dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền để phân loại một số loài sán lá đơn chủ (monogenea) thuộc họ diplectanidae ký sinh trên cá mú (epinephelus spp.) tại khánh hòa

Đặc điểm hình thái và mức độ cảm nhiễm của các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae Monticelli, 1903 Bychowsky, 1957 ký sinh trên cá mú Epinephelus spp.. Đặc điểm di truyền của các

Trong thời gian vừa qua, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ tận tình từ quýthầy cô, gia đình và bạn bè cả về vật chất và tinh thần, đã tạo điều kiện cho em hoànthành đợt thực tập tốt nghiệp.

Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thúy Bình, thầy Phan Văn

Út đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo trong qua trình thực hiện đề tài này

Xin được cảm ơn các quý thầy cô trong Khoa Nuôi trồng, đặc biệt l à bộ mônBệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho em những kiếnthức trong suốt những năm học vừa qua

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ sinh học

và môi trường, trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho em thực tập tại đây

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè,tập thể lớp 46BH đã luôn động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thựchiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Giải thích thuật ngữ, chữ viết tắt v à ký hiệu

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

Phần 1 TỔNG QUAN 2

1 VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.1 Họ cá mú (Seranidae) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái 2

1.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố 2

1.2 Đặc điểm chung về sán lá đơn chủ (Monogenea) 3

2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SÁN LÁ ĐƠN CHỦ KÝ SINH TRÊN CÁ MÚ (EPINEPHELUS SPP.) 5

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú nói chung 5

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 7

2.2 Tình hình nghiên c ứu họ Diplectanidae (Monogenea, Monopiscotylidae) ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) 9

2.2.1 Trên thế giới 9

2.2.2 Việt Nam 11

2.3 Tình hình nghiên cứu đặc điểm di truyền các loài sán lá đơn chủ 11

Phần 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 13

1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 13

2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái sán lá đơn chủ ký sinh trên cá 14

Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 22

1.1 Mô tả đặc điểm hình thái 22

1.1.1.Giống Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 23

1.1.2 Giống Diplectanum Diesing, 1858 33

1.2 Mức độ cảm nhiễm 37

2 Đặc điểm di truyền các loài Monogenea thuộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 40

Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46

1 Kết luận 46

1.1 Đặc điểm hình thái và mức độ cảm nhiễm của các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae (Monticelli, 1903) Bychowsky, 1957 ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46

1.2 Đặc điểm di truyền của các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46

2 Đề xuất ý kiến 47

2.1 Về nghiên cứu bệnh sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú 47

2.2 Về nghiên cứu di truyền 47

Tài liệu tham khảo 48 Phụ lục

CĐCN : cường độ cảm nhiễm

TLCN : tỷ lệ cảm nhiễm

DNA : deoxyribonucleic acid

Bp : base pair - cặp bazơ

MCO : male copulatory organ – cơ quan giao cấu đực

n subfam : new subfamily – họ phụ mới

Vdd : thể tích dung dịch

Vagina : cơ quan giao cấu cái

lsr : large subunit ribosomal – ribosome tiểu phần lớn

ssr : small subunit ribosomal – ribosome tiểu phần nhỏ

Mồi : là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với

một đầu của mạch khuôn v à DNA polymerase sẽ nối dài mồi đểhình thành mạch mới [2]

Bảng 2.1 Số lượng và kích cỡ các mẫu cá mú 13 Bảng 2.2 Thành phần và thể tích dd ly trích 18 Bảng 2.3 Thành phần và thể tích dd dùng cho phản ứng PCR 19 Bảng 3.1 Thành phần loài Monogenea thuộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957

ký sinh trên mang cá mú (Epinephelus spp.) 22

Bảng 3.2 Kích thước các loài ký sinh trùng thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên

cá mú (Epinephelus spp.) 35

Bảng 3.3 Tên tác giả, năm công bố và số serries trình tự gen của các loài sán lá

đơn chủ tại ngân hàng gen 41

Hình 1.1 Vòng đời của sán lá đơn chủ 4 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 14 Hình 2.2 Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) 16

Hình 3.1 Loài P coioidesis Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999.

A – toàn bộ cơ thể; B – cơ quan giao cấu đực;

C – cơ quan giao cấu cái; D – hình chụp cơ quan giao cấu 24

Hình 3.2 Cơ quan giao cấu đực và cái của loài P cupatus 24 Hình 3.3 Loài P cupatus A – giác bám và đĩa bám; B – cơ thể;

C – giác bám; D – cơ quan giao cấu đực; E – thanh nối bụng;

F – thanh nối lưng; G – móc bám bụng; H – móc bám lưng 25

Hình 3.4 Loài P mellanesinensis A – giác bám và đĩa bám;

B – giác bám; C – thanh nối bụng; D – thanh nối lưng;

E – móc bám bụng; F – móc bám lưng 26

Hình 3.5 Loài P mellanesinensis A – cơ quan giao cấu đực và cái;

B – cơ quan giao cấu cái; C – trứng; D – dạng ấu trùng; E – cơ thể 26

Hình 3.6 Loài P summanoides, A – Cơ quan giao cấu đực và cái;

B – Toàn bộ cơ thể; C – Đĩa bám 27

Hình 3.7 Loài P summanae Young, 1969 28 Hình 3.8 Loài P epinepheli Yamaguti,1938 A, B – cơ thể; C – dạng ấu trùng 29 Hình 3.9 Loài P epinepheli Yamaguti,1938 A – giác bám và đĩa bám;

B – trứng; C – cơ quan giao cấu cái 29

Hình 3.10 Loài P lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981.

A – cơ quan giao cấu đực và cái; B - Các biến dị của cơ quan giao cấu cái 30

Hình 3.11 Loài P lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981 31 Hình 3.12 Loài P sp 1 31 Hình 3.13 Loài P sp 1 Giác bám và đĩa bám 32

B – Cơ quan giao cấu đực 34

Hình 3.16 Loài Diplectanum grouperi A – đẻ trứng;

B – cơ quan giao cấu đực và trứng 34

Hình 3.17 Biểu đồ cường độ cảm nhiễm các loài Monogenea trên cá Mú Đen (E.

coioides) nuôi và tự nhiên 37

Hình 3.18 Biểu đồ tỷ lệ cảm nhiễm các loài Monogenea

trên cá Mú Đen (E coioides) nuôi và tự nhiên 38

Hình 3.19 Biểu đồ mức độ cảm nhiễm của một số lo ài Monogenea

trên các loài ký chủ đặc hữu 39

Hình 3.20 Cây phát sinh loài 43 Hình 3.21 Cơ quan giao cấu đực của một số loài thuộc giống

Pseudorhabdosynochus và Diplectanum 44

xuất giống cá chẽm và một số đối tượng quan trọng khác như cá Mú Đen (Epinephelus

coioides), cá Mú Mè (E malabaricus), cá Hồng Vân Bạc (Lutjanus arhentinaculatus),…[36] Hiện nay, phong trào nuôi cá biển phát triển rộng khắp trên thế

giới với sản lượng hàng năm tăng nhanh Theo dự báo đã được công bố, nghề nuôi cábiển sẽ phát triển nhanh và đạt tới sản lượng từ 3,5 – 4 triệu tấn năm 2010 [52] Nước ta

đã và đang mở rộng diện tích nuôi cũng như các đối tượng nuôi cá biển tuy nhiên vẫn chỉtập trung ở một số tỉnh có lợi thế về biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, KhánhHòa, Ninh Thuận, Bình Thuận [3] Trong đó, Khánh Hòa là địa phương nuôi cá biểnphát triển mạnh trong cả nước, cá được nuôi tập trung ở huyện Cam Ranh, huyện VạnNinh và Vũng Ngán [16] Cùng với sự phát triển nhanh chóng đó thì dịch bệnh bùngphát đã làm tổn thất kinh tế ở nhiều nước trong khu vực và trên thế giới

Bệnh KST là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra nhiều lo ngạicho nghề nuôi cá biển nói chung và nghề nuôi cá mú nói riêng Với điều kiện nhưhiện nay, phòng chống dịch bệnh đang trở thành nhu cầu bức bách Muốn phòng trịbệnh có hiệu quả tốt thì cần phải hiểu biết rõ về đối tượng gây hại Chính vì thế, em

đã thực hiện đề tài: “Dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền để phân loại một

số loài sán lá đơn chủ (Monogenea) thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú

(Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa” với các nội dung như sau:

- Mô tả đặc điểm hình thái các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae ký

sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa.

- Lập cây phát sinh loài, so sánh đặc điểm di truyền của các loài sán lá đơn chủthuộc cây phát sinh loài

Phần 1 TỔNG QUAN

1 VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1 Họ cá mú (Seranidae)

Cá mú là một trong những loài cá biển có giá trị kinh tế cao, sống ở v ùngbiển nhiệt đới và cận nhiêt đới Hiện nay có nhiều loài đang trở thành những đối

tượng nuôi quan trọng như cá Mú Mè (Epinephelus bleekeri), cá Mú Cọp (E.

fuscoguttatus), cá Mú Chấm Đỏ (E akaara), cá Mú Chuột (Cromileptes altivelis)…

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Fao, 2003 những loài cá mú trong nghiên cứu có vị trí phân loại như sau:

Ngành VertebrataLớp Osteichthys

Bộ Perciformes

Họ Serranidae

Giống Epinephelus Loài Epinephelus spp.

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cá mú rất đa dạng về màu sắc, vân chấm, kích thước và hình dạng thân Chúng

có thể thay đổi các đặc điểm này theo từng giai đoạn, trạng thái sinh lý hay môi trường.Tuy nhiên, cá mú có những điểm chung như: thân hình thoi cân đối, miệng rộng, hàmdưới nhô ra hướng lên trên, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn Cá mú thường chỉ có một vâylưng với từ 7-11 tia vây cứng và 10-21 tia vây mềm Vây hậu môn có 3 gai cứng, conđực hơi dài hơn so với con cái Nắp mang có 3 gai cứng [10][14][30]

1.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố

Họ cá mú (Serranidae) có 75 giống và trên 400 loài sống chủ yếu ở vùngbiển cận nhiệt đới, nhiệt đới Thái B ình Dương, Đại Tây Dương và Ấn Độ Dương.Tại Việt Nam tìm thấy 48 loài thuộc 11 giống, trong đó có khoảng 14 loài thuộc

giống Epinephelus với nhiều loài đang là đối tượng nuôi phổ biến Điều này cho

thấy thành phần giống loài cá mú tại Việt Nam khá phong phú [10]

Cá mú là loài thích sống đáy, nơi có rạn san hô và đá ngầm Đa số các loài phân

bố ở độ sâu nhỏ hơn 100m Chúng là loài rộng muối, có thể sống được ở độ mặn từ 45‰, tốt nhất ở 20-30‰, sinh sản và phát triển ở 15-35oC, thích hợp nhất là 24-30oC

15-Cá mú là cá dữ, trong tự nhiên thức ăn chủ yếu của chúng là các loài giáp xác, cá, vàđộng vật không xương sống, tập tính bắt mồi đặc trưng là rình ở các khe đá, bụi rong

và bụi san hô Cá mú có tốc độ sinh trưởng khá nhanh, cá giống 30-50 g nuôi sau 6-8tháng đạt 500 g - 1 kg Nhưng tốc độ này lại khác nhau giữa các loài: ví dụ cá Mú Nghệ

(Epinephelus laceolatus) đạt 3-4 kg/năm, trong khi đó cá Mú Son (Cephalopholis

miniata) chỉ 0,3-0,4 kg/năm Cá mú còn có đặc điểm chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là

con cái, sau một thời gian chuyển thành con đực Thời điểm và kích thước chuyển đổikhông giống nhau giữa các loài khác nhau [1][15][31]

1.2 Đặc điểm chung về sán lá đơn chủ (Monogenea)

Trên thế giới, có khoảng 1500 loài sán lá đơn chủ khác nhau [34], chúng là kýsinh trùng ngoại ký sinh được tìm thấy trên bề mặt cơ thể (như: mang, da, vây, niêmmạc miệng, mũi và mắt cá) Sán lá đơn chủ có chu kỳ phát triển trực tiếp, khôngqua giai đoạn ký chủ trung gian, không xen kẽ thế hệ v à cũng không thay đổi kýchủ Sán lá đơn chủ hút chất nhầy, biểu mô hoặc máu của ký chủ [ 7][8]

Nhìn chung, cơ thể sán lá đơn chủ có kích thước nhỏ, kích thước chiều dài

khoảng 0.5- vài mm Chẳng hạn như sán lá ký sinh ở mang (Pseudorhabdosynochus spp., Diplectanum spp.,…) kích thước nhỏ hơn 1mm; một số giống loài sán lá ký sinh ở da (như Benedenia spp., Neobenedenia spp.…) kích thước từ 2-6mm có thể

nhìn thấy bằng mắt thường Tuy nhiên, có những loài kích thước rất lớn thuộc họ

Capsalidae (Capsala martinieri 27 × 23 mm, Yamaguti 1963, p 116; E hippoglossi

24 × 11 mm, Yamaguti 1963, p 126; N sturionis 13–14 × 5–6 mm, Yamaguti

1963, p 133) [45][34]

Các giống loài sán lá đơn chủ ký sinh trên cá nước ngọt hình dạng ít thay đổi,thường là hình phiến lá, hình sợi mảnh hay bầu dục [1] Cơ thể sán lá đơn chủ

không có gai, bên ngoài bao bọc bởi lớp nguyên sinh chất hợp bào mỏng, trong suốt

do tế bào thượng bì phân tiết tạo thành đó là các tầng cơ để bảo vệ cơ thể và giúp cơthể vận động được Phía trước cơ thể có miệng, cơ quan đầu có tác dụng hút thức ăn

và vận động Cơ quan tiêu hóa, sau miệng là hầu, thực quản, ruột hình ống thẳnghoặc phân làm hai nhánh [8]

Phía sau cơ thể sán lá đơn chủ có đĩa bám (haptor), cấu tạo gồm các móc lớn ởgiữa (anthor) và các móc rìa (marginal) ở xung quanh, bám sâu và phá hoại tổ chức

cơ thể của ký chủ mở đường cho vi khuẩn, nấm và các vi sinh vật xâm nhập vào gâyviêm loét tổ chức, hút máu và niêm dịch kích thích cơ thể ký chủ phân tiết ra cácsản vật, phá hoại cơ năng hoạt động sinh lí bình thường của vật chủ Đĩa bám sau cócấu tạo phức tạp và là căn cứ chủ yếu để phân loại các giống loài của sán lá đơnchủ Thông thường đĩa bám sau có 3 dạng : đĩa bám do chất kitin hình thành nhiều móclớn và móc nhỏ (Diplectanidae, Dactylogyridae; Gyrodactylidae); đĩa bám phân th ànhnhiều ngăn, sắp xếp đối xứng, mỗi ngăn có tác dụng hút t hức ăn (Capsalidae…) và đĩabám sau do chất kitin tạo thành đồng thời giữ lại các móc câu thời kì hậu ấu trùng(Diclyleothriodae; Mazocraeidae; Discocotylidae; Diplozonidae…) [7]

Ngoài ra, một số loài có tuyến ở phía sau tiết ra niêm mạc dịch Hệ thần kinh

và hệ bài tiết đơn giản Cơ quan sinh dục của sán lá đơn chủ đực và cái trên cùngmột cơ thể Cơ quan sinh dục đực có từ 1 đến nhiều tinh ho àn, thường nằm ở saubuồng trứng và giữa hai nhánh ruột, ống dẫn tinh liền với cơ quan giao cấu thôngđến xoang sinh dục ở phía trước cơ thể Cấu tạo của cơ quan giao cấu cũng là tiêuchuẩn quan trọng để phân loại đến lo ài Lỗ sinh dục ở giữa hoặc một bên phía sauđoạn ruột bắt đầu phân nhánh Cơ quan sinh dục cái có buồng trứng, ống dẫn trứng,

tử cung đến xoang sinh dục, tuyến no ãn hoàng cũng phát triển [7][8]

Chu kỳ phát triển của hầu hết giống lo ài sán lá đơn chủ là đẻ trứng, số ít đẻ

con (Gyrodactylus) Trứng trong cơ thể sau khi thụ tinh theo lỗ sinh dục ra ngo ài,

nhờ cấu tạo có cuống nên nổi lên mặt nước, bám lên mang cá hay các vật bám trongnước Sau một thời gian trứng nở ra ấu ra tr ùng, cơ thể ấu trùng dài có 4 điểm mắt,4-5 nhóm lông tơ Nhờ lông tơ, ấu trùng có thể vận động trong nước, tìm gặp và

bám vào mang, xoang miệng, da ký chủ Ở nhiệt độ 14 -15oC cứ 33 phút đẻ mộttrứng nhưng nếu nhiệt độ nâng lên 20 -24oC chỉ cần 15 phút Khi nhiệt độ 30oC trởlên, quá trình đẻ trứng bị ức chế Thời gian nở của trứng cũng phụ thuộc rất lớn v àonhiệt độ của nước [8][16].

Sán lá đơn chủ xuất hiện nhiều trên cá thường là chỉ thị của hệ thống nuôinghèo nàn và chất lượng nước kém Sán lá đơn chủ sinh sản rất nhanh trong điềukiện nuôi cá với mật độ cao, hàm lượng ammonia hay nitrite cao, ô nhiễm hữu c ơhoặc hàm lượng oxy thấp, số lượng của các loài sán lá đơn chủ đẻ con sẽ tăng lêngấp đôi trong khoảng 24h Tỷ lệ sinh sản cũng có thể điều khiển đ ược bằng nhiệt

độ, mặc dù không khác nhau ở vùng nước nhiệt đới (giới hạn hẹp về nhiệt độ) [25]

2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SÁN LÁ ĐƠN CHỦ KÝ SINH TRÊN

Việt Nam từ đầu những năm 1970 [26] Đến sau những năm 80, công nghiệp nuôi

cá biển ở khu vực này đã gặp phải những vấn đề về bệnh dịch nghiêm trọng, đặc

biệt ảnh hưởng tới cá mú (Epinephelus spp.) và cá chẽm (Lates calcarifer) Quy mô

lớn về hợp tác quốc tế sản xuất con giống cũng nh ư sự mở rộng các trại cá lànguyên nhân chính gây ra một số bệnh KST Gây hại cá nước mặn chủ yếu là sán láđơn chủ, đặc biệt là các giống loài thuộc họ Capsalidae và Diplectanidae [36].Ngoài ra, có nhiều giống loài Monogenea thường xuyên ký sinh trên cá mú nuôi ở

Đông Nam Á thuộc họ Diplectanidae (Pseudorhabdosynochus epinepheli, P.

coioideis, P lantauensis , Diplectanum spp.) ; Capsalidae (Allobenedenia spp., Benedenia spp., Neobenedenia spp.) ; Dactylogyridae (Dactylogyrus spp., Haliotrema spp.) [31][34].

Cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90, nghề nuôi cá mú trong lồng nổi ở ĐôngNam Á bị ảnh hưởng bởi một bệnh gọi là bệnh “cá mú ngủ” Cá bị bệnh không códấu hiệu gì đặc biệt trừ thân cá chuyển màu tối hơn và chết, chủ yếu vào ban đêm.Kiểm tra những con cá màu tối này phát hiện thấy bị cảm nhiễm rất nặng bởi sán láđơn chủ thuộc Capsalidae [35] và do đó đã mở đường cho tác nhân cơ hội như virus

và vi khuẩn [36]

Ogawa và cộng sự, 1994 đã đưa ra bảng tổng kết về sự cảm nhiễm B.

epinepheli trên một số loài cá biển Nhật Bản, trong đó có các lo ài cá mú như Epinephelus akaara, E moara, E suillus, E septemfasciatus [32] Tại Malaysia, 2

loài sán lá đơn chủ A epinepheli và Benedenia sp là nguyên nhân gây chết cá mú

nuôi được báo cáo bởi Leong, 1994 [34], năm 1995, ông và cộng sự đưa ra thêm

một kết luận là hầu hết cá mú đều cảm nhiễm bởi P epinepheli [38]

Cá bị nhiễm nặng sán lá đơn chủ có thể bị mù mắt, xuất huyết, tổn thương tơmang ảnh hưởng tới hô hấp hoặc gây lở loét tr ên da mở đường cho các tác nhân cơhội khác xâm nhập gây bệnh Bệnh này có thể gây chết hàng loạt cá con cỡ 10-15cm, cũng có thể gây chết cá lớn nếu c ường độ cảm nhiễm cao [36] Theo Y.Danayadol, 1994 cá mú nuôi lồng ở giai đoạn nhỏ thường bị thiệt hại do sán lá đơnchủ, đặc biệt là khi chất lượng nước kém Bệnh phổ biến vào mùa khô khi độ mặn

của nước lên cao (33-35 ppt) Ở giai đoạn đầu khi bị bệnh, da cá chuyển màu đensạm và tới giai đoạn cuối thì bên ngoài bị tổn thương, tuy nhiên tỉ lệ chết thấp hơn

30% Những con cá bị thương tổn tìm thấy chủ yếu là loài Dactylogyrus spp [49].

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 2001, ở vịnh Hạ Long, Bùi Quang Tề tìm thấy 4 giống ký sinh trùng,

trong đó 1 giống thuộc họ Diplectanidae là Pseudorhabdosynochus; 3 giống khác là

Ancyrocephalus, Benedenia và Haliotrema ký sinh trên cá mú nuôi lồng [8].

Nguyễn Thị Muội 1980, Đỗ Thị Hòa 2002, Phan Văn Út 2006, đã phát hiện

loài B epinepheli ký sinh trên cá mú nuôi ở Khánh Hòa gây ra bệnh mè cá Ngoài

ra, trên da của cá biển tự nhiên cũng bắt gặp loại ký sinh trùng này ký sinh với cácthành phần giống loài khác nhau [8][16] Tại vịnh Hạ Long, Quảng Ninh và Cát Bà,

Hải Phòng, Benedenia spp cũng đã được Bùi Quang Tề phát hiện là tác nhân gây

chết hàng loạt cho cá mú nuôi bè [8]

Kết quả nghiên cứu về KST ký sinh ở cá mú (Epinephelus spp.) nuôi lồng tại vịnh Hạ Long của Bùi Quang Tề và ctv cho thấy loài sán lá đơn chủ P epinepheli

và Ancyrocephalus sp ký sinh ở mang của 3 loài cá (Mú Mỡ (Epinephelus tauvina),

Mú Chuối (E resfaxciatus), Mú Sáu Sọc (E moara) với tỉ lệ cảm nhiễm cao 71,4%

– 93,8% [7] Phan Văn Út, 2006 cho biết các bệnh do Monogenea ký sinh ở cá múnuôi tại Khánh Hòa có tần số bắt gặp cao: 71,4% hộ phỏng vấn gặp bệnh m è cá (do

Benedenia và Neobenedenia ký sinh trên da) và 60,3% gặp bệnh sưng mang [16].

Bệnh do sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú là một bệnh khá nguy hiểm nên đã

có rất nhiều thử nghiệm phòng trị bệnh này, tham khảo một số phương pháp sau:Biện pháp phòng bệnh: Sán lá đơn chủ là tác nhân gây bệnh ký sinh trùng rấtphổ biến trên cá mú (và cá giò) ở hầu hết các giai đoạn khác nhau từ cá giống đến

cá nuôi thương phẩm Việc điều trị nhóm tác nhân gây bệnh sán lá đ ơn chủ gặpnhiều khó khăn do các loại hoá chất chỉ có khả năng tiêu diệt được sán lá đơn chủ ởgiai đoạn đang phát triển mà không có tác dụng ở giai đoạn ấu trùng Thêm vào đó,khi sử dụng hoá chất hoặc tắm cá bằng n ước ngọt, sán lá đơn chủ tách khỏi vật chủ

và bám vào thành lồng nuôi Khi có điều kiện thuận lợi chúng lại tấn công vật chủ

Vì vậy, việc phòng nhóm tác nhân gây bệnh này có ý nghĩa quan trọng Các phươngpháp phòng bệnh chủ yếu đối với nhóm tác nhân gây bệnh sán lá đ ơn chủ là kiểmtra con giống trước khi mua về Cá giống nên được tắm bằng nước ngọt trong thờigian 10-20 phút trước khi thả Trong quá trình nuôi thường xuyên vệ sinh lồng lưới,cũng như vớt bỏ thức ăn thừa hàng ngày, hoặc thay lồng nuôi khi cần thiết.

Biện pháp trị bệnh: kết quả thực nghiệm cho thấy tắm cá bằng n ước ngọt làmột trong những biện pháp có hiệu quả cao trong điều trị bệnh sán lá đ ơn chủ Tuynhiên, việc tắm cá bằng nước ngọt trong 10-25 phút chỉ có tác dụng làm cho sán láđơn chủ rời khỏi vật chủ Vì vậy, nước chứa sán lá đơn chủ sau khi tắm cần được xử

lý bằng 20-30ml chlorin/m3 hoặc 300ml formalin/m3

Việc điều trị bệnh sán lá đơn chủ bằng nước ngọt nên được lặp lại 2-3 lầnvào các ngày tiếp theo nhằm đạt hiệu quả trị bệnh cao Đây l à biện pháp trị bệnh cábiển nuôi lồng rất phổ biến hiện nay, tuy nhi ên sau nhiều lần xử lý bằng nước ngọtmột số loài sán lá đơn chủ có thể thích ứng với nước ngọt Vì vậy, việc tắm cá bằngnước ngọt trong thời gian 10-15 phút, sau đó sử dụng thêm một trong các loại hoáchất sau nhằm tăng hiệu quả trị bệnh nh ư tắm formalin với nồng độ 150-250ml/m3nước hoặc oxy già với nồng độ 150 ml/m3 nước trong 10-15 phút tuỳ theo điều kiệnsức khoẻ cá

Việc điều trị bệnh cá bằng phương pháp tắm thường làm cá bị trầy xước tạođiều kiện cho các tác nhân gây bệnh thứ cấp nh ư vi khuẩn và nấm tấn công Vì vậy,việc kết hợp sử dụng một vài loại thuốc kháng sinh được phép sử dụng trong nuôitrồng thủy sản như Oxytetrecyclin, Erythromycin, Streptomycin tắm cho cá trongthời gian cuối có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng ngừa tác nhân gây bệnh thứcấp tấn công[17].

Biện pháp tắm Oxy già (H2O2) 100 ppm hay formalin (100 ppm) trong 10 - 15phút có hiệu quả khi điều trị bệnh này theo Cruz-Lacierda và ctv, 2004 [7]

Các biện pháp dùng hóa chất để trị bệnh sán lá đơn chủ cho cá ít nhiều cũng sẽảnh hưởng đến sức khỏe cá, đặc biệt khi cá đang bị bệnh Do vậy để phòng bệnh sán

lá đơn chủ cho cá nuôi, các trang trại nuôi cá cần có kỹ thuật quản lý tốt để l àm hạn

chế sự phát triển của ký sinh trùng, ví dụ cắt đứt vòng đời phát triển của chúng, hay

di chuyển cá nuôi ra khỏi vùng có ấu trùng của sán lá đơn chủ [26][19]

2.2 Tình hình nghiên cứu họ Diplectanidae (Monogenea, Monopiscotylidae) ký

sinh trên cá mú (Epinephelus spp.)

2.2.1 Trên thế giới

Họ Diplectanidae Monticelli, 1903 ký sinh trên mang cá xương thuộc họ cávược và có thể gây hại trên toàn thế giới [23], đã có rất nhiều nghiên cứu về khảnăng gây bệnh của một số loài thuộc Diplectanidae [23][37][27] và chúng được coi

là mối đe dọa tới sức khỏe vật nuôi Nguy ên nhân của bệnh là kết quả của sự xuấthiện quá nhiều sán lá đơn chủ, sự sinh sản phụ thuộc vào nhiệt độ, và khi vật chủphải sống một thời gian dài trong môi trường khắc nghiệt Những nghiên cứu xahơn về sự xuất hiện của họ Diplectanidae trên cá xương, phân biệt nguyên nhân gâybệnh ký sinh trùng là cần thiết nếu muốn mở rộng quy mô nuôi cá và ngăn chặnnhững dạng ký sinh đặc hữu [23] [21]

Trước kia, Diplectanidae Monticelli, 1903 bao gồm 5 họ phụ DiplectaninaeMonticelli, 1903, Lamellodiscinae, Oliver, 1969, Murraytrematoidinae Oliver, 1982,Rhabdosynochinae Oliver, 1987 and Rhamnocercinae Monaco, Wood & Mizelle, 1954(Oliver, 1897) Tuy nhiên, theo nghiên cứu mới nhất (Domingues & Boeger, 2008) 2 họphụ Diplectaninae Monticelli, 1903 và Lamellodiscinae được cộng nhận và 2 họ phụNasobranchitrematinae n subfam và Pseudomurraytrematoidinae n subfam được đề nghị

Họ Diplectanidae, họ phụ Diplectaninae có các giống

Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958; Diplectanum Diesing, 1858; Lobotrema

Tripathi, 1959, Lepidotrema Johnston & Tiegs, 1922, Spinomatrix Boeger, Fehlauer

& Marques, 2006 Theo cách truyền thống, sự phân loại họ Diplectanidae đã có căn

cứ, xét ở phạm vi rộng, đó là dựa vào hình thái các phần cứng của đĩa bám (haptor)[18] Có 2 giống của họ này (thuộc họ phụ Diplectaninae Monticelli, 1903) là hạtnhân quan trọng bởi vì có nhiều tranh luận về vị trí phân loại v à vị trí phát sinh củavài loài trong chúng, tập trung vào một số nghiên cứu (ví dụ Oliver, 1968; Kritsky

& Beverley-Burton, 1986) [45] Giống thứ nhất, Diplectanum Diesing, 1858 có đặc

điểm là đĩa bám bắt đầu ở chỗ thắt lại của c ơ thể, với hai cặp móc bám (hamuli), 3thanh nối (transverse bars), giác bám l ưng (dorsal squamodiscs) và bụng (ventralsquamodiscs) được tạo thành từ các hàng gai cứng [48] Thứ hai, giống

Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 được mô tả bởi sự có mặt của một c ơ quan

giao cấu đực, có liên kết cứng, được chia ngăn, hình bầu (bulb-sharp) Chúng đãđược báo cáo ký sinh trên nhiều loài cá, chủ yếu là cá mú (Serranidae) ở khắp cácvùng nước ấm của các đại dương trên thế giới [33]

Các loài P sulamericanus (Santos, 2000), P beverleyburtonae (Oliver,

1984) thu thập trên cá mú ở Rio de Janeiro, Brazil - nơi có tiềm năng phát triển nuôimặn - đã được mô tả và mô tả lại chi tiết bởi Santos và cs, 2000 Đồng thời, trong

báo cáo này ông cũng đã thiết lập danh sách 17 loài Pseudorhabdosynochus spp cảm nhiễm trên các loài cá mú (Epinephelus spp.) với vị trí địa lý và đặc điểm chính

của giác bám [23]

Justine, 2005 đã bổ sung vào danh sách các loài thu ộc giống

Pseudorhabdosynochus (do Santos, 2000 đã nêu) hai loài, đó là P coioidesis Bu,

Leong, Wong, Woo & Foo, 1999 (từ cá Mú Đen E coioides và E areolatus ở Malaysia, Hong Kong và Indonesia) và P chinensis Zhang, Yang & Liu, 2001 (t ừ

cá Mú Mỡ E tauvina ở Trung Quốc) [29].

Trên thế giới, có 159 loài cá mú thuộc họ phụ Epinephelinae đã biết, bao

gồm 98 loài thuộc giống Epinephelus Bloch [28] Tuy nhiên, các loài Epinephelus

có thể là á huyết thống (paraphyletic) [24] và họ Diplectanidae thường là những loàiđặc hữu nên có thể dự đoán rằng còn rất nhiều loài thuộc họ Diplectanidae nói

chung cũng như thuộc giống Pseudorhabdosynochus nói riêng chưa được biết đến

[29] Hệ thống các loài sán lá này đã thực sự được quan tâm, thêm vào đó, để hiểuhơn về tính đa dạng sinh vật biển [29]

New Caledonia - một phá rộng nhất trên thế giới - có ít nhất 44 loài cá mú

thuộc giống Epinephelus và hầu hết chúng là nơi ẩn náu của các loài thuộc họ

Diplectanidae [29]

2.2.2 Việt Nam

Đỗ Thị Hòa, 2003 cho biết tại khu bảo tồn Hòn Mun, cá mú con nuôi lồng cỡ

10-15cm đã bị chết hàng loạt do cảm nhiễm bởi P epinepheli với mật độ rất cao [8].

Phạm Thị Sinh, 2004 tìm thấy P epinepheli ở cá Mú Đen E coioides [16] và Phan Văn Út, 2006 xác định 2 loài thuộc giống Pseudorhabdosynochus là P.

epinepheli và P sp, 2 loài thuộc giống Diplectanum ký sinh trên mang một số loài

cá mú nuôi (Epinepheli spp.) tại Khánh Hòa [16].

Từ năm 2005 – 2007, Võ Thế Dũng và cs đã có 3 nghiên cứu về ký sinh

trùng trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa: báo cáo thứ nhất năm 2005, phát hiện 4 loài Monogenea thuộc họ Diplectanidae là P epinepheli, P coioides, P.

sp, D grouperi ở một số loài cá mú tự nhiên, nuôi lồng, nuôi ao [4]; báo cáo thứ 2

năm 2007, tìm thấy 7 loài đó là D grouperi, P epinepheli, P coioides, P.

lantauensis, P summanae, P summanoides, P serrani ký sinh trên cá mú nuôi lồng

và nuôi ao [5]; báo cáo thứ 3 cùng năm 2007, phát hiện 3 loài D grouperi, P.

epinepheli, P lantauensis trên cá mú tự nhiên [6].

2.3 Tình hình nghiên cứu đặc điểm di truyền các loài sán lá đơn chủ

Người ta đã ứng dụng di truyền trong các nghiên cứu về sán lá đơn chủ bởi

có rất nhiều tranh luận về vị trí phát sinh của các lo ài của chúng Người ta khó nhậnbiết được rằng những sai khác về đặc điểm h ình thái của một số loài là biến dị trongloài (do khác biệt về ký chủ, vùng địa lý) hay là hai loài hoàn toàn khác nhau? Ví dụ,

Bu & cs, 1999 thông báo sự khác nhau về hình dạng của thanh nối lưng (dorsal bar) và

cơ quan giao cấu cái (vargina) của P lantauensis (từ cá E coioides ở Malaysia và Indonesia, cá E aerolatus ở Hong Kong) với P lantauensis trong mô tả gốc của Beverley – Burton & Suriano, 1981 (ở cá E bruneus và E fario tại Hong Kong) [47].

Di truyền học sẽ trả lời được điều đó bởi bộ gen trong cùng một loài thì khácnhau rất ít cho dù hình dạng có thay đổi Có thể sử dụng các chỉ thị di truyền đểnghiên cứu đặc điểm di truyền ở mức độ kiểu gen

* Chỉ thị di truyền (genetic marker):

Một số chỉ thị được sử dụng phổ biến là: biểu diễn trình tự DNA (DNAsequence), ribosomal DNA, protein (allozymes), DNA ti thể (mt DNA marker), đahình chiều dài các đoạn DNA được cắt bởi các enzyme giới hạn ( Restrictionfrangment length polymorphir m - RFLP marker), đa hình các đoạn DNA đượckhuếch đại ngẫu nhiên (Random amplified polymorphism DNAs - RAPD marker),

đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại (Amplified frangment lengthPolomorphism - AFLP marker), khuếch đại các đoạn lặp đơn giản (SSR – SimpleSequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (microsatellites marker), đa h ìnhnucleotide đơn (SNP marker) Mỗi loại chỉ thị có nguyên tắc và phạm vi ứng dụngkhác nhau [39]

Ribosomal DNA là 1 gen bao gồm 3 đoạn gen: 18S, 5.8S, 28S và 2 đoạnchèn giữa gen đó là ITS1 (chèn giữa 18S và 5.8S), ITS2 (chèn giữa 5.8S và 28S)[40] 28S là đoạn gen lớn nhất của ribosomal DNA, có khả năng đặc tr ưng cho loàinghiên cứu và được sử dụng trong các nghiên cứu về di truyền Trong thực tế người

ta thường sử dụng 1 đoạn gen và/hoặc 1 đoạn chèn giữa gen để làm chỉ thị trongnghiên cứu, ví dụ X Y Wu, 2004, 2005; I.D.Whittington, 2004; …[45][45][47]

Năm 2004, Whittington và cs dùng đoạn gen 28S để nghiên cứu mối quan hệphát sinh loài của 17 loài thuộc họ Capsalidae (Monocotylidae và Udonellidae được

sử dụng làm nhóm ngoại) Kết quả cho thấy Capsalinae, Encotyllabinae,Entobdellinae và Trochopodinae có cùng tổ tiên còn Benedeniinae là không cùng tổ

tiên, trong đó giống Neobenedenia hiện tại thuộc họ phụ Benedeniinae nên tách

riêng sang 1 họ phụ khác [45] Wu và cs (2004) dựa vào đoạn chèn giữa gen ITS1

và trình tự DNA ribosome tiểu phần lớn - 28S (lsr DNA) đã phân tách được 2 loài

cận giống, mà trước đây bị coi là cùng loài P latauensis thu trên cá E coioides và

E bruneus tại Quảng Đông, Trung Quốc [47] Ngoài ra, loài Diplectanum grouperi

Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999 tìm th ấy trên cá Mú Đen E coioides được đề nghị chuyển sang giống Pseudorhabdosynochus do gần gũi về mặt di truyền với

giống này [45]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu

*Thời gian: thực hiện đề tài từ 27/08/2008 đến 08/11/2008.

Thu mẫu từ tháng 01/2008

*Địa điểm thực hiện:

- Thu mẫu cá mú nuôi và tự nhiên tại một số địa điểm: Cam Ranh, Nha Trang(Bình Tân, Cầu Đá, Bãi Trụ) thuộc Khánh Hòa (xem phụ lục 1)

- Tìm, phân loại KST tại Viện Công nghệ sinh học v à môi trường–ĐH Nha Trang

*Đối tượng nghiên cứu: sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.)

tại Khánh Hòa như: cá Mú Đen (E coioides), Cá Mú Mè ( E bleckeri), Mú Sọc Ngang (E fasciatus), Mú Vạch E bruneus, Mú Chấm Tổ Ong (E merra), Mú Đen (E coioides) (xem phụ lục 2).

Bảng 2.1 Số lượng và kích cỡ các mẫu cá mú

Kích cỡTên loài ký chủ Số lượng(con)

khối lượng (g) chiều dài (cm)

(Số liệu trong bảng được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD)

2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái sán lá đơn chủ ký sinh trên cá

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu

ký sinh trùng ở cá của Dogiel (1929) và của Hà Ký (1992), Berland (2005)

Kiểm tra, thu thập KST

Quan sát mẫu tươi dưới

- Đựng cá trong thùng xốp, vận chuyển về phòng thí nghiệm và sục khí liêntục cho tới khi tiến hành kiểm tra, giải phẫu cá Thao tác cân, đo cá nhanh để cákhông bị khô nhớt Ghi lại tình trạng cá, địa điểm thu, số liệu cân, đo, v à ngày thángmột cách chính xác.

- Tiến hành kiểm tra sán lá đơn chủ: đây là những KST ngoại ký sinh, chúngthường có mặt trên mang, da, vây, mắt, hốc mũi của cá nên cơ quan được kiểm tra

là mang, da, vây cá

* Kiểm tra da, vây cá: quan sát bằng mắt th ường để phát hiện những KST cókích thước lớn Cạo nhớt da, chú ý cạo ở gốc vây, mắt và hốc mũi, dàn đều lên lam,nhỏ nước biển sạch rồi đậy lamel quan sát trên kính soi nổi (KSN) (hiệu OlympusSZX9, số serial SZX9 – 3122) trước rồi sau đó quan sát ở kính hiển vi (KHV) (hiệuOlympus BX41, số serial 2K07583) độ phóng đại tăng dần (từ 4X đến 40X) Nếu mẫu

cá to thì cạo nhớt vào hộp lồng đựng nước muối biển, đem quan sát dưới KSN Khiphát hiện sán lá đơn chủ thì thu mẫu làm tiêu bản để xác định cường độ cảm nhiễm

* Kiểm tra mang: dùng kéo cắt rời xương nắp mang cá, quan sát và ghi lạinhững dấu hiệu bất thường ở mang Sau đó, cắt rời từng cung mang bỏ v ào hộp lồngđựng nước biển sạch, quan sát dưới KSN Lấy kẹp và kim giải phẫu vạch từng tơmang để quan sát Nếu phát hiện thấy KST, tách riêng tơ mang có trùng đưa lên lamkính và tách trùng để quan sát dưới KHV Định lượng trùng trên toàn bộ mang.(Nếu không đủ thời gian làm hết mẫu thì bảo quản mẫu trong cồn 70ohoặc Formol4%, sau đó định lượng tiếp).

2.2.3 Cố định và làm tiêu bản KST

Khi phát hiện thấy KST thuộc họ Diplectanidae th ì giữ lại làm tiêu bản

- Cố định: dùng cồn 70º hoặc Ammonidium picrate nhỏ lên trùng Nếu sốlượng trùng nhiều có thể giữ trùng trong tube cồn 70º hoặc cồn tuyệt đối nếu mẫudùng cho nghiên cứu DNA

- Làm tiêu bản: Nếu mẫu giữ trong cồn, cần phải làm trong lại bằng lactophenol,

cố định lại trong cồn Dùng vaseline chấm vào 4 góc của lamel, đậy lên lam đã có trùngđược cố định, gắn tiêu bản bằng Bom Canada hoặc dán keo, ghi etyket

- Phương pháp đo: đo KST bằng thước đo thị kính của KHV Cần đo một sốchỉ tiêu như sau: chiều dài, rộng (tại vị trí rộng nhất) của cơ thể trùng; kích thướccủa cơ quan giao cấu đực, cái; kích thước các móc bám (đo theo hình 2.3) Đo hếttoàn bộ trùng được làm tiêu bản.

* Thước đo của trắc vi thị kính: 4X: 40 vạch = 1 mm; 10X: 1 vạch = 0,01 mm;40X: 20 vạch = 0,05 mm; 100X: 50 vạch = 0,05 mm

- Phương pháp đếm: vì đối tượng KST trong nghiên cứu thuộc họDiplectanidae nên yêu cầu phải xác định được giống/loài (như vậy có thể đếm saukhi soi tươi và định danh)

+ KST trên da: mỗi con cá lấy 3 lam nhớt da để đếm v à đếm toàn bộ trùngtrên từng lam, sau đó tính cường độ cảm nhiễm trung bình trên 1 lam

+ KST trên mang: nếu số lượng ít, đếm toàn bộ trùng trên mang Nếu sốlượng nhiều, đếm tất cả sán lá đơn chủ ký sinh trên một cung mang, mỗi con cá đếm

3 cung mang và tính cường độ cảm nhiễm trung bình trên 1 cung mang

Số cá có trùngTLCN = Số cá kiểm tra * 100

Số trùngCĐCN = Cơ quan (hoặc bộ phận cơ quan)

a b

Hình 2.2 Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) A – cơ quan giao cấu đực(a-chiều dài, b-chiều rộng), B – cơ quan giao cấu cái, C – móc bám lưng,

D – móc bám bụng, E – thanh nối lưng, F – thanh nối bụng

IL – chiều dài phía trong, OL – chiều dài phía ngoài

thể kết hợp chụp hình trùng bằng máy tính kết nối KHV (số serial: US00203669)hoặc máy ảnh kỹ thuật số Sau đó vẽ tr ùng (tốt nhất vẽ khi quan sát trên KHV vì cóthể nháy vi cấp để xem những nét khuất của hình ảnh).

2.2.5 Định danh

Các KST được định danh dựa vào một số chỉ tiêu như sau: hình dạng, kíchthước cơ thể trùng, cơ quan giao cấu đực, cái, các móc bám; kiểu đĩa bám; h ìnhdạng, số lượng hàng gai, vị trí của giác bám (Theo một số bài báo liên quan đăngtrên các tạp chí quốc tế như Journal of Fish Disease, Systematic Parasitology)

2.3 Phương pháp nghiên cứu di truyền sán lá đơn chủ

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA

* Nguyên tắc: mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầubằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hànhcác thí nghiệm tiếp theo Cần tách chiết nucleic acid trong điều kiện nhiệt độthấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội b ào (deoxyribonuclease-Dnase,ribonuclease-Rnase) [2]

* Tiến hành: Áp dụng quy trình tách chiết DNA của hãng Promega[http://www.promega.com/tbs/] (M ột số chi tiết trong quy trình được điều chỉnh đểphù hợp với mẫu thực)

- Chuẩn bị mẫu:

Bước 1: Giải đông tube chứa trùng, soi dưới kính giải phẫu để biết chắc chắn có

trùng Đối với mẫu giữ trong cồn tuyệt đối, cho riêng từng cá thể vào tube ependorf,

để tự nhiên cho cồn bay hơi hết trước khi tiến hành tách chiết

Bước 2: Thêm 27,5 µL dung dịch (dd) ly trích (Digestion Solution Master Mix) vào

mỗi tube mẫu đã ghi nhãn đầy đủ Thành phần và thể tích dd ly trích (xem bảng 2.1.)

Tính thể tích cần pha theo công thức:

V dd = V/mẫu x (số mẫu + 1) Bước 3: Ủ các tube mẫu ở 55-56o từ 4-5 giờ hoặc qua đêm bằng máy ổn nhiệt(heating block)

Bước 4: Lấy mẫu đã ủ ra, thêm vào mỗi mẫu 250 µL dung dịch (dd) đệm phân giải

(Lysis Buffer) Wizard®SV Trộn đều dd trong tube bằng máy Vortex

Bước 5: Quá trình phân giải diễn ra nhanh chóng sau khi th êm dd đệm phân giải.

- Tách chiết DNA từ dịch tan (sử dụng máy ly tâm - Microcentrifuge)

Bước 6: Lắp tube hình trụ có màng lọc vào tube thu nhận sản phẩm thừa sau ly tâm Bước 7: Ly tâm phức tube 13000 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 8: Nhấc ống hình trụ nhỏ ở bên trên ra, loại bỏ dung dịch trong ống thu ở

dưới Đặt ống hình trụ nhỏ trở lại như cũ

Bước 9: Thêm 650 µL dd rửa (Wash Solution) Wizard®SV (đã pha với 95% cồntheo hướng dẫn cuả nhà sản xuất) vào mỗi phức tube Ly tâm 13000 vòng/phúttrong 1 phút Loại bỏ dd ở ống thu Lặp lại bước này 2-3 lần

Bước 10: Loại bỏ dd trong ống thu Ly tâm 13000 v òng/phút trong 2 phút để làm

khô chất gắn trên màng lọc (binding matrix)

Bước 11: Chuyển ống hình trụ nhỏ sang tube Eppendorf 1,5 mL mới Th êm 30 µL

dd Nuclease – Free Water ở nhiệt độ phòng Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 12: Ly tâm phức tube (minicolumn/elution assembly) vừa tạo 13000

vòng/phút trong 1 phút Không lo ại bỏ dung dịch trong tube rửa trôi (elution tube)

Bước 13: Thêm một lần nữa 30 µL dd Nuclease – Free Water Ủ 2 phút ở nhiệt độ

phòng Ly tâm phức tube (minicolumn / elution tube) 13000 v òng/phút trong 2 phút

Bước 14: Loại bỏ ống hình trụ nhỏ và lưu giữ tube chứa DNA tinh sạch trong tủ

đông -20oC cho các thí nghiệm tiếp theo

Reaction) Karl Mullis & cs, 1985

* Nguyên tắc: Tất cả các DNA polymerase khi tổng hợp một mạch DNA mới

từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuy ên biệt [2]

Mồi D2iTaq DNA polymeraseNước cất 2 lần

Mẫu DNA

551110,426,610

Khi pha xong Master Mix, chuẩn bị số lượng tube PCR = (số lượng mẫu +1).(Trong đó, 1 mẫu làm đối chứng) Dùng Micropipette hút a µL dd Master Mix vào

= 48 nếu mẫu là 2 µL sản phẩm đã chạy PCR).

Ly tâm nhẹ các tube PCR để dd lắng xuống đáy, đặt (không cần theo thứ tự)vào máy PCR (sản phẩm của hãng Biorad) chạy với chu trình luân nhiệt như sau:Chu kỳ 1 (1 lần) Bước 1: 95oC trong 5 phút

Chu kỳ 2 (25 lần) Bước 1: 94oC trong 1 phút

Bước 2: 56oC trong 30 giâyBước 3: 72oC trong 1 phútChu kỳ 3 (1 lần) Bước 1: 72oC trong 10 phút

Bước 2: 4oC tới ∞

2.3.4 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ph ương pháp điện di

*Nguyên tắc: Các DNA sợi đôi nhờ mang rất nhiều điện tích âm, khi chịu tácđộng của một điện trường sẽ bị di chuyển về cực dương của điện trường Sau khicác DNA cùng kích thước tập trung lại sẽ phát sáng d ưới ánh đèn cực tím nhờ đượcnhuộm bằng ethidium bromide (EB) [2]

*Tiến hành:

- Chuẩn bị gel: (Nồng độ gel 1 – 1,5% ) Pha 0,4 – 0,6 g agarose với 40 mLTBE 0,5X trong bình tam giác Đun cách thủy cho tới khi tan hoàn toàn, dd trongsuốt, không còn vẩn đục Để gel nguội đến 60oC, thêm 2 µL EB 10 mg/mL vào ddthạch agarose, lắc đều, tránh tạo bọt khí (Chú ý: EB l à hóa chất cực kỳ nguy hiểm).Sau đó, đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị sẵn Để gel đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng,

gỡ lược theo chiều thẳng đứng Đặt bả n gel vào máng điện di sao cho các giếng ởgần cực (-) Đổ dd TBE 0,5X cho ngập mặt gel

- Chạy điện di và đọc kết quả: dùng micropipette hút 2 µL dd đệm tải(Loading buffer) vào mỗi ô trong khay trộn Số ô cần dùng = (số mẫu + 1) Tiếp đó,hút 2 – 4 µL mỗi mẫu (sản phẩm PCR) trộn đều với 1 ô dd đệm tải, b ơm mẫu vàogiếng gel theo thứ tự Giếng đầu tiên dùng cho thang DNA (marker) Ch ạy điện ditrong khoảng 30 – 40 phút, dòng điện 90V (Nếu chạy với thời gian d ài, chú ý đểcác vạch màu xanh không chạy ra khỏi bản gel)

Khi chạy điện di xong, lấy bản gel ra , đặt l ên hộp đèn UV đọc kết quả Sosánh với các vạch DNA (mẫu) với thang DNA (marker) để biết kích th ước của sản

nối máy tính (do công ty Biorad sản xuất, số serial 75S/03295)

* Đọc kết quả: - Nếu sản phẩm chỉ có một vạch, vạch r õ là kết quả tốt

- Nếu sản phẩm có 2 vạch trở lên là bị ngoại nhiễm

2.3.5 Giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit E.Z.N.A Cycle-Pure Kit (OmegaBio-tek, Doraville, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm đã tinh sạchđược gửi đi giải trình tự tại Công ty TNHH Sản xuất – Thương mại – Dịch vụ NamKhoa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, Tp HCM [56] Cáctrình tự được nối với nhau bằng chức năng Contig Express của phần mềm VectorNTI v 9 Trình tự Nucleotide thu được sau đó được so sánh với trình tự trên ngânhàng gen (Genbank) bằng chức năng Basic Logical Alignment Search Tool(BLAST) [54]

2.3.6 Phương pháp thu thập và xử lý dữ liệu

* Thu thập dữ liệu: - Thu thập trình tự gen đã giải được của các loài Monogenea thuộc

họ Diplectanidae (chủ yếu thuộc giống Pseudorhabdosynochus) trong nghiên cứu.

- Tìm trình tự gen của các loài trong nghiên cứu (để so sánh với cáctrình tự đã giải được) và của một số loài đóng vai trò là nhóm ngoại từ Genbank

* Xử lý dữ liệu: - Quan sát các trình tự gen bằng mắt thường, dùng phần mềmBioedit 7.0 (Hall, 1999) Sau đó, các trình tự được gióng hàng bằng chức năngClustal X ver.1.8 (Thompson và cs, 1997)

2.3.7 Phân tích cây phát sinh loài

Nghiên cứu phát sinh loài được tiến hành với trình tự gen 28S của ribosomalDNA Chuỗi trình tự của 7 loài được sử dụng trong phân tích phát sinh loài v ới 6loài được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup)

Phân tích phát sinh loài được tiến hành bằng phần mềm PAUP 4.0(Swofford, 2001) [44], dùng thuật toán Maximum parsimony, độ lặp lại 1000 và

100 cây (tree) lưu lại sau mỗi lần lặp lại Giá trị tin cậy (bootstrap value) đ ược sửdụng với độ lặp lại là 1000 lần Cây tiến hóa được trình bày, xử lý và điều chỉnhbằng phần mềm Treeview 1.6.6 [41]

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1 Đặc điểm hình thái các loài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae Bychowsky,

1957 ký sinh trên mang cá mú (Epinephelus spp.)

1.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Bằng việc quan sát các đặc điểm h ình thái của một số loài ký sinh trùng dướikính hiển vi chúng tôi đã thu được kết quả như sau:

Bảng 3.1 Thành phần loài và mức độ cảm nhiễm của Monogenea thuộc họ

Diplectanidae Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.)

T Tên sán lá đơn chủ Ký chủ (%) trùng/mang (%) trùng/mang

Giống Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958

1 P coioidesis Bu, Leong,Wong, Woo & Foo, 1999 E coioides 23,08 63,33±27 70 2,85±2,6

2 P cupatus Young, 1969 E fasciatus 30,77 4,22±2,32 0 0

3 P epinepheliYamaguti,1938 E coioides 7,69 3,15±0,83 0 0

4 P lantauensis Beverley –Burton & Suriano, 1981 E coioides, 38,46 19,51±12 20 3,5±1,49

5 P mellanesinensis Laird,1958 E merra 78,57 5,36±5,49 0 0

6 P summanae Young,1969 E coioides 15,38 1,14±0,38 0 0

7 P summanoides YangTingbao, David I Gibson,

Zeng Bijian, 2005 E coioides 30,77 2,13±1,19 10 1,25±0,3

11 Diplectanum grouperi Bu,

Leong, Wong, Woo &

(Số liệu trong bảng được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD)

1.1.1 Giống Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958

Giống: Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958

Đặc điểm:

Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 được mô tả bởi cơ thể hình lá dẹp, 4 điểm mắt,

sự hiện diện của cơ quan giao cấu đực hình bầu (bulb sharp), chia thành từng ngăn (thường là 4ngăn) và có liên kết cứng Việc xác định các loài thuộc nhóm này dựa trên hình dạng, kích cỡcủa cơ quan giao cấu đực (male copulatory organ - MCO), cơ quan giao cấu cái (vagina), giácbám (squamodiscs), thanh nối lưng (dorsal bar), thanh nối bụng (ventral bar), móc lưng (dorsalhammuli), móc bụng (ventral hammuli), các móc rìa (hooks) và số lượng các hàng gai(elements) trên giác bám [18][23] Có 2 giác bám lưng và bụng Đĩa bám (haptor) của

Pseudorhabdosynochus spp bao gồm 1 thanh nối bụng ở giữa đĩa bám, 2 thanh nối lưng đối

xứng 2 bên, một đôi móc bụng gốc chẻ thành 2 nhánh, một đôi móc lưng có 1 nhánh cụt và 14móc rìa quanh đĩa bám Tuy nhiên, rất khó để phân biệt được thật sự chính xác các loài bởi sẽ cónhiều biến dị trong loài về một vài đặc điểm hình thái Ví dụ, số lượng hàng gai trên giác bám

của P amplidiscatus và P capurroi biến động từ 14-16, ở P epinepheli là 14 - 17 và ở P.

sulamericanus là 15 - 16 [23]

(1) Loài: P coioidesis Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999

Ký sinh trên mang cá Mú Đen Epinephelus coioides.

Đặc điểm: Cơ thể P coioidesis thuôn dài, tỷ lệ chiều dài/chiều rộng ~ 3/1 Cơ

quan giao cấu đực hình bầu, nhỏ, bên trong chia thành 4 ngăn hẹp, có kết cứng bằngkitin, các ngăn có vách ngăn nhưng không phân thành múi r õ rệt Cuống của cơquan giao cấu đực thường cong lên Cơ quan giao cấu cái nhỏ hơn cơ quan giao cấuđực, phía trên có dạng phễu, phía dưới uốn lại hình chữ “D”

Giác bám kitin được tạo thành từ 15-16 vòng gai kitin dạng mở xếp sít nhau.3-4 vòng đầu độ cong lớn hình giọt nước, các vòng sau đó độ cong nhỏ dần Đĩabám khá nhỏ so với toàn bộ cơ thể Thanh nối bụng lõm ở giữa cả phía trên và dưới.Thanh nối lưng ngắn, đầu to hơn quay vào bên trong Đôi móc b ụng có gốc chẻnhánh, nhánh ngoài phình ra, to h ơn khá nhiều so với nhánh trong Đôi móc lưng cómột nhánh cụt và nhỏ hơn so với đôi móc bụng Rìa đĩa bám có 14 móc nhỏ.

(2) Loài P cupatus Young, 1969

Ký sinh trên cá E fasciatus

Đặc điểm:

Thân trùng khá cân đối Cơ quan giao cấu

đực hình bầu, các vách ngăn phẳng và gần như

tạo thành các tia phóng xạ từ phần lõm của cơ

quan này Cơ quan giao cấu cái cong, phía đầu có

móc hình chữ “V”, có 3 móc cong lên ở phía

dưới, trong đó 1 móc nhỏ hơn 2 móc còn lại

Hình 3.1 Loài P coioidesis Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999.

A – toàn bộ cơ thể; B – cơ quan giao cấu đực; C – cơ quan giao cấu cái;

D – hình chụp cơ quan giao cấu

B

D

Hình 3.2 Cơ quan giao cấu đực

và cái của loài P cupatus

Hình 3.2 Cơ quan giao cấu đực

và cái của loài P cupatus