nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng

Việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọntốt cho các bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa... Các tế bào biểu mô

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mô giác mạc là một trong những

di chứng thường gặp của tổn thương bề mặt nhãn cầu (BMNC) Ở Việt Nam,một trong những nguyên nhân phổ biến gây tổn thương BMNC là bỏng mắt

do hoá chất hoặc nhiệt Biểu hiện của hội chứng này là mất độ trong của giácmạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giácmạc Hội chứng suy giảm tế bào gốc của giác mạc cũng có thể gây nên hiệntượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát Vìvậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau Để điều trị,các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng

ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạcvùng rìa Mục đích của các phẫu thuật nhằm làm tăng số lượng tế bào gốcbiểu mô giác mạc hoặc cải thiện môi trường vùng rìa củng giác mạc và hỗ trợquá trình tái tạo lớp biểu mô giác mạc Tuy nhiên, phương pháp ghép kết mạcrìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắtlành phải khá lớn Mặt khác, phương pháp này cũng không thể thực hiện được

ở các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt [3,4,5, 25]

Đối với các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương BMNC cả hai mắt,trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép vùng rìa dị thân,ghép kết mạc - rìa dị thân hoặc ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy dị thân.Tuy nhiên, những bệnh nhân này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép

và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao

Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng lànhững biểu mô lát tầng không sừng hoá Những tế bào lớp đáy của cả hai loạibiểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý Vềnguồn gốc phôi thai, hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc là ngoại bì da.Năm 2003, Nakamura và cộng sự đã nuôi cấy thành công tế bào biểu mô niêmmạc miệng và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc Việc sử dụng tấm biểu

mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọntốt cho các bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa Với

phương pháp này, người bệnh không phải dùng thuốc chống thải loại mảnhghép như khi ghép vùng rìa hoặc ghép kết mạc-rìa dị thân

Với mong muốn đưa một phương pháp điều trị tổn thương BMNC mới

vào Việt Nam, trong phạm vi đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng”, chúng tôi tiến

hành một phần nghiên cứu với mục tiêu sau đây:

Xác định ưu nhược điểm của hai phương pháp tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng thỏ: bằng dịch treo và bằng mảnh mô niêm mạc miệng.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu(BMNC)

1.1.1 Sơ lược giải phẫu lớp vỏ ngoài của nhãn cầu

Lớp vỏ ngoài của nhãn cầu hay còn gọi là lớp áo xơ là một màng liênkết xơ khá dày và dai, gồm có hai phần: giác mạc trong suốt chiếm 1/6 phíatrước, củng mạc màu trắng đục chiếm 5/6 phía sau Vùng giáp ranh giữa củngmạc và giác mạc gọi là vùng rìa Vùng rìa củng-giác mạc có vai trò rất quantrọng trong việc tái tạo biểu mô bề mặt nhãn cầu

1.1.2 Định nghĩa bề mặt nhãn cầu

Về mặt giải phẫu, bề mặt nhãn cầu là toàn bộ biểu mô được giới hạnbởi hai đường xám của mi trên và mi dưới Về mặt mô học, biểu mô bề mặtnhãn cầu gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và biểu mô vùng rìa

1.1.3 Biểu mô giác mạc

Biểu mô giác mạc là biểu mô lát tầng không sừng hoá, dày khoảng50m, chiếm khoảng 10% chiều dày giác mạc Biểu mô giác mạc gồm 5-6hàng tế bào, chia thành ba lớp: lớp bề mặt, lớp trung gian và lớp đáy Biểu mônày có khả năng tái tạo rất cao Các tế bào biểu mô ở lớp bề mặt liên tục bong

ra và mất đi trong màng nước mắt và sẽ được thay thế bởi những tế bào mớinhờ sự phân chia của các tế bào gốc cư trú ở vùng rìa củng-giác mạc Biểu môgiác mạc được chứng minh là có sự đổi mới toàn bộ hằng định sau khoảng 7-

10 ngày

Lớp tế bào bề mặt thường gồm hai hàng tế bào đa diện dẹt Các tế bàonày liên kết với nhau rất chặt chẽ nhờ các cấu trúc liên kết: vòng dính, dải bịt,thể liên kết Chính sự liên kết chặt chẽ này đã tạo ra một hàng rào vững chắc

ở biểu mô giác mạc ngăn không cho nước và các chất ở bên ngoài thấm qua

Ở mặt tự do của tế bào có rất nhiều vi nhung mao, các vi nhung mao này cólớp áo glycocalyx Các vi nhung mao làm tăng diện tích bề mặt tế bào biểu

mô tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi chất dinh dưỡng và oxy qua màng

tế bào Hơn nữa, các vi nhung mao cùng với lớp glycocalyx đã góp phần tạo

ra sự ổn định cho lớp phim nước mắt, chống khô giác mạc và hạn chế xâmnhập của các tác nhân bệnh lý

Lớp tế bào trung gian gồm 2-3 hàng tế bào đa diện Đây là lớp chuyểntiếp giữa lớp tế bào đáy và lớp tế bào bề mặt

Tế bào lớp đáy có hình trụ, xếp thành một hàng bám chặt vào màngđáy,dán vào màng Bowman chính thức Tế bào đáy có khả năng gián phân đểtạo ra các tế bào lớp trên của giác mạc

1.1.4 Biểu mô kết mạc

Kết mạc là một bộ phận phụ thuộc nhãn cầu, trải từ vùng rìa củng giác

mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần Kết mạc mi lợp mặt trong của mi mắt, thuộc loại biểu mô trụ tầng không sừng hoá Kết mạc nhãn

cầu lợp mặt trước nhãn cầu (trừ diện giác mạc), thuộc loại biểu mô lát tầng

không sừng hoá Kết mạc cùng đồ tiếp nối kết mạc nhãn cầu với kết mạc mi.

Biểu mô của kết mạc nhãn cầu gồm 6-8 hàng tế bào, các tế bào biểu môkết mạc không đều đặn và có kích thước nhỏ hơn so với các tế bào biểu môgiác mạc Đặc biệt, xen kẽ với các tế bào nằm trên cùng của kết mạc có một

số tế bào hình đài, chiếm khoảng 5-10% số lượng tế bào biểu mô bề mặt nhãncầu Trong bào tương của chúng có nhiều không bào chứa các hạt nhày.Chức năng của chúng là tiết dịch nhày tạo thành phần của lớp phim nước mắt.Bản chất của chất nhày là glycoprotein do đó khi nhuộm P.A.S và quan sáttrên kính hiển vi quang học thấy các tế bào hình đài bắt màu khác so với các

tế bào xung quanh Các tế bào hình đài chỉ có trong kết mạc, không có ở giácmạc Vì vậy về mặt mô học, sự có mặt của các tế bào hình đài ở vùng trungtâm giác mạc là bằng chứng thuyết phục của hiện tượng xâm lấn kết mạcvào giác mạc - hậu quả của suy giảm tế bào gốc vùng rìa củng-giác mạc.Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa với nhiều mạch máu, mạch bạchhuyết và nhiều loại tế bào: lympho bào, dưỡng bào, tương bào và bạch cầu đanhân Những tế bào này có thể đi vào lớp biểu mô

1.1.5 Biểu mô vùng rìa củng-giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc

 Vùng rìa là vùng tiếp nối giữa củng mạc với giác mạc, ở đây có sự

học, mốc xác định của vùng rìa là: tại đây không có màng Bowman và màngDescemet Việc phân định ranh giới giữa vùng rìa và kết mạc là tương đốikhó Nhưng có thể xác định được vị trí tương ứng, đó là nơi gặp nhau giữamống mắt và mô nền giác mạc; hơn nữa, khác với kết mạc, biểu mô vùng rìakhông có tế bào hình đài tiết nhày [1].

Về mặt cấu tạo, vùng rìa củng-giác mạc là một vùng hình nhẫn nằmgiữa củng mạc và giác mạc Vòng nhẫn này rộng hơn ở phía trên (1,5mm) vàphía dưới (1mm), còn ở hai bên thì hẹp, khoảng 0,8mm [4]

Biểu mô vùng rìa củng giác mạc gồm 7-10 hàng tế bào, các tế bào liênkết chặt chẽ với nhau giống như các tế bào của biểu mô giác mạc Bên dướimàng đáy, mô liên kết của vùng rìa tập trung nhiều dây thần kinh và giàu mạchmáu, ngoài ra còn thấy sự có mặt của một số tế bào trung mô

 Tế bào gốc biểu mô giác mạc

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các tế bào gốc của biểu môgiác mạc tập trung ở lớp đáy của biểu mô vùng rìa Để chứng minh được giảthuyết này, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều bằng chứng thuyết phục:

- Trước hết, Keratin 3 (K3) được biết là dấu ấn của các tế bào biểu môgiác mạc biệt hoá ở mức cao K3 biểu lộ ở tất cả các tế bào biểu mô vùngtrung tâm giác mạc, nhưng ở biểu mô vùng rìa K3 chỉ biểu lộ ở các tế bào trênlớp đáy

- Một bằng chứng nữa cho quan niệm tế bào gốc biểu mô giác mạc cưtrú ở vùng rìa là từ những nghiên cứu về nuôi cấy tế bào Thực nghiệm chothấy các tế bào đáy vùng rìa thể hiện đặc điểm tăng sinh của các tế bào gốc.Trong nuôi cấy, các tế bào này có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn nhiều sovới các tế bào biểu mô ở trung tâm giác mạc

Có những nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc vùng rìa để lý giải cho sự tồntại của những tế bào gốc ở đây Với chức năng tái tạo các cơ quan, tế bào gốc

cơ thể trưởng thành có mặt rải rác khắp cơ thể Nhưng chúng chỉ cư trú trongnhững nơi có điểu kiện bảo vệ tốt Năm 1978, Shofield đã nêu một giả thuyết

về “ổ tế bào gốc” để giải thích trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc Theo

cao, trong đó có chứa nhiều yếu tố khác nhau được cho rằng có vai trò trongviệc duy trì trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc như: các cytokine, sựtương tác giữa các tế bào gốc với mô đệm, sự kết dính giữa các tế bào [28]

Thật vậy, vùng rìa giác mạc tập hợp tất cả những điều kiện tối ưu để bảo

vệ các tế bào gốc khỏi các kích thích làm chúng biệt hoá Tại đây, bên cạnh các

tế bào gốc còn có nhiều hắc tố bào, có các tế bào trình diện kháng nguyênLangerhans và những lympho bào T hỗ trợ Chúng được cho rằng có vai tròbảo vệ các tế bào gốc Hắc tố bào có những nhánh bào tương xoè rộng ra xungquanh bao lấy tế bào biểu mô lớp đáy, chúng tổng hợp và vận chuyển sắc tốmelanin vào tế bào biểu mô do đó làm giảm đến mức tối thiểu những tổnthương gây ra bởi bức xạ cực tím Ngoài ra, không như ở giác mạc, màng đáybiểu mô vùng rìa có cửa sổ và lồi lõm do mô đệm có nhú Cấu trúc hình tháinày ở vùng rìa cho thấy các tế bào gốc có sự liên hệ mật thiết với các tế bào ở

mô đệm phía dưới Cấu tạo đặc biệt của màng đáy vùng rìa được xem như làyếu tố quyết định sự phân bố các tế bào gốc trong ổ của nó

1.1.6 Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc

 Nguyên nhân

Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa có thể nguyên phát, liên

quan tới những bệnh lý làm thay đổi vi môi trường của tế bào gốc, ví dụnhư: tật không mống mắt, viêm giác mạc liên quan tới suy nhiều tuyến nội

tiết, chứng đỏ da dày sừng bẩm sinh; hoặc có thể là hậu quả thứ phát của

sự phá huỷ tế bào gốc do các yếu tố bên ngoài như: bỏng hoá chất, bỏngnhiệt, hội chứng Stevens Jonhson, đeo kính áp tròng hoặc do nhiễm khuẩnlan rộng [11, 29, 30, 31]

 Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa

Suy giảm vùng rìa có thể xảy ra lan tràn toàn bộ hoặc chỉ ở một góc củavùng rìa Trong trường hợp suy giảm một phần vùng rìa, sự xâm lấn của biểu

mô kết mạc chỉ ảnh hưởng tới một phần bề mặt giác mạc

Triệu chứng chủ quan của người bệnh: Nhìn mờ, cộm chói, chảy nướcmắt, co quắp mi mắt và có thể có những đợt đau đỏ mắt tái phát

Trong suy giảm tế bào gốc một phần sự xâm nhập tổ chức xơ mạch ởvùng rìa biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau, trong khi biểu mô giác mạc ởtrung tâm vẫn còn bình thường

Trong suy giảm tế bào gốc toàn bộ, mức độ tổn thương phụ thuộc vàonguyên nhân do thứ phát hay nguyên phát Biểu hiện lâm sàng c ó thể chỉ làgiác mạc mờ đục, bề mặt gồ ghề không đều, có tân mạch nông hoặc sâu trong

bề dày giác mạc hoặc kết mạc hóa giác mạc Nặng hơn nữa có thể là ổ loétgiác mạc khó hàn gắn, bờ ổ loét ranh giới rõ và gồ lên, xung quanh ổ loét cóthể tồn tại tổ chức xơ tân mạch, BMNC gồ ghề với biểu hiện của một quátrình viêm mãn tính, nhuyễn giác mạc, giác mạc mỏng hoặc thủng giác mạc

có thể xảy ra trong trường hợp nặng

số trường hợp như thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa toàn bộ cả hai bên mắt thìghép đồng loại hoặc sử dụng nguồn tế bào biểu mô tự thân thay thế là giảipháp phải lựa chọn, mô vùng rìa đồng loại có thể lấy từ giác mạc của tử thihoặc của người hiến tình nguyện Rất nhiều các nghiên cứu về khả năng vàthành công của ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đã được thôngbáo Sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy là một lựa chọn hợp lý

và tỏ ra có nhiều tiến bộ hơn các phương pháp ghép dị thân vì khi ghép dịthân bệnh nhân phải sử dụng thuốc ức chế miễn dịch để chống thải loại mảnhghép, vừa gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn vừa gây ra sự tốnkém về kinh tế cho bệnh nhân, vả lại nếu có sử dụng lâu dài thì cũng khôngthể chắc chắn được sự tồn tại của mảnh ghép trên cơ thể người bệnh Một ưuđiểm nữa của phương pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng đó là niêmmạc miệng được cho là ở giai đoạn biệt hoá thấp hơn so với tế bào sừng ở da,

nó có khả năng phân chia rất nhanh duy trì trong khoảng thời gian dài ở điềukiện nuôi cấy mà không hoá sừng Hơn thế nữa, K3 thể hiện ở cả biểu mô

giác mạc và biểu mô niêm mạc miệng chứ không có ở biểu mô da, chứng tỏ

sự gần gũi hơn của biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc

Sử dụng tấm biểu mô kết mạc để cấy ghép cũng có thể dùng để điều trịtổn thương bề mặt nhãn cầu có thể thay thế kết mạc hoặc giác mạc tổnthương Nicol Scuderi và cộng sự năm 2002 đã nuôi cấy thành công tấm biểu

mô kết mạc và ghép tự thân tấm này trên mắt của 4 bệnh nhân tổn thương kếtmạc, kết quả cho thấy bệnh nhân đã nhanh chóng cải thiện được về mặt thẩm

mỹ, biểu mô tồn tại tốt [24] Mặc dù khi cấy ghép tấm biểu mô niêm mạcmiệng hay biểu mô kết mạc đều có thể xảy ra hình thành tân mạch ngoại vigiác mạc nên có thể mất khả năng nhìn của người bệnh, song nghiên cứu chothấy ở tấm biểu mô niêm mạc miệng, do sự thể hiện FGF2 của tế bào gây ra

và để tránh biến chứng hình thành tân mạch việc sử dụng kháng FGF2 có thểkhắc phục được, mặt khác thủ thuật lấy tấm biểu mô niêm mạc miệng đơngiản hơn nhiều so với lấy tấm biểu mô kết mạc

Như vậy, trong trường hợp không thể sử dụng tấm biểu mô giác mạcnuôi cấy, việc lựa chọn phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng là lựachọn khả quan giúp cải thiện tầm nhìn cho bệnh nhân, bảo vệ phần còn lại củanhãn cầu và giảm các triệu chứng khó chịu gây ra cho người bệnh

1.2 Cấu trúc biểu mô lợp bề mặt khoang miệng

Niêm mạc lợp mặt trong thành miệng gồm mặt trong hai má, mặt dướivòm miệng và 2 mặt lưỡi Niêm mạc miệng gồm hai phần chính: biểu mô bềmặt được hỗ trợ bởi lớp mô liên kết xơ chun và lớp dưới biểu mô

Ở nhiều vùng của miệng, niêm mạc miệng gắn chặt vào cấu trúc mô phíadưới bởi thành phần mô liên kết lỏng lẻo là tầng dưới niêm mạc, trừ ở vùng vòmmiệng lớp đệm của niêm mạc miệng dính chặt vào màng xương Ba lớp này cócấu trúc tương tự như cấu trúc của biểu mô, chân bì và hạ bì của da [18]

Biểu mô niêm mạc miệng là loại biểu mô tầng, nó có thể sừng hoá hoặckhông sừng hoá tuỳ thuộc vào từng vùng của niêm mạc miệng Biểu mô lợpniêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng không sừng hóa giống vớibiểu mô trước giác mạc, các tế bào lớp bề mặt không có hạt keratohyaline, ở

bào khác không thuộc dòng sừng hoá: tế bào sắc tố, tế bào Langerhans, tế bàoMerkel Các tế bào biểu mô liên kết với nhau bởi thể liên kết Ở lớp đáy, các

tế bào liên kết với thành phần lớp đệm nhờ thể bán liên kết và màng đáy,màng này chứa nhiều collagen type IV, laminin và fibronectin

Các xơ trung gian trong tế bào được tìm thấy ở tất cả các loại biểu mô

và là các dấu ấn cơ bản nhất của sự biệt hoá tế bào Thông tin về xơ keratintrong tế bào phản ánh cả kiểu loại và tình trạng biệt hoá của tế bào, vị trí phânlớp của biểu mô Xơ keratin có đường kính từ 6-11nm, là lớp phụ của xơtrung gian đó là những protein dạng sợi dài Trong tế bào biểu mô xơ nàyluôn có cấu trúc cặp, gồm 1 keratin type I (acide) có trọng lượng phân tửkhoảng 50-60 kD và 1 keratin type II (trung tính hoặc base) có trọng lượngphân tử khoảng 50-70kD, những cặp xơ keratin này kết hợp chặt chẽ xoắnnhau để tạo thành chuỗi xuắn Nó hình thành một mạng lưới khắp bào tương,các xơ này gắn kết với thể liên kết và thể bán liên kết, nó neo các tế bào biểu

mô với nhau và với các màng đáy [1]

Như vậy, về mặt cấu trúc mô học niêm mạc má là loại biểu mô giốngvới biểu mô giác mạc, nó còn có chung nguồn gốc, có thể nuôi cấy thànhcông và thay thế được biểu mô giác mạc

1.3 Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng và ứng dụng

1.3.1 Lựa chọn nền nuôi cấy

Để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng, việc đầu tiên là chuẩn bịnền nuôi cấy cho phù hợp và đảm bảo hỗ trợ được cho các tế bào Có rấtnhiều loại nền nuôi cấy khác nhau, có thể là nền tự nhiên như màng ối, nềntổng hợp hoặc phối hợp hai loại trên [18] Về thành phần và cấu trúc thì màng

ối có rất nhiều ưu điểm vượt trội so với các màng sinh học khác bởi tính chungiãn, trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng và khó rách

Việc sử dụng màng ối sử dụng làm chất nền nuôi cấy niêm mạc miệng

và dùng trong tái thiết bề mặt nhãn cầu đã được Nakamura và cộng sự nghiêncứu năm 2003 Khi nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng trên nền màng ốingười, kết quả là tấm biểu mô có rất nhiều thể liên kết và dính chặt vào màng

đáy bằng thể bán liên kết, tế bào thể hiện keratin 3, 4 và 13 [19] Theo nghiêncứu của tác giả Fukuda K và cộng sự (1999), màng đáy của màng ối hoàntoàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen typ IV, V,fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để thay thế kếtmạc Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hoá và sự tăngsinh của các tế bào biểu mô [7] Mặt khác, hiệu quả chống viêm và bảo vệ bềmặt nhãn cầu của màng ối được giải thích qua sự có mặt nhiều loại cytokinchống viêm Màng ối có chức năng của một biểu mô phủ, là biểu mô chế tiết

và có khả năng trao đổi chất qua đường tế bào và gian tế bào Màng ối còn cókhả năng kháng khuẩn nên nguy cơ nhiễm trùng hậu phẫu ít hơn so với ghépcác màng sinh học khác Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễdàng, cùng với tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tácdàn trải trong quá trình phẫu thuật được dễ dàng Màng ối là một nguyên liệusẵn có, dễ lấy, dễ xử lý Màng ối được bảo quản ở nhiệt độ - 80O C có thể đểđược nhiều tháng [6, 12, 20]

Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội,được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao

Trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứngdụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc” chúng tôi đã nghiên cứu và đưa

ra được quy trình xử lý màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc.Công trình đã được nghiệm thu và đánh giá tốt Nghiên cứu này giúp chúng tôi

có một nền thích hợp để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy

Có hai phương pháp chính để nuôi tạo được tấm biểu mô niêm mạcmiệng đó là nuôi cấy bằng mảnh mô và nuôi cấy bằng dịch treo tế bào

 Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô

Trong phương pháp này, màng ối được sử dụng rộng rãi với vai trò vừa

là chất nền vừa là chất mang của các tế bào biểu mô nuôi cấy Tấm biểu môniêm mạc miệng được đặt trực tiếp lên bề mặt màng đáy của màng ối (mặtbiểu mô hướng lên trên) và để nó dính chặt vào đấy Khi đã gắn chặt, màng ối

gồm các chất dinh dưỡng và các tác nhân phân bào kích thích các tế bào gốcniên mạc miệng tăng sinh rồi di cư ra khỏi phạm vi của mảnh mô để bao phủ

bề mặt của tấm màng ối

Có một vài điểm khác nhau trong kỹ thuật nuôi cấy giữa các công bốtrên thế giới Năm 2007, tác giả Madhira và cộng sự khi nghiên cứu trênngười tình nguyện từ 18 tới 60 tuổi không có tiền sử hút thuốc lá và viêmnhiễm khoang miệng, súc miệng bằng Bentadin 3 ngày liền, lấy kích thướcmiếng niêm mạc miệng là 3x3mm sau khi gây tê tại chỗ Vị trí lấy mẫu ởniêm mạc má, dưới kính vi phẫu loại bỏ hoàn toàn lớp dưới biểu mô và mô

mỡ Mẫu niêm mạc miệng sau đó được rửa 3 lần với PBS có chứa kháng sinhpenicillin, streptomicin, gentamicin, amphotericin Mảnh mô được cắt nhỏ vàđặt vào màng ối đã loại bỏ biểu mô, không sử dụng nền tế bào 3T3, sau đóđược nuôi trong môi trường HCE trong đó có chứa MEM và Ham’s F12 với tỉ

lệ 1:2 cùng với các yếu tố khác như EGF, insulin, penicillin, streptomicin,amphotericin, gentamicin, 10% huyết thanh bào thai bê trong vòng 3-4 tuầntrong điều kiện 370C, 5%CO2 Kết quả: Sau 3-4 tuần nuôi cấy, tấm biểu môniêm mạc miệng quan sát bằng kính hiển vi điện tử, thấy giữa các tế bàobiểu mô có liên kết khe và thể liên kết PCR cho kết quả tế bào biểu môniêm mạc miệng nuôi cấy biểu lộ markers của tế bào biệt hoá như CK 3, 4,

13, 15 và connecxin 43, có tế bào thể hiện markers tế bào gốc biểu mô nhưcác đồng dạng của p63, p75 đó là các markers cho tế bào gốc biểu mô niêmmạc miệng [16]

 Phương pháp nuôi cấy bằng dịch treo

Phương pháp này sử dụng enzyme dispase có tác dụng làm tan rãcollagen của màng đáy để tách các tế bào biểu mô ra khỏi mô đệm của chúng

và enzyme trypsin để ly giải những đám tế bào biểu mô niêm mạc miệngthành dạng dịch treo chứa những tế bào riêng rẽ Dịch treo này sẽ được cấylên bề mặt màng ối hoặc đáy của giếng nuôi cấy Thêm môi trường vào giếngnuôi cấy

Ở đây, màng ối đóng vai trò làm chất mang cho các tế bào biểu mô

Nakamura và cộng sự năm 2003, khi nuôi tấm biểu mô niêm mạcmiệng của thỏ đã lấy mảnh mô có kích thước từ 4-6mm2 trong điều kiện gây

mê tĩnh mạch Mảnh mô được loại bỏ mô liên kết phía dưới biểu mô, sau đóđược rửa trong môi trường PBS 3 lần trong 10 phút ở nhiệt độ phòng có pha50UI/ml kháng sinh penicillin-streptomycin và 5µg/ml amphotericin B Cácmảnh mô sau đó ủ với dispase 1,2UI ở 370C trong vòng 1 giờ, xử lý tiếp theobằng 0,25% trypsin-EDTA trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, dừng tác dụng củaenzyme bằng cách rửa bằng môi trường 1DMEM:1Ham’s F12 có bổ sung10% FBS, insulin 5µg/ml, cholera toxin 0,1nmol/l, EGF người tái tổ hợp10ng/ml, penicillin-streptomycin 50UI/ml, hỗn hợp tế bào sau đó ly tâm 1000vòng/phút trong vòng 5 phút rồi pha với môi trường nuôi cấy ở nồng độ

100000 tế bào/ml, gieo trên nền màng ối đã loại bỏ biểu mô có nền 3T3 đã xử

lý bằng mitomycin, nuôi cấy trong vòng 2 tuần, kỹ thuật tạo tầng được ápdụng trong vòng 1 tuần ở điều kiện 370C, 5%CO2 [19]

Cũng tác giả này, năm 2004 khi tiến hành nghiên cứu trên 6 mắt của 4bệnh nhân đã có lời khuyên: trước khi lấy mảnh niêm mạc miệng để nuôi cấy,bệnh nhân cần được các nha sỹ khám và có sự chuẩn bị trước như đánh răngthường xuyên, không sử dụng thuốc lá, súc miệng bằng Iodine Sau khi lấy,mảnh niêm mạc miệng người cũng được xử lý giống như đối với thỏ [21].Còn tác giả Nishida và cộng sự (2004), đã lấy mẫu niêm mạc má của bệnhnhân để nuôi cấy với kích thước là 3x3mm và nuôi cấy tế bào biểu mô niêmmạc miệng bằng dịch treo trên nền màng polymer nhạy với nhiệt trên nền3T3 Ở 370C, các tế bào biểu mô gắn chặt và tăng sinh trên nền polymer,nhưng khi hạ nhiệt độ xuống thì tấm biểu mô sẽ tách rời khỏi màng này Ưuđiểm của phương pháp này là không cần enzyme để giải phóng tấm biểu môkhỏi màng nuôi cấy [22]

Trong nghiên cứu của DH Ma và cộng sự năm 2009, mảnh niêm mạcmiệng lấy để nuôi cấy lại có kích thước lớn hơn (6x6mm), mảnh mô được xử

lý với dispase II 1,2UI ở 370C trong vòng 1 giờ, tiếp đó được xử lý bằngtrypsin-EDTA ở 370C, cứ 3 phút lại nạo nhẹ miếng mô cuối cùng dung dịch tếbào được hoà với SHEM có 5% huyết thanh bê, dịch tế bào được gieo lên

màng ối đã loại bỏ biểu mô, kết thúc nuôi cấy không tiến hành tầng hoá bằngcách cho mẫu tiếp xúc với không khí [15].

Như vậy, tuỳ từng tác giả, mảnh mô lấy để nuôi cấy có kích thước khácnhau, phương pháp xử lý bằng enzym cũng hoàn toàn khác nhau Vì thế, mộttrong các mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là lựa chọn phương pháp nuôicấy thích hợp

1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường thông dụng nhất sử dụng cho nuôi cấy tế bào gốc là môitrường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) có nồng độ glucosecao DMEM là môi trường nuôi cấy đệm bicarbonate được thiết kế để duy trì

pH từ 7,2 đến 7,4 với nồng độ CO2 là 5% Môi trường nuôi cấy cũng có thờihạn sử dụng nhất định, đặc biệt khi chúng đã được bổ sung thêm huyết thanhhoặc glutamin vì khả năng chuyển đổi của L-glutamine và D-glutamine Điềukiện bảo quản môi trường thích hợp nhất là trong tối ở 4oC Huyết thanh bổsung vào môi trường nuôi cấy thường được dùng là huyết thanh bào thai bê(Fetal Bovine Serum- FBS) hoặc huyết thanh bò (Bovine Serum - BS) Trongnuôi cấy biểu mô niêm mạc miệng thông thường được sử dụng đó là DMEM

và Ham’s F12 tỷ lệ 3:1 có bổ sung rất nhiều thành phần khác nhau FBS đượcnhiều tác giả sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào gốc FBSđóng vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào nuôi cấy và cung cấp các yếu tốkích thích tăng sinh như yêú tố kích thích sinh trưởng tiểu cầu (PDGF), yếu tố

tế bào gốc (stem cell factor) Bên cạnh đó FBS còn làm tăng độ nhớt trongmôi trường và duy trì một áp suất thẩm thấu thích hợp cho các tế bào đượcnuôi cấy Tuy nhiên giá thành của FBS rất cao

1.5 Ứng dụng của tấm biểu mô niêm mạc miệng

Sau những thành công nuôi cấy trên thực nghiệm, các nhà khoa học đãthành công trong nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng để ghép giác mạc

tự thân trên người Theo Nakamura và cộng sự (2004), khi tiến hành nghiêncứu trên 6 mắt của 4 bệnh nhân, kết quả sau 2 ngày cấy ghép, bề mặt giác mạccủa bệnh nhân phẳng và trong, biểu mô hoá hoàn toàn Tân mạch ngoại vi bềmặt hình thành chỉ thấy ở vùng ngoại biên, không thấy xuất hiện ở trung tâm

giác mạc Không thấy có biến chứng gì sau mổ Không có biến chứng gì vềmặt lâm sàng ngoại trừ một số trường hợp bị tổn thương biểu mô nhỏ Khảnăng nhìn của tất cả các mắt tiến hành phẫu thuật đều cải thiện từ 2 dòng trởlên ở thời điểm 11 tháng sau phẫu thuật Với thời gian theo dõi trung bình là13,8 tháng tình trạng các mắt đều ổn định, biểu mô tồn tại tốt [21]

Theo Nishida K và cộng sự (2004) báo cáo kết quả trên 4 bệnh nhân bịLSCD hai bên mắt Tấm biểu mô nuôi cấy sau 2 tuần được cấy ghép cho kếtquả biểu mô hoá hoàn toàn giác mạc xảy ra trong vòng 1 tuần ở cả 4 mắt, độtrong của giác mạc được cải thiện tốt trong thời gian theo dõi là 14 tháng vàkhông thấy xuất hiện biến chứng gì [22] Leonard P.K và cộng sự năm 2006

đã công bố kết quả cấy ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng người lên giácmạc bị thiếu hụt hoàn toàn vùng rìa Các tấm biểu mô giống nhau về mặt hìnhthái được tạo ra, chỉ sau 2-5 ngày biểu mô hoá hoàn toàn đã được tạo ra, 19tháng sau ghép bề mặt giác mạc vẫn ổn định, thị lực của 9 trên 10 mắt tănggấp đôi [14] Nghiên cứu của Inatomi và cộng sự năm 2006 cho thấy: khi tiếnhành trên 15 mắt ở 12 bệnh nhân thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa do hội chứngStevens-Johnson, bị bỏng nhiệt và hoá học, sau khi được cấy ghép tấm biểu

mô niêm mạc miệng với thời gian theo dõi là 34 tháng thấy bề mặt nhãn cầu

ổn định và tầm nhìn được cải thiện và không có biến chứng gì ở 10 mắt, trong

5 mắt còn lại chỉ có 2 mắt phải phẫu thuật lại [9] Nghiên cứu của DH Ma vàcộng sự năm 2009, cho thấy khi áp dụng kỹ thuật này trên 2 mắt bệnh nhânbỏng kiềm cấp, 1 mắt bỏng kiểm mãn và 2 mắt bị bỏng nhiệt mãn Bệnh nhântheo dõi với thời gian là 29,6±3,6 tháng (26-34 tháng) đưa ra kết luận về khảnăng áp dụng của tấm biểu mô niêm mạc miệng có thể kích thích quá trìnhbiểu mô hoá giảm viêm nhiễm trong trường hợp bỏng cấp tính và tái thiết bềmặt nhãn cầu trong trường hợp mãn tính [15] Như vậy, đối với bệnh nhân bịtổn thương BMNC cả hai mắt thì việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệngnuôi cấy để ghép giác mạc là lựa chọn đúng đắn và bức thiết trong giai đoạnhiện nay

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

 Thỏ ta thuần chủng cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 2,0 ± 0,2 kg.Thỏ được nuôi trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi làm thínghiệm

 Bánh rau của sản phụ được mổ lấy thai tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội.Tiêu chuẩn chọn là những sản phụ khoẻ mạnh, không có bệnh nhiễm trùngtoàn thân, chưa vỡ ối hoặc vỡ ối trước 6 giờ và có phản ứng huyết thanh âmtính với: HIV, HBsAg, giang mai

 Màng ối lấy từ màng rau của bánh rau đã xử lý theo quy trình của bộmôn Mô-Phôi Trường Đại học Y Hà Nội

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Mô –Phôi Trường Đại học Y Hà Nội

2.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10/2010 đến tháng 8/2012

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Mô hình nghiên cứu

Hình1 Mô hình nghiên cứu

Lấy mô vùng

niêm mạc

miệng thỏ

Xử lý mẫu Thu hoạch, định

danh tấm biểu mô

Nhận định kết quả

Nuôi cấy bằng dịch treo

Nuôi cấy bằng mảnh mô

2.4.2 Chuẩn bị lồng nuôi cấy

 Rửa màng rau bằng mước muối sinh lý có pha kháng sinh trong 10 phút

 Nạo sạch máu ở màng rau bằng nạo tế bào Cắt màng rau thànhnhững miếng 3x3cm

 Rửa màng rau lần lượt qua hai lần PBS có pha kháng sinh

 Bóc màng ối ra khỏi màng rau

 Ngâm màng ối trong Ammonium 10%

 Nạo sạch cả 2 mặt của màng ối tới khi trong suốt tương đối

 Rửa lại 2 lần bằng PBS Các miếng màng ối sẵn sàng được sử dụnghoặc sẽ được bảo quản trong DMSO 15%

 Tiến hành căng màng ối vào đáy của lồng nuôi cấy, để khô

2.4.3 Quy trình lấy mẫu nuôi cấy

 Gây mê tĩnh mạch tai thỏ, sử dụng thiopental liều 20mg/kg cân nặng

 V ị trí trích thủ: Trích thủ mảnh niêm mạc miệng vùng giữa của

má thỏ kích thước 8x8mm trong phương pháp nuôi bằng dịch treo và3x3mm trong phương pháp nuôi bằng mảnh mô Tiến hành nuôi cấy theo

2 phương pháp

2.4.4 Quy trình xử lý mảnh niêm mạc miệng nuôi cấy

 Rửa mảnh niêm mạc miệng bằng PBS có bổ sung kháng sinh,kháng nấm

* Nuôi cấy mảnh mô

 Bơm môi trường nuôi cấy vào lồng nuôi và giếng nuôi

Giếng nuôi cấy được đặt trong tủ ấm 370 C, 5%CO2 Thay môi trườngđều đặn 2 ngày/lần Thời gian nuôi cấy thường kéo dài 14 đến 16 ngày

Hình 2 Mô hình nuôi cấy bằng mảnh mô

* Nuôi bằng dịch treo tế bào:

Ủ mảnh niêm mạc miệng trong dispase II 1,2 UI/ml trong tủ 370C, 5%

CO2, thời gian 1 giờ

Bóc tách lấy phần biểu mô

TB biểu mô niêm mạc miệng

phát triển ra ngoài mảnh mô

Màng ối

Mảnh niêm mạc miệng Giếng nuôi cấy

Lồng nuôi cấy

Ủ trong Tripsin 0,1% +EDTA 0,1%.

Nạo lấy lớp đáy của biểu mô

Ly tâm lạnh ở nhiệt độ 40C các tế bào biểu mô

Đếm tổng số tế bào thu được

Tạo dịch treo có mật độ tế bào 5x105 tế bào/ml

Nuôi cấy trong lồng nuôi cấy:

+ Cho 1 ml dịch treo tế bào vào lồng nuôi cấy

+ Thêm môi trường vào giếng đặt lồng nuôi cấy

+ Đặt giếng nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 Thay môi trường đềuđặn 2 ngày 1 lần Thời gian nuôi cấy khoảng 14-16 ngày

Hình 3 Mô hình nuôi cấy bằng dịch treo

2.4.5 Môi trường nuôi cấy, quy trình nuôi cấy và theo dõi

Môi trường SEM (Supplemental Hormonal Epithelial Medium) gồm:DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 của Gibco, bổ xung: peniciline 100UI/ml Streptomycin100µg/ml, Amphotericin B 200 µg/ml, Insulin 5µg/ml, 5% FBS, tri-iodothyronine, isopropranolol

* Nuôi cấy mảnh mô hoặc dịch treo của biểu mô niêm mạc miệng trong

tủ 370C, 5% CO2 Thay môi trường 2 ngày/lần Theo dõi sự phát triển của các

đáy của lồng nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật tạo tầng (air-lifting) để tăng số hàngcho tấm biểu mô nuôi cấy trong thời gian 2-4 ngày.

Quy trình tạo tầng cho tấm biểu mô nuôi cấy như sau:

+ Khoảng ngày thứ 12 của nuôi cấy, khi thấy các tế bào biểu mô mọckín giếng nuôi cấy, tiến hành tạo tầng cho tấm biểu mô

+ Bơm môi trường vào giếng nuôi cấy và lồng nuôi cấy

+ Hút hết môi trường trong lồng nuôi cấy bỏ đi, để cho các tế bào biểu

mô tiếp xúc với không khí

+ Đặt giếng nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5%CO2

+ Thay môi trường trong giếng nuôi cấy hàng ngày

* Lấy tấm biểu mô nuôi cấy để định danh

2.4.6 Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy

Sau khi nuôi cấy được tấm biểu mô kích thước 4 cm2, tiến hành địnhdanh tế bào của tấm biểu mô nuôi cấy bằng các kỹ thuật hiển vi quang học,hoá mô, hoá mô miễn dịch

a Nhuộm giemsa

Mục đích: quan sát bề mặt của tấm biểu mô nuôi cấy

Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng nuôi cấy được trải phẳng lên lamkính, cố định bằng cồn Ethylen 1000 trong 15 phút, sau đó nhuộm giemsatrong 10 phút Rửa lam kính dưới vòi nước chảy, để khô, dán lamelle, sau đókiểm tra trên kính

b Nhuộm Hematoxylin-Eosin

Mục đích: quan sát mặt cắt đứng của tấm biểu mô

Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịchBouin trong 1-2 giờ khử nước bằng cồn 70o, 80o, 90o, 95o, 100o Sau khi làmtrong miếng mô bằng cách ngâm lần lượt qua 3 lọ Tuluen tiến hành đúcmiếng mô trong khuôn nến Cắt mẫu thành những lát mỏng 3-5µm Nhuộmmàu theo phương pháp Hematoxylin-Eosin (H.E) Quan sát bằng kính hiển viquang học

c Kỹ thuật hiển vi điện tử

Tấm biểu mô được kiểm tra bằng cả kính hiển vi điện tử quét (SEM) vàkính hiển vi điện tử xuyên (TEM)

Mục đích: quan sát cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô, tìm các cấu trúcliên kết giữa các tế bào biểu mô với nhau và giữa tế bào biểu mô với màng ối

Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịchglutaraldehyde 2,5% pha với đệm PBS trong 2giờ, rửa 3 lần trong 15 phút vớiPBS, tiếp tục cố định trong 1giờ 30 phút bằng dung dịch osmium tetroxide1% Sau đó rửa lại miếng mô thêm 3 lần nữa bằng PBS trước khi chuyển quacồn để khử nước (500, 700, 800, 900,950, và 1000)

Với TEM, miếng mô sẽ được đúc trong khuôn nhựa epon, cắt lát siêumỏng (300-400Ao) Những lát cắt này sẽ được đặt trên lưới đồng, và đượcnhuộm bằng uranyl acetate và citrate chì Mẫu được đọc trên kính Jeol1010tại viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương

Với SEM, miếng mô sẽ được chuyển qua dung dịch hexamethyldisilazanetrong vòng 10 phút, sau đó để khô trong không khí Khi đã khô, miếng mô được

mạ phủ vàng, sau đó kiểm tra trên kính tại viện 69 Bộ tư lệnh Lăng Chủ Tịch

Hồ Chí Minh

2.5 Chỉ tiêu nghiên cứu

 Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô

 Chất lượng của tấm biểu mô nuôi cấy

 Thời gian nuôi cấy

 Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy

 Cấu trúc siêu vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy

2.6 Tiêu chuẩn tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy

 Mặt tấm biểu mô phẳng, đều

 Diện tích khoảng 4cm2

 Nền màng ối đáp ứng được kỹ thuật khâu ghép

 Tế bào biểu mô hình đa diện, liên kết với nhau, bám dính vào màng ối

 Có từ 2 đến 5 hàng tế bào biểu mô

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khi nhuộm bề mặt bằng giemsa, biểu mô màng ối quan sát được thuộc biểu

mô đơn, các tế bào đa diện khá đều đặn xếp sát nhau, ranh giới rõ (Hình 4)

Hình 4 Bề mặt màng ối người (Giemsa, x 1000)

1 Nhân TBBM màng ối 2 Ranh giới TBBM màng ối

1

2

Trên lát cắt đứng dọc, màng ối gồm 3 lớp rõ: trên cùng là biểu môvuông đơn, dưới biểu mô là màng đáy mỏng, dưới màng đáy là một lớp trung

mô vô mạch và thuần nhất (Hình 5)

1

2 3

4

Cấu trúc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mô bằng dung dịch Amonium10%: màng ối rất mỏng, lớp biểu mô và lớp trung mô đã bị nạo bỏ toàn bộ, phầncòn lại chỉ là lớp màng đáy hoặc còn dính một số lá sợi collagen nhỏ

Hình 6 Màng ối nạo biểu mô bằng Amonium 10% (HE x 800)

3.1.2 Hình thái vi thể mảnh niêm mạc miệng tại vi trí trích thủ

Biểu mô lợp niêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng khôngsừng hóa gồm rất nhiều hàng tế bào, các tế bào lớp bề mặt dẹt và vẫn cònnhân Lớp tế bào đáy có hình trụ, nhân hình trứng, bào tương rất ưa base Môliên kết dưới biểu mô tạo thành các nhú chân bì cao Trong mô liên kết chứanhiều mạch máu và các tế bào liên kết (Hình 7)

Hình 7 Biểu mô niêm mạc miệng (HE x 800)

a Biểu mô b Mô liên kết c Lớp đáy của biểu mô

3.1.3 Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng

Sau khi nghiên cứu quy trình trích thủ và xử lý mảnh niêm mạc miệng ổn định, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy nhiều đợt bằng cả hai phương pháp: nuôi mảnh mô và nuôi dịch treo Kết quả nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng được thể hiện trong Bảng 1.

Bảng 1 Tỉ lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng

Phương pháp nuôi bằng mảnh

mô

Phương pháp nuôi bằng dịch treo