR-ABL được coi là khâu quan trọng nhất trong cơ chế bệnh sinh củabệnh CML

Chuyển đoạn t(9;22)(q34,q11) hình thành nên gen hỗn hợp BCR-ABL

do các gen sau đây tham gia:

•Proto-oncogen ABL: Proto-oncogen ABL ở người có cấu trúc tương tựoncogen v-ABL của virus A-MuLV (gây lơ xê mi cấp dòng lympho trênchuột) Gen ABL nằm trên nhánh dài của NST số 9 Hai exon đầu tiên là 1a

và 1b nằm cách exon thứ 2 tương ứng là 18 và 200 kb 9 exon tiếp theo có cấutrúc và trình tự oncogen v- ABL của virus

•Gen BCR: Gen BCR nằm trên nhánh dài của NST số 22 Gen này cóchứa khu vực điểm đứt gãy chính (Major breakpoint cluster region - M- BCR)rất đặc trưng trong chuyển đoạn t(9;22)(q34,q11) gặp trong CML M- BCR có

5 exon Trong CML, điểm chuyển đoạn của gen BCR nằm ở: (l) giữa exon 2

và 3; hoặc (2) giữa exon 3 và 4 của M- BCR

•Proto-oncogen c-sis: Gen c-sis là proto-oncogen ở người có cấu trúctương đồng với oncogen v-sis của Simian Sarcoma Virus Gen c-sis mã hoá

tổng hợp yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (Platelet-DerivedGrowth Factor PDGF).

1.3.2.1 Vai trò của gen BCR-ABL trong cơ chế bệnh sinh của CML[9]

Một số nghiên cứu được tiến hành trên mô hình động vật thực nghiệm

đã chỉ ra mối liên quan trực tiếp giữa NST Ph1, gen hỗn hợp BCR-ABL vàbệnh CML Theo tác giả Kantarjian, khi ghép tế bào tuỷ có bộ NST chứa genBCR-ABL cho chuột, một số chuột thực nghiệm có biểu hiện tương tự CMLsau 2-8 tuần, bao gồm: (1) lách to, (2) các khối u chứa bạch cầu hạt, (3) sốlượng bạch cầu tăng cao [10]

Trong giai đoạn tăng tốc và chuyển cấp, NST Ph1 có thể nhân đôi vàxuất hiện thêm nhiều rối loạn NST khác như có ba NST số 8, ba NST số 19

Người ta đưa ra giả thiết cơ chế đồng hồ sinh học để lý giải cơ chếchuyển cấp trong CML, theo đó đến BCR-ABL đóng vai trò gián tiếp làmtăng khả năng đột biến của quần thể tế bào gốc tạo máu, hậu quả là CML tấtyếu chuyển cấp sau một thời gian nhất định

1.3.3 Sản phẩm mã hoá của gen hỗn hợp BCR-ABL

1.3.3.1 Protein P210 - sản phẩm của gen BCR-ABL [1]

Gen hỗn hợp BCR-ABL mã hoá tổng hợp một protein có trọng lượng

210 kDa (ký hiệu là P210) Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được

protein P210 chính là sản phẩm của gen hỗn hợp BCR-ABL do có khả nănggắn với kháng huyết thanh đặc hiệu tại gốc - NH2 của cả hai protein do genbcr và gen ABL mã hoá tổng hợp dùng làm kháng nguyên mẫu

1.3.3.2 Protein P210 trong cơ chế bệnh sinh của bệnh CML [1]

P210 có hoạt tính tyrosin kinase cao và được tìm thấy trong bào tương

tế bào Ngược lại, sản phẩm mã hoá bình thường của gen ABL là proteinP145 có hoạt tính tyrosine kynase thấp và được tìm thấy trong nhân tế bào

Cơ chế hoạt động của protein P210 là gắn với ATP sang gốc tyrosin ởprotein đích, tức là xúc tác cho phản ứng phosphoryl hoá Đây được coi lànguyên nhân làm rối loạn quá trình truyền tín hiệu biệt hoá và tăng sinh tớicác tế bào tạo máu và qua đó gây CML Hiện nay có hai giả thiết về cơ chếhoạt động của protein P210 gây tăng sinh các tế bào tạo máu trong CML là:(1) ưu thế về sinh sản của tế bào ác tính; (2) bất thường về chức năng chếttheo chương trình (apoptosis) của tế bào ác tính.

Người ta xác định được rằng P210 làm giảm khả năng liên kết của các

tế bào gốc tạo máu với các tế bào đệm của vi môi trường tạo máu dẫn đến bấtthường về quá trình truyền tín hiệu biệt hoá và trưởng thành tới các tế bào gốctạo máu P210 có khả năng tạo được các phức hợp với các protein có vai tròtrong sự liên kết tế bào gốc tạo máu với tế bào đệm của vi môi trường tạo máunhư P210-ABL, Actin

P210 được cho là làm giảm khả năng chết theo chương trình(apoptosis) của tế bào máu, dẫn đến sự tăng sinh bạch cầu trong CML Thựcnghiệm của Dubrez cho thấy khi dùng eptoside gây tổn thương DNA và khởiphát quá trình chết theo chương trình thì dòng tế bào có gen BCR-ABLdương tính và âm tính có các tổn thương DNA tương tự nhau Tuy nhiên quátrình chết theo chương trình bị chậm lại rõ rệt ở các tế bào dương tính về gen

BCR-ABL so với các tế bào âm tính về gen này.

Protein P210 ức chế quá trình chết của tế bào theo chương trình bằngcách trì hoãn chuyển qua giai đoạn G2M của chu kỳ tế bào khi có DNA hưhỏng, Protein 210 có hiệu quả chống sự chết tế bào theo chương trình trongcác tế bào máu lệ thuộc các yếu tố Protein 210 không ngăn được sự chết tếbào theo chương trình ở các tế bào giết tự nhiên Các tế bào giết tự nhiênđược hoạt hóa qua lymphokin chống lại CML hoặc các tế bào bình thường

1.4 Biểu hiện lâm sàng và huyết học trong các giai đoạn bệnh của CML

CML thường được chia làm ba giai đoạn: giai đoạn mạn tính, giai đoạntăng tốc và giai đoạn chuyển lơ xê mi cấp

1.4.1 Giai đoạn mạn tính của CML

 Triệu chứng lâm sàng[8][11].

Phần lớn bệnh khởi phát không rõ ràng, đa số bệnh nhân ở giai đoạnmạn tính các triệu chứng thường thấy như, dễ mệt mỏi, giảm khả năng chịuđựng khi gắng sức, chán ăn, khó chịu vùng bụng Các triệu chứng thường

mơ hồ, không đặc hiệu, tiến triển chậm vào lúc khởi phát từ vài tuần đếnvài tháng

Khám thực thể có thể phát hiện da niêm mạc nhợt và lách to Triệuchứng lách to xuất hiện khoảng ở 50% bệnh nhân lúc chẩn đoán ở các nướcphương tây, nhưng ở Việt Nam tỷ lệ này cao hơn nhiều từ 94 -97% Lách cóthể rất to chiếm gần hết ổ bụng gan có thể to vừa phải nhưng bờ gan thườngmềm Các triệu chứng lâm sàng ít gặp; tăng chuyển hóa, viêm khớp do bệnhgút cấp, cương đau dương vật [8][11][12]

Hiện nay, do tiến bộ của kỹ thuật xét nghiệm và nhu cầu khám bệnhđịnh kỳ, một nhóm bệnh nhân CML chưa có biểu hiện lâm sàng khi phát hiệnbệnh mà chỉ có dấu hiệu cận lâm sàng như số lượng bạch cầu tăng vừa phải,NST Ph1 dương tính trước khi khởi phát bệnh

 Hình ảnh tế bào học của máu ngoại vi [8][11][13]

Trong giai đoạn mạn tính, hình ảnh tế bào học ở máu ngoại vi trongCML rất điển hình và là một dấu hiệu quan trọng để chẩn đoán xác định

Về số lượng các tế bào máu: Số lượng hồng cầu và nồng độhemoglobin giảm, thường là thiếu máu bình sắc, số lượng bạch cầu tăng cao,thường là trên 100 G/l, số lượng tiểu cầu bình thường hoặc tăng (60% bệnh nhân

có số lượng tiểu cầu trên 500 G/l, một số trường hợp có thể trên 1000 G/l)

Về hình thái, công thức bạch cầu điển hình của CML giai đoạn mạntính gặp đủ các tuổi của dòng bạch cầu hạt.

 Hình ảnh tế bào học của tuỷ xương[8][7].

Tuỷ sinh máu trong CML luôn ở tình trạng giàu tế bào Dòng bạch cầuhạt tăng sinh rõ rệt thể hiện bằng tỷ lệ dòng bạch cầu hạt so với dòng hồngcầu (M:E) tăng cao Thông thường trong CML tỷ lệ M:E >10:1 (bình thường

tỷ lệ M:E là 3-4:1) Đây là một dấu hiệu đặc trưng được sử dụng trong chẩnđoán xác định CML và chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác thuộc hộichứng tăng sinh tuỷ ác tính hoặc phản ứng giả lơ xê mi

Trong giai đoạn mạn tính của CML, công thức bạch cầu dòng hạttrong tuỷ có xu hướng chuyển sang trái (tăng tỷ lệ các tế bào từ nguyên tuỷbào đến tuỷ bào) Tỷ lệ bạch cầu ưa bazơ và bạch cầu ưa axit tăng rõ rệttrong tuỷ xương

Tuỷ xương trong CML thường có biểu hiện xơ hoá ở các mức độ khácnhau Xơ hoá tuỷ trong CML là do sự tăng sản xuất collagen type III cấuthành nên các sợi reticulin Hiện tượng xơ hóa và mức độ tăng mẫu tiểu cầu

có xu hướng đi đôi với nhau Người ta cho rằng ở đây có thể có vai trò nhấtđịnh của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (Platelet-DerivedGrowth Factor - PDGF) mà một trong các chức năng chính đã được xác định

là kích thích các tế bào fibroblast sản xuất ra sợi collagen

1.4.2 Giai đoạn tăng tốc của CML

Giai đoạn tăng tốc tương đối khó xác định rõ trong CML về biểu hiệnlâm sàng và đặc điểm tế bào học của máu ngoại vi, tuỷ xương và lách Đây làthời điểm mà bệnh nhân chuẩn bị chuyển cấp nhưng lại chưa có đủ dấu hiệu

để chẩn đoán chuyển cấp thực sự (tỷ lệ tế bào blast thường trên 10% nhưngdưới 20% trong máu ngoại vi và tuỷ xương) Giai đoạn tăng tốc có thể rấtnhanh, gần như không nhận ra được giữa giai mạn tính và giai đoạn chuyển

cấp Giai đoạn tăng tốc cũng có thể kéo dài vài tháng đến 1 năm trước khibệnh nhân chuyển cấp lơ xê mi cấp thực sự.[14]

1.4.3 Giai đoạn chuyển cấp của CML

Trong giai đoạn chuyển cấp, hình ảnh tế bào học máu ngoại vi củaCML tương tự như lơ xê mi cấp nguyên phát

Hình ảnh tế bào tuỷ của CML thường có các biến đổi tương tự nhưLXM cấp nguyên phát với trên 20% tế bào blast, giảm sinh dòng hồng cầu

và mẫu tiểu cầu do lấn át của các tế bào non ác tính

Giai đoạn chuyển cấp trong CML khá rõ ràng về biểu hiện lâm sàngđặc trưng của LXM cấp, bao gồm: thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng, hộichứng thâm nhiễm Tiên lượng của CML chuyển cấp khác với LXM cấpnguyên phát ở chỗ bệnh đáp ứng rất kém với điều trị, thời gian sống thêmngắn (3 tháng đến 1 năm kể cả khi điều trị đa hoá trị liệu tích cực)

1.5 Các phương pháp điều trị bệnh CML

1.5.1 Hoá trị liệu trong CML [7][15][16].

Hoá trị liệu là một phương pháp điều trị giúp đạt tình trạng lui bệnh ổnđịnh về huyết học cho phần lớn bệnh nhân CML giai đoạn mạn tính với giáthành điều trị hợp lý Vì thế, mặc dù ra đời khá lâu, hoá trị liệu vẫn được coi

là phương pháp điều trị bệnh CML chủ yếu ở các nước đang phát triển Tronggiai đoạn chuyển cấp của CML, đa hoá trị liệu vẫn là phương pháp điều trịchủ yếu giúp đạt tới tình trạng lui bệnh cho bệnh nhân Đa hoá trị liệu có thể

sử dụng như một phương pháp điều trị độc lập hoặc phối hợp với ghép tuỷ.Các hóa chất được sử dụng để điều trị CML bao gồm:

1.5.2 Ghép tuỷ đồng loại trong CML [17][18]

Ghép tuỷ đồng loại trong CML giai đoạn mạn tính có thể giúp đạt tỷ lệsống thêm không tái phát trên 5 năm đối với 50-80% bệnh nhân, dài hơn so

với sử dụng phương pháp hoá trị liệu cổ điển hoặc Interferon Alpha Tỷ lệ

tái phát trên các bệnh nhân ghép tuỷ trong giai đoạn mạn tính vào khoảng

Imatinib làm giảm khả năng nhân lên của tế bào gốc dòng bạch cầu hạt,đại thực bào của bệnh nhân CML và ức chế phát triển các tế bào gốc ác tínhtiên phát

Imatinib được Cục quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ (FDA; Food andDrug Administration) chấp thuận sử dụng tháng 05 năm 2001 và hiện tại làphương pháp điều trị khởi đầu chuẩn cho bệnh nhân CML giai đoạn mạn tính

- Liều dùng uống 400 mg/ngày, (viên nang hàm lượng 100mg).

Tác dụng phụ:

Thuốc có các tác dụng phụ: Giảm bạch cầu hạt trung tính, giảm tiểucầu, thiếu máu, nhức đầu, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, khó tiêu, đau bụng, phùquanh hốc mắt, viêm da, co thắt cơ và co thắt cứng cơ, đau khớp, đau xương,

ứ dịch, phù, mệt mỏi, tăng cân.Chán ăn, chóng mặt, di cảm, rối loạn vị giác,

mất ngủ, đỏ bừng mặt, ho, chảy máu cam, đầy hơi, chướng bụng, táo bón, khômiệng, viêm dạ dày, phù mặt, khô da,vã mồ hôi về đêm, tăng men gan và ứcchế tủy có hồi phục

Tác dụng phụ ít gặp: ly giải khối u, phù não và rối loạn thị giác do phùvõng mạc, thiếu máu huyết tán qua trung gian miễn dịch, đau thần kinh ngoạibiên, giảm trí nhớ, run tay chân, đánh trống ngực, xuất huyết não

Phản ứng da khi dùng Imatinib với tỷ lệ khoảng 7-21%, các phản ứng

da hiếm khi phải dừng thuốc vĩnh viễn

Sự kháng thuốc

Đa số bệnh nhân CML đáp ứng tốt với điều trị Imatinib nhưng có một

tỷ lệ nhỏ không đạt đáp ứng tối ưu, hoặc không đạt bất kỳ đáp ứng nào, hoặcmất đáp ứng trong vòng một thời gian sau điều trị Điều này cho thấy có một

sự kháng với điều trị Theo các nghiên cứu tại Châu Âu, tỷ lệ này chiếmkhoảng gần 30% [4] Kháng thuốc thường xảy ra trên bệnh nhân có tiền sửbệnh lâu dài hoặc trên bệnh nhân giai đoạn bệnh tiến triển đáp ứng kém vớiđiều trị ban đầu và đáp ứng thoáng qua với điều trị giai đoạn sau của bệnh.Kháng Imatinib có thể là kháng nguyên phát hoặc kháng thứ phát, hoặc theodạng của sự mất đáp ứng: kháng về huyết học, về tế bào di truyền, về sinh họcphân tử Kháng thuốc nguyên phát là tình trạng không đáp ứng với điều trị ởmọi mức độ hoặc đáp ứng không hoàn toàn Nếu bệnh nhân đáp ứng ban đầuvới điều trị nhưng sau đó mất đáp ứng không có lý do rõ ràng, có thể coikháng thuốc thứ phát hoặc mắc phải

Cơ chế kháng Imatinib bao gồm cơ chế phụ thuộc BCR-ABL và cơ chếđộc lập BCR-ABL Cơ chế phụ thuộc ABL-BCR gồm: khuyếch đại gen BCR-ABL và các đột biến điểm tại vùng mã hóa của kinase BCR/ABL Các cơ chếkháng thuốc độc lập BCR-ABL gồm các tiến trình liên quan đến sự vận

chuyển thuốc trong và ngoài tế bào hoặc sự hoạt hóa các đường truyền tínhiệu khác

 Dasatinib (BMS-354825, Sprycel)

Dasatinib ức chế BCR-ABL kinase với nồng độ trong ống nghiệm IC50

là 3 mol/l, khả năng này hơn Imatinib là 325 lần, và có hiệu quả chống lại tất

cả các đột biến vùng kinase kháng Imatinib ngoại trừ đột biến T315I Khônggiống Imatinib chỉ gắn với dạng không hoạt động của BCR-ABL, Dasatinib

có thể gắn vào cả dạng hoạt động và không hoạt động của BCR-ABL,Dasatinib được chứng minh là có hiệu quả làm giảm sự tăng sinh và thời giansống của các tế bào nhạy cảm và các tế bào kháng với Imatinib

Dasatinib được FDA chấp thuận sử dụng vào tháng 06 năm 2006, chocác bệnh nhân LXMKDH không đáp ứng hoặc không dung nạp với Imatinib

Liều dùng: Liều 100mg/ngày với bệnh nhân giai đoạn mạn tính, 70mg

x 2 lần /ngày cho bệnh nhân giai đoạn tăng tốc hoặc giai đoạn lơ - xê - mi cấp

Dasatinib được dung nạp tốt, phần lớn các tác dụng phụ nặng liên quanđến thuốc được xử trí bằng dùng thuốc hoặc giảm liều Ức chế tủy thường là

lý do để dùng thuốc hoặc giảm liều Các tác dụng khác có thể xảy ra từ mức

độ nhẹ đến mức độ vừa

 Nilotinib (AMN107, Tasigna)

Nilotinib là phân tử được thiết kế một cách hợp lý để đạt được sự cảithiện phù hợp tại vị trí gắn ABL Nilotinib là chất ức chế tyrosine kinase phân

tử nhỏ, hấp thu qua đường uống chọn lọc cao Nó gắn với BCR-ABL mộtcách hiệu quả và nhiều đột biến BCR-ABL kháng với Imatinib Nilotinib cókhả năng mạnh hơn Imatinib 20-50 lần trong việc ức chế BCR-ABL kinase vànhạy hơn Imatinib 3-7 lần trên các dòng tế bào CML FDA chấp thuận cho sửdụng Nilotinib từ tháng 07/2007

Liều dùng : 400mg x 2 lần ngày để điều trị CML giai đoạn mạn có NST

Ph1 dương và giai đoạn tăng tốc ở người lớn đã kháng với Imatinib hoặckhông dung nạp thuốc Imatinib

Nilotinib hiếm gặp tác dụng phụ giữ nước, phù co thắt cơ Giảm tiểucầu và giảm bạch cầu đa nhân trung tính độ 3 và 4 xảy ra trên 29% bệnh nhânCML giai đoạn mạn tính

1.6 Các xét nghiệm chẩn đoán và theo dõi điều trị

Chẩn đoán CML qua huyết tủy đồ và được xác định khi có sự hiện diệncủa NST Ph1 và/hoặc các bản sao BCR-ABL

1.6.1 Xét nghiệm di truyền tế bào

 Công thức nhiễm sắc thể: Sự hiện diện NST Ph1 thường được pháthiện qua xét nghiệm công thức NST trên mẫu tủy hoặc máu ngoại vi vớiphương pháp nhuộm băng, trong đó băng G được sử dụng nhiều nhất Phântích NST có thể phát hiện các bất thường NST đi kèm và các chuyển vị NSTphức tạp Xét nghiệm này được quan sát trên 20 tế bào đang gián phân(metaphase) Bình thường ở tủy xương, các tế bào sinh máu vẫn liên tục tăngsinh và trưởng thành do vậy quá trình phân chia tế bào xảy ra một cách tựnhiên Dựa vào tính chất này có thể làm tiêu bản tế bào nhiễm sắc thể tủyxương trực tiếp bằng cách ức chế phân bào ở giai đoạn kỳ giữa và phá vỡ tếbào hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, sau đó làm tiêu bản và phântích các bất thường NST

 Phương pháp lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH, Fluorescence in situ

hybridization):[2]

Kỹ thuật FISH sử dụng đầu dò là một đoạn DNA đặc hiệu được gắnhuỳnh quang Biến tính DNA cho mẫu bệnh phẩm thành hai chuỗi đơn hìnhthành các đích đến của đầu dò Khi các điều kiện phản ứng quay trở lại bìnhthường (hồi tính) thì sự bổ sung trình tự của đầu dò lên các DNA đích trong

quá trình tái tạo cấu trúc kép của DNA sẽ tạo ra các tín hiệu huỳnh quangtương ứng với từng phần đặc hiệu trên chuỗi kép DNA và được phát hiện trênkính hiển vi huỳnh quang Như vậy, đây là một kỹ thuật phát hiện tổn thương

tế bào di truyền có ứng dụng một số yếu tố công nghệ ở mức độ phân tử Xétnghiệm thường được thực hiện mỗi 3 tháng cho đến khi bệnh nhân đạt luibệnh hoàn toàn về mặt tế bào di truyền

FISH có độ nhạy cao hơn công thức NST Kỹ thuật này cho phép pháthiện gen tổ hợp BCR-ABL trong bộ NST của tế bào, trên cơ sở phân tích 50-

200 tế bào phân bào metaphase hoặc interphase Do không bắt buộc phải có tếbào phân bào metaphase, xét nghiệm có thể được thực hiện nhanh (1-2 ngày),

và linh hoạt (không bắt buộc phải lấy nguồn tế bào từ tủy xương mà có thể sửdụng bệnh phẩm từ máu ngoại vi) Tuy nhiên, FISH không phát hiện được cáctổn thương di truyền khác ngoài NST Ph1 và gen BCR-ABL, trừ khi dự đoánđược và bổ sung các đầu dò tương ứng ngay từ đầu

1.6.2 Xét nghiệm sinh học phân tử [21]

 Một số kỹ thuật PCR cải tiến dùng trong chẩn đoán và điều trị CML

RT - PCR (reverse transcription polymerase chain reaction): kỹ thuật

PCR sử dụng để nhân các đoạn DNA từ mạch khuôn là mARN và ARN Kỹthuật RT - PCR gồm hai giai đoạn: phiên mã ngược từ mạch khuôn ARN tạocDNA và khuếch đại đoạn DNA Trong giai đoạn một sử dụng các enzymephiên mã ngược tạo nên các đoạn cDNA mạch kép, tương ứng với các đoạnkhuôn là mARN hoặc ARN ở giai đoạn hai, thực hiện phản ứng PCR chuẩn

để nhân đoạn cDNA tạo nên số lượng bản sao DNA cần thiết Sản phẩm PCRđược điện di trên thạch và kết quả được quan sát bằng tia cực tím RT -PCRđược dùng để xác định loại bản sao BCR-ABL mà bệnh nhân có các bản saonhư b2a2, b3a2, e1a2, e19a2 Phương pháp này không định lượng số bản saoBCR-ABL mà chỉ phát hiện định tính

Nested PCR: Là kỹ thuật phải tiến hành PCR liên tiếp 2 lần để nhân

bản 1 đoạn gen xác định Phản ứng sử dụng 2 cặp mồi: 1 cặp mồi vòng ngoài

và 1 cặp mồi vòng trong PCR lần 1 dùng cặp mồi vòng ngoài để nhân bảnvùng DNA chứa đoạn DNA đích; sau đó sản phẩm PCR lần 1 được dùng làmkhuôn để thực hiện phản ứng PCR lần 2 với cặp mồi vòng 2 - là cặp mồi đặchiệu cho gen đích

Mục đích của phản ứng Nested PCR là làm tăng độ nhạy và độ đặchiệu Thường được sử dụng trong trường hợp bệnh phẩm có ít bản sao genđích (như phát hiện các tế bào tồn dư sau điều trị ung thư máu)

RQ-PCR (Real time quantitative- Polymerase chain reaction)

• Giới thiệu chung

Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sựphân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gelsau khi phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phépphát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đangdiễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về sốlượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNAsợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primerđặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR) Thiết

bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module pháthiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đạixảy ra Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm đượckhuếch đại trong mỗi chu kỳ

Trong nghiên cứu này kỹ thuật Real time PCR sử dụng các đầu dò laigắn huỳnh quang (Taqman hoặc Light Cycler) bổ sung thêm vào các đoạnmồi đặc hiệu gen BCR-ABL Bình thường, dầu dò không phát huỳnh quang

Trong quá trình thực hiện PCR khi Taq polymerase kéo dài các đoạn mồitrong pha kéo dài chuỗi của PCR, hoạt tính exonuclease của nó cắt đứt liênkết giữa đầu phát sáng và hấp thu, dẫn tới việc chất huỳnh quang được giảiphóng Trong pha tuyến tính của PCR, có sự tương quan giữa lượng sản phẩmđích và lượng huỳnh quang được giải phóng.Trên cơ sở đó, có thể xác địnhchính xác lượng sản phẩm đích, cho phép phát hiện và lượng hóa bệnh tồn dưtối thiểu cũng như mức độ lui bệnh về mặt phân tử.

RQ-PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng

ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạycao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của RQ-PCR có thể là chấtlượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (sốbản copy của DNA) Số liệu của RQ-PCR có thể đánh giá mà không cầnđiện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưavào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và sốliệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễmbẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại đượcloại bỏ

• Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR

Kết quả định lượng của RQ-PCR được biểu hiện bằng đường congkhuếch đại mẫu Trong đó số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tínhiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩmđược khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y Đường cong khuếchđại có 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởimột pha ổn định (plateau phase) Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sảnphẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ Tuy nhiên, khi phản ứngdiễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một hoặc nhiềuthành phần bị hạn chế Ở điểm này phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định

(các chu kỳ 28-40) Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền(background), việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được(các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ Sau đó, sảnphẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện đượctín hiệu huỳnh quang Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳngưỡng (threshold cycle, CT) Do giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khicác tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên RQ-PCR có thể được sử dụng

để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diệntrong phản ứng CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiệndiện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉcần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệuhuỳnh quang ở trên background Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặcsớm Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu

kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trênbackground, vì vậy phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn Các dạng quan

hệ này là cơ sở cho hướng định lượng của RQ-PCR

• Sản phẩm định lượng của RQ-PCR

Trong nghiên cứu này phương pháp RQ- PCR biểu hiện của gen laiBCR-ABL nhằm phát hiện một lượng rất nhỏ tế bào ung thư còn sót lại sauquá trình điều trị thuốc

Đặc trưng của RQ-PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quátrình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đủ sốlượng để làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được kíchthích Chính nhờ đặc trưng này mà người làm thí nghiệm có thể biết được sốlượng bản DNA đích ban đầu có trong phản ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnhquang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống

nhỏ hay lớn Có hai cách định lượng tác nhân đích dựa vào mục đích địnhlượng mà người làm thử nghiệm quan tâm.

*Định lượng tuyệt đối

- Mục đích: Định lượng số copies của tác nhân đích có trong mẫu thửhay bệnh phẩm

- Ví dụ: Định lượng virus viêm gan B, viêm gan C trong mẫu máu bệnhnhân để theo dõi điều trị đặc hiệu

- Cách làm: Thực hiện xét nghiệm RQ-PCR của mẫu thử cùng lúc vớicác mẫu chuẩn đã biết trước số lượng rồi tính ra copies DNA của tác nhânđích có trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn xác định mốiquan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (CT) với số lượng copies DNA đích ban đầu cótrong ống phản ứng Cuối cùng xác định số copies của tác nhân đích dựa vào

hế số pha loãng mẫu và hệ số tách chiết DNA hay RNA của phương phápchuẩn bị mẫu trước khi thực hiện PCR

*Định lượng tương đối: Để định lượng tác nhân đích mà người làm thínghiệm không thể cân đo đong đếm được mẫu thử để có số lượng chính xác

* Định lượng tương đối dựa trên đơn vị khối lượng.

- Áp dụng: Định lượng biểu hiện gen với lượng mẫu thử nghiệm phải đượcxác định chính xác (lượng tế bào, lượng nucleic acid tách chiết từ mẫu…)

- Ví dụ: Định lượng biểu hiện gene P53 trên cấy tế bào có thử chất nghiêncứu X gây ung thư so với cấy tế bào chứng không thử chất nghiên cứu X

* Định lượng tương đối dựa trên gen tham chiếu.

- Áp dụng: Định lượng tác nhân gây bệnh trong các mẫu thử mà không thểxác định chính xác số lượng hay định lượng biểu hiện gen trong các môung thư

- Mức độ biểu hiện gen ung thư được định lượng tương đối dựa trên mức độbiểu hiện của gen tham chiếu của chính bệnh nhân đó

- Gen tham chiếu (house keeping gene): Là gen cần thiết để duy trì hoạtđộng cơ bản của tế bào.Có mức độ biểu hiện ổn định trong điều kiện bìnhthường cũng như bị bệnh.Thường biều hiện với lượng copy lớn: 25copies-hàng nghìn copies/tế bào

- Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cách định lượng tương đối qua tỷ

lệ bản sao BCR-ABL/gen tham chiếu (gen tham chiếu được sử dụng làG6PDH)

1.7 Theo dõi đáp ứng điều trị

- Không còn bạch cầu hạt tuổi trung gian,

- < 5% bạch cầu ưa bazơ, lách không to

• Lui bệnh mức độ tế bào di truyền: (bằng xét nghiệm FISH và/hoặc lậpcông thức NST)

- Lui bệnh hoàn toàn (CCyR: Complete Cytogenetic Respone): Ph1(+) 0%;

- Lui bệnh một phần ( PCyR: Partial Cytogenetic Respone): Ph1(+) 1-35%

- Lui bệnh phần lớn (MCyR: Major Cytogenetic Respone): Ph1(+) 0%-35%;

- Lui bệnh ít (Minor CyR: Minor Cytogenetic Respone): Ph1(+) 36%-65%;

- Lui bệnh tối thiểu (Minimal CyR): Ph1(+) 66%-95%;

- Không lui bệnh (No CCyR): Ph1(+) >95%

• Lui bệnh mức độ phân tử:

* Tiêu chuẩn theo ELN 2009.[24]

- Lui bệnh về mặt phân tử hoàn toàn (CMR): Không xác định được biểuhiện gen lai BCR-ABL bằng kỹ thuật RQ-PCR và/hoặc hai lần xét nghiêmliên tiếp bằng kỹ thuật Nested- PCR

*Tiêu chuẩn theo NCCN 2003 [44]

- Lui bệnh về mặt phân tử hoàn toàn (CMR): Không xác định được biểuhiện gen lai BCR-ABL bằng kỹ thuật RQ-PCR

1.7.2.Độ nhạy của các loại xét nghiệm.

fusion gen

5 10-2 Lui bệnh hoàn toàn ở

mức di truyền tế bào(CCyR)

Nested- PCR BCR-ABL RNA 10-5

RQ-PCR BCR-ABL RNA 10-6 Lui bệnh hoàn toàn ở

mức phân tử (CMR)

1.7.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán kháng thuốc Imatinib [36]:

Kháng IM nguyên phát: Không đạt được lui bệnh về mặt huyết học

trong thời gian 3-6 tháng tính từ lúc bắt đầu điều trị IM hoặc không đạt đượcbất kỳ lui bệnh về di truyền tế bào trong 6 tháng hoặc không lui bệnh phầnlớn về di truyền tế bào trong 12 tháng hoặc không lui bệnh hoàn toàn về ditruyền tế bào trong 18 tháng

Kháng IM thứ phát: bệnh nhân có đáp ứng ban đầu với IM (đạt lui

bệnh hoàn toàn về mặt huyết học trong vòng ba tháng, đạt lui bệnh hoàn toàn

về di truyền tế bào trong 6 tháng, 12 tháng hoặc 18 tháng) nhưng mất đáp ứng

về mặt huyết học hoặc di truyền tế bào sau một thời gian dùng thuốc

1.7.4 Tầm quan trọng của theo dõi đáp ứng điều trị Imatinib [26].

Khoảng một thập kỷ trước, Imatinib thế hệ đầu tiên của các thuốc điềutrị nhắm đích ức chế tyrosin kinase đã ra đời, đánh dấu một phương pháp điềutrị mới hiệu quả cao đối với bệnh nhân CML thời kỳ tăng tốc và mãn tínhnhưng kháng điều trị với Interferon Và hiện nay Imatinib được chỉ định làliệu pháp đầu tay cho hầu hết các bệnh nhân CML và các thuốc thế hệ 2 TKIchỉ thường sử dụng cho những bệnh nhân thất bại điều trị với IM Các nhàlâm sàng nhanh chóng sử dụng IM cho các bệnh nhân CML vì kết quả điều trịtuyệt vời của nó và bệnh nhân hầu như không ảnh hưởng đến chất lượng sống.Tuy nhiên khoảng 30% bệnh nhân CML phải dừng điều trị IM do không dungnạp hoặc đề kháng với thuốc, do đó việc theo dõi sát, thường xuyên các mức

độ đáp ứng điều trị là một việc cực kỳ cần thiết

Theo dõi đáp ứng điều trị thuốc TKI nói chung và IM nói riêng phảidựa vào: (1) phân tích tế bào di truyền từ tủy xương trong vòng 12 đến 18tháng đầu (2) Định lượng thường xuyên đột biến BCR-ABL bằng phươngpháp RQ-PCR (3) Sàng lọc đột biến BCR-ABL kinase domain (KD)

Giá trị dự đoán của đáp ứng về tế bào di truyền:

Việc theo dõi điều trị trong hai năm đầu điều trị TKI rất quan trọng và cần sựcẩn trọng theo dõi sát sao Nghiên cứu IRIS và các nghiên cứu khác về IM chothấy sự mất đáp ứng về lui bệnh phần lớn tế bào di truyền (MCyR); mất đápứng hoàn toàn về mặt huyết học và chuyển sang giai đoạn tăng tốc chuyển cấphoặc chết vì bất cứ nguyên nhân gì thường xảy ra cao nhất trong 2-3 năm đầuđiều trị TKI Theo thống kê mới nhất của IRIS nguy cơ của các hiện tượng trênkhoảng 5,2 % trong ba năm đầu và chỉ khoảng 0,9 % sau ba năm

Tổ chức ung thư Châu Âu (ELN) hướng dẫn, việc theo dõi xét nghiệm

di truyền tế bào và tháng 3,6,12,18 vẫn là tiêu chuẩn xác định chính việc đápứng tối ưu hay thất bại điều trị với IM Thất bại điều trị IM thường được chỉđịnh điều trị các phương pháp điều trị tiếp theo, có thể là tăng liều thuốc hoặcchuyển sang các thuốc TKI mạnh hơn Nghiên cứu 224 bệnh nhân điều trị IM,kết quả bệnh nhân thất bại điều trị hoặc không đáp ứng tối ưu tại thời điểm3,6 và 12 tháng (theo tiêu chuẩn của ELN) cho thấy thất bại điều trị hoặckhông đạt đáp ứng tối ưu tại các thời điểm 3,6,12 tháng liên quan với tiênlượng sống không bệnh 5 năm (PFS) kém

Giá trị dự đoán của đáp ứng lui bệnh phân tử.

Nghiên cứu IRIS ( báo cáo tại hội nghị ASH 2008) được nghiên cứu đatrung tâm tại hai nước Đức và Úc cho thấy thời gian sống không bệnh (EFS)dựa vào đáp ứng phân tử tại thời điểm 6 tháng kém hơn ở những bệnh nhânđạt >10% IS BCR-ABL 5 năm sống không bệnh ở nhóm > 10% IS BCR-ABL là 56%, trong khi đó nhóm đạt 1-10% IS BCR-ABL là 85% Tại thờiđiểm 12 tháng nhóm không đạt được 1% IS BCR- ABL có EFS thấp hơn,64% cho nhóm 1-10% IS BCR- ABL so với 56% cho nhóm >10 IS BCR-ABL Tương tự đạt lui bệnh phần lớn về phân tử tại thời điểm 18 tháng cũng

có tiên lượng rất tốt về thời gian sống không bệnh (EFS), 95% ở nhóm bệnhnhân đạt dưới 0.1% IS BCR- ABL; 86% ở nhóm bệnh nhân đạt 0,1-1% IS và62% ở nhóm bệnh nhân đạt 1-10%IS

Qua các nghiên cứu kết luận rằng việc theo dõi đáp ứng điều trị bằngcác xét nghiệm không những về hình thái học di truyền học mà còn cả nhữngxét nghiệm định lượng RQ-PCR theo dõi trong suốt quá trình điều trị là rấtquan trọng để đánh giá đáp ứng điều trị, nhất là các thời điểm 3,6,12,18 tháng

để tiên lượng trước cho bệnh nhân

Tiêu chuẩn của ELN về thất bại điều trị hoặc không đạt đáp ứng tối ưunhư sau:

< CHR hoặckhông CyR( >95% Ph1)

< PCyR(>35% Ph1)

< CCyR

Thất bại Bất kỳ thời điểm nào: mất đáp ứng CHR, CCyR hoặc

xuất hiện đột biến ABL KD

1.8 Khái niệm bệnh tồn dư tối thiểu.

Bệnh tồn dư tối thiểu (MRD) là tên gọi cho số tế bào ung thư còn lạitrong cơ thể bệnh nhân trong quá trình điều trị hoặc sau điều trị khi bệnh nhân

đã đạt được lui bệnh (không còn dấu hiệu, triệu chứng của bệnh), đó lànguyên nhân chính gây nên tái phát ở bệnh ung thư nói chung và leukemia nóiriêng [22]

Khoảng một thập kỷ trở về trước không có xét nghiệm nào đủ nhạydùng để đánh giá hoặc phát hiện tế bào ung thư để lượng giá tồn dư tối thiểu.Tuy nhiên hiện nay đã có những xét nghiệm sinh học phân tử rất nhạy đểđánh giá MRD trên cơ sở phân tích DNA, RNA hoặc protein, do đó có thểđánh giá được mức độ rất nhỏ của tế bào ung thư trong mẫu xét nghiệm, thậmchí có thể phát hiện 1 tế bào ung thư trong một triệu tế bào bình thường

Trong điều trị ung thư, đặc biệt là leukemia xét nghiệm đánh giá MRDđóng nhiều vai trò quan trọng: Xác định tế bào ung thư đã bị tiêu diệt hay vẫnphải tiếp tục theo dõi, so sánh hiệu quả các phương pháp điều trị khác nhau,theo dõi tình trạng lui bệnh hoặc tái phát của bệnh leukemia hoặc ung thư để

có những điều trị phù hợp với cá thể bệnh riêng lẻ

Những xét nghiệm để đánh giá MRD đều là không đơn giản, thường làmột phần của các nghiên cứu hoặc thử nghiệm và chỉ một số xét nghiệm đượcchấp nhận để sử dụng thường quy trên lâm sàng.

Hầu hết các nghiên cứu về MRD được làm trên bệnh nhân leukemia vàchủ yếu có hai thể bệnh chính là CML ở người lớn và ALL ở trẻ em (thể ungthư phổ biến nhất ở trẻ em) Các kỹ thuật xét nghiệm để đánh giá tồn dư tốithiểu thường dựa trên cơ sở phân tích DNA hoặc RNA hoặc đánh giá cloneđột biến sử dụng kháng thể miễn dịch (IG) hoặc receptor tế bào T (TCR)

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về điều trị CML bằng IM, IRIS làmột nghiên cứu quốc tế, ngẫu nhiên, so sánh hiệu quả của Imatinib và INF kếthợp với Aracytin liều thấp [23] Có 1106 bệnh nhân CML giai đoạn mạn tínhmới chẩn đoán trong vòng 6 tháng, được chia thành 2 nhóm, chọn ngẫu nhiênhoặc điều trị với Imatinib liều 400mg/ngày hoặc điều trị với INF alpha vàAracytin Nghiên cứu ghi nhận sự hơn hẳn của Imatinib so với INF kết hợpvới Aracytin

Sau 12 tháng theo dõi điều trị tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn về tế bào ditruyền là 74% tỷ lệ đáp ứng tốt về tế bào di truyền là 85% trên nhóm điều trịvới Imatinib so với 9% và 22% của nhóm điều trị phối hợp INF và Aracytin

Tỷ lệ giảm 3 log nồng độ bản sao BCR-ABL từ đường cơ bản lúc chẩn đoán

là 57% ở nhóm điều trị Imahnib và 24% ở nhóm INF và Aracytin.[48]

Sau 5 năm tỷ lệ sống toàn bộ là 89% và tỷ lệ này là 95% nếu bỏ qua cáctrường hợp tử vong do bệnh CML Sau 7 năm theo dõi tỷ lệ đáp ứng hoàntoàn về tế bào di truyền là 82%, tỷ lệ đáp ứng tốt về sinh học phân tử lúc 5-6năm là 85-90%

Ngoài ra một số tác giả khác như Gluckman, Hughes T, Kantarjian H,Marin D…[20][24][25] cũng có những nghiên cứu về mối liên quan giữa đápứng điều trị các mức độ huyết học, di truyền tế bào, phân tử và thời gian sống

thêm ở bệnh nhân CML điều trị bằng IM, đặc biệt là xét nghiệm đánh giá sựlui bệnh hoàn toàn về mặt phân tử (CMR) có sự tiên lượng rất tốt về thời giansống thêm của bệnh nhân và xét nghiệm để theo dõi chính là kỹ thuật RQ-PCR Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao nhưng cũng cần có sự chuẩn hóa thốngnhất của các labo khác nhau để đem lại sự đánh giá chính xác cho bệnh nhântheo dõi điều trị [22]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

109 bệnh nhân chẩn đoán xác định là CML giai đoạn mạn tính tại ViệnHuyết học truyền máu TW 2009-2013 tham gia chương trình điều trị Gleevec

2.1.1 Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân chẩn đoán xác định CML giai đoạn mạn tính tại ViệnHuyết học truyền máu TW từ năm 2009 đến năm 2013, tham gia chương trìnhđiều trị Imatinib (Gleevec)

- Tuổi >15 tuổi

- Có bảo hiểm y tế

- Bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ

- Có các bệnh lý khác kèm theo dẫn tới không áp dụng được phác đồđiều trị

- Có tiền sử tâm thần, lạm dụng thuốc/rượu hay các tình trạng có thểlàm ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu

2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá.

2.1.3.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán CML: [23][24]

- Các triệu chứng lâm sàng (lách to, thiếu máu, biểu hiện tắc mạch v.v…)

- Xét nghiệm tế bào máu ngoại vi có số lượng bạch cầu tăng cao và gặp đủcác lứa tuổi của dòng bạch cầu hạt

- Xét nghiệm tuỷ đồ cho thấy có sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt biệt hoá

- Xét nghiệm nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph1) và/hoặc gen tổ hợpBCR-ABL dương tính

2.1.3.2 Mức độ đáp ứng trong điều trị Imatinib đối với CML:

Theo tiêu chuẩn của NCCN và ELN 2009, các mức độ đáp ứng trong điều trị Imatinib đối với CML bao gồm: [23][24]

• Lui bệnh mức độ huyết học: (bằng xét nghiệm tổng phân tích tế bào máungoại vi và huyết đồ);

- Số lượng tiểu cầu (SLTC) < 450x109/l,

- Số lượng bạch cầu (SLBC) < 10x109/l,

- Không còn bạch cầu hạt tuổi trung gian,

- < 5% bạch cầu ưa bazơ, lách không to

• Lui bệnh mức độ tế bào di truyền: (bằng xét nghiệm FISH và/hoặc lậpcông thức NST)

- Lui bệnh hoàn toàn (CCyR): Ph1(+) 0%;

- Lui bệnh một phần ( PCyR): Ph1(+) 1-35%

- Lui bệnh phần lớn (MCyR): Ph1(+) 0%-35%;

- Lui bệnh ít (Minor CyR): Ph1(+) 36%-65%;

- Lui bệnh tối thiểu (Minimal CyR): Ph1(+) 66%-95%;

- Không lui bệnh (No CCyR): Ph1(+) >95%

• Lui bệnh mức độ phân tử:

* Tiêu chuẩn theo ELN 2009.[24]

- Lui bệnh về mặt phân tử hoàn toàn (CMR): Không xác định đượcbiểu hiện gen lai BCR-ABL bằng kỹ thuật RQ-PCR và/hoặc hai lần xétnghiêm liên tiếp bằng kỹ thuật Nested- PCR

*Tiêu chuẩn theo NCCN 2003[44]

- Lui bệnh về mặt phân tử hoàn toàn (CMR): Không xác định đượcbiểu hiện gen lai BCR-ABL bằng kỹ thuật RQ-PCR

2.1.3.3 Bệnh tồn dư tối thiểu:

- Xác định tỷ lệ (số lượng bản dịch mã của gen BCR-ABL /G6PDH)(bằng phương pháp xét nghiệm định lượng: RQ-PCR) [25]

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu hồi cứu mô tả cắt ngang kết hợp tiến cứu

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu

- Lựa chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn

- Bệnh nhân được xét nghiệm tổng phân tích máu ngoại vi, huyết tủy

đồ, công thức nhiễm sắc thể, gen BCR-ABL, các xét nghiệm này được tiếnhành thời điểm lần đầu vào viện và trong suốt quá trình điều trị để theo dõiđáp ứng điều trị

- Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu hai tuần xét nghiệm một lần

- Xét nghiệm huyết tủy đồ và công thức nhiễm sắc thể và/ hoặc FISHmỗi 3 tháng cho đến khi đạt lui bệnh về tế bào di truyền

- Khi xét nghiệm Ph1 và/ hoặc FISH âm tính, tiến hành làm xétnghiệm PCR định tính (Nested-RT-PCR) mỗi ba tháng cho đến khi đạt luibệnh về mặt phân tử

- Khi xét nghiệm PCR định tính âm tính, tiến hành làm xét nghiệmPCR định lượng (RQ-PCR)

- Lập bệnh án nghiên cứu bao gồm đầy đủ các thông tin theo mẫu riêng

- Nhận xét các mức độ đáp ứng điều trị

2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu.

- Thu thập hồ sơ bệnh án để chọn những bệnh nhân đạt lui bệnh vềmức độ tế bào di truyền và phân tử ở mức xét nghiệm PCR định tính (Nested-RT-PCR) âm tính

- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lui bệnh như trên đểlàm xét nghiệm PCR định lượng (RQ-PCR).

- Tiến hành xét nghiệm RQ- PCR xác định tỷ lệ (số lượng bản phiên

- Lấy 2ml dịch tủy hoặc máu ngoại vi cho vào ống chống đông EDTA,tách tế bào bạch cầu, bảo quản mẫu để làm xét nghiệm RQ -PCR phát hiệnđột biến gen BCR-ABL

 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu

- Ống Heparin Sodium (Hãng: Beaton Dickinson, Mỹ)

- Chai nuôi cấy vô trùng ( 25cm2; hãng SPL Hàn Quốc)

- Pipet nhựa vô trùng ( Samco Scientific, Mexico)

- Ống Falcon 15 ml ( Corning, Mỹ)

- Ống Falcon 50ml (Corning, Mỹ)

- Ống tan máu

- Pipet pasteur thủy tinh

- Lam kính Trung Quốc

- Tuýp Eppendorf 1.7ml