Nghiên cứu sử dụng enzyme protamex trong quá trình khử protein và thử nghiệm một số giải pháp cải tiến công đoạn rửa

Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm Trần Thị Luyến, 2003.... Chính vì vậy cần nghiên cứu tìm ra quy trình sản xuất tối ưu đối v

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi tới Ths Ngô Thị Hoài Dương – người đã định hướng và tận tình hướng dẫn, động viên, góp nhiều ý kiến thiết thực, quý giá trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô Viện công nghệ sinh học & môi trường, Bộ môn hóa sinh – vi sinh thực phẩm – Khoa chế biến - Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình hoàn thành đề tài Xin cảm ơn tất cả những người bạn đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Bố mẹ của con Cuối cùng, con xin kính gửi tới và gia đình lòng biết ơn sâu sắc nhất đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong những năm qua

Em mãi mãi ghi nhận sự giúp đỡ quí báu của quí thầy, cô, gia đình và bạn hữu

Nha Trang, tháng 7 năm 2010

Sinh viên thực hiện

NGÔ THANH TUYỀN

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN .i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH .vii

DANH MỤC BẢNG .ix

LỜI NÓI ĐẦU .1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITIN-CHITOSAN .2

1.1 Giới thiệu phế liệu tôm và các hướng tận dụng 2

1.1.2 phế liệu tôm 2

1.1.3 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm 3

1.1.3.1 Cấu tạo của vỏ tôm 3

1.1.3.2 Thành phần sinh hoá của vỏ tôm 4

1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm 5

1.2 Tổng quan về chitin, chitosan và công nghệ sản xuất chitin, chitosan 10

1.2.1 Sự tồn tại của chitin, chitosan trong tự nhiên 10

1.2.2 Tính chất của chitin, chitosan 11

1.2.2.1 cấu trúc của chitin 11

1.2.2.2 cấu trúc của chitosan 13

1.2.3 Công nghệ sản xuất chitin, chitosan 14

1.2.3.1 Phương pháp hóa học 15

1.2.3.2 Phương pháp sinh hoc 15

1.3 Ứng dụng của Chitin-Chitosan 16

1.3.1 Trong y học và mỹ phẩm 16

1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm 17

1.3.3 Ứng dụng trong nông nghiệp 17

1.3.4 Ứng dụng trong sinh học 17

1.3.5 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 17

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và việt nam 18

1.4.1 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học 19

1.4.2 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến 21

1.4.3 Sản xuất chitin, chitisan theo phương pháp sử dụng enzyme 26

1.5 Protease và quá trình thủy phân protein 29

1.5.1 Khái niệm chung và đặc tính của enzyme 29

1.5.2 Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme 29

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme 31

1.5.4 Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme protease 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 34

2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 34

2.1.2 Enzyme Protamex 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 34

2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 34

2.2.2 Phương pháp phân tích và đánh giá chất lượng chitin 35

2.2.2.1.Kiểm nghiệm hoá học 35

2.2.3 Bố trí thí nghiệm để chọn các điều kiện xử lý thích hợp 35

2.2.3.1 Bố trí thí nghiệm 35

2.2.3.2 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret 35

2.2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hoá học của đầu tôm, dịch ép và bã ép đầu tôm 37

2.2.3.4.Quy trình dự kiến sản xuất chitin từ phế liệu đầu tôm 38

2.2.3.5 Các thí nghiệm của mẫu thủy phân khử protein tối ưu Dùng enzyme Protamex 39

2.2.3.6 Nghiên cứu cải tiến quá trình rửa trong công đoại khử protein bằng enzyme

protamex 41

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC 44

2.3.1 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700-1990 44

2.3.2 Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 550oC 44

2.3.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret 44

2.3.3.1 Dụng cụ 44

2.3.3.2 Hóa chất 45

2.3.3.3 Tiến hành 45

2.3.4 Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Biuret 46

2.3.4.1 Dụng cụ: giống như phương pháp Microbiuret 46

2.3.4.2 Hóa chất 46

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret 47

3.1.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret 47

3.1.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret 47

3.2 Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu đầu tôm, bã ép, dịch ép .48

3.2.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm 48

3.2.2 Thành phần hóa học của đầu tôm sau khi ép 48

3.2.3 Thành phần hóa học của đầu tôm ban đầu và sau khi ép 49

3.3 Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme protamex 50

3.4 Kết quả nghiên cứu công đoạn rửa sau khi thuy phân protein bằng enzyme protamex 52

3.4.1 Kết quả rửa chitin thô sau khử protein bằng enzyme protamex bằng nước thường 52

3.4.2 Kết quả nghiên cứu công đoạn rửa nhiều lần với dung dịch mước muối 54

3.4.3 Kết quả nghiên cứu công đoạn rửa nhiều lần với dung dịch axit acetic 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Ý kiến đề xuất 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ các hướng tận dụng của phế liệu tôm 6

Hình 1.2.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á 19

Hình 1.3.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) 20

Hình 1.4.Quy trình sản xuất của Pháp 21

Hình 1.5 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản 23

Hình 1.6 Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc 24

Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003) 25

Hình 1.8 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) 26

Hình 1.9 Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003) 27

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm xác định thành phần hoá học của đầu tôm 37

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm xác định thành phần hóa học của bã ép đầu tôm 38

Hình 2.3.Quy trình dự kiến 38

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình bố trí công đoạn rửa với nhiều cách khác nhau 42

Hình 2.5.Công thức của phức Biuret 44

Hình 2.6 Công thức cấu tạo của Sodium citrate 45

Hình 3.1 Đô thị biểu diễn phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret 47

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret 47

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn thành phần hóa học của nguyên liệu/bã ép đầu tôm tính theo hàm lượng chất khô 49

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein còn lại trên chitin thô khi rửa thường 1 lần và 3 lần 52

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn lượng nito hòa tan trong nước rửa ở nước rửa lần đầu khi sử dụng nước thường rửa 1 lần và 3 lần với các tỷ lệ khác nhau 53

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn lượng nước cần dùng trong mỗi tỷ lệ nước rửa khác nhau 53 Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein còn lại trong công đoạn rửa bằng dung dịch nước muối 54 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn lượng nito hòa tan trong nước rửa ở các lần rửa khi có

sử dụng nước muối rửa 3 lần với các nồng độ khác nhau 55 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hàn lượng protein còn lại trên chitin tho sau khử protein khi rửa 3 lần với dung dịch axit acetic, tỷ lệ 1:2 56 Hình 3.10 Biểu đồ diễn lượng nito hòa tan trong nước rửa khi rửa 3 lần với tỷ lệ 1:2 có bổ sung axit acetic với các nồng độ khác nhau 57

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp

xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003) 26 Bảng 1.2.Chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain (Trần Thị Luyến, 2003) 28 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret 36 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret 37 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme protamex 40 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

enzyme protamex 40 Bảng 3.1 Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 48 Bảng 3.2 Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng sau khi

ép 48 Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng

enzyme Protamex 50 Bảng 3.4 Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng

enzyme protamex 51 Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất 51

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy sản được coi là ngành mũi nhọn, sự phát triển của ngành chế biến thủy sản được xem là nhiệm vụ chiến lược của nhà nước ta, hàng năm ngành đã đem về hàng triệu đô la, là nguồn ngoại tệ đáng kể trong ngân sách Nhà nước Trong đó mặt hàng về tôm đặc biệt là tôm thẻ chân trắng trong mấy năm gần đây đang chiếm

ưu thế mỗi năm xuất khẩu hàng ngàn tấn Đi cùng với sự phát triển này thì lượng phế liệu thải ra từ tôm là một con số không nhỏ đòi hỏi phải có biện pháp xử lý, sử dụng tốt nguồn phế liệu này để không gây ôi nhiễm môi trường, gây lãng phí cho sản xuất Tận dụng phế liệu tôm để thu chitin & chitosan là một biện pháp có hiệu quả cao bên cạnh việc dùng phế liệu tôm để chế biến thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên hiệu quả kinh tế thu được phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng chitin- chitosan Hiện nay có nhiều quy trình sản xuất chitin, chitosan nhưng qui trình cho đối tượng là tôm thẻ nhưng chưa nhiều, chất lượng chưa cao và đồng đều bên cạnh

đó là lượng chất thải gây ô nhiêm môi trường là rất lơn Chính vì vậy cần nghiên cứu tìm ra quy trình sản xuất tối ưu đối với phế liệu tôm thẻ chân trắng để tạo ra chitin, chitosan có chất lượng tốt nhất nhằm mở rộng ứng dụng của chitosan đồng thời sử dụng lượng hóa chất thấp nhất, thời gian xử lý ngắn, giảm thiểu tối đa lượng nước rửa trong quá trình sản xuất và để tận dụng triệt để nguồn phế liệu tôm cho các ngành công nghiệp khác

Vì lý do này mà đề tài: “Nghiên cứu sử dụng enzyme protamex trong quá trình khử protein và thử nghiệm một số giải pháp cải tiến công đoạn rửa” được

chọn thực hiện để góp phần tìm ra các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng chitosan nhằm đạt được mục tiêu nói trên.

Nha trang ngày 20 tháng 7 năm 2010

Sinh viên thực hiện

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG

vượt quá 60% khối lượng sản phẩm Có thể lấy tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii làm ví dụ, đầu tôm chiếm tới 60% trọng lượng tôm Đầu tôm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tôm Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng,

lượng đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37% Lượng phế liệu này có thể giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế biến tốt hơn Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của PLT từ 30-70% (Watkin và cộng sự, 1982 ; Evers và Carroll [7], 1996 [21], trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến Halanda và Netto (2006) cho rằng PLT có thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [24] Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng bóc

vỏ, bỏ đầu Phần đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10-15% trọng lượng của tôm nguyên liệu Tuy nhiên, tỉ lệ này tuỳ thuộc vào giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng [6] [7]

Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính

là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm

2003 Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%, đứng thứ 2 sau xuất khẩu dầu khí Năm 2004, xuất khẩu thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản Năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu Năm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006

Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giá trị 4 - 4,5 tỷ USD Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề cá Tôm được dự kiến đạt khoảng 483 nghìn tấn nguyên liệu để phục vụ cho xuất khẩu khoảng 390.000 tấn năm 2010 Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học Thuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm Trần Thị Luyến (2004) cho biết trong vỏ tôm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng, trong vỏ tôm khô khoảng 20- 40% khối lượng Như vậy hàng năm có thể sản xuất gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành Thuỷ sản

1.1.3 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm:

1.1.3.1 Cấu tạo của vỏ tôm

Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất không hòa tan

Vỏ chia làm 4 lớp chính:

* Lớp biểu bì

* Lớp màu

* Lớp canxi

* Lớp không bị canxi hóa

- Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi Lớp màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì không

- Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khí hoặc những không bào Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,

là con đường cho caxi thẩm thấu vào

- Lớp biểu bì: những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi Fucxin, có điểm pH =5,1 không chứa chitin Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của axít ở nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong Màu của lớp này thường vàng rất nhạt

- Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp

- Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và puinone

1.1.3.2 Thành phần sinh hoá của vỏ tôm:

Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng

Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn

Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các

protein dưới dạng phức hợp chitin-protein; liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

Canxi: Trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ

yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng

Sắc tố: Trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là

Astaxanthin

Enzyme: Theo tạp chí Thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của

đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu

Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như: nước, lipid, phospho,…

1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm:

Phế liệu tôm có thể tận dụng để thu hồi protein, astaxanthin, chitin, chitosan

và cácenzyme protease Qua nhiều tài liệu khoa học, có thể tổng kết các lĩnh vực ứng dụng của phế liệu tôm như sau:

Hình 1.1 sơ đồ các hướng tận dụng của phế liệu tôm

Ở nước ta, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn nhất trong các sản phẩm đông lạnh Chính vì vậy, phế liệu tôm là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện

Cùng vói sự phát triển của khoa học kĩ thuật và nhu cầu bức thiết về ô nhiễm môi trường từ nguồn phụ phế phẩm thải ra từ các nhà máy chế biến thủy sản, đặc biệt là nguồn phế liệu tôm thì những năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu để thu nhận và tân dụng nguôn phế liệu này thành những sản phẩm có giá trị bên cạnh

đó còn tạo ra những giá trị không nhỏ: Trước tiên, môi trường xung quanh các nhà máy chế biến tôm sẽ đỡ bị ô nhiễm; song nhiều người lao động có việc làm; giá trị

`

Phế liệu tôm

Khử protenin Khử khoáng

chitin Deacetyl hóa

Chitosan

Chiết rút enzyme

Công nghiệp thực phẩm

Công nghiệp dược

Chiết rút astaxanthin

Ứng dụng trong công nghiệp dược

Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Ứng dụng trong nông nghiệp

Ứng dụng trong các ngành khác

con tôm sẽ được nâng lên (có thể bù đắp phần nào thiệt hại do bị áp thuế suất chống bán phá giá ở mức cao khi xuất khẩu vào thị trường Mỹ), nguồn thu ngân sách địa phương có thể tăng lên, có trong một số loại sản phẩm có giá trị sản xuất trong nước giá rẻ[30]

a Sử dụng phế liệu tôm để sản xuất chitin – chitosan

Chitin là một polysacchairid xuất hiện trong thiên nhiên nhiều chỉ sau cellulose Chitin có mặt trong vỏ các loài giáp xác, màng tế bào nấm thuộc họ Zygemycetes có trong sinh khối nấm mốc, và một vài loại tảo Còn chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau, có mầu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và a-xít đậm đặc nhưng tan trong a-xít loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309-311oC, trọng lượng phân tử trung bình: 10.000-500.000 dalton tùy loại Chính nhờ vào những đặc tính sinh học này mà chitosan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, xử lý nước, công nghiệp nhuộm, giấy, mỹ phẩm, thực phẩm… Ở nước ta, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn nhất trong các sản phẩm đông lạnh Chính vì vậy, vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện Quy trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu tôm, dựa trên nguyên tắc loại bỏ muối canxi, protein và các tạp chất khác Quy trình tóm lược như sau: Vỏ tôm xử lý

→ vỏ tôm sạch → loại khoáng và tách protein → chitin → deacetyl hóa → chitosan[25]

Từ nguồn chitosan thu được này, tiếp tục nghiên cứu để tạo ra lớp vỏ màng bọc chitosan bằng cách sử dụng các chất phụ gia khác nhau (nhưng có cùng bản chất hóa học), thường là các chất hóa dẻo được sử dụng nhằm làm tăng tính dẻo dai

và đàn hồi của màng Thí dụ như phụ gia: ethylen glycol (EG), polyethylen glycol

(PEG), glycerin

Cách tạo màng vỏ bọc như sau: Chitosan thu được từ vỏ tôm đem nghiền nhỏ bằng máy để nhằm mục đích gia tăng bề mặt tiếp xúc Pha dung dịch Chitosin 3% trong dung dịch axit acetic 1,5% Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG – EG 10% (tỷ lệ

1:1) và trộn đều để yên một lúc để loại bột khí Sau đó đem dung dịch đã pha quét đều lên một ống inox đã được nâng nhiệt 64- 65oC (ống inox được nâng nhiệt bằng hơi nước nóng đun sôi) Để khô vỏ trong vòng 35 phút rồi tách vỏ Lúc này ta được

vỏ bóng có mầu vàng, ngà, không mùi vị, đó là lớp màng vỏ bọc chitosan có những tính năng mới ưu việt

Tháng 6 năm 2002, dự án sản xuất thử chất Chitozan bắt đầu được thực hiện tại trường Đại học Thủy sản Nha Trang Quy trình sản xuất chất Chitozan của trường Đại học Thủy sản khá đơn giản Vỏ tôm, cua, ghẹ được đưa vào bể xử lý – chúng là nguyên liệu để làm ra chất Chitin Từ chất Chitin, qua xử lý, họ thu được chất Chitosan rất có giá trị Với việc đưa ra một quy trình sản xuất chất Chitosan có chất lựơng từ vỏ tôm, cua, ghẹ, nước ta đã có thể chủ động có được sản phẩm này

mà không phải nhập khẩu như trước kia Giá bán trên thị trường mỗi kilogram Chitozan khoảng 400 ngàn đồng Một số cơ sở nghiên cứu khoa học ở Thái Lan đã đặt mua ở trường Đại học Thủy sản một số lượng không nhỏ chất Chitosan

Ước tính, cứ 1kg tôm đưa vào chế biến đông lạnh, thải ra 0,4 kg vỏ Với lượng tôm đưa vào chế biến trên các nhà máy hiện nay, lượng vỏ rõ ràng là không

ít Vỏ tôm, cua, ghẹ tưởng như bỏ đi lại tạo ra chất Chitozan có giá trị Chỉ riêng điều này cho thấy sự cần thiết phải phát triển công nghiệp chế biến chitin-chitosan[25][26]

b Sử dụng phế liệu tôm để tách chiết astaxanthin[7]

Astaxanthin là dẫn xuất của caroten Trong vỏ giáp xác astaxanthin tham gia vào trong thành phần của lipoprotein, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein

và dễ bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt Hàm lượng astaxanthin trong vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy theo loài (từ 10÷140 mg/kg trọng lượng ướt hay là khoảng 50÷700 mg/kg trọng lượng khô)

Trong vỏ của các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin liên kết chặt chẽ với lớp

vỏ calcium carbonat-chitin, gây khó khăn cho việc chiết xuất astaxanthin Nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng acid hay hỗn hợp các acid, để loại bỏ calcium carbonat (ở giai đoạn khử khoáng) trước khi chiết xuất astaxanthin bằng dung môi thích hợp

Fukuda và Kozo (1997) đã khử calcium carbonat trong vỏ tôm bằng HCl, rồi trung hoà bằng NaOH trước khi chiết xuất astaxanthin bằng ethanol 80%

Ở Việt Nam, Hoàng Thị Huệ An đã nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ vỏ tôm, đạt hiệu suất thu hồi trung bình là 49% hàm lượng astaxanthin có trong PLT Trong vỏ tôm tươi, hàm lượng astaxanthin chiếm 59±3,4 mg astaxanthin/kg, còn trong vỏ tôm khô thì hàm lượng này là 19,2±1,7 mg astaxanthin/kg Từ kết quả này cho thấy PLT trước khi sản xuất chitin-chitosan cần được chiết xuất astaxanthin để cung cấp cho các ngành công nghiệp khác, nhằm nâng cao giá trị của phế liệu tôm

Astaxanthin có màu đỏ, hòa tan trong các dung môi hữu cơ: ete, aceton, cồn,… và dễ bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt, oxy không khí

Astaxanthin được dùng làm thức ăn tạo màu cho cá cảnh, làm tăng sắc tố cho lòng đỏ trứng gà Ngoài ra còn làm thức ăn của cá, tạo màu cần thiết cho một số sản phẩm như cá ướp đông, cá khô, sản phẩm thủy phân, thịt cá hồi Theo hướng này đang được nghiên cứu[7]

c Sử dụng phế liệu trong chăn nuôi

Do hàm lượng protein trong đầu tôm cao do đó nó được làm nguồn thức ăn cho chăn nuôi Hiện nay ở nước ta đa số sử dụng phế liệu tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi Bột tôm được chế biến tốt có chứa axit amin tương tự amin trong đậu tương hay trong bột cá Phế liệu tôm có chất lượng càng cao thì bột tôm có chất lượng càng cao Do vậy xử lý và chế biến phế liệu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất bột tôm có chất lượng cao Nếu công nghệ chế biến không phù hợp thì

nó cũng ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do các chất béo và axit béo thiết yếu sẽ bị ảnh hưởng

Theo đặc điểm từng vùng mà nguồn nguyên liệu này được sử dụng khác nhau Ở Nha Trang nguồn phế liệu này được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm ở dạng tươi (phế liệu tôm tươi được nghiền nhỏ) và làm thức ăn cho tôm cá dưới dạng bột đầu tôm, vỏ tôm nghiền khô (sản xuất tại công ty Long Thao, Long Sinh,…) Theo hướng này chiếm trên 30% lượng phế liệu

Có 2 phương pháp được áp dụng phổ biến trong sản xuất bột tôm là phương pháp sấy khô và phương pháp ủ xilô

+ Phương pháp sấy khô bằng nhiệt: Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, có thể chế biến nhanh lượng phế liệu tôm đông lạnh, tính kinh tế cao Nhược điểm là chất lượng kém, giá trị dinh dưỡng không cao

+ Phương pháp ủ xilô: ở phương pháp này người ta sử dụng axit hữu cơ và

vô cơ trong việc ủ nhằm tăng tác động của enzyme khử trùng và hạn chế phát triển của vi sinh vật Sau khi ủ tiến hành trung tính bằng các chất kiềm, chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi Phương pháp này có ưu điểm là chất lượng tốt và giá thành cao

d Sản phẩm súp và canh

Có thể sử dụng các mẫu thừa của tôm chất lượng cao sau khi chế biến làm món canh và súp tôm Đầu tôm được sử dụng làm nguyên liệu tạo mùi cho món súp tôm đặc biệt Tôm vụn được sử dụng làm món canh tôm

e Làm các sản phẩm định hình

Thịt tôm vụn hoặc không đạt tiêu chuẩn có thể được chế biến thành các sản phẩm định hình Sản phẩm này được định hình lại thành hình con tôm hay các hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm Bằng cách tạo ra các hình dạng khác nhau, ướp tẩm gia vị hay bao bột, ta có thể làm ra rất nhiều sản phẩm tôm đẹp mắt Các sản phẩm định hình này được làm chín trong các thiết bị thông thường hay

lò vi sóng giống như các sản phẩm được chế biến từ tôm khác

1.2 Tổng quan về chitin, chitosan và công nghệ sản xuất chitin, chitosan

1.2.1 Sự tồn tại của chitin, chitosan trong tự nhiên

Chitin và dẫn xuất của nó là Chitosan là những polysaccharide mạch thẳng, chúng phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật Ở động vật thủy sản, Chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là ở vỏ tôm, cua, ghẹ,…

Vì vậy, chúng là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất Chitin-Chitosan

Trong động vật: Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao của một

số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn, Chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật không xương sống

Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loài tảo chlorophyceae Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể Nó có cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi ít nhiều có tổ chức Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của Chitin,

nó liên kết dưới dạng phức hợp Chitin-protein,Chitin với các hợp chất hữu cơ,… khi tồn tại như thế Chitin có sự đề kháng đối với các chất thủy phân, hóa học và enzyme Do đó nó gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người

ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của Chitin

Trong tự nhiên, Chitosan rất hiếm gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor,…) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của mối chúa Sự deacetyl bằng kiềm, Chitin tạo thành Chitosan và tan được trong dung dịch acid acetic loãng

1.2.2 Tính chất của chitin, chitosan

1.2.2.1 cấu trúc của chitin

a Cấu tạo của chitin

Chitin là một polysaccharide nên có cấu trúc dạng chuỗi

Trong đó : Chitin : R : -NH-COCH3

CHITIN: Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến tính

gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside

Công thức phân tử: (C8H13O5N)n

Phân tử lượng : M = (203,19)n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:

Đối với tôm hùm : n = 700÷800

Đối với cua : n = 500÷600

Đối với tôm thẻ: n = 400÷500

Công thức cấu tạo:

Hình.1.2 Cấu tạo của Chitin

b Tính chất của chitin

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo

Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO4, nước javen, NaClO, …người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884÷890 cm

Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,

có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da Chitin bị men lysozyme, một loại men chỉ có ở cơ thể người, phân giải thành Hydroxy N-acetyl-D-glucosamine

Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch hydroxyl (NH3), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia Điều này có thể là do

sự thay đổi nhóm hydroxyl (-OH) tại vị trí C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH3) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết

Chitin + nNaOH (đậm đặc) Chitosan + nCH 3 COONa

Khi nung nóng Chitin trong dung dịch NaOH đặc thì Chitin sẽ bị khử mất gốc acetyl tạo thành Chitosan Khi đun nóng Chitin trong acid HCl đặc thì Chitin sẽ

bị thủy phân tạo thành Glucosamine 85,5%, acid acetic 14,5%

Đun

1.2.2.2 cấu trúc của chitosan

a Cấu tạo của chitosan

CHITOSAN: Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, gồm các phân tử

D-1,4glucosamine Khi xử lý kiềm đặc từ Chitin ta thu được Chitosan

Công thức phân tử : (C6H11O4N)n

Phân tử lượng: M= (161,07)n

Công thức cấu tạo :

Hình 1.3 Cấu tạo của Chitosan.

b Tính chất của chitosan

Đặc tính cơ bản của Chitosan: Chitisan có nguồn gốc thiên nhiên, không độc, dùng an toàn cho người trong thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học, có nhiều tác dụng sinh học đa dạng: có khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích tăng sinh tế bào ở người, động vật, thực vật, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng

Tính chất hóa học : Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị, hòa tan dễ dàng trong dung dịch acid loãng Loại Chitosan co khối lượng trung bình thấp từ 100000÷400000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và trong thực phẩm

Tính chất sinh học: Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như : tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng té bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u

Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to

vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid- insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên Chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư,

HIV/AISD, chống tia tử ngoại, chống ngứa,… của Chitosan

1.2.3 Công nghệ sản xuất chitin, chitosan

Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy

ở dạng tinh khiết Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kỳ mục đích thương mại nào Phương pháp dùng để phân tách và tinh sạch chitin phải đảm bảo lấy đi khoáng và tận dụng được các hợp chất có giá trị khác Do đó, nhiều phương pháp đã được áp dụng cho việc thu hồi chitin Hơn nữa, tính hữu ích của các nguồn chitin khác nhau phụ thuộc vào sự sẵn có của nguyên liệu, phương pháp đơn giản, hàm lượng chitin, và sự phù hợp để tận thu các sản phẩm có giá trị khác

Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính:

- Khử khoáng: Loại bỏ khoáng bằng acid hoặc là một tác nhân tạo phức

- Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease

Hai bước này có thể đổi vị trí cho nhau phụ thuộc vào phương pháp thu hồi protein, carotenoid và hơn nữa là ứng dụng chitin Chitin sử dụng như một chất hấp thụ hay hỗ trợ enzyme nên khử khoáng trước, bởi vì bước này lấy đi muối khoáng

và bảo vệ cấu trúc chitin đảm bảo sự deacetyl polysaccharid khi xử lý kiềm nhẹ để khử protein Tăng cường mức deacetyl gia tăng các nhóm amino tự do tham gia vào quá trình hấp phụ và gắn kết protein Tuy nhiên, để thu hồi protein thì nên thực hiện bước khử protein trước Khi đó, sản lượng protein và chất lượng là lớn nhất Sau quá trình khử khoáng và khử protein, sản phẩm được tẩy màu bằng acetone hoặc hydrogen peroxide Bước này là không cần thiết và phụ thuộc vào yêu cầu của sản phẩm cuối cùng Có hai phương pháp chính để sản xuất chitin: phương pháp hóa học và phương pháp sinh học

1.2.3.1 Phương pháp hóa học

Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc sử dụng HCl hoặc acid hữu

cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế như sau:

CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O

Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:

a Nồng độ axít: Nồng độ axít quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến sản

phẩm còn nhiều tạp chất Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất lượng sản phẩm

b Tỉ lệ axít/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá lớn sẽ

ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí

c Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến chất

lượng sản phẩm Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ rất khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm sau này Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị loại triệt để

Thông thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu có điều kiện ta có thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn

1.2.3.2 Phương pháp sinh hoc:

Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại công đoạn khử protein và deacetyl không sử dụng hoá chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme

để loại bỏ protein một cách triệt để Việc deacetyl được thực hiện bởi enzyme deacetylase Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng

nhiều bởi hoá chất [7] Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều

khó khăn như giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hoá học nhưng không thể đạt được bằng phương pháp sinh học [23] Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp Hiện nay, một trong những khó khăn trong phương pháp hoá học để sản xuất chitin là thể tích chất thải có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý quá

lớn Những chất này là do trong công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hoá học có thể gây nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993)

và gây ô nhiễm môi trường (Allan và cộng sự, 1978) [23] Điều này là do không xác định được bản chất hoạt động của hoá chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu Ngược lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme có thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý môi trường Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hoá thì chúng ta phải

áp dụng những phương pháp xử lý nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme

Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzyme protease và vi khuẩn có khả năng tạo protease để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hoá học Quá trình này giúp tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng đến môi trường Hall & De Silva (1994) đã đề xuất một phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới

1.3 Ứng dụng của Chitin-Chitosan:[2][6][12]

1.3.1 Trong y học và mỹ phẩm

Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm:

Tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng chậm kéo dài, làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn

dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV Dùng làm vật liệu y sinh: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…Trong mỹ phẩm chitosan được bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt

để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím…

1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm:[3]

Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử axit của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên Tạo màng để bao gói thực phẩm, hoa quả, rau tươi Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng, chitosan được coi là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm, bánh kẹo, nước giải khát, thức ăn vật nuôi và thủy sản Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

1.3.3 Ứng dụng trong nông nghiệp:[2][6]

Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh

Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa

1.3.4 Ứng dụng trong sinh học:

Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp polymer sinh học

1.3.5 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

Trong công nghiệp dệt: Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa,

ưu điểm có thể thay thế được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ xát, bề mặt đẹp, bền trong kiềm

Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan chitosan trong dung dịch acid

acetic loãng cùng với axetat nhôm và axit stearic thu được hỗn hợp Hỗn hợp này đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt lửa Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động

Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na2SO4 bão hòa rồi đem kéo sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose Khả năng bắt màu thuốc nhuộm càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin

Trong công nghiệp giấy: Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ

cần thêm trọng lượng bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bền của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét khi in Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy

Trong ngành phim ảnh: Phim chitosan có độ nhớt rất cao, không tan trong

nước, acid Độ cứng được cải thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý phim

bằng dung dịch acid

Ứng dụng trong mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng trong sản xuất kem

chống khô da, do bản chất chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhóm NH4+ thường được các nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím Vì vậy chitosan là gạch nối giữa hoạt chất của kem và da

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và việt nam

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của Chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn

Độ, Pháp

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ như:[6]

1.4.1 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học:

- Quy trình của Stevens:

Hình 1.2.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Công Nghệ Châu Á

Cao hơn 1%

Cao hơn 1%

Phế liệu tôm tươi

Khử protein (NaOH 4%, t = 24 giờ, to=30oC)

Kiểm tra hàm lượng protein

Khử khoáng (HCl 4%, t=24 giờ, to=30oC)

Kiểm tra hàm lượng khoáng

Chitin

- Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản):

Hình 1.3.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)

Nhận xét: Quy trình đã đơn giản hóa công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian

sản xuất so với các quy trình khác Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu đượccó độ tinh khiết cao Tuy nhiên sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp do nhiệt độ xử lý ở các công đoạn khá cao

1.4.2 Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến:

Hình 1.4.Quy trình sản xuất của Pháp

NaOH 40%

to = 85oC

t = 4h w/v = 1/4

To phòng

T = 30 phút w/v = 1/5

Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều

Sản phẩm thu được rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để

Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch

polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt Mặt khác, acetone rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản xuất công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay

Việc nghiên cứu sản xuất Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta Năm 1978 trường Đại học Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết Chitin-Chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện

- Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại học Thủy sản:

Nhận xét: Sản xuất chitosan theo quy trình này sản phẩm tạo thành có chất

lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó dễ làm ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm

Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và

có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: trường Đại học Thủy sản, Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội, Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản – Viện nghiên cứu môi trường Thủy sản 2,

…đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha Trang

đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme Những kết quả đó

đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu của tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắc khe hơn về chất lượng của chitin, chitosan trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay

Hình 1.5 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản

Nhận xét : Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy

màu Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian sử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm

NaOH 8%

to = 100oC

t = 2h w/v = 1/2,5

- Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam

Hình 1.6 Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc

Viện khoa học Việt Nam Nhận xét: Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không

đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện lại kéo dài, nhiều công đoạn

Nấu trong NaOH

- Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến)

Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa

học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003)

Nhận xét: phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có chất lượng không thua kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm tổng thời gian cần thiết giảm rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thị đây là phương pháp tốt hơn hẳn Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm

là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng Theo quy trình công nghệ này sản phẩm chitosan dạt được có các chỉ tiêu chất lượng như bảng 1.3

HCl 10%

to phòng t= 5h w/v = 1/5

NaOH 40%

to = 80±2oC

t = 5h w/v = 1/10 Rửa trung tính

Chitosan

Bảng 1.1 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)

Trạng thái Mềm mại Tổng thời gian thực hiện 9,5 giờ

Hàm lượng các chất không tan 1,6% Độ tan 98,32%

Độ nhớt 14,48oE Phản ứng biure Âm tính

1.4.3 Sản xuất chitin, chitisan theo phương pháp sử dụng enzyme::

-Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto[27]

Hình 1.8 Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006)

Sấy lạnh

Ưu điểm : Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều Sản phẩm Chitin thu được có chất lượng khá tốt, màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố trong công đoạn chiết astaxanthin Ngoài ra còn tận thu được protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đáng kể lượng hóa chất sử dụng.

Nhược điểm: Enzyme đắt tiền dẫn đến chi phí giá thành sản phẩm cao

- Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003)[6]

Hình 1.9 Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003)

HCl 10%

To phòng

T = 5h w/v = 1/5

Rửa sạch

Deacetyl Rửa trung tính Làm khô

Chitosan Chitin

Rửa trung tính

Bảng 1.2 hất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain (Trần Thị Luyến, 2003)

Nhận xét : Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình

khác Đặc biệt độ DA, độ tan và hiệu suất của quy trình có ưu thế hơn hẳn Nhưng

để nâng cao chất lượng của chitosan có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên, cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này Cần tiếp tục nghiên cứu và sản xuất enzyme deacetylase để thay thế hoàn toàn cho NaOH đặc trong công đoạn deacetyl

Gần đây Đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Chitin từ đầu-vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học (Sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) do tác giả Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú thực hiện nhằm thu nhận chitin từ phế liệu đầu

vỏ tôm bằng phương pháp công nghệ enzyme

Nguyên liệu để phục vụ thí nghiệm bao gồm: phụ phẩm đầu và vỏ tôm khô (Nam Định), phụ phẩm sau khi mua về được sấy lại cho khô giòn ở nhiệt độ 40oC rồi nghiền nhỏ thành bột để thu nhận chitin Vỏ dứa được thu mua ở chợ

Nghiên cứu thử nghiệm tách chiết chitin bằng phương pháp hóa học Kết quả cho thấy, lượng chitin trung bình thu được từ 100g nguyên liệu bột đầu – vỏ tôm khô là 7,4-7,5 g Kết quả này thấp hơn nhiều so với các số liệu công bố trong các tài liệu khác Nguyên nhân là do nhóm nghiên cứu đã sử dụng đầu vỏ tôm chứa nhiều

thịt Hiệu suất thu hồi chitin phụ thuộc vào mẫu nguyên liệu đó chứa nhiều hay ít protein

Tiếp tục tách chiết chitin nhờ sử dụng enzyme bromelanin, tác giả cho rằng, việc xử lý bột vỏ tôm với dịch ép bã dứa không chỉ loại được phần lớn lượng protein của vỏ tôm mà còn loại được hết các chất khoáng trong vỏ tôm Dịch ép bã dứa có nhiều axit hữu cơ có phản ứng với các chất khoáng trong vỏ tôm Phương pháp này tỏ ra có nhiều ưu điểm như: không cần axit để loại khoáng, tiêu tốn ít xút cho loại protein, hiệu quả thu hồi chitin cao hơn, chất lượng phế phẩm chitin nhận tốt hơn và ít gây ô nhiễm môi trường hơn Nhược điểm duy nhất của phương pháp

là mất nhiều thời gian thực hiện quy trình

1.5 Protease và quá trình thủy phân protein

1.5.1 Khái niệm chung và đặc tính của enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học, mang bản chất là protein mà chỉ cần một lượng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một lượng cơ chất rất lớn thành sản phẩm

Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần các chất vô cơ và hữu cơ khác nên enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các quy trình công nghệ của những ngành công nghiệp khác nhau

1.5.2 Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme

Bản cất của enzyme : Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh

học, do vậy nó có đủ tính chất như một protein thông thường

Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực… enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein

Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại, dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao, enzyme thương bị mất hoạt tính xúc tác

Cấu trúc của enzyme: enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác

được chia thành hai loại sau:

+ Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản): trong thành phần phân tử chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân

+ Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp): trong thành phần cấu tạo của nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme), những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận chuyển

Trung tâm hoạt động của phân tử enzyme: chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so

với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau Ở enzyme một cấu

tử thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như

(-SH, OH, -COOH…) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polipeptit kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra các trung tâm hoạt động này còn có sự tham gia của các ion kim loại

Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lý do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi

Cơ chế tác dụng của enzyme: enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau:

E P ES S

E   

+Trong giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

+Trong giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

+Trong giai đoạn tứ ba: sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với các cơ chất khác

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme[4][5]

Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ các chất phản ứng, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng

độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme…

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng do

enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo qui luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến một mức độ nhất định Đa số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 600C trở nên, trong nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 100C thì tốc đọ phản ứng tăng lên 1,5÷2 lần

Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp Ngoài ra còn phụ thuộc vào nông độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dụng của nhiệt độ

+ Ảnh hưởng của pH: enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường Mỗi enzyme

chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme

Một số enzyme hoạt động ở pH vùng rất acid như pepsin pH= 1,8÷2,2, và hoạt động vùng rất kiềm như tripsin pH= 5÷9 cùng một lọa enzyme thu được ở các nguồn khác nhau, cũng có pH tối thích khác nhau

- pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme

- pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử

cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ

đó phản ứng có vận tốc cao nhất

+ Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của

enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng cảu sản phẩm Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để Mặt khác nếu thời