NGHIÊN cứu TÁCH CHIẾT độc tố CONOTOXIN từ BA LOÀI ốc cối CONUS STRIATUS, CONUS TEXTILE, CONUS VEXILLUM và bước đầu KHẢO sát THÀNH PHẦN của độc tố BẰNG sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ========== NGUYỄN ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ CONOTOXIN TỪ BA LOÀI ỐC CỐI CONUS STRIATUS, CONUS TEXTILE, CONUS VEXILLUM VÀ BƯỚC Đ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

==========

NGUYỄN ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ CONOTOXIN TỪ BA LOÀI

ỐC CỐI CONUS STRIATUS, CONUS TEXTILE, CONUS VEXILLUM

VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 PGS – TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA

2 CN NGUYỄN THANH SƠN

Nha Trang, tháng 07 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Qua 3 tháng nỗ lực phấn đấu cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các thầy

cô và bạn bè tôi đã hoàn tất đồ án này Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS - TS Ngô Đăng Nghĩa và CN Nguyễn Thanh Sơn đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đồ án

Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô giáo, các cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm: Bộ môn Công Nghệ Sinh học, bộ môn Môi Trường, tổ Nghiên Cứu thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập

Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp 48cnsh, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên tôi

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chật lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đồ án

Sinh viên

Nguyễn Anh Phương

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặt vấn đề 3

1.1.1 Tính cấp thiết của đề tài 3

1.1.2 Ý nghĩa khoa học của đề tài 4

1.1.3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4

1.2 Tổng quan về ốc Conus và tuyến độc tố 4

1.2.1 Bộ máy nọc độc của ốc cối 6

1.2.2 Cơ chế tác động của độc tố ốc cối 11

1.2.3 Tác dụng của độc tố ốc cối 11

1.2.4 Những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 13

1.2.4.1 Tài liệu nước ngoài 13

1.2.4.2 Tài liệu trong nước 14

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 15

1.3.1 Tổng quan về phương pháp sắc ký 15

1.3.1.1 Lịch sử ra đời phương pháp sắc ký 15

1.3.1.2 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 17

1.3.1.3 Phân loại phương pháp sắc ký 17

1.3.1.4 Các cách tiến hành phân tích sắc ký 19

1.3.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 20

1.3.2.1 Cơ sở lý thuyết 20

1.3.2.2 Hệ thống HPLC 26

1.3.2.3 Chọn điều kiện sắc ký 30

1.3.2.4 Tiến hành sắc ký 32

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.2 Hóa chất và dụng cụ 34

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 34

2.2.2 Hóa chất 34

2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35

2.3 Phương pháp thực hiện 36

2.3.1 Giải phẫu tách tuyến nọc độc 36

2.3.2 Chuẩn bị mẫu phân tích cho HPLC 36

2.3.3 Xác định độc tố conotoxin bằng HPLC 36

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Xác định khối lượng độc tố thô/cá thể 38

3.2 Phố HPLC 41

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Một số đề xuất 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IUPAC Hội hoá học cơ bản và ứng dụng quốc tế

GC Sắc ký khí

LC Sắc ký lỏng LSC Sắc ký lỏng – rắn BPC Sắc ký hấp phụ IEC Sắc ký trao đổi ion SEC Sắc ký phân loại theo kích cỡ GSC Sắc ký khí – rắn

GLC Sắc ký khí – lỏng WLOT Cột ống mở PLOT Cột nhồi

KL Khối lượng

NP Pha thuận

RP Pha ngược MeOH Methanol ACN Acetonitril TFA Trifluoro acetic acid

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Hình dáng bên ngoài conus vexillum 6 1.2 Hình dáng bên ngoài conus textile 6 1.3 Cấu tạo tuyến nọc độc conus textile 6 1.4 Phân loại các phương pháp sắc ký 18 1.5 Quá trình tách các chất A và C trong cột tách sắc ký 20 1.6 Sắc ký đồ quá trình phân tách ở Hình 1.5 21 1.7 Các thông số chính của quá trình sắc ký lỏng cơ bản 24 1.8 Độ phân giải ở các nồng độ khác nhau 24 1.9 Tính không đối xứng của peak 26 1.10 Các bộ phận cơ bản của hệ thống HPLC 26

3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng trung bình tuyến nọc độc

của 3 loài ốc cối

40

3.2 Biểu đồ so sánh khối lượng độc tố ốc thô, độc tố

ốc thô/cá thể của 3 loài ốc cối

41

3.3 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 60 phút 42 3.4 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 90 phút 42 3.5 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 120 phút (lần 1) 43 3.6 Phổ sắc ký đồ của Conus striatus ở Gradient 120 phút 44 3.7 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 120 phút (lần 2) 44 3.8 Phổ sắc ký đồ của Conus vexillum ở Gradient 120 phút 45

MỞ ĐẦU

Ốc cối là một trong những họ động vật thân mềm lớn (gồm khoảng 700 loài) thuộc loại ăn thịt, có nọc độc, phân bố khắp nơi trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển nhiệt đới Độc tố của chúng là các peptide có hoạt tính gây độc thần kinh còn gọi là conotoxin chứa trong ống độc Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài này đặc biệt các nghiên cứu về hệ protein của từng loài cũng như xác định các protein độc của chúng rất được các nhà khoa học quan tâm Ở Việt Nam, thành phần protein các loài ốc cối còn chưa được nghiên cứu, khai thác [4] Trong đồ án này chúng tôi trình bày phương pháp nghiên cứu tách chiết độc tố conotoxin từ ba

loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum và bước đầu khảo sát

thành phần của độc tố bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nội dung chính như sau:

 Tìm hiểu khái quát về ốc cối và tuyến nọc độc của chúng

 Tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối Conus striatus, Conus

textile, Conus vexillum

 Tìm hiểu phổ Sắc ký đồ của ba loài ốc cối trên

 Thảo luận kết quả và đề xuất ý kiến

Chương 1 TỔNG QUAN

Ốc là tên chung để chỉ hầu hết các loài động vật thân mềm trong lớp Chân bụng với đặc điểm có vỏ xoắn khi trưởng thành (có các loài ốc không có vỏ hoặc vỏ rất nhỏ, ví dụ ốc sên trần) Đặc điểm chung là có vỏ cứng bằng đá vôi, tạo thành ống rỗng, cuộn vòng quanh trục chính thành các vòng xoắn, thường theo chiều thuận với chiều kim đồng hồ Ốc sống ở rất nhiều môi trường, từ rãnh nước, sa mạc, cho đến những vực biển sâu Đa số các loài ốc sống ở môi trường biển Nhiều loại khác sống trên cạn, trong môi trường nước ngọt và nước lợ [3]

Ở Việt Nam, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có mức độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối đã được khai thác với sản lượng lớn Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn lợi ốc đã và đang có chiều hướng suy giảm nhanh chóng do việc khai thác quá mức, chưa có biện pháp quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt chủng đã được liệt kê trong danh mục những loài cần được bảo tồn (Sách đỏ Việt Nam, 2003)

Hiện nay tại Việt Nam người ta chỉ quan tâm đến các loài ốc bởi giá trị thương mại và thực phẩm của chúng, trong khi đó chúng còn có các giá trị như trong y học, đa dạng sinh học cho đến nay hầu như chưa có nhiều các nghiên cứu

Ốc cối (Conus) là một trong những loài có giá trị thương mại, y học, tính đa dạng sinh học cao Chúng có số lượng loài lớn nhất trong số các động vật không xương ở biển gồm khoảng 700 loài, độc tố contoxin của chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, thuốc giảm đau trong khoa học thần kinh Ở Việt Nam hiện nay đã phát hiện được khoảng 62 loài ốc Conus [2] trong đó có 20 loài thường xuất hiện ở các vùng

biển Việt Nam đó là: Conus capitaneus, Conus tulipa, Conus lividus, Conus miles,

Conus marmoreus, Conus bandanus, Conus litteratus, Conus bilious, Conus vexillum, Conus caracteristicus, Conus distans, Conus imperialis, Conus quercinus,

Conus textile, Conus betulinus, Conus generalis, Conus lynceus, Conus musteus,

Conus lynceus, Conus varius, Conus flavidus

 Phân loại ốc cối [3]

Giới (Kingdom): Animalia Linnaeus, 1758 – animals

Phân giới (Subkingdom): Bilateria (Hatschek, 1888) Cavalier-Smith, 1983 – bilaterians

Chi (Branch): Protostomia Grobben, 1908 – protostomes

Dưới chi (Infrakingdom): Lophotrochozoa – Lophotrochozoans

Liên ngành (Superphylum): Eutrochozoa

Ngành (Phylum): Mollusca (Linnaeus, 1758)

Lớp (Class): Gastropoda Cuvier, 1795 - Snails and Slugs

Phân lớp (Subclass): Orthogastropoda Lindberg, 1996

Liên bộ (Superorder): Caenogastropoda Cox, 1960

Bộ (Order): Sorbeoconcha Ponder & Lindberg, 1997 Phân bộ (Suborder): Hypsogastropoda Lindberg, 1997

Phân bộ (Infraorder): Neogastropoda Thiele, 1929

Liên họ (Superfamily): Conoidea Fleming

Họ (Family): Conidae Rafinesque, 1815 - Cone

Giống (Genus): Conus Linnaeus, 1758

1.1 Đặt vấn đề

1.1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Conotoxin trong các loài Conus là một trong những độc tố đa dạng nhất Ước

tính có khoảng 700 loài ốc Conus trên toàn thế giới, mỗi loài có đến 50-200 độc tố

conotoxin khác nhau [1]

Độc tố của Conus là hỗn hợp của các polypeptide gồm các acid amin trong

đó có một khung là các cystein với các cầu nối disulfide có khả năng ức chế các kênh ion và các thụ thể dẫn truyền thần kinh Ngoài vai trò quan trọng là bắt mồi và bảo vệ thì conotoxin còn là một công cụ hữu ích trong khoa học thần kinh Hơn nữa, conotoxin cũng cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc, ví dụ ω-

conotoxin MVIIA từ Conus magus có khả năng bao vây kênh calcium N đang là

một trong những loại thuốc đặc hiệu để điều trị cơn đau mãn tính và đột quị [1]

Ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum là một trong hơn 700

loài Conus sống ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới Độc tố conotoxin của chúng nằm ở bầu độc và ống độc Đa dạng về thành phần và cấu trúc của các conotoxin đang được nghiên cứu và một số loài được cho là có tiềm năng sử dụng như là các tác nhân dược lý đặc biệt trong chẩn đoán và trị liệu

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành “NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ

CONOTOXIN TỪ BA LOÀI ỐC CỐI Conus striatus, Conus textile, Conus

vexillum VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”

1.1.2 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Bước đầu xác định phổ Sắc ký đồ của độc tố 3 loài ốc Conus striatus, Conus

textile, Conus vexillum, qua đó biết được mức độ phức tạp của các hỗn hợp peptide

trong độc tố, làm nền tảng cho các nghiên cứu sâu về sau

1.1.3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Cung cấp dữ liệu ban đầu về thông tin của phổ độc tố, từ đó có thể đi sâu nghiên cứu các thành phần cơ bản của từng loại peptide

1.2 Tổng quan về ốc Conus và tuyến độc tố

Hiện nay trên thế giới có hơn 700 loài ốc Conus, chúng chủ yếu phân bố ở vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm Tuy nhiên một số loài có thể thích ứng với sự

thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển Nam Phi hay vùng biển phía tây Califonia ở Hoa kỳ

Hầu hết các loài ốc Conus nhiệt đới sống ở gần hoặc trong các rạn san hô, một số có thể tìm thấy dưới các tảng đá hoặc vùng nước nông khi thủy triều lên xuống Chúng được tìm thấy nhiều ở vùng biển nước Úc Những loài này đều có đặc điểm chung là có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn rất đẹp mắt Vỏ thuôn dài, dày, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều kim đồng hồ Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân liền trong vỏ bao bọc bởi một lớp nhày Sống ở vùng biển nhiệt đới, ở các rặng san hô, đầm lầy ngập mặn Thức ăn của chúng là các loài động vật thân mềm khác

Chúng phân bố rất rộng, từ vùng dưới triều đến độ sâu khá lớn, nhưng thường sống chui trong các khe kẽ rạn san hô ở độ sâu từ 10-30 m Ốc Conus tấn công mồi bằng việc bắn mũi tên nhỏ có chất độc vào con mồi, do cấu tạo vỏ của chúng có kẽ hở rộng nên chúng có thể thò vòi tiếp xúc với con mồi ở phạm vi khá rộng, dễ gây nguy hiểm cho con mồi Khi con vật phóng mũi tên (răng kitin) hoặc chích vào con mồi, vòi thò ra và một bộ phận hình mũi tên đâm con mồi, rồi phóng chất độc vào Nọc độc là một hỗn hợp chứa nhiều loại phân tử protein độc, trong đó chứa hàng trăm chất độc, khiến cho con mồi không thể nào kháng cự được

Ốc cối có hình dạng như trái tim (một số vùng ở Việt Nam ngư dân thường gọi là ốc trái tim), cùng với sự đa dạng về loài thì chúng cũng có kích cỡ rất khác nhau Loài có kích cỡ lớn nhất có thể dài đến 23 cm Ốc cối thường có màu sắc sặc

sỡ và có hoa văn rất độc đáo Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống Chúng thường đi săn mồi và ăn các loại giun, trùng, cá nhỏ, động vật hai mảnh vỏ và cả một số loài ốc cối khác Vì chúng chuyển động rất chậm nên khi bắt một số con mồi

di chuyển nhanh như cá chúng sử dụng độc tố để tấn công con mồi Chúng cung cấp nguồn dược phẩm quan trọng nhất và lớn nhất so với bất kỳ loài sinh vật nào trong

tự nhiên Khi lọt vào cơ thể, phân tử độc của ốc Conus liền phá vỡ liên lạc giữa các

tế bào Các nhà nghiên cứu đang bào chế thuốc chữa trị cho các bệnh thuộc hệ thần

kinh tự động miễn dịch, ung thư và triệu chứng đau mạn tính Thuốc tổng hợp chế

từ chất độc ốc Conus có công dụng gấp morphine hàng nghìn lần mà lại không gây

nghiện Ngoài ra, nọc độc ốc Conus còn có thể chữa động kinh và trầm cảm mãn

tính

Hình 1.1: Hình dáng bên ngoài Hình 1.2: Hình dáng bên ngoài

Conus vexillum Conus textile

Hiện nay khoa học đã nghiên cứu khoảng 1000 loại peptide từ độc tố ốc cối

1.2.1 Bộ máy nọc độc của ốc cối

Bộ máy nọc độc của ốc Conus gồm 4 bộ phận: túi độc, ống dẫn độc, túi răng

kitin và vòi phóng độc

Hình 1.3: Cấu tạo tuyến nọc độc của Conus textile

Túi răng kitin (Dr), ống dẫn (Od), túi độc (Td), vòi hút (Vh)

+ Túi độc: là bộ phận lớn nhất của bộ máy nọc độc có hình lưỡi liềm, màu

trắng nằm ở góc phải so với trục cơ thể hình nón, mặt lõm hướng về phía trước Túi

độc dài khoảng 2,2-2,5 cm, rộng 0,5-0,7 cm Nó có chức năng cơ học và đảm nhận việc bài tiết chất độc

Những mô tả về mô học đã cho thấy chức năng cơ học của tuyến này, nó đảm nhiệm việc bài tiết chất độc Khi cắt ngang tuyến độc cho thấy cấu trúc bên trong có 3 lớp: 2 lớp bao gồm các tế bào hình đa giác, nằm giữa các lớp là một vòng

cơ dày 100 micron, đóng vai trò như một loại bộ khung, tăng cường cho sự liên kết của lớp ngoài

+ Ống dẫn nọc độc: là cơ quan chính của bộ máy nọc độc Nó là một ống dài màu vàng và có đường kính khoảng vài trăm micrometer, cuộn lại thành từng búi, chiều dài của ống độc có thể tới 6-10 cm Nó nằm ở phía sau hầu về phía bên phải ngay sau vòng cơ Khi cắt dọc ống này cho thấy một vùng sáng rõ rất lớn được lấp đầy chất độc trong các cấu trúc dạng dây của các hạt màu, được bao quanh bởi một lớp biểu mô mỏng của các tế bào tiết hình khối nằm ở phần gốc sợi cơ Thành ống bao gồm một lớp cơ vòng nhẵn trung gian và một lớp cơ theo chiều dọc bên ngoài Ngay từ năm 1946, Hermitte đã lưu ý rằng, nó không chỉ là một ống dẫn đơn giản

để vận chuyển chất độc đến bộ máy đầu độc mà còn là cơ quan nơi mà chất độc được hình thành Hệ thống ống dẫn nọc độc được chia làm các đoạn khác nhau dựa vào đặc điểm cấu trúc và chức năng của chúng:

- Phần đầu ống dẫn nọc độc:

Là phần nối liền với túi cơ, dài khoảng 30-35 mm, màu hồng cam và đường kính khoảng 250 µm Dưới kính hiển vi quang học cho thấy có 3 vùng khác biệt trong phần này: lớp ngoài cùng của mô liên kết, lớp biểu mô của tế bào, và một khoang ở bên trong Lớp ngoài được tạo nên bởi hầu hết các sợi fibril giống collagen, các tế bào cơ được nằm sâu trong lớp collagen và kết hợp với các lớp dưới Bề mặt bên trong của lớp collagen này là một lớp mỏng vô định hình mà nó bao bọc lớp tế bào biểu mô Các tế bào trong lớp biểu mô này có chứa các ty thể tập trung ở bề mặt quay về phía lớp collagen Bề mặt trên cùng của các tế bào biểu mô

được bao bọc bởi các lông nhung nhỏ

Mặc dù bản chất của quá trình vận chuyển giả định trong phần đầu ống dẫn nọc độc chưa được biết, nhưng có thể các chức năng của biểu mô cũng giống như con đường hấp thu các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ (như amino acid, acid béo) từ khoang ống dẫn giống như một phần của cơ chế tuần hoàn Các mảnh vỡ tế bào trong khoang chính là một nguồn cơ chất phân tử hấp dẫn

- Ống dẫn nọc độc ngoại biên:

Là phần ống dẫn nọc độc khoảng 1/4 khoảng cách đến hầu, có hình thái thay đổi đột ngột, màu trắng kem, có đường kính khoảng 375 µm Lớp ngoài vẫn là collagen, nhưng bản chất của lớp biểu mô khá khác nhau Các hạt độc có đường kính ≥ 5 µm

Trong vùng sâu hơn của ống dẫn nọc độc ngoại biên, các hạt độc cho thấy sự khác biệt về siêu cấu trúc và có thể được phân chia ít nhất thành 2 lớp Mối quan hệ giữ hai lớp này với nhau hoặc với quá trình sinh độc tố nhìn chung chưa được hiểu

rõ từ những đặc điểm giải phẫu Rất nhiều hạt độc đặc trưng cho toàn bộ ống dẫn

độc ngoại biên, chúng được tìm thấy cả trong các tế bào biểu mô và trong khoang Các hạt độc trưởng thành có kích thước dài khoảng 20 µm và rộng khoảng 5 µm được tìm thấy trong phần gần đầu của ống dẫn độc

+ Phức hệ vòi hầu: nằm ở phía trước của bộ máy nọc độc:

- Ở phần này, ống dẫn quanh co, đường kính ống dẫn nọc độc khoảng 475

µm Một số tế bào biểu mô dạng khối có chứa các thể hạt nội bào giống với những thể hạt tìm thấy ở khoang của ống dẫn nọc độc, nhưng phân bố của các hạt này thì rất khác nhau Ở phần khoang của ống dẫn các thể hạt được tập trung với mật độ cao và các hạt nội bào thì rất thưa thớt Các tế bào biểu mô ngay cạnh hầu thì không

hề có chứa các thể hạt

- Khi ống dẫn nọc độc đi đến hầu nó hẹp lại rất nhanh, đường kính khoảng

125 µm Ở điểm bắt đầu của ống dẫn xuyên qua hệ thống cơ của hầu, hầu hết các tế bào biểu mô dường như không có chứa các thể hạt như mô tả trong phần kết nối

Ngoài ra, một dạng khác biệt của các tế bào biểu mô nhỏ nằm rải rác trong vùng này

- Ở khoảng cách khoảng 250 µm về phía thành của hầu, ống dẫn nọc độc hẹp được phân thành 2 nhánh nhỏ hơn, mỗi nhánh có chiều rộng khoảng 10 µm Sau phần rẽ đôi của ống dẫn, mỗi nhánh tiếp tục rộng ra khoảng 500 µm trước khi đổ vào khoang của hầu

+ Phần liên kết giữa ống dẫn độc và vòi: Vùng này có hai đặc điểm quan trọng với sự sản xuất và giải phóng độc

- Thứ nhất, ống dẫn độc nhỏ hẹp đi tới các nhánh nhỏ chỉ khoảng 10 µm hoặc nhỏ hơn về bề ngang khi chúng đi qua thành hầu Dạng này có thể kéo dài 100

µm Đường kính nhỏ và khá dài của các nhánh liên kết cho thấy rằng sự phóng độc dường như không liên quan đến tốc độ dòng chảy cao hay lượng thể tích lớn Có thể các dãy lông nhung trong phần ngoại biên của các nhánh dẫn có liên quan đến vận chuyển độc vào hầu

- Một đặc tính quan trọng thứ hai là dạng tế bào biểu mô duy nhất mà bao bọc quanh các nhánh ống dẫn đi qua thành túi hầu Các tế bào đổi màu này còn được gọi là các tế bào màu tía, xuất hiện trong thành ống dẫn ngay trước khi vào hầu, và chúng xếp theo đường dẫn cho đến điểm mà ở đó lớp biểu mô này gặp lớp biểu mô không gấp nếp của túi hầu Đặc điểm đặc trưng và sự định vị của các tế bào màu tía này cho thấy rằng chúng đóng một vai trò quan trọng trong sự sản xuất hay phóng độc Có thể các tế bào này tiết và góp một thành phần đặc trưng vào chất độc cuối cùng dùng để phóng Nhiều thành phần có thể là các peptide không được tìm thấy ở nơi khác trong ống dẫn độc, các enzyme như phospholipase hoặc chất nhày đơn giản

+ Túi chứa kim phóng độc: gồm có một nhánh ngắn và một nhánh cong dài, nằm phía bên phải hầu Túi này có chứa rất nhiều kim phóng độc còn được gọi là dải răng kitin

+ Phức hệ vòi hầu:

Giải phẫu bộ răng kitin của ốc Conus: Dải răng kitin là một bộ phận trong cơ quan tiêu hóa, những cơ quan này đã biến đổi trong quá trình tiến hóa Loài Conus

có rất nhiều răng Các dải răng kitin được xếp song song thành 2 hàng theo chiều dọc, các đầu nhọn quay về phía đáy túi Hình thái của răng kitin có thể biến đổi rất lớn giữa các loài và nó quan hệ mật thiết với các loại thức ăn (Endean & Rudkin, 1965)

Conus không những nhạy cảm với những biến đổi hóa học của môi trường

mà còn có khả năng tạo ra các chất hóa học có mùi hôi làm vũ khí tấn công làm tê liệt con mồi Những chất hóa học này tiết ra từ thực quản hoặc tuyến nước bọt sẽ làm mềm vỏ con mồi và bơm vào cơ thể con mồi sau khi vỏ con mồi bị khoan thủng bằng hàm răng kitin Chúng tiêm nọc độc bằng các kim tiêm có dạng như những chiếc răng kitin Những dải răng kitin cùng với các chất hóa học đã giúp chúng vượt qua được sự phòng thủ của con mồi

+ Túi răng kitin:

- Các tế bào tạo răng nằm ở cuối túi kim phóng độc, chịu trách nhiệm cho việc hình thành răng Răng bằng kitin, ban đầu mềm dẻo, nhưng sau đó nó trở nên cứng trong suốt quá trình di chuyển từ nhánh dài đến nhánh ngắn Các dải răng kitin được xếp thành 2 hàng theo chiều dọc và xếp song song với nhau, các đầu nhọn quay về phía đáy túi Khi ở bên trong nhánh ngắn, các răng trưởng thành và cứng Phần này được bao bọc bởi một lớp biểu mô ngoài dày khoảng 7,5 µm, một lớp mô liên kết hẹp và một lớp biểu mô bên trong của các tế bào dài khoảng 25 µm Biểu

mô bên trong cuộn nếp phức tạp và dày khoảng 125 µm

- Dải răng kitin chủ yếu quay theo hướng hầu, tuy nhiên các hướng khác có thể được tìm thấy Trong một số trường hợp, các đám thể hạt nhuộm màu tối hiện diện trong biểu mô lớp trong, và các thể hạt tương tự có thể được tìm thấy bên trong răng Ở vùng mà các răng kitin chuyển vào nhánh dẫn xuyên qua hầu, tất cả chúng hướng về phía trước và được bao bọc bởi cơ của thành hầu Trong khoang của răng chứa rất nhiều hỗn hợp giàu các thể hạt và vật chất phi tế bào

- Việc khảo sát các răng không cố định khẳng định sự hiện diện của các vật chất dạng hạt Sự giống nhau về hình thái của vật chất trong khoang của ống dẫn độc rất hợp lý với việc các độc tố peptide tồn tại cả hai nơi Vì thế, răng kitin của

Conus californicus trong túi kitin xuất hiện ngay trước các thành phần peptide độc

trước khi được chuyển tới vòi phóng độc để sử dụng trong việc săn mồi Giả thuyết này đối lập với các ý kiến đã thảo luận trong phần giới thiệu

1.2.2 Cơ chế tác động của độc tố ốc cối [3]

Tuyến nọc độc chứa lượng lớn các peptide có tác động chọn lọc lên hệ thần

kinh ngoại biên và trung tâm thần kinh của động vật có xương sống và không có xương sống Các thành phần khác nhau sẽ có tác động riêng biệt lên các ion và các thụ thể cũng như các nhân tố khóa khác của hệ thống thông tin liên lạc giữa các tế

bào

Tuyến nọc độc của ốc cối chứa các peptide ngắn được gọi là conotoxin, mỗi loài ốc cối sản sinh ra một hỗn hợp các peptide độc rất phức tạp, có cấu trúc và tính

dược lý đặc trưng Conotoxin gồm những nhóm sau:

- Conotoxin tác động lên kênh natri: µ-, µ0- và δ-conotoxin

- Conotoxin tác động lên kênh canxi: nhóm ω-conotoxin

- Conotoxin tác động lên thụ thể nicotinic acetylcholine: họ α-conotoxin

- Conotoxin tác động lên kênh kali: κ-conotoxin Conotoxin tác động lên methyl-D-aspartate: họ conantokin

N-1.2.3 Tác dụng của độc tố ốc cối

Tác dụng của độc tố ốc cối: chính nhờ vào khả năng phá vỡ liên lạc giữa các tế bào mà khoa học có thể hiểu được cơ chế hoạt động của tế bào Tuy nhiên, nghiên cứu chất độc của ốc cối tỏ ra hứa hẹn nhất ở khu vực y tế chữa bệnh Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang bào chế thuốc chữa trị cho các bệnh thuộc hệ thần kinh tự động miễn dịch, ung thư và triệu chứng đau mãn tính Thuốc tổng hợp chế từ chất độc ốc

cối có công dụng gấp morphine hàng nghìn lần mà lại không gây nghiện Ngoài ra,

nọc độc ốc cối còn có thể chữa động kinh và trầm cảm mãn tính [8]

Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất

từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào Trong khi nghiên cứu chất độc

có thể gây chết người của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này

có tác dụng giảm đau Nhiều độc tố khác của ốc biển cũng đã được dùng để chữa các bệnh nguy hiểm như tim mạch, Parkinson Những người bị đau nhức kinh niên như bệnh nhân bị ung thư, bị cắt cụt tay chân dùng các thuốc giảm đau thông thường không có hiệu quả, chỉ còn mong vào những thuốc loại morphine - một chế phẩm của thuốc phiện Morphine dùng lâu gây nghiện, cứ phải tăng liều và đến một lúc nào đó, người ta phải truyền chậm để morphine liên tục có trong máu,

ở Mỹ có gần 50.000 người phải truyền thuốc như vậy Nhưng trong số đó, nhiều người vẫn còn đau đớn khổ sở Người ta đã tìm ra thuốc Prialt mạnh gấp 50 lần morphine, dùng dưới dạng bơm truyền Prialt là một thuốc tổng hợp, giống như độc tố của loài ốc biển hình chóp (Cone snail) Người tìm ra thuốc này là Olivera giáo sư môn sinh vật học tại Đại học Utah ở Salt Lake City Người ta đang thử một độc tố khác của con ốc biển, có tính chất bảo vệ dây thần kinh, hy vọng dùng được cho những bệnh nhân bị bệnh động kinh Ngoài ra, còn một số độc tố của nhiều loại ốc biển khác nhau cũng đang được nghiên cứu để chữa các bệnh tim, mạch máu, bệnh Parkinson [9]

Độc tố ACV1 được ông Bruce Livett và cộng sự ở Đại học Melbourne trích

ra từ loài ốc sên biển có vỏ hình nón còn gọi là ốc cối (Conus spp.) Một thành viên

của nhóm nghiên cứu cho biết: “Chúng tôi tin rằng ACV1 không những hạn chế được cơn đau, mà còn thúc đẩy sự tái tạo các dây thần kinh bị thương tổn Đặc điểm này chưa hề thấy trên các thuốc giảm đau trước đây” Hơn nữa, ACV1 có hiệu quả trong việc điều trị tất cả các loại bệnh đau kinh niên Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu

sẽ phải tiếp tục thí nghiệm để đảm bảo rằng ACV1 không gây nghiện hoặc gây hiệu ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc hiện nay Các nhà khoa học

cũng đã khẳng định độc tố ốc cối có thể làm giảm đau tốt gấp 10.000 lần morphine [8]

1.2.4 Những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.4.1 Tài liệu nước ngoài [3]

Năm 1998, theo Dr Bruce Livett, Dept (miền đông nam nước Australia) cho biết độc tố ốc có nhiều loại khác nhau gồm: tetrodotoxin, saxitoxin và conotoxin

trong ốc cối Mặt khác, nghiên cứu nọc độc của ốc vùng Sydney đó là Conus

imperialis và Conus pennaceous chứa độc tố alpha conotoxin, omega conotoxin

được sản xuất bởi Conus geographus và Conus magus

Năm 1999, trong bài báo “Đa dạng sinh học của giống Conus (Fleming,

1822): Nguồn phong phú các peptide có hoạt tính sinh học” của Frédéric Le Gall, Philippe Favreau, Georges Richard, Evelyne Benoit, Yves Letourneux và Jordi

Molgo (Pháp) nghiên cứu tổng quan về đa dạng sinh học của họ Conidae, ảnh hưởng của môi trường sống lên Conidae đồng thời mô tả các cơ quan của tuyến nọc

độc gồm: vòi hút, hầu, ống dẫn độc tố, túi nọc độc, túi răng kitin và các loại conotoxin trong hệ thống độc tố ốc cối Cũng trong năm này các nhà khoa học Mỹ

là Manami Nishivà Alan J Kohn đã nghiên cứu so sánh túi răng kitin của 11 loài

trong giống Conus spp Trong đó có Conus bandanus và Conus textile

Năm 2002, Jennifer Marshall, Wayne P Kelley, Stanislav S Rubakhin, Paul Bingham, Jonathan V Sweedler, và William F Gilly trong “Những yếu tố

Jon-tương quan đến giải phẫu về sự sản sinh độc tố trong Conus californicus” mô tả chi

tiết về cấu trúc mô học của ống dẫn độc và dải răng kitin đồng thời cho biết chức

năng các cơ quan trong tuyến nọc độc của Conus californicus

Năm 2008, các nhà khoa học Thomas F.Duda Jr, Matthew B.Bolin, Christopher P.Meyer, Alan J.Kohn (Mỹ) đưa ra kết quả nghiên cứu khi sử dụng kỹ

thuật di truyền để phân định và mô tả một số loài trong giống Conus spp mà trước đây biện pháp mô học thông thường chưa thực hiện được gồm các loài sau: Conus

sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis, Conus musicus và Conus parvatus tại

miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và Conus nux đông Thái Bình Dương

1.2.4.2 Tài liệu trong nước

Năm 2006, Đào Việt Hà Viện Hải Dương học Nha Trang đưa tin: “Loài ốc

bùn Nassarius papillosus (Linnaeus, 1758) được xác định là đối tượng gây ra vụ

ngộ độc ngày 17-10-2006 tại Quảng Ngãi” [9] Tại Việt Nam, đã xác định được ít nhất ba loài ốc cối chứa độc tố dưới dạng nọc độc (venom) có khả năng gây chết người, nhưng qua con đường chích khi chúng ta vô tình đụng chạm, cầm nắm phải chúng chứ không phải qua đường tiêu hóa

Nhưng cũng từ mẫu ốc trên viện Pasteur Nha Trang lại có kết quả sau khi

phân tích là đối tượng gây ra vụ ngộ độc trên với cái tên Pimple Nassa chứa độc tố

tetrodotoxin giống như độc tố có trong cá nóc Là loại độc tố thần kinh cực độc (liều

gây độc từ 0,5 đến 2 mg) [3] Theo chị Thanh Hương trong họ ốc cối có 2 loài ốc

cối được Viện Hải dương học Nha Trang xếp vào danh mục “Các loài hải sản độc hại gây chết người” trong tài liệu truyền thông Đó là ốc cối địa lý và ốc cối hoa lưới Chúng được phân bố nhiều ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương; tại Việt Nam, chúng xuất hiện ở ven biển phía Nam và các hải đảo Chị đã mô tả hình dáng bên ngoài cũng như môi trường sống của chúng Đồng thời đã đưa ra những dấu hiệu khi bị trúng độc và phương pháp phòng ngừa sơ cứu [10]

Nguồn tin từ DS Phạm Nga: “Từ loại ốc sên biển (Conus textile), nhà thần

kinh học George Milijianich (Mỹ) đã chế ra một loại thuốc giảm đau có tên là zinocotiden, được giới thiệu là công hiệu hơn morphine hàng chục lần” [11], hay nguồn tin khác độc tố ốc lợi bông có tác dụng chống đau Các nọc độc của nó chứa nhiều peptide có tác dụng khác nhau Có nhiều độc tố của ốc lợi bông đang được thử nghiệm lâm sàng, một trong số đó - MVHA - có các thuộc tính chống đau mạnh, cao hơn cả morphine Peptide này chủ yếu được sử dụng để điều trị các chứng đau không thể chữa được bằng các thuốc chống đau thông thường (morphine) Các độc tố khác

của ốc lợi bông hiện đang được triển khai ở cấp lâm sàng

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Tổng quan về phương pháp sắc ký

1.3.1.1 Lịch sử ra đời phương pháp sắc ký [5]

Sắc ký lỏng thường được khám phá bởi Mikhail Twsett, một nhà khoa học Nga Thuật ngữ này có ngữ căn “Chromato” (màu sắc) và “Graphy” (viết, ghi) được Twett đặt ra khi ông quan sát thấy sắc tố thảo mộc có thể được phân tách nhờ cột phấn (Cacbonat Canxi) khi ether đóng vai trò pha động đi qua Khi mô tả tiến trình ông đã tiên đoán phương pháp này sẽ có những ứng dụng rộng rãi và ông đã nói đúng Ngày nay HPLC là một công nghệ hữu hiệu với doanh số bán ra hàng năm vào khoảng 1 tỷ đô la trong phạm vi toàn thế giới Tất cả các công ty dược phẩm và

kỹ thuật sinh học đều dùng HPLC trong nghiên cứu triển khai, chế tạo và kiểm tra chất lượng Nó đã trở thành kỹ thuật chính trong phân tích định tính, định lượng và chế tạo các phân tử sinh học…

Các mốc thời gian về phát minh sắc ký có thể khái quát như sau:

+ 1903: Mikhail Twsett dùng ete tách các sắc tố thảo mộc ở một cột phấn ông đặt tên cho phương pháp là “sắc ký” (Chromatography)

+ 1951: Martin và Synge được giải thưởng NOBEL do định đề về lý thuyết sắc ký

+ 1958: Stein và Moore phát triển phương pháp tách trao đổi ion tự động của các axit amin, kết quả họ nhận được giải NOBEL năm 1972 vì đã xác định Protein bằng kỹ thuật này

+ 1959: Porath và Flodin phát hiện Polydextran liên kết chéo có thể được dùng để phân tách các phân tử sinh học

+ 1965: Stahl phát hành “Thin Layer Chromatography Handbook (sổ tay sắc

ký lớp mỏng)

+ 1969: Journal Of Gas Chromatography (báo sắc ký khí) trở thành Journal

of Chromatography (báo sắc ký)

+ 1972: Maors và Kirkland dùng các tiểu phần có kích thước nhỏ ( 10 pm) làm chất nhồi cột

+ 1976: Regnier báo cáo phân tách protein bằng HPLC rây phân tử và trao đổi ion Sự di chuyển bề mặt phân cách có thể hình thành bởi phép phân tích sắc ký lỏng/khối phổ (Mass Spectrography)

+ 1977: Krummeu và Frei, Molnar và Horvath thông báo kết quả phân tách protein, dùng các bơm HPLC kiểm soát bằng bộ vi xử lý Bennett dùng TFA (Trifluoro Acetic Axit) để phân tách Peptide bằng sắc ký pha đảo

+ 1978: Toga Soda giới thiệu các cột TSK để dùng trong các sắc ký rây phân

tử Rivier sử dụng TEAP (Triethylammonium Phosphte) làm pha động để phân tích Peptide

+1979: Mikes báo cáo dùng polymer phân tách Protein bằng trao đổi ion hiệu năng cao

+ 1980: Meek dự đoán thời gian lưu giữ Peptide

+ 1981: Cuộc họp đầu tiên của International Symposium On HPLC of Protein And Peptides (hội thảo quốc tế về HPLC của Protein và Peptide; về sau được gọi là International Symposium on HPLC of Protein, Peptides And Polynucleotide (ISPPP) tổ chức ở Washinton p.c (hội thảo quốc tế về HPLC của protein, peptide và polynucleotide)

+ 1983: Kato mô tả sắc ký tương tác kỵ nước hiệu năng cao

+ 1984: Những cột nhỏ với lòng đường kính bên trong 1 mm được dùng để tách Protein

+ 1984-1986: Snyder, Hearn, Horvath, Karger và một số người khác phát triển các kiểu tương tác cơ học Protein ở HPLC Nhiều kiểu phát triển khác được

mô tả ở báo cáo hội thảo của Gournal of Chromatography kết hợp với ISPPP hay hội thảo quốc tế về sắc ký lỏng ở cột, cả hai cùng họp hàng năm

+ 1985: sự phân tán điện trên bề mặt phân cách tạo nên nguyên lý sắc ký lỏng - khối phổ (LC/MS)

1.3.1.2 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân riêng vật lý mà trong đó các thành phần sẽ được phân riêng nhờ sự phân bố giữa hai pha, một pha cố định gọi là pha cố định và pha còn lại chuyển động theo một hướng gọi là pha di động Sắc ký cột là một quá trình mà trong đó pha di động thì liên tục di chuyển qua lớp sắc ký và mẫu được đưa vào hệ thống bằng các lần bơm nhất định “Định nghĩa chính thức của Hội hoá học cơ bản và ứng dụng quốc tế (IUPAC)” [5]

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động

và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Trong

hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình

sắc ký [6]

1.3.1.3 Phân loại phương pháp sắc ký [5]

Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí hay lỏng) còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC) và SẮC KÝ LỎNG (Liquid Chromatography - LC) Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành các nhóm nhỏ hơn

Hình 1.4: Phân loại các phương pháp sắc ký

- Sắc ký khí: trong sắc ký khí mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này

+ Khi pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn thì kỹ thuật phân tích được gọi là sắc

1.3.1.4 Các cách tiến hành phân tích sắc ký [7]

Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến

hành sắc ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:

 Phương pháp tiền lưu

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất Ví dụ, hỗn hợp hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử - thể tích dung dịch chảy qua cột Đồ thị này thường gọi là Sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất) Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yếu hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A + B Trong phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu

tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp A + B Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất

 Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi Trong phương pháp rửa giải, người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn ái lực của các cấu tử cần

tách với cột

 Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột

và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc ký Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa

các cấu tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa

1.3.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh (High Performance Liquid Chromatography) nghĩa là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

1.3.2.1 Cơ sở lý thuyết

Trong sắc ký, mẫu phân tích ở trạng thái lỏng được nạp vào cột Cột sắc ký

có tiết diện nhỏ, cột hẹp chứa chất nhồi hay chất nền Dung môi được bơm qua cột, tạo nên quá trình rửa giải từ đầu cột đến cuối cột và sau đó đến detector Sự tương tác khác nhau của các thành phần khác nhau có trong mẫu phân tích với pha tĩnh ảnh hưởng đến quá trình tách Điều này thấy trong hình 1.5, hỗn hợp của các phân

tử A và C đã được nạp vào đầu cột

Hình 1.5: Quá trình tách các chất A và C trong cột tách sắc ký

Trong lúc di chuyển với dung môi (pha động), A và C tách rời khỏi nhau vì

C có ái lực lớn hơn với pha tĩnh và kết quả di động qua cột chậm hơn A Kết quả cuối cùng A giải hấp (Elute) khỏi cột trước sau đó đến C Việc đo độ hấp thụ và một vài đặc tính khác được dựa trên Sắc ký đồ biểu thị thời gian dung lượng giải hấp, như thấy ở hình 1.6 đối với các phân tử có ghi ở hình 1.5 [5]

Hình 1.6: Sắc ký đồ của quá trình phân tách ở Hình 1.5

Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ:

+ Thời gian lưu chết (dead time) [5]:

- Phần lớn các phân tử hữu cơ có phổ hấp thụ ở vùng tử ngoại thấp (210 nm)

và sự hấp giải thường được theo dõi bằng phép đo quang phổ Dung lượng thấm hay dung lượng pha động V M là dung lượng của pha động trong cột Dung lượng này

là tổng của chất lỏng bên ngoài (V0) và bên trong thành cột (Vi )

- V M là lượng chất lỏng cần cho đỉnh không lưu giữ đi qua cột, đại lượng này dùng để ứng dụng làm điểm tham khảo khi tách bằng sắc ký, “t0” là thời gian lưu chết (dead time), “V M” hay “t0” của một cột có thể xác định bằng nhiều cách, cho một lần hoạt động nào đó

V M  0,5.L.d c

Trong đó: L là chiều dài của cột (cm)

c

d là đường kính của cột (cm)