Luận văn thạc sĩ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG

2.4 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần.... ðể hoàn thiện quá trình nghiên cứu con lai soma sau dung hợp, tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằn

-

-

TRẦN VĂN GIÁP

NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2011

-

-

TRẦN VĂN GIÁP

NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 60.62.05

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sư dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 08 năm 2011

Tác giả

Trần Văn Giáp

Luận văn ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật của Viện Sinh học Nông nghiệp- Trường ñại học Nông nghiêp

Hà nội Tại ñây tôi ñã ñược tạo mọi ñiều kiện thuận lợi về trang thiết bị, hoá chất, các ñiều kiện cơ sở vật chất khác ñể học tập, nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp ñỡ quý báu ñó

Nhân dịp này, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Bố mẹ và gia ñình ñã nuôi dưỡng, dạy bảo và ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt những năm tháng học tập và tiến hành luận văn này Cảm ơn tất cả các bạn bè thân thiết ñã cổ vũ, ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà nội, tháng 8 năm 2011

Tác giả

Trần Văn Giáp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

• AFLP-Amplified Fragment length polymorphism

• PLRV Potato leafroll luteovirus PLRV

• PVA Potato A potyvirus

• SGAA-Steroidal Glycoalkaloid Aglycone

• SSR-Simple Sequence Repeat

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các từ viết tắt trong luận văn iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

Danh mục các ñồ thị viii

MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu ñề tài 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 5

2.1.1 Nguồn gốc 5

2.1.2 Phân loại 6

2.1.3 ðặc ñiểm thực vật học 7

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 9

2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 9

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 12

2.3 Bệnh virus hại khoai tây và biện pháp khắc phục 13

2.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây 13

2.3.2 Tác hại của bệnh virus 15

2.3.3 Giải pháp khắc phục 17

2.4 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào

trần 25

2.4.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới 25

2.4.2 Một số kết quả nghiên cứu dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây ở Việt Nam 31

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu 33

3.2 Nội dung nghiên cứu 35

3.3 Phương pháp nghiên cứu 36

3.4 Xử lý số liệu 44

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Kết quả ựánh giá ựộ bội của các dòng cây tái sinh 45

4.2 Kết quả xác ựịnh con lai soma bằng phương pháp isozym 47

4.3 đánh giá các ựặc tắnh kháng virus PVX, PVY của con lai soma bằng phương pháp chỉ thị phân tử 50

4.4 Kết quả ựánh giá khả năng sinh trưởng phát triển in vitro của con lai soma tái sinh ựược 55

4.5 đánh giá khả năng hình thành củ in vitro của con lai soma 60

4.6 đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành năng suất của con lai soma trong ựiều kiện in vivo 64

4.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh ựánh giá chất lượng củ dòng 76, 79 và bố mẹ 76

4.8 đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA 77

KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 84

5.1 Kết luận 84

5.2 đề nghị 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây trên thế giới

năm 2007 ……… 10

Bảng 2.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 11

Bảng 2.3 Nhóm virus chính hại khoai tây 14

Bảng 2.4 Tổng hợp nghiên cứu dung hợp protoplast trên cây khoai tây 30

Bảng 4.1 Kết quả ñặc tính kháng virus PVX, PVY của các dòng bố mẹ và con lai của chúng 54

Bảng 4.2 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ 55

Bảng 4.3 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 76, 79 và bố mẹ 57

Bảng 4.4 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 21-1 và bố mẹ 58

Bảng 4.5 Số liệu hình thành củ của con lai soma và bố mẹ 61

Bảng 4.6 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ chúng 65

Bảng 4.7 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ 66

Bảng 4.8 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ 68

Bảng 4.9 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng khảo sát 70

Bảng 4.10 Phân loại cấp củ sau thu hoạch 73

Bảng 4.11 ðặc ñiểm hình thái củ 74

Bảng 4.12 Các chỉ tiêu hóa sinh 76

Bảng 4.13 Kết quả test ELISA virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo 79

Bảng 4.14 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVX 79

Bảng 4.15 Kết quả test ELISA virus PVY trước khi lây nhiễm nhân tạo 80

Bảng 4.16 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVY 81

Bảng 4.17 Kết quả test ELISA sau khi lây nhiễm virus PVY 82

Bảng 4.18 Vị trí các dòng khoai tây trong bản test ELISA PVY 83

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Kết quả xác ñịnh ñội bội của mẫu nhị bội A15 46

Hình 4.2 Kết quả ñộ bội của các dòng con lai 46

Hình 4.3 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A16 và B186 48

Hình 4.4 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A15 và A41 49

Hình 4.5 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai B186 và B208 50

Hình 4.6 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM 339 52

Hình 4.7 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM 003-111 53

Hình 4.8 Minh họa hình ảnh dòng 81-2 và bố mẹ trong in vitro 56

Hình 4.9 Minh họa dòng 76, 79 và bố mẹ in vitro 58

Hình 4.10 Minh họa dòng 21-1 và bố mẹ in vitro 59

Hình 4.11 Minh họa củ dòng 76, 79 và bố mẹ chúng 62

Hình 4.12 Minh họa củ dòng 21-1 và bố mẹ chúng 63

Hình 4.13 Minh họa củ dòng 81-2 và bố mẹ chúng 64

Hình 4.14 Con lai soma 81-2 và bố mẹ chúng (in vivo) 66

Hình 4.15 Dòng 76, 79 và bố mẹ chúng (in vivo) 67

Hình 4.16 Dòng 21-1 và bố mẹ (in vivo) 69

Hình 4.17 Hình ảnh củ của sau thu hoạch của các con lai 72

Hình 4.18 Củ của bố mẹ và các con lai trong ñiều kiện chậu vại 75

Hình 4.19 Hình ảnh test ELISA virus PVX của các dòng khoai tây 80

Hình 4.20 Hình ảnh test ELISA virus PVY trước lây nhiễm nhân tạo 81

Hình 4.21 Hình ảnh test ELISA virus PVY sau lây nhiễm nhân tạo 84

DANH MỤC CÁC ðỒ THỊ

ðồ thị 4.1 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ 56

ðồ thị 4.2 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ 57

ðồ thị 4.3 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ 59

ðồ thị 4.4 Chiều cao, số lá trung bình dòng 81-2 và bố mẹ (in vivo) 65

ðồ thị 4.5 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ (in vivo) 67

ðồ thị 4.6 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ (in vivo) 68

ðồ thị 4.7 Biểu ñồ thể hiện tỷ lệ các cấp củ 74

MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ủề

Khoai tây- Solanum tuberosum.L là một trong những cây lương thực

có giá trị Trên thế giới khoai tây đứng hàng thứ 5 về diện tích trong các loại cây trồng làm lương thực, thực phẩm và đứng thứ 4 về sản lượng

ở nước ta khoai tây là một cây trồng vụ đông quan trọng trong công thức luân canh, lúa xuân - lúa mùa sớm - khoai tây Là một cây trồng lý tưởng cho

vụ đông của Đồng bằng Bắc Bộ

Tuy nhiên hầu hết các giống khoai tây ở nước ta đều cho năng suất thấp

và phẩm chất kém dần, nguyên nhân chủ yếu là do thoái hoá giống với hai tác nhân là virus và sự già hoá của giống Khắc phục được hiện tượng này sẽ góp phần phát triển nền sản xuất khoai tây ở nước ta

Các phương pháp chọn tạo giống khoai tây truyền thống chủ yếu nhờ vào kỹ thuật lai tạo vấp phải những khó khăn về mặt di truyền cũng như việc chọn tạo sau lai Chính bản chất tứ bội (2n=4x=48) của khoai tây làm cho chương trình chọn tạo giống gặp khó khăn và phức tạp hơn các cây trồng nhị bội Cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học thì công nghệ tế bào thực vật mà cụ thể là công nghệ tế bào trần đU mở ra con đường để khắc phục các hiện tượng này, nó đU được Wenzel (1979)(57) đề xuất thông qua sơ đồ (phụ lục 14) Bằng cách giảm độ bội xuống monoploid sau đó chọn lọc cá thể lưỡng bội diploid và cuối cùng là dung hợp tế bào trần hai tế bào thể diploid

đU chọn lọc để tạo giống khoai tây mong muốn Sau quá trình dung hợp việc xác định thể lai và tái sinh các thể lai có ý nghĩa này thành cây hoàn chỉnh từ

đó nhân thành giống mới có khả năng kháng virus

Trờn thế giới cú khỏ nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu về tạo giống khoai tõy khỏng virus bằng dung hợp tế bào trần N.Fish, A.Karp and M,G.K.Jones (1988)(40) nghiờn cứu dung hợp tế bào trần bằng phương phỏp xung ủiện

giữa Solanum tuberosum với S brevidens, các ông ñã thành công trong việc

tái sinh con lai sau dung hợp, xác ñịnh con lai bằng phương pháp isoenzyme ñánh giá tính kháng virus PLRV (Potato Leaf Roll Virus) Sau ñó, Naoto Kadotani và Keisuke Kasaoka (2004)(38) cũng thành công trong nghiên cứu

về dung hợp xung ñiện giữa Solanum.tuberosum cv May Queen và S

etuberosum, trải qua các bước tái sinh, xác ñịnh con lai theo phương pháp

RFLPs , ñánh giá tính kháng virus, cuối cùng tạo cây lai có tính kháng dòng

virus PVY

Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu về dung hợp tế bào trần và các ứng dụng của nó mới chỉ dừng lại ở bước ñầu nghiên cứu quy trình tách, nuôi cấy, dung hợp, tạo micro callus và macro callus, bước ñầu tái sinh ñược cây hoàn chỉnh ðể hoàn thiện quá trình nghiên cứu con lai soma sau dung hợp, tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật trên thì việc nghiên cứu xác ñịnh con lai, ñánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển in vitro và in vivo, ñánh giá các ñặc tính kháng, các chỉ tiêu hóa sinh là cực kỳ quan trọng và cấp

thiết Với tất thảy những mục ñích ñó, chúng tôi thực hiện luận văn: “Nghiên

cứu xác ñịnh con lai soma khoai tây, ñánh giá ñặc ñiểm sinh trưởng và khả năng chống chịu virus của chúng”

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Xác ñịnh ñược con lai soma sau dung hợp, ñánh giá các ñặc tính có lợi theo tính trạng mong muốn, nhằm chọn lọc các dòng ñể phát triển thành giống kháng virus phục vụ sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

+ Nghiên cứu xác ñịnh con lai soma

- Xác ựịnh ựược ựộ bội con lai thông qua phương pháp Flow Cytometry

- Xác ựịnh con lai bằng kỹ thuật Iso enzym

+ đánh giá con lai

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, hình thành năng suất ựồng ruộng

- đánh giá các chỉ tiêu hóa sinh

- đánh giá khả năng kháng virus PVY của con lai soma, các dòng bố mẹ bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA

- đánh giá khả năng kháng virus (PVX, PVY) của con lai soma, các dòng bố mẹ bằng phương pháp chỉ thị phân tử

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Việc nghiên cứu xác ựịnh chắnh xác con lai soma, và ựánh giá các ựặc ựiểm nông sinh học, tắnh chống chịu virus ựể chọn lọc ra các dòng triển vọng phát triển thành các giống khoai tây có phẩm chất tốt, chống chịu virus là rất cần thiết và cấp bách, là cơ sở ựể hoàn thiện quy trình tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

đề xuất thử nghiệm ựánh giá diện rộng các con lai soma trên ở các ựặc tắnh kháng bệnh và năng suất, nhằm tuyển chọn các dòng thắch hợp nhất phát triển thành giống sản xuất

1.4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu ñề tài

- Vật liệu nghiên cứu: Kế thừa nguồn vật liệu là các dòng khoai tây bố

mẹ có các ñặc tính kháng virus PVX, PVY có nguồn gốc tạo CHLB ðức, các con lai soma ñã ñược tạo ra tại Viện Sinh học Nông nghiệp Trong phạm vi ñề tài này, chúng tôi chỉ tiến hành ñánh giá các ñặc ñiểm sinh trưởng phát triển của con lai soma so với bố mẹ chúng mà chưa có ñiều kiện ñể so sánh với các dòng, giống khoai tây trồng trọt phổ biến

- ðề tài nhằm nghiên cứu xác ñịnh con lai soma ñã ñược tạo ra, từ ñó ñánh giá các ñặc ñiểm sinh trưởng phát triển, khả năng kháng virus của chúng nhằm mục ñích bước ñầu giới thiệu các dòng làm vật liệu cho công tác chọn giống khoai tây kháng virus PVX, PVY

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

2.1.1 Nguồn gốc

Nghiên cứu tuổi cacbon phóng xạ cho thấy khoai tây ựược trồng ắt nhất 8.000 năm về trước trên bình nguyên đông Nam Peru và Tây Bắc Bolivia (Nguyễn Văn Hiển, 2000)(4) Nhiều cuộc thám hiểm của Liên xô (cũ) trước ựây ựã xác nhận rằng: Trung tâm thứ 2 của khoai tây có nguồn gốc ở Mexico

và hiện nay người ta còn bắt gặp rất nhiều khoai tây dại ở ựây (Hồ Hữu An, 2005)(1)

Trong các loài hoang dại họ hàng thì phức hợp S canasense/S

Leptophys có mối quan hệ gần gữi nhất với các loài khoai tây trồng nhị bội

Phức hợp S tenotomum/S phureja là dạng nguyên thủy nhất trong các loài

khoai tây trồng nhị bội (Nguyễn Văn Hiển, 2000)(4)

Tuy nhiên loài khoai tây trồng trọt là S tuberosum là một loài tứ bội

Các giống này ựược du nhập vào Châu Âu năm 1570 Và sau ựó lan rộng ra khắp thế giới Hiện nay ựã có tới 151 nước trồng khoai tây (Hồ Hữu An, 2005)(1)

Khoai tây ựược du nhập vào Việt Nam từ năm 1890 và chủ yếu ựược trồng ở ựồng bằng Sông Hồng (Nguyễn Quang Thạch, 1993)(10) Khoai tây ựược trồng trong 11 công thức luân canh với lúa và rau màu trong hệ thống canh tác ở ựồng bằng Sông Hồng (đỗ Kim Chung, 2003)(2) Diện tắch khoai tây tăng từ 25.748 ha vào năm 1992 tới 35.000 ha vào niên vụ 2002 Ờ 2003 (đỗ Kim Chung, 2003)(2) Mức tiêu thụ khoai tây hàng năm ở nước ta khoảng 555.827 tấn Năng suất khoai tây có tăng dần nhưng chậm, dao ựộng

từ 10 Ờ 12 tấn/ha (Hồ Hữu An, 2005)(1)

2.1.2 Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi

Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp

Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta Trong chi này có khoảng trên 200 loài ñược phân bố khắp thế giới Sự ña dạng về loài, giống tập trung chủ yếu ở

vùng Trung-Nam Mỹ và Australia cùng với loài S tuberosum có khoảng 7

loài trồng trọt khác

Có nhiều cách ñể phân loại khoai tây, dựa vào ñặc ñiểm hình thái thân,

lá, hoa…hay số lượng nhiễm sắc thể Theo J.G Hawkerkks (1991)(21), khoai tây ñược phân thành 18 nhóm, trong ñó có 68 loài dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, ñược chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng NST

• Nhóm 1: Diploid: 2n = 2x = 24

S.x arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum Juz.et Buk

S phueja Juz.et Buk

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng

Ở các thân ngầm dưới mặt ñất (còn gọi là tia củ) cũng có khả năng ra

rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh Bộ rễ phân bố chủ yếu trên ñất canh tác 0 – 40 cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1.5 – 2m (Tạ Thu Cúc, 2007)(3)

* Thân:

Thân khoai tây mọc thẳng, ñôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70cm ñến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm sóc… mà chiều cao cây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặc

xanh nhạt hay ñậm, ñôi khi có màu phớt hồng hoặc tím…tùy thuộc vào giống

* Lá:

Lá hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lá kép xẻ lông chim, có 3 – 7 ñôi mọc ñối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùng thường lớn hơn gọi là lá chét ñỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, ñiều kiện chăm sóc mà có thể màu xanh, xanh ñậm hoặc xanh nhạt, …

* Hoa:

Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên một chùm hoa Nó thuộc loại hoa lưỡng tính và có cấu tạo 5 : 5 : 5, cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng, cũng có thể là phớt hồng, tím, hồng, vàng hoặc ñỏ v.v phụ thuộc vào từng loại và giống

*Củ:

Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ ñược hình thành

là do thân phát triển dưới ñất, trong ñiều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây có thể là tròn, elíp, tròn dài, ñôi khi hình vuông Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống,

có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng, hay vàng nhạt v.v

* Mầm:

Mầm khoai tây phát triển từ ñiểm sinh trưởng của mắt củ, là cơ quan sinh sản vô tính của khoai tây Màu sắc của mầm khác nhau phụ thuộc vào từng giống có thể màu trắng hoặc màu tím, khi gặp ánh sáng mầm có màu xanh

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng khoai tây

Khoai tây ñược ví như “kho báu’’ngoài yếu tố thuộc nhóm thực phẩm cao cấp, ngoài thành phần dinh dưỡng trong củ phong phú và ña dạng bao gồm: tinh bột, protein, lipit, các loại vitamin (B1, B2, B3, B6, PP, C), các chất khoáng, các axitamin tự do Thì nó còn có nhiều tính chất ñáng quý khác như:

dễ trồng, dễ mọc, không ñắt, chất lượng cao, phong phú về giá trị sử dụng: chế biến ñược nhiều món ăn, làm thuốc chữa bệnh (bệnh viêm loét dạ dày, hành tá tràng, bệnh thần kinh, bỏng, quai bị )

Khoai tây còn là cây dễ thích nghi, năng suất cao, thích ứng với chi phí ñầu vào thấp Mọi bộ phận trên củ khoai tây ñều có giá trị dinh dưỡng

Theo nguồn: United States Department of Agriculture, National

Nutrient Database, 2008 cho biết thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ

khoai tây sau khi luộc cả vỏ và nướng

Bên cạnh giá trị lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, khoai tây còn

là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp (Nguyễn Quang Thạch, 1993)(10), nguyên liệu trong ngành dược phẩm, cũng như sử dụng khoai tây làm mỹ phẩm (ðỗ Kim Chung, 2003)(2) Do ñó khoai tây ñược khẳng ñịnh là rất quan trọng ñối với con người

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước

2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Vào thế kỷ XIX, khoai tây thực sự ñược trồng phổ biến ở các châu lục với khoảng 151 nước Ngày nay, khoai tây ñược trồng chủ yếu ở khu vực

Châu Á, Châu Âu cho năng suất và sản lượng lớn Số liệu ñược thể hiện qua bảng sau

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế

giới năm 2007 (FAOSTAT) Chỉ tiêu

Quốc gia

Diện tích thu hoạch (ha)

Sản lượng (tấn)

Năng suất (tấn/ha)

Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau ñó mở rộng sang các nước phát triển Vậy tại sao hiện nay khoai tây ñược trồng chủ yếu ở những nước

ñang phát triển? Theo các chuyên gia nhận ñịnh: Khoai tây chính là cây lương thực của tương lai dành cho những nước nghèo và nước ñang phát triển “ Khi giá lúa gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây ñược phát hiện là nguồn cây trồng giàu dinh dưỡng cho những nước ñó với giá rất rẻ ” (FAO 2006) Mặt khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO 2005)

Do ñó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tương lai, với diện tích trồng ngày càng ñược mở rộng và năng suất, chất lượng khoai tây ngày càng tăng, nhất là ở các nước ñang phát triển cộng với những nước nghèo

Bảng 2.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 (triệu

Qua bảng 2.2 cho biết: Từ năm 1991- 2003 sản lượng khoai tây ở các nước ñang phát triển tăng liên tục từ 84,86 triệu tấn (1991) – 152,11 triệu tấn (2003) và tăng ñều hơn so với các nước phát triển mặc dù sản lượng thấp hơn Bởi các nước ñang phát triển ngày càng mở rộng diện tích trồng nhưng năng suất không cao, còn các nước phát triển thì diện tích thu dẹp dần, năng suất khá cao do có vốn ñầu tư lớn và kinh nghiệm trồng trọt lâu năm Vào những năm 2005, lần ñầu tiên sản lượng khoai tây ở các nước ñang phát triển vượt qua sản lượng khoai tây ở các nước phát triển Trong ñó Trung Quốc là quốc gia dẫn ñầu về sản lượng khoai tây ñạt 72 (triệu tấn ) năm 2007 và 1/3 sản lượng khoai tây của thế giới ñược thu hoạch ở Trung Quốc và Ấn ðộ

Ở các nước ñang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém một phần là do nguồn giống không ñảm bảo chất lượng, củ giống không rõ nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn ñến sự thoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ

Do vậy, các nhà nghiên cứu ñang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạch bệnh và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Ở Việt Nam, khoai tây do người Pháp ñưa vào năm 1890, sau ñó ñược trồng rộng rãi và tập trung chủ yếu ở lưu vực ðồng Bằng Sông Hồng Trong vài năm trở lại ñây, diện tích và sản lượng khoai tây tại ðồng Bằng Sông Hồng

và một số ñịa phương khác giảm rõ rệt, nguyên nhân là do thiếu nguồn giống tốt

Vấn ñề khó khăn nhất hiện nay ñối với ngành sản xuất khoai tây ñó là giống Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng từ 20 - 25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự

duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc, do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54 – 65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45 – 60% Khoai tây trồng chủ yếu bằng con ñường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong ñiều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 – tháng 10), ñiều kiện nóng ẩm của mùa hè

củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất lượng củ thấp

Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ

lẻ, chưa mang tính hệ thống Trước tình hình ñó cần xây dựng các chương trình nhân tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con nông dân

2.3 Bệnh virus hại khoai tây và biện pháp khắc phục

Như chúng ta ñã biết, khoai tây là loại cây trồng rất dễ bị tấn công bởi

một số tác nhân gây bệnh: Virus (PVX, PVY, PLRV, LR, S, M, A, PSTVD), vi khuẩn (Ralstonia solanacearum), nấm (Phytophthora infestans), nhóm ngành

giun tròn (nematodes-bệnh do tuyến trùng), và một số loại bệnh khác…

2.3.1 Tìm hiểu về virus hai khoai tây

Theo Ross (1961)(49) , khoai tây là ký chủ của khoảng 33 loài virus Ông khẳng ñịnh hiện tượng thoái hóa khoai tây là do virus Việc phát hiện này ñã chứng minh quan ñiểm môi trường của H Morsstatt (1925), quan ñiểm dinh dưỡng và nước của F Merkenschlager (1929) và L V Rozalin (1960) về sự thoái hóa giống là chưa ñầy ñủ

Virus xâm nhiễm rộng khắp các vùng trồng khoai tây, tập trung chủ yếu ở Andean thuộc Nam Mỹ trung tâm khởi nguyên cây khoai tây (Jones 1981; Valkonen 1992)(53)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV–International Committee on Taxonomy of Viruses) ñã xây dựng hệ thống dữ liệu về các nhóm virus gồm ñặc ñiểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu ño lường (số hóa) các loại virus ñó

Với loài S tuberosum L phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như

sau:

Bảng 2.3 Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987;

Burton 1989; Brunt et al 1996)

• PVY – Smith phát hiện năm 1931 tại Anh Nhóm này gồm 3 dòng chính: PVYO gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới, PVYN gây ra các vết chết hoại trên gân lá thuốc lá, PVYC ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới Bên cạnh ñó mới phát hiện ra PVYNTN, PVYNW, PVYZ.PVYNTN Virus Y kết hợp với virus PLRV sẽ gây hại rất nặng ở Châu Âu Khả năng gây giảm năng suất từ 50-90% Riêng virus Y ñặc biệt gây hại nặng ở các vùng trồng khoai tây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam

• PVA – Nhóm virus này khá phổ biến trên thế giới, Murphy và Mckay

phát hiện ở Eire năm 1932 Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng

A1 cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S tuberosum.cv King Edward, ngược

lại dòng A2 thì không (Valkonen et al.1992)(53) Virus này gây hại giảm năng suất trên 50%

• PVX – phát hiện ở Anh bởi Smith (1931) Theo Cockerham (1955); Valkonen et al.(1996)(53) PVX ñược chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng của gen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiện PVXHB Gây giảm năng suất từ 10 - 25%

• PVV – Rozendaal phát hiện ở Nertherlands năm 1971, gây hại nhiều ở Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm Qua phân tích

Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S

tuberosum cv Pentland Dell

• PVM – Schltz và Folson phát hiện năm 1923 tại Mỹ, khá phổ biến và gây ra vài triệu chứng lạ Theo Konovalov (1986), Vũ Triệu Mân (1986)(7) cho biết hai giống khoai tây ở Nga ñã bị nhiễm virus PVM làm giảm năng suất tới 60-70%

• PVS – ðược De Bruyn ouboter phát hiện ở Nertherlands năm 1952, gây hại ít làm giảm năng suất từ 10-15% thường gây hại khi kết hợp với các virus khác

2.3.2 Tác hại của bệnh virus

Virus khoai tây ñược ñánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, làm giảm ñáng kể năng suất và chất lượng củ Bởi bệnh virus có những ñặc tính sau:

- Là bệnh không chữa ñược khi ñã bị nhiễm Do virus khi xâm nhiễm vào cây trồng chúng không có sự trao ñổi chất riêng và ñộc lập mà phải sử

dụng vật chất của ký chủ ñể nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trí xâm nhiễm Như vậy, tế bào ký chủ ñã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tác nhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus ñồng thời cũng ức chế các quá trình sinh tổng hợp của ký chủ

- Bệnh virus khoai tây có ñặc tính di truyền Ở những cây nhân giống theo con ñường hữu tính, bệnh virus rất ít truyền qua hạt Ngược lại cây nhân giống vô tính, virus có mặt ở mọi tế bào ñang sống nên rất dễ lan truyền Khi virus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyện tới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con Khi ñó, một củ mẹ bị nhiễm bệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễm virus Do vậy, năm này qua năn khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanh chóng Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trình sống của cây

- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus ñược truyền ngay hoặc có thời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trích nạp virus cho tới lúc truyền sang cây mới

Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gây nên hiện tượng thoái hóa giống Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồng của củ, biểu hiện củ nhỏ ñi về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu, hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khả năng quang hợp Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn ñến tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào ñó Ngoài ra, khi củ giống bị già sinh lý do bảo quản lâu trong ñiều kiện nóng ẩm cũng dẫn ñến hiện tượng thoái hóa củ Trong ñó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng thoái hóa

Ở Anh khoai tây bị nhiễm virus PLRV, PVY và PVX gây thiệt hại

trung bình từ 30 – 50 triệu pound mỗi năm

Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20 triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giới

Theo Banttari et al (1993)(14) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY

và PLRV dẫn tới năng suất giảm 80%

Hiện nay, người trồng khoai tây ñã sử dụng quá nhiều lượng thuốc trừ sâu, với mục ñích tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh (rệp muội, bọ phấn…) Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Jones et al (1982), Debok và Vander want (1987)(55), Valkonen et al (1992)(53) cho thấy giải pháp sử dụng thuốc trừ sâu ñể kiểm soát sự nhân lên của virus là không hiệu quả Do ñó, việc sử dụng thuốc trừ sâu tràn lan không những không cho hiệu quả trừ bệnh mà còn làm tăng tính kháng thuốc của côn trùng truyền virus, xuất hiện nhiều loài mới trong quần thể, hơn nữa còn gây ảnh hưởng tiêu cực ñến hệ sinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh Quan trọng nhất là lượng thuốc còn tồn dư trong củ khoai tây sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng

Cho nên hướng ñi theo con ñường tạo giống khoai tây kháng virus, kháng vector truyền bệnh ñược xem là giải pháp tối ưu Hướng ñi này ñã và ñang nhận ñược sự quan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây nói riêng và cây trồng nói chung

2.3.3 Giải pháp khắc phuc

2.3.3.1 Các giải pháp về canh tác

Trước những tác hại của bệnh virus trên, các nhà nghiên cứu về cây khoai tây ñã ñề xuất một số giải pháp nhằm canh tác phòng trừ sự nhiễm bệnh virus khoai tây như sau:

• Loại bỏ nguồn cây, củ bị nhiễm virus

• Hạn chế tối ña sự nhân lên và lan rộng của phân tử virus

• Trồng xen canh, luân canh một sô loại cây trồng có tính kháng virus, xua ñuổi côn trùng truyền bệnh virus Ngoài ra, có thể áp dụng biện pháp dùng côn trùng ñể kiểm soát vector truyền virus, tuy nhiên phương pháp này rất ñắt (Corsini et al.1994; Valkonen et al.1992)(53)

• Hay sử dụng giải pháp phun xịt dầu khoáng dể ngăn chặn vector truyền virus theo kiểu không bền vững (R.M.Solomon-blackburn và H.Barker, 2000)(48)

Ngoài ra, việc áp dụng biện pháp trồng trọt cũng có hiệu quả khắc phục

sự thoái hóa khoai tây do nhiễm virus (Guilley và Lehingrat,1986 )(17)

• Chọn vùng trồng thích hợp, vùng có khí hậu ôn hòa, mát mẻ, thường xuyên có gió chống rệp Tránh trồng lại ở các vùng ñất ñã trồng cây họ cà trước ñó

• Sử dụng các giống sạch thay cho giống bị bệnh trước, thường xuyên kiểm tra và vệ sinh ñồng ruộng, nhổ bỏ cây bị bệnh

• Chủ ñộng phòng trừ môi giới truyền bệnh, áp dụng biện pháp kỹ thuật cạnh tác, biện pháp phòng trừ tổng hợp và biện pháp sinh học ñể phòng trừ

2.3.3.2 Giải pháp công nghệ sinh học

A Tạo giống khoai tây chuyển gen kháng virus

- Tính kháng bắt nguồn từ gen Cp (CPMR-Coat Protein Mediated Resistance)

Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây ñể tạo giống kháng virus, ñây là hướng nghiên cứu ñầu tiên về tính kháng virus bắt nguồn từ tác

nhân gây bệnh Trong ñó, Hemenway (1988)(20) ñã chuyển nạp thành công gen Cp của PVX vào khoai tây, thu ñược kết quả tạo khoai tây chống chịu virus PVX

Cơ chế của tính kháng là chống lại sự tích lũy virus trong cây Kawchuk et al (1991)(28) chứng minh nồng ñộ virus PLRV ở cây chuyển gen

Cp rất thấp chỉ khoảng 1% giống như cây ñối chứng trong giai ñoạn tiền xâm nhiễm

Tính kháng CPMR thường là tính kháng ñặc hiệu dòng virus, nhưng không phải tất cả (Okanoto et al 1996)(43) Chúng có thể kháng ñược nhiều dòng virus khác và ít nhất là kháng với chính dòng virus mang gen chuyển ñó

Một số dòng chuyển gen Cp ñã ñược kiểm tra về ñặc tính kháng virus trên ñồng ruộng và ñã xác nhận kháng virus: PLRV ở Austrailia (Graham et al 1993)(19), ở Mỹ (Thomas et al, 1997)(52), ở Canada (Kawchuk et al, 1991) (28) và kháng virus PVX ở Switzerland (Mal noe et al, 1994)(32), ở Hà Lan (Van Den Elzen et al, 1993)(54)

Tuy nhiên, tính kháng CPMR chỉ có hiệu quả với nhóm virus xâm nhập qua lây nhiễm cơ giới, không kháng ñược nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng ñối với trường hợp kháng dòng virus PVY (Lawson et al, 1990) và kháng TRV (Ploeg et al, 1993)(44)

-Tính kháng bắt nguồn từ protein di chuyển

Virus mã hóa một số loại protein di chuyển hỗ trợ sự lây lan của virus trong cây Khi ñó các phân tử protein này chính là mục tiêu trong tạo giống kháng virus

Vào năm 1996, Tacke ñã chuyển trình tự gen ORF của virus PLRV sang cây khoai tây, gen này mã hóa cho protein pr17 giúp virus di chuyển trong mạch phloem Dòng khoai tây chuyển gen có biểu hiện ñột biến protein

pr17 thì kháng ñược với virus PVX, PVY Ngược lại, dòng không có ñột biến trên thì chỉ kháng virus PLRV nhưng không kháng PVX và PVY Khi tiến hành kiểm tra về tính kháng với virus PLRV của các cây chuyển gen thấy ñược lượng kháng nguyên (virus) trong cây giảm rõ rệt Qua nghiên cứu này Tacke chứng minh tính kháng PLRV ñược kiểm soát ở mức RNA, trong khi

ñó tính kháng PVX và PVY là tính kháng bắt nguồn từ protein ñược mã hóa của tác nhân gây bệnh Do ñó, những cây tích lũy protein này sẽ kháng ñược

sự lây nhiễm của nhiều loại virus khác nhau, PVY và PVX Cơ chế kháng này không mang tính ñặc hiệu dòng virus

-Tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản (Replicase (polymerase) mediated

resistance)

Năm 1990, nhà khoa học Golemboski ñã chuyển vùng gen polymerase

của virus TMV (Tobacco Mosaic tobamovirus) vào cây khoai tây, gen này tạo

ra tính kháng virus theo cơ chế “tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymerase” Tiếp ñó, hàng loạt nghiên cứu về chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus và tương tự như cơ chế kháng trên ñối với nhiều loại virus khác nhau, virus PVX (Braun và Hemenway 1992; Longstaff et al 1993)(20), kháng PVY (Audy et al 1994) Nguyên lý của phản ứng kháng là

sự ức chế quá trình tái bản của virus (Braun và Hemenway 1992; Mueller et al.1995)(20) Nghiên cứu của Mosanto (1994) ñã chuyển vùng gen polymerase PLRV vào khoai tây Các dòng chuyển gen biểu hiện toàn bộ gen chuyển polymerase và kháng tốt với virus PLRV.Cho tới nay cơ chế kháng này vẫn chưa ñược hiểu rõ ràng

-Tính kháng theo cơ chế làm câm gen hậu phiên mã

(PTGS-Postranscriptional Gene Silencing)

Trong một số trường hợp tính kháng chuyển gen bắt nguồn từ quá trình

phiên mã RNA tỏ ra ưu thế hơn phương pháp gen mã hóa protein cũng như một vài phương pháp trên Dougherty năm 1994 cho biết các cây chuyển gen

Cp của virus TEV (Tobacco etch potyvirus) không ñược dịch mã thì có biểu

hiện tính kháng hoặc nhiễm với virus TEV sau vài tuần lây nhiễm Ông giải thích hiện tượng trên là do sự phân giải RNA chuyển gen hậu phiên mã ñã xảy ra trong cây, lượng RNA bị giảm mặc dù gen chuyển ñã ñược phiên mã Tiếp ñó, tính kháng virus PVX bằng phương pháp chuyển gen RNA polymerase ñược nghiên cứu bởi Mueller (1995) Kết quả cho thấy những cây

có tính kháng cao nhất với virus PVX thì lượng polymerase là thấp nhất và số bản sao của gen chuyển nhiều Tính kháng không ảnh hưởng ñến sự phiên mã của gen chuyển Cơ chế kháng ở ñây là sự làm câm gen sau phiên mã (PTGS) PTGS không những ñược cảm ứng bởi gen chuyển mà còn bởi virus (Baulcombe 1996) và dường như là phản ứng phòng thủ chung của cây trồng

và ñược giải thích theo nhiều cơ chế bảo vệ cây trồng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh (pathoge-derived protection) Nguyên lý của cơ chế PTGS ñược mô

tả theo cơ chế phân giải ñặc hiệu gen chuyển mRNA và RNA mục tiêu, theo

cơ chế PTGS ñòi hỏi hai trình tự RNA có mức tương ñồng cao (English et al 1996)

Hướng nghiên cứu về tính kháng virus PVY ở cây khoai tây, Smith et

al (1994) ñã chỉ ra rằng mức ñộ phiên mã gen ngoại cần thiế ñể khởi ñộng PTGS Có sự tương quan với tăng cường sự giảm RNA (Metzlaff et al 1997; Holtor et al 1999) Do ñó sự giảm mRNA không dẫn tới sự giảm quá trình phiên mã nhưng ảnh hưởng tới giảm sự phân giải (De Carvalho Niebel et al.1995)

Một số virus thực vật mã hóa tạo ra các protein ức chế phản ứng PTGS (Voinenet et al 2000), dẫn tới làm “ñảo ngược” tính kháng của cây Những protein ñược phân thành các nhóm sau:

+ Nhóm 1: Chúng ức chế phản ứng PTGS ở tất cả các mô trong cây

+ Nhóm 2: Chúng ngăn cản sự mở rộng của phản ứng PTGS sang các tế bào mới (Brignetic et al.1998)

+ Nhóm 3: Chúng ức chế sự làm câm gen, bằng việc “khóa” các quá trình tổng hợp tín hiệu làm câm gen có thể khuếch tán

-Tạo giống khoai tây kháng vector truyền virus

Bệnh virus lây lan qua tiếp xúc cơ giới, truyền qua vector (côn trùng, tuyến trùng) trong ñó côn trùng là tác nhân truyền bệnh chính Nên ngoài việc tạo giống kháng virus cần tạo giống kháng côn trùng truyền virus Tính kháng côn trùng truyền bệnh virus dựa trên tổ hợp nhiều yếu tố khác nhau: Yếu tố hóa sinh và ñặc ñiểm hình thái (có lông), ñặc biệt là thành phần glycoalkaloid

Theo nghiên cứu Tingey et al (1978) và Sinden (1982) cho biết hàm lượng glycoalkaloid có mối liên hệ với tính kháng vector truyền bệnh virus, nếu hàm lượng càng cao tính kháng càng mạnh và ngược lại Hợp chất này gây ñộc với một số loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (beetle-insect) ăn lá (Levinson 1976; Raman eta al 1979; Sanford et al 1996)(45)

Một số loài khoai tây dại S berthaultii, S polyadenium, S wittmackii

và S tarijense có ñặc ñiểm mang nhiều lông, có tuyến dính trên lá và thân do

ñó làm giảm tính ăn của loài rệp Macrosiphum persicae nên ñã hạn chế sự

truyền bệnh virus, nhất là virus PVY (Gunenc và Gibson 1980) Ngoài ra tính kháng côn trùng truyền bệnh virus còn phụ thuộc vào tuổi cây trong từng loài,

ñối với nhóm khoai tây dại S brevidens các lá non và lá trưởng thành rất ít bị rệp tấn công ngược lại lá non của S etuberosum lại dễ bị tấn công hơn lá già

nên rất dễ bị nhiễm virus (Valkonen 1992)(53)

Về yếu tố hóa sinh, liên quan ñế men phân giải các hợp chất nào ñó trong ruột côn trùng Trong cây mang ñặc tính kháng côn trùng sẽ sản xuất ra một số enzyme và protein ñặc hiệu khi côn trùng ăn vào trong ruột sẽ gây ức chế quá trình tiêu hóa của chúng, làm cho sâu có biểu hiện chán, ngán ăn, sau vài ngày có thể chết

Phương pháp tạo giống kháng côn trùng truyền bệnh virus cũng rất có

ý nghĩa tuy nhiên chỉ phù hợp với nhóm sâu non ăn lá, ăn thân, ít có ý nghĩa với nhóm côn trùng trưởng thành

B Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

ðối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiểu dòng mang ñặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu ñiểm: Tổ hợp ñược bộ genome của cả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp

tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ ñầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus

Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, theo một số nghiên cứu ñã xác ñịnh có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài

nguyên thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như một số loài

dại không mang củ có ñặc tính kháng virus tốt (Spooner và Hijmans , 2001)

Trong số ñó dòng S etuberosum có ñặc tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen et al, 1992; Thieme et al, 2000)(53)(45), S tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme et al, 2003)(46), loài khoai tây S cardiophyllum

Lindl và S etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes,

1990) thể hiện tính kháng cao với nấm Phytophthora infestans (Hanneman và

Bamberg 1986) Chúng ñược thu thập và thăm dò về tính kháng virus và tác

nhân gây bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng ñịnh 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩa ðây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâu

Rất khó khăn ñể có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng Châu Âu bằng lai hữu tính, do ñó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu

hiệu ñể ñưa nguồn gen ñó vào quỹ gen của loài S Tuberosum, vượt qua ñược

tính không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống (Millam et al, 1995)(35) Sự dung hợp giữa tế bào trần

của loài khoai tây dại không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S

Tuberosum tạo con lai soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus

và kháng vector truyền bệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et

al, 1988; Pehu et al, 1990; Vankonen et al, 1992)(53)(40)

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các biến ñổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi vector (Thieme et al, 2000)(45) Một số con lai soma ñược lai lại thành công với dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng (Willliams et al, 1992; Helges et al, 1993; Thieme et al, 2000)(45) Hàng loạt con lai soma của

S etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY

(Novy và Helgeson, 1994)(39) và tính rất kháng với PVX (Gavlirenco et al, 2003)(17) Nghiên cứu của Polgar et al (2002)(44) ñã tạo ñược 150 dòng lai

soma giữa thứ khoai tây Hungari và S brevidens cùng một vài thế hệ BC Kết

quả cho thấy rằng tất cả con lai và hầu hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV

Một nghiên cứu mới mẻ của Thieme et al (2010)(47) cho biết loài khoai

tây dại S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện tính rất kháng với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera

infestans Khi ñó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc

loài S tuberosum ñể tạo thể lai mới kế thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại

S tarnii

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phương pháp lai soma có nhiều ưu ñiểm và hiệu quả hơn cả Về phương pháp lai hữu tính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo ðối với phương pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khi chuyển gen kháng virus vào cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng (Cockerham, 1970; Ross, 1986; Jones 1990; Mendoza et al, 1990)(49) mà còn xuất hiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt ñộng của cây chủ Nhược ñiểm của phương pháp chuyển gen là mang tính kháng ñặc hiệu dòng virus, dễ

bị phá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng ñộ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng (Anderson et al, 1989; Stark và Beachy, 1989)

ðể có thể giải quyết vấn ñề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, trong ñó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vector truyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

2.4 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

2.4.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới

Thật là lý tưởng cho công cuộc chống thoái hoá khoai tây do virus gây

ra nếu con người chọn tạo ra các giống có khả năng chống virus Chính vì thế

các nghiên cứu tạo giống chống chịu virus ñã ñược tiến hành gần một thế kỷ nay Từ lâu công việc ñó ñã thu ñược kết quả ñối với virus A và X Do vì việc phòng chống các mô giới truyền bệnh – rệp gặp khó khăn, nên các nghiên cứu tập trung vào việc tạo ra các giống chống chịu virus Y và virus cuốn lá ( PLRV) ðây là hai virus ñược truyền vào cây qua rệp Quá trình chọn tạo

giống khoai tây Slanum tuberosum L bằng các phương pháp kinh ñiển như lai

tạo, ñột biến, chọn lọc Vấp phải những khó khăn về mặt di truyền Trên cơ sở

bộ genom tứ bội (tetraploid) (2n=4x=48 NST) tạo ra tỷ lệ phân li lớn sau lai tạo, khiến quá trình chọn lọc sau ñấy rất khó khăn với một quần thể rất lớn Quá trình tạo một giống mới tốn rất nhiều công sức và thời gian Tối thiểu phải trên 10 năm ñể ra ñời một giống mới Mặt khác, các ñặc tính di truyền ña gen cần ñược chuyển nạp khi lai tạo giữa các dòng hoang dại và dòng trồng trọt thường bị thất thoát nhiều, thậm chí mất hẳn qua quá trình giảm phân của các thế hệ con cháu Ngay từ 1963, Chase ñã ñề nghị một sơ ñồ tạo giống khoai tây, dựa trên khả năng giảm mức bội thể xuống nhị bội (diploid) Khoai tây nhị bội(2n=2x=24 NST) có thể thu ñược qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

từ các dòng tứ bội Thể nhị bội này cũng có thể thu ñược theo con ñường mẫu

sinh (Parthenogenese) khi lai khoai tây tứ bội với khoai tây dại Solanum

phureja Việc ñưa các thể nhị bội vào công tác giống khoai tây ñã làm ñơn

giản hoá tỷ lệ phân ly sau lai tạo Hơn nữa nhờ có kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn

từ các dòng nhị bội này lại có thể thu ñược các dòng ñơn bội (monohaploid 1n=1x=12 NST) Thể ñơn bội này sau khi nhân ñôi nhiễm sắc thể sẽ trở thành nhị bội ñồng hợp tử Những vật liệu nhị bội ñồng hợp tử này là những vật liệu khởi ñầu rất quan trọng cho việc tạo giống chống chịu

Tuy nhiên chọn tạo giống trên cơ sở những dòng nhị bội này gặp phải hai khó khăn chính :

+ Khả năng thụ tinh của các thể nhị bội bị giảm mạnh ,ñôi khi bất thụ

+ Khi trở lại dạng trồng trọt (tứ bội ) bằng cách nhân ñôi một cách ñơn giản các thể nhị bội này, sẽ làm giảm ñộ heterozygote, dẫn ñến giảm sức sống và giảm năng suất của cây tứ bội tạo ra (Nguyễn Quang Thạch, 1993)(10)

Hầu hết khoai tây trồng hiện nay thuộc nhóm cây tứ bội (2n=4x=48),

do ñó muốn dung hợp ở mức nhị bội cần giảm ñộ bội xuống trước khi tiến hành lai soma bằng kỹ thuật nuôi cây bao phấn

Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào trần (Wenzzel

sơ ñồ tạo giống này là sự dung hợp của hai tế bào trần nhị bội (2x) ñể tạo con lai soma tứ bội (4x) Thể tứ bội này có thể ñược nhân vô tính và trở thành một giống ổn ñịnh (Diemling, 1989) Mặt khác thông qua dung hợp tế bào trần hàng rào lai tạo giữa các cây xa nhau về mặt di truyền cũng ñược khắc phục

Việc nghiên cứu tái sinh tế bào trần khoai tây ñược rất nhiều tác giả quan tâm (Binding và Nehls, 1977; Binding et al, 1978; Bokemaln và Roest, 1983; Schuchman, 1985) Theo hướng giáo sư Wenzel ñã ñề xuất , các công trình nghiên cứu về dung hợp tế bào trần cũng dần ñược tăng lên Công trình

nổi tiếng của Melchers et al (1978) về lai soma giữa loài khoai tây S

tuberosum và cà chua lycopersicom esculentum là một mở ñầu về hàng loạt

các nghiên cứu về dung hợp giữa loài khoai tây dại với khoai tây trồng vốn không thể tiến hành bằng con ñường lai hữu tính Butenko và Kuchko (1980)

(16) ñã tiến hành dung hợp tế bào trần S tuberosum với S chacoense mang

ñặ tính kháng virus PLRV (Browwn và Thomas ,1979) tạo con lai soma mang ñặc tính rất kháng với dòng virus PLRV Nhiều tác giả (Barsby et al, 1984; Austin et al, 1985; Helgeson et al, 1986; Fish et al, 1987)(40) ñã tập trung

nghiên cứu sử sụng S brevidens như một ”partner” nghiên cứu vì giống này

chống chịu với rất tốt với virus PVX và PVY Khi ñó các ông tiến hành lai

soma giữa S brevidens với loài khoai tây trồng S tuberosum nhằm tạo con lai

mang ñặc tính kháng hai loại virus ñó

Việc xác ñịnh các con lai soma hetezygote là rất cần thiết sau dung hợp

tế bào trần Trước tiên cần xác ñịnh ñộ bội của các thể lai, tiếp ñó bằng các phương pháp di truyền như AFLP, RAPD, RELP, PCR, Isozym… có thể xác ñịnh chính xác con lai soma hetezygote tổ hợp bộ genome của cả bố và mẹ dung hợp Ngoài ra, ñể xác ñịnh con lai soma, một số tác giả ñề xuất và nghiên cứu thành phần, hàm lượng alkaloid trong cây lai

Nghiên cứu của Pehu et al (1990) về dung hợp protoplast giữa S

tuberosum và S brevidens ñã tạo con lai soma thành công ðể xác ñịnh con

lai soma ông tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ

bao gồm solanidine và slanthrene của S tuberosum, tomatidine của S

brevidens (Laurila et al 1996) ñều có mặt trong cây lai So sánh với bố mẹ,

cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S tuberosum nhưng

hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/100g tươi

N.Q.Thach, U Frei và G Wenzel (1993)(42) ñã tạo thành công con lai

soma mang ñặc tính kháng virus giữa các nhóm khoai tây thuộc loài Solanum

tuberosum L, xác ñịnh con lai soma bước ñầu ñánh giá ñộ bội bằng phương

pháp ñếm nhiễm sắc thể, sau ñó tiến hành phấn tích isozym esterase và peroxidase (Deimling et al 1988), kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) Kết quả cho thấy các con lai ñều có sự biểu hiện của 2 allele trội ñơn gen Rx và

Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Với tổ hợp lai ñiển hình giữa S tarnii (2n=2x=24) và S etuberosum cv

Delikat ñã ñược dung hợp xung ñiện thành công Con lai soma tạo thành ñược

xác ñịnh ñộ bội bằng máy Flow Cytometry, xác nhận con lai soma hetezygote bằng kỹ thuật SSR, chỉ thị AFLP và phân tích ña hình isozym Những cây lai

soma ñều biểu hiện tính rất kháng với dòng virus PVY và kháng nấm P

infestans rất tốt qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction) Thế hệ

BC1 và BC2 cũng biểu hiện tính kháng virus và kháng nấm cao, không những vậy tính kháng này rất bền vững ở cả con lai và thế hệ BC (Ramona Thieme; Elena Rakosy–Tican; Tatjana Gavrilenko; Thomas Thieme 2007)(45)

Bảng 2.4 Tổng hợp nghiên cứu dung hợp protoplast trên cây khoai tây

Tổ hợp ñặc tính tốt, trưởng thành muộn, sản lượng cao

Waara et al 1992(56)

Tổ hợp gen kháng Rx và Ry trong thể lai soma tứ bội

Thach et al 1993(10)

Tổ hợp tính chất sản lượng cao và hình dạng củ ñẹp cùng với tính kháng tuyến trùng có khả năng kết bào xác

Novy and Helgeson 1994(39)

S tuberosum dihaploid +

S brevidens dihaploid

Chuyển gen kháng bệnh virus PRLV sang quỹ gen của khoai tây trồng

Austin et al 1985