Xây dựng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm

Trên thế giới, sự lây nhiễm IHHNV trên tôm có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp mô bệnh học, phương pháp lai tại chỗ, hay bằng các phương pháp sinh học

Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gởi đến ba mẹ, người đã nuôi con khôn lớn, là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc, luôn tạo mọi điều kiện cho con ăn học nên người

Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thu Thủy, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Trọng Hiếu, anh Nguyễn Văn Hưng và anh Nguyễn Duy Khánh, đã rất tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm qua

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và tất cả các anh chị trong công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt đồ án này

Em cảm ơn chị Ngô Huỳnh Phương Thảo, trưởng phòng CNSH Thủy Sản – Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em rất nhiều trong công tác tìm mẫu làm thực nghiệm

Và cuối cùng, gởi lời cảm ơn đến tập thể 48 CNSH, các bạn trường ĐH Khoa học

tự nhiên, Đại học Mở và Đai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, những người bạn đã luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập ở trường và trong thời gian thực tập vừa qua

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Lưu

MỤC LỤC

Danh mục các từ viết tắt iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Đặt vấn đề 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 5

1.2 Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) 6

1.2.1 Hình thái cấu trúc 6

1.2.2 Cách thức lan truyền 9

1.2.3 Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV 10

1.2.4 Sự nhạy cảm của các loài tôm với IHHNV 11

1.2.5 Mô mục tiêu 12

1.3 Các phương pháp phát hiện IHHNV trên tôm 12

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học 12

1.3.2 Phương pháp lai tại chỗ 13

1.3.3 Phương pháp kháng thể đơn dòng 13

1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử 14

1.3.4.1 Kỹ thuật PCR 14

1.3.4.2 Kỹ thuật Real-time PCR 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.1 Mẫu thí nghiệm 16

2.1.2 Cặp mồi cho phản ứng PCR 16

2.1.3 Hóa chất 17

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Thu mẫu 18

2.2.2 Tách chiết DNA 18

2.2.3 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 19

2.2.4 Điện di gel agarose 22

2.2.5 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA 26

3.2 Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV 26

3.2.1 Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của cặp mồi trên lý thuyết 26

3.2.2.1 Thiết kế mồi 26

3.2.2.2 Các thông số của mồi 26

3.2.2.3 Tính đặc hiệu của mồi 30

3.2.2 Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR 34

3.2.2.1 Sự hoạt động của mồi trên thực tế 34

3.2.2.2 Nhiệt độ lai 36

3.2.2.3 Độ đặc hiệu của mồi 37

3.2.2.4 Độ nhạy của quy trình 39

3.3 Ứng dụng quy trình để chẩn đoán bệnh IHHNV trên tôm 40

Kết luận và kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

IHHNV : Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (virus gây

bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ)

kDa : kilodalton

mM : MilliMol

nm : Nanometer

PCR : Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophosis

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV 11

Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV 318F/R 16

Bảng 3: Cách pha mix PCR 21

Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV 318F/R 27

Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R 27

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới 4

Hình 2: Cấu trúc của IHHNV 6

Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh 8

Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV 10

Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A được tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV 12 Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR 14

Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 28

Hình 8: Một số cấu trúc sefl - dimer của mồi 29

Hình 9: Một số cấu trúc hetero - dimer của mồi 30

Hình 10: Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên NCBI 31

Hình 11: Kết quả sắp gióng mồi xuôi và mồi ngược với các trình tự tải về từ GeneBank bằng phần mềm BioEdit 32

Hình 12: Kết quả kiểm tra mồi xuôi và mồi ngược bằng phần mềm Anhyb 34

Hình 13: Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của cặp mồi 35

Hình 14: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi IHHNV 318F/R 36

Hình 15: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi IHHNV 318F/R 38

Hình 16: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 39

Hình 17: Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung

Trong khi bệnh đốm trắng do WSSV (White Spot Syndrome Virus) gây nguy

hiểm ở tôm sú (Penaeus monodon) thì bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ do

IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) gây ra là tác nhân

nguy hiểm nhất ở tôm Penaeus stylirostris (còn gọi là Litopenaeus stylirostris) và tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei (hay Litppenaueus vannamei) Tuy virus này không gây chết cho tôm sú (P monodon) nhưng lại là một trong những tác nhân gây hội

chứng chậm lớn và dị hình (Runt Deformity Syndrome - RDS), đặc biệt nguy hiểm

cho tôm thẻ chân trắng P vannamei và gây chết hàng loạt ở tôm P stylirostris Việc

gia tăng hội chứng RDS trong các trang trại nuôi tôm đã buộc các nhà nghiên cứu

phát triển nguồn tôm P vannamei sạch bệnh không bị nhiễm IHHNV

Trên thế giới, sự lây nhiễm IHHNV trên tôm có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp mô bệnh học, phương pháp lai tại chỗ, hay bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR và Real-time PCR… Tại Việt Nam,

bộ Kit Real-time PCR nhằm phát hiện IHHNV đã được thương mại hóa bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tuy nhiên, giá thành và các yêu cầu về trang thiết bị phòng thí nghiệm cũng như kỹ thuật của người làm xét nghiệm đòi hỏi rất cao, do vậy phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi cho các trung tâm kiểm dịch dịch bệnh thủy sản ở các tỉnh thành trong cả nước Vì vậy, việc xây dựng quy trình PCR phát hiện bệnh IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam là điều cần thiết, nhằm phát hiện và xử lý kịp thời bệnh do IHHNV gây ra

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình PCR để

phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm”

Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:

- Xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện IHHNV trên tôm có độ nhạy cao, chi hợp lý

- Khảo sát khả năng ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh

1.1.1 Trên thế giới

Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam Trong các đối tượng thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất Theo công

bố của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture Organization), sản lượng tôm thế giới trong 2 thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 % Theo báo cáo của hội nghị nuôi tôm toàn cầu (2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới

từ năm 1999 như sau: 1,084 triệu tấn (1999), 1,143 triệu tấn (2000), 1,291 triệu tấn (2001), 1,445 triệu tấn (2002), và 1,84 triệu tấn (2003) Mức tăng bình quân khoảng 10,5 % mỗi năm[1]

Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD Với hiệu quả kinh tế và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư

Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài những mặt lợi còn có mặt trái của nó Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên thế giới đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn Dịch bệnh đã liên tiếp xuất hiện ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm Ước tính tổng thiệt hại

do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD[2, 3]

Bệnh hoại tử máu và vỏ do IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) là một trong những bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm Virus này khi thâm nhập vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ Nuôi tôm ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này Tôm nhiễm virus có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi trên mặt nước, xoay tròn và chết Tỷ lệ tôm

chết khi nhiễm bệnh khá cao: tôm P vannamei 10-50%, tôm tự nhiên (Ecuado) 63%,

tôm nuôi (Panama) 95% [9, 10]

IHHNV được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1981 ở Hawaii khi gây chết hàng

loạt tôm P stylirostris[10, 16, 17] Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi như Tahiti, Florida, Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize, Ecuador, Brazil, Honduras, France

và Jamaica[23] và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản ở các nước trên

Theo các báo cáo khoa học của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE – Office International des Epizooties), IHHNV xuất hiện khắp nơi trên thế giới hoặc trong môi trường hoang dã hoặc trong tôm Penaeid nuôi Ở Tây bán cầu, IHHNV thường được tìm thấy ở tôm Penaeid hoang dã ở Đông Thái Bình Dương từ Peru đến Mexico (Hình 1)

Hình1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới

Những năm gần đây, bệnh do IHHNV xuất hiện ở các nước Trung Mỹ như: Belize, Brazil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, E1 Salvador, Honduras, Mexico, New

Caledonia, Panama, Peru, Mỹ và Venezuela, châu Phi có Madagascar và Tanzania, các quốc gia châu Á có Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philippines, Singapore, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam

1.1.2 Ở Việt Nam

Hoạt động nuôi tôm biển ngày càng đóng vai trò quan trọng ở nước ta Tôm nước lợ là đối tượng nuôi chủ lực ở các tỉnh ven biển kéo dài từ Quảng Ninh, Hải Phòng đến tận Kiên Giang, Cà Mau Trong đó, Cà Mau và Bạc Liêu là hai tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn nhất cả nước

Trên cả nước, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 546.757 ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng 2,84 % tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %), còn lại là nuôi quảng canh cải tiến

và quảng canh Các tỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm 87,17 % của cả nước với 476.528 ha Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn 200.000 tấn[1]

Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi của người dân chưa cao, độ rủi ro về dịch bệnh còn cao Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh chết trên diện rộng từ năm 1993 đến nay đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm Năm 2003, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 32.423 ha, chiếm 3,2 % gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm[3]

Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh tôm trên toàn quốc đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng Riêng năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng Đồng Bằng Sông Cửu Long là khu vực bị thiệt hại lớn nhất do nơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước[1, 3]

Theo khảo sát của các nhà khoa học, bên cạnh WSSV, MBV và YHV, IHHNV

là một trong những virus gây bệnh phổ biến có mặt tại nhiều vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước[4, 5]

1.2 Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV)

Hình 2: Cấu trúc của IHHNV

Bộ gen của IHHNV là phân tử DNA sợi đơn có trình tự đọc xuôi ngược đều như

nhau và có dạng kẹp tóc hình chữ Y ở cả 2 đầu kết thúc

Phân loại: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy)

Tên khoa học: Infectious hypodermal and hematopoietic necrosic virus

Tên thông thường: IHHNV

Tên khác: Infectious hypodermal and haematopoiectic virus

Vật chủ: Penaeidae (tôm Penaeid)

Trình tự bộ gen IHHNV đã được giải mã gần như hoàn toàn, bao gồm 3 khung đọc mở ORF - Open Reading Frame (ORF1, ORF2 và ORF3) (Genbank AF218266)[4,

6, 9, 16, 17, 18]

(Hình 3) Thành phần base của sợi DNA trên genome IHHNV là 20,68%

A, 19,00% C, 24,04% G và 36,28% T Vì vậy, %A+T là 56,96% và %G+C là 43,04%[9]

Trong số các ORF này, ORF1 chiếm khoảng 50% bộ gen, gồm 2001 nucleotide (nucleotide thứ 816-2816) và mã hóa cho một polypeptide gồm 666 amino acid[9, 14, 16] Polypeptide này là protein không cấu trúc 1 (NS1) với nhiều chức năng khác nhau như: đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo DNA virus, tham gia vào quá trình đóng gói DNA virus trong các tế bào của động vật có xương sống, tăng cường biểu hiện gen mã hóa vỏ capside[9]…

ORF2 bắt đầu từ nucleotide thứ 56, tính theo chiều ngược và có đoạn chồng lấp với ORF1 ORF này gồm 1092 nucleotide, tương đương với nucleotide từ vị trí 760-1851, mã hóa cho protein chưa biết rõ chức năng Tuy nhiên, Shinke (2000) đã nghiên cứu và dự đoán rằng ORF2 có thể mã hóa cho protein không cấu trúc 2 (NS2) chưa biết chức năng cụ thể, gồm 434 amino acid[9]

ORF3 gồm 990 nucleotide, bắt đầu từ nucleotide thứ 2758-3747 Đầu 5’ của ORF3 cũng chồng lấp với ORF1 và mã hóa cho 1 polypeptide gồm 329 amino acid[9, 17] , là protein vỏ capsid của virus (VP) Dựa trên cấu trúc và tổ chức gen của các Parvovirus khác, người ta thấy rằng ORF3 mã hóa cho các protein cấu trúc[9, 14, 16]

Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh

Bộ gen của IHHNV (GenBank, AF218266) bao gồm 4075 bp, với 3 khung đọc

mở Trong đó, ORF1 mã hóa cho protein không cấu trúc ( từ nucleotide 816-2816), ORF2 mã hóa cho protein chưa biết chức năng (từ nucleotide thứ 760-1851) và

ORF3 mã hóa cho protein cấu trúc (từ nucleotide 2758-3747)

Sử dụng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE) để phân tích cấu trúc protein của virus này, người ta tìm thấy 4 loại protein có trọng lượng 74, 47, 39 và 37,5 kDa trong các virion tinh sạch[9, 11, 14] Theo trình tự amino acid từng phần, protein cấu trúc có khối lượng phân tử 47 kDa được xác định là do gen nằm trên ORF3 mã hóa[14]

Có 2 genotype IHHNV khác nhau đã được xác định và chứng minh là xâm

nhiễm vào tôm thẻ chân trắng (P vannamei) và tôm sú (P monodon) là IHHNV type

1 và type 2[4, 6, 15]

Ngoài ra, hai biến thể địa lý khác (geographic variants) của IHHNV cũng được tìm thấy Type A được tìm thấy ở Madagascar và Australia trong khi type B được tìm thấy ở Tanzania[4, 6, 18, 22] Cả Type A và B đều có chứa 3 ORF nhưng đã được chứng minh là không gây nhiễm vào các loài thuộc họ Penaeid[18, 22]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng IHHNV phân lập từ Philippine có độ tương đồng cao nhất với IHHNV ở Hawaii, chỉ sai khác 0,2% trình tự các nucleotide IHHNV phân lập từ Thái Lan lại thể hiện sự sai khác cao hơn so với IHHNV ở Hawaii, chỉ tương đồng 96,2% IHHNV phân lập từ Đài Loan rất giống với IHHNV ở Thái Lan, tương đồng tới 99,7%, chỉ khác nhau 9 nucleotide Dịch chiết DNA từ

P.monodon ở vùng Tanzania, Madagascar và Mauritius có chứa trình tự tương đồng

với IHHNV Trong số đó, trình tự tương đồng ở Tanzania giống tới 91,8% so với IHHNV ở Hawaii Trình tự ở Madagascar thể hiện sự tương đồng thấp hơn, 85,9% so với IHHNV ở Hawaii Trình tự ở Mauritius chỉ khác trình tự ở Madagascar 1 nucleotide[6, 14, 16]

1.2.2 Cách thức lan truyền

IHHNV lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều dọc Sự lan truyền theo chiều ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau hoặc do nguồn nước bị nhiễm, lan truyền theo chiều dọc do trứng bị nhiễm mầm bệnh[4]

Sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus cởi áo trong không bào của tế bào chất và DNA được vận chuyển đến nhân, nơi nó được phiên mã thành RNA thông tin Giống nhiều virus DNA khác, chu trình nhân lên của IHHNV có thể chia thành hai giai đoạn: giai đoạn khởi đầu sao chép DNA virus và giai đoạn sau, tổng hợp các protein chức năng của virus Các gen tham gia vào giai đoạn đầu và giai đoạn sau tập trung ở hai vùng khác nhau trên bộ gen của virus Sự biểu hiện của chúng được điều hòa bởi hai promoter phiên mã độc lập[9]

1.2.3 Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV

Các dấu hiệu tôm bệnh phát triển chậm và biến dạng vỏ do IHHNV thường xuất hiện ở giai đoạn hậu ấu trùng ở 35 ngày tuổi Trước giai đoạn này tôm có thể mang mầm bệnh nhưng không có biểu hiện ra bên ngoài[8, 21]

Một số biểu hiện bệnh có thể gặp bao gồm: giảm ăn, đôi khi tôm bơi chậm trên mặt nước rồi xoay tròn và chìm xuống đáy Tôm non giảm tăng trưởng và phát triển bất thường Tôm giai đoạn tiền trưởng thành có hiện tượng biến dạng chủy[4, 9]

Ở tôm

sú có hiện tượng tôm ngả màu xanh, dấu hiệu biến dạng chủy ở tôm sú xảy ra chậm so với tôm thẻ chân trắng, quan sát được ở những tôm có kích thước lớn, xuất hiện đốm trắng hoặc vàng trên vỏ kitin, đặc biệt là ở các phiến vỏ nối giữa lưng và bụng, tôm sắp chết thường có màu xanh nhợt và phần bụng có màu trắng đục, chủy bị biến dạng

và phát triển lệch về một bên[4, 9]

(Hình 4)

Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV

Mũi tên chỉ các vị trí xuất hiện đốm trắng hoặc vàng trên tôm P stylirostris nhiễm bệnh

Ngoài ra, IHHNV còn gây ra các triệu chứng cận lâm sàng như giảm tốc độ phát triển và làm giảm hiệu suất nuôi trên tôm sú, có thể giảm 10-50% so với mùa vụ tôm không nhiễm bệnh IHHNV[8]

1.2.4 Sự nhạy cảm của các loài tôm với IHHNV

Hầu hết các loài thuộc họ Penaeid có thể bị IHHNV xâm nhiễm, bao gồm cả

những loài P monodon, P.vannamei và P stylirostris là những loài được nuôi nhiều Trong đó P stylirostris là loài bị ảnh hưởng nhiều nhất (Bảng 1) Tôm P stylirostris

có tỉ lệ chết rất cao khi bị nhiễm IHHNV, trong khi đó ở một số loài khác như P vannamei hay P monodon, IHHNV chỉ làm chậm khả năng tăng trưởng của tôm và

làm lớp vỏ ngoài bị dị dạng[4, 9, 14, 18]

Những nghiên cứu cho thấy rằng IHHNV có mối liên hệ mật thiết với bệnh đục cơ tôm và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống

Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV

Bệnh do IHHNV thường xảy ra nghiêm trọng cho hầu hết tôm ở vùng Thái

Bình Dương, virus có thể gây dịch cấp và có thể gây chết trên 90% tôm P stylirostris trong vòng 20 ngày Đối với P stylirostris, ở giai đoạn tôm non và giai đoạn gần

trưởng thành bị ảnh hưởng nghiêm trọng[9, 10, 20]

Tuy nhiên, đối với P vannamei,

IHHNV thường gây hội chứng còi cọc, dị dạng (RDS), dẫn tới tôm bị giảm trọng lượng, phát triển không đều và làm dị dạng biểu bì, là những tác động chính hơn là gây chết[4, 19, 20, 21]

Ở hầu hết các giai đoạn vòng đời của tôm như: trứng, ấu trùng, hậu

ấu trùng, tôm non và tôm trưởng thành của tôm thẻ chân trắng, P vannamei đều nhạy

cảm với virus này Trứng được sinh ra từ tôm mẹ bị nhiễm IHHNV với hàm lượng cao sẽ không nở được Naupli được sinh ra từ bố mẹ bị nhiễm IHHNV sẽ bị nhiễm bệnh[13]

1.2.5 Mô mục tiêu

IHHNV xâm nhiễm và sao chép trong các mô có nguồn gốc ngoại bì và trung phôi bì Tuy nhiên, mô mục tiêu chủ yếu bao gồm: mang, biểu bì (hay còn gọi là dưới vỏ), mô liên kết, cơ quan tạo máu, cơ quan bạch huyết, tuyến râu, tuyến sinh dục và dây thần kinh bụng bao gồm nhánh và trung tâm thần kinh bụng[9, 10, 22]

1.3 Các phương pháp phát hiện IHHNV trên tôm

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học

Phân tích mô học cho thấy tế bào nhiễm IHHNV xuất hiện các thể nhân phồng lên, thể Cowdry type A (Hình 5) Khi nhuộm lát cắt với hematoxylin và eosin, IHHNV thường được thấy trên các tế bào có nguồn gốc ngoại bì và trung bì, ít khi gặp trên các tế bào có nguồn gốc nội bì IHHNV cũng được tìm thấy trên màng nhầy của các tế bào biểu mô, dạ dày, manh tràng và tế bào gan tụy[8, 9, 10, 12, 13, 10, 21]

Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A được tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV

Mũi tên hướng lên chỉ nhân của tế bào tôm bị nhiễm IHHNV, mũi tên hướng xuống chỉ

nhân của tế bào tôm bình thường

Nghiên cứu mô học thường được sử dụng để phát hiện những tổn thương ở vỏ, mang, tế bào biểu bì, mô máu, dây thần kinh… Đây là phương pháp phổ biến nhất

trong chẩn đoán bệnh thủy sản [10, 20] nhưng thường chỉ cho kết quả chính xác khi tôm nhiễm bệnh nặng

1.3.2 Phương pháp lai tại chỗ

Lai tại chỗ (in situ hybidrization) là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự

nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hoặc trong mô Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào

Phương pháp lai tại chỗ cũng được phát triển để chẩn đoán bệnh IHHNV[8]

Mặc dù phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng tốn nhiều thời gian

Tuy nhiên, phương pháp này phải thông qua một số phương pháp như dot blot, lai Western hoặc hóa mô miễn dịch để kiểm tra kết quả, do vậy, tiêu tốn nhiều thời gian (khoảng 10 ngày)

1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử

1.3.4.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là một phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã biết trước Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) Nguyên tắc của phản ứng PCR được minh họa trong hình 6:

Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR

Trên thế giới, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng rộng rãi để phát hiện nhiều bệnh

do vi khuẩn và virus gây ra trên tôm trong đó có bệnh do IHHNV gây ra[17, 22] Kỹ thuật này được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh chóng và cho kết quả chính xác trong chẩn đoán IHHNV

1.3.4.2 Kỹ thuật Real-time PCR

Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA diễn ra theo từng chu kỳ và được theo dõi trực tiếp Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành Để có được tín hiệu Real-time phản ứng đang diễn ra, người ta sử dụng chất phát huỳnh quang (fluorophores), hoặc các mẫu dò đánh dấu (labeled probes) như: Beacon, TaqMan,… có gắn chất phát huỳnh quang (FAM, TAMRA, …) Các phẩm nhuộm như SYBR Green, Hoechst khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang Mix PCR có chứa phẩm nhuộm phát huỳnh quang, khi gắn vào mạch đôi DNA sẽ thể hiện cường độ màu tương ứng với nồng độ ban đầu của DNA bản mẫu

Đối với tôm, kỹ thuật Real-time PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh

do virus gây ra như bệnh đỏ đuôi (Taura), bệnh hoại tử (IHHNV)… [2]

.Kỹ thuật time PCR phát hiện và định lượng IHHNV cho kết quả nhanh và có độ nhạy cao[4] Để tăng cường kiểm soát khả năng tạp nhiễm, người ta sử dụng thêm mẫu chứng là DNA được tách chiết từ tôm, chứa những trình tự đã biết trước, chẳng hạn như gene β-actin,

Real-để khuếch đại song song với DNA của virus Cài đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng, xây dựng đường chuẩn và dựa vào giá trị chu kỳ ngưỡng (CT) để kết luận mẫu có nhiễm IHHNV hay không

So với phương pháp PCR truyền thống thì phương pháp này đòi hỏi phòng thí nghiệm được đầu tư trang thiết bị hiện đại hơn, cán bộ phụ trách xét nghiệm phải được đào tạo bài bản hơn và chi phí cho mỗi phản ứng Real-time PCR là cao hơn rất nhiều nên khó có thể ứng dụng rộng rãi cho tất cả các hộ nuôi tôm

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Mẫu thí nghiệm

Mẫu chứng dương là dịch chiết DNA của IHHNV và mẫu tôm postlarvae đã được xác định mang bệnh IHHNV được cung cấp bởi Phòng chẩn đoán bệnh thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học, TP Hồ Chí Minh

Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV dùng để khảo sát quy trình được cung cấp bởi các trại nuôi tôm ở Cam Ranh – Khánh Hòa

2.1.2 Cặp mồi cho phản ứng PCR

Cặp mồi IHHNV318F/R được thiết kế dựa trên tham khảo cặp mồi IHHNV309F/R và được đặt tổng hợp bởi công ty Intergrated DNA Technologies (IDT – Hoa Kỳ) (Bảng 2)

Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV318F/R

Độ dài (bp)

Độ dài sản phẩm khuếch đại (bp)

Nhiệt

độ biến tính (T m, 0 C)

2.1.3 Hóa chất

a) Hóa chất tách chiết DNA

Dung dịch Trizol (Phenol pH4 38%, Guanidium thyocianate 0,8 M, Glycerol 5%, Sodium acetate 0,1 M, pH 8,0)

Enzyme Taq DNA polymerase

Deoxynucleotide triphosphate: dATP, dTTP, dGTP, dCTP

 Tủ vô trùng để tách chiết và đặt phản ứng PCR (Việt Á, Việt Nam)

 Máy ly tâm (Eppendorf, Đức)

 Máy vortex (IKA, Hàn Quốc)

 Máy PCR (Stratagene, New Zealand)

 Bồn ủ nhiệt khô (Việt Á, Việt Nam)

 Bộ điện di (UVP, USA)

 Bàn đèn tử ngoại (UVP, USA)

 Máy chụp hình kỹ thuật số (Canon, Nhật)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

2.2.2.1 Nguyên tắc

DNA từ các mẫu tôm được tách chiết bằng phương pháp kết tủa (Chomozynski

và Sacchi, 1987) Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein, màng tế bào…) DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu hồi qua các lần ly tâm Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE 1X và bảo quản ở -

200C

2.2.2.2 Các bước tiến hành

- Đánh dấu các eppendorf vô trùng bằng ký hiệu mẫu

- Cho vào mỗi eppendorf 200 µl dung dịch TE 1X

- Đối với mẫu bảo quản trong cồn trên 950, phải làm khô hết ethanol (cả trên

bề mặt lẫn trong mô cơ của tôm) trước khi cho vào dung dịch TE 1X để nghiền

- Đối với mẫu bảo quản trong tủ đông phải để rã đông trước khi tiến hành nghiền mẫu

- Lót lớp giấy thấm bên dưới, đặt mẫu tôm lên trên, dùng chày để cố định và panh kẹp để gắp những bộ phận là cơ quan đích, nơi khu trú của IHHNV (đối với mẫu tôm postlarvae thì gắp khoảng 15-20 con), cho vào eppendorf

có sẵn 200 µl TE 1X rồi nghiền nhuyễn mẫu (Lưu ý: mỗi mẫu dùng 1 chày khác nhau để nghiền, trong suốt quá trình xử lý mẫu luôn có 1 đèn cồn và 1 cốc cồn 960 để khử trùng panh kẹp, tránh trường hợp lây nhiễm từ mẫu này sang mẫu khác)

- Bổ sung thêm 300 µl dung dịch TE 1X vào, vortex để trộn đều dịch

- Lấy 200 µl dịch chiết trên cho vào eppendorf 1,5 ml có 900 µl dung dịch Trizol, vortex 30s để trộn đều hỗn hợp và tan lớp tủa tạo thành ở phía trên, sau đó để yên hỗn hợp trong 10 phút

- Cho thêm vào 200 µl dung dịch chloroform, trộn đều, đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Thu 600 µl dịch nổi có chứa DNA vào eppendorf sạch khác có sẵn 600 µl dung dịch isopropanol đã bổ sung chất trợ tủa, trộn đều, để yên 10 phút trong tủ lạnh, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng), cho từ từ 900 µl dung dịch ethanol 70% vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn và làm khô ở 600C trong 10-15 phút

- Hòa tan trong 50 µl dung dịch TE 1X

2.2.3 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

– 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới

Giai đoạn lai (hybridization): Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 – 700C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn kéo dài (elongation): Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 720C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase hoạt động Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích sẽ được nhân bản thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 – 40 lần thì từ một DNA đích sẽ được nhân bản thành 230

c) MgCl 2

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép Mg2+ là Co–factor của Taq polymerase

nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại, nếu nồng độ quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh Do đó, nồng độ MgCl2 sử dụng cần được tối ưu hóa cho từng

hệ thống PCR cụ thể Thông thường, MgCl2 được sử dụng ở nồng độ từ 1,5 mM – 4

mM

d) Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphotphat)

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotide Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR, còn sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase

e) Mồi

Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR Do đó, công việc thiết kế mồi sẽ đóng vai trò then chốt quyết định sự thành công của quy trình PCR

f) DNA mạch khuôn

Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao, thậm chí chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng Tuy nhiên, nồng độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/ phản ứng

2.2.3.3 Các bước tiến hành

Phản ứng PCR được thực hiện có thể tích 25 µl bao gồm: 20 µl mix PCR (Bảng 3) + 5 µl dịch DNA tách chiết (hoặc 5 µl nước cất đối với chứng âm), cho vào eppendorf 0,2 ml Pha mix PCR theo bảng sau:

Bảng 3: Cách pha mix PCR

eppendorf (µl)

Thể tích cho 55 eppendorf (µl)