Nghiên cứu xác định vitamin c trong thuốc, thực phẩm chức năng, hoa quả và nước giải khát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC Phân tích, xử lý số liệu Kết quả thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu Mẫu các loại quả, thuốc và sản phẩm chức năng được thu thập từ các cửa hàng

BO GIAO DUC VÀ ĐÀO TẠO

THÁI ĐẠI QUÂN

NGHIÊN CUU XAC DINH VITAMIN C TRONG THUOC, THUC PHAM CHỨC NĂNG, HOA QUÁ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT BANG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUñN VũN THIC Sũ HÚA HIC

VINH - 2013

BO GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

THÁI ĐẠI QUẦN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH VITAMIN C TRONG THUÓC, THỰC PHẢM CHỨC NĂNG, HOA QUÁ VÀ NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG

PHƯƠNG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO

CHUYEN NGANH: HOA PHAN TICH

MA SO: 60.44.29

LUñN VON THOC SO HUA HOC

Người hướng dẫn khoa học:

TS ĐINH THỊ TRƯỜNG GIANG

MUC LUC

DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU VIET TAT

DANH MUC CAC BANG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỎ

LOI CAM ON

CHUONG 1 TONG QUAN TALI LIEU esessesssssessessseseeseescesessessneneeseenes 3

1.1 Giới thiệu về vitamin ¿5 5s+++sxeexextsrxerersersrserreree 3

INN4.T n8hhG 4 3

112 Đặc điểm chưng và phán Ìoại - 5+ 2c S218 E12511 1351355111511 xc2 3

1.1.2.1 Dac diém chung

1.122 Phân loại

1.2 Vitamin C (Acid ascorbic)

1.21 Lược sử

1.24 Cấu tạo của vifdimiH C 5+ tt SE SE E1 gxggngrgrrey 6

1.2.5, NQUON GOC.oeccccscescsessesessessessesessessessscsseesssesssessvasstsseetesssavansaeeseeeesees 7

1.2.5.1 Nguồn gốc /57/17.2:8PEPPPRA 6 a a 7

1.2.5.2 Nguôn gốc từ động vật 5: 225 E121121211212121221211222xxe 9 1.2 6 Vai trò của vitamin C trong co’ thé SONg c0.c0ccceescesvesesesees ves esseseees 10 1.2.7, Nhu clita vé Vitainin Cocceccecsesssssessessssssssesesssasesssessssesssesessuesssseaseasens 10 1.2.7.1 Thiếu vitamin C - 5: 5+ 2t 2 55221221511221121121121121 1121221 xe 12 I2ZN.,.a 0n ốốỐằỐỐằ 13

1.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu . + «>sess=xsss2 14

F76» nh Ầ 14

1.3.3 Thuốc HAP.4ACOL KID%S - 2-5252 S5+‡StSxtSxeExesxtrtrsrrxerrvsrs 15 1.3.4 Thuốc AMPHA BC COIMLEX -22©55c55z+csesxerxrrrxrrxerres 17 1.3.5 Thực phẩm chức năng: RUTIIN-C 5©5+Scccccseceecsrcrrrrs 18 1.36 Thực phẩm chức năng: Nam dược giải rượi ccccccccsccsc+ 19 1.37 Nước giải khát (Faith) nước khống chanh muiỗi 5-2 21 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - 21

1.41 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21 LALA, Co SOD) Mel co.cc cece cccccccceceescecesesceseseevevesescsvesesvssesestssesestevesesessesese 21

1.412 Nguyên tắc của quá trình sắc ky) trong COb .cccccccccceccccscesescecesesesvesees 22 1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng địng, - 5S E22 2e 23

1.4.1.4 Cac dai lượng đặc trưng của sắc ̇ý đồ 55222 1E222E2522222224 24

1.4.1.4 1 Thời gian lưu: Nelention tim (ÍR) - - 555 5:5 S252 3S Ssx‡szxxs2 24

1.4.L43 Độ chọn ÏỌC Œ TS 1121221 1111152111111 152 1111181 xe 25

1.4.144 Số đĩa lý thuyết N 1522 1112122121222 rerye 25

1.4.1.4 5 Độ phân giải R (Đe€SỌUHÏOR)) À5 22 512281151 E3251E155311551 11551 x+5 26

1.4146 Hệ số khơng đối xứng T - 5 ST E2 E12 2 reo 26 I1 0/020 27

JIĐN/, 1T .4 4 n6 6 he cee ee teseetetsteseseeesaes 27

1.42 Hệ thống HPLC - +22 SE+E2E‡EE E323 E2 E221 1 1E rrrke 28

1.4.2.1 Bình đụng đủ! THƠÌ 5 St S1 E221 321 Ẻ SE HH khen 28

IV, (1.010 hx;-ằaÝỶŸ-ŸÝẢỶẢẢẢ 28

1.4.2.3 Bơm (THHHP) c5 213121 1132111551 11111151 1111111111 1111111111 kg 28 1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (iHj€€fiOR) 5 22 111111 SEE ket trxey 28

1.4.2.5 Cột sắc Đý S5 52 2122121212212 rye 29 1.4.2.6 Dầu dị (IDel€€ÍO) 1S SE t2 215111111111 1512111211111112121111111 x0 29

1.4.2.7 Bộ phận ghi tín hiỆ1H - - St E220 1321 1151 111511115115111111 111 kcg 30

1.4.2.9 Chọn điều kiện sắc k - 5 S5 5 S212111121211112121222122 se 30

1.4291 Lựa chọn pha fĩHÌH - 2c 2t E 323113513121 111511111 51111111151 111kg 31 1.4292 Lựa chọn pha đỘng S0 221321 1132 1S SH hen 32

1.43 Tiến hành đo sắc kỊ -.-© +52 2 SE S SE tre rrerrey 33

1.4.3.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy HÓC 1S SE SE 128122121822 rrrre 33

1.4.3.2 Chuẩn bị dung môi pha động

1.5.1.1 Lấy mẫu thử: - SE E11 221222212 nu rya 36 1.5.1.2 Tiến hành đo sắc Ìÿ 1S SE E1E1E12212122 E1 rereo 36

1.5.1.3 Đo tín hiệu defe€ÍOF 36

1.5.2 Cac phwong phap định: ÏƯỢH ST ee enneecuseeeneneeensees 37 1.5.2.1 Phương pháp chuẩn ngoại (Externais Standard) - 5s 55c: 37 1.5.2.2 Phương pháp chuẩn nội (Internais Siandiard) - s-5s+s sec: 39 1.5.2.3 Phương pháp thêm chuẩH 1 E11 121111122121 re 4I 1.5.2.4 Kỹ thuât đường chuẩn thêm chuẩN TT S222 rrre 42 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM - 43 2.1 Trang thiết bị và hóa chất - + ++sers+xexeexerrerrersrsrrsrs 43 2.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 2-5-2 s2 52s 44

2.3 Nguyên tắc xử lý mẫu 44

2.4 Các sơ đồ xứ lý mẫu xác định vitamin C - - 5 c5 s5se+se+ 46

2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPL/C - 5° - 48 2.6 Cài đặt các thông số đO + 5£ 5e 2 SE ‡x‡EseESEkexeexerkerkersrsrrsrs 48

2.7 Quy trình đo trên máy HP C - «- < << + E< x + se sec 49 2.8 Phương pháp khảo sát đánh giá - « =< + sex sex se sec 49

2.81 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOO)

của phương pháp phâh fÍCÌ 5c cv vi rvvg 49

2.8.2 Khảo sát độ ÏẶT ÏẠI - ST SH ng ng kg 30

2.83 Xác định hiệu suất thu hỒÌi 5 SE SE SEE SE 50

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 5c ss©55se5s<2 51

3.1 Xac dinh khoang tuyến tính và đường chuẩn của Vitamin C 51

3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tÍCH - - -< << SH ch HH HH TH ch chư 54 3.2.1 Gidi han phat hién (LOÌ)) 5-5555 S5 svrseeerexk 34 3.2.2 Gidi han định lượng LOQ uc cect cece eee cece eneeecneeeeneeneees 54 3.3 Xác định hàm lượng vitamin C theo hai cách sau - ð5

331 Tính hàm lượng vitamin C từ dịch lọc mẫu cam sành, quýt theo

7u 87/7 RRRRRREESEREREREREREh 35 3.3.2 Tính hàm lượng vitamin C trong các mẫu thuốc, thực phẩm chức năng theo chuẩn thử song song 2-2 5s ©£S<£ se x£ xe +xcrxersrserses 56

3.4 Đánh giá phương phááp - - - << G4 1 Y9 v9 mg ve 59

3.4.1 Xác dinh d6 lap lai ctia phiwong phaip - 55s <<+<+ 59

3.4.2 Xác định hiệu suất thu hOi.c.c.ccccccccceccccesessesssesssssssssssssssssssevsessseees 62 3.5 Cac sắc đồ của phép đo HPL/C 5- <2 5 2ss£zs+seczczzscecz 64

$0 89.) , Ô

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

Hệ số biến thiên

DANH MUC CAC BANG

Bảng 1.1 Phân loại Vitamin hòa tan trong chất béo và vitamin hòa tan trong nước

Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin C có trong một số thực vật

Bảng 1.3 Hàm lượng vitamin C có trong một số động vật

Bảng 1.4 Lượng vitamin C cần theo độ tuổi

Bảng 3.1 Diện tích peak của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn Bảng 3.2 Giá trị LOD và LOQ

Bảng 3.3 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu

Bảng 3.4 So sánh kết quả phân tích hàm lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC và giá trị ghi trên bao bì

Bảng 3.5 So sánh kết quả phân tích hàm lượng vitamin C trong các mẫu Cam sành và Quýt phương pháp đường chuẩn và phương pháp chuẩn thử song song

Bảng 3.6 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các mẫu

Cam sành và mẫu Quýt

Bảng 3.7 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên

Bảng 3.8 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh không gian của cấu trúc vitamin C Hình 1.2 Cam sành

Hình 1.3 Quýt

Hình 1.4 Thuốc hapacol kids

Hình 1.5 Thuốc ampha be comlex

Hình 1.6 Thực phẩm chức năng rutin c

Hình 1.7 Thực phẩm chức năng nam dược giải rượu Hình 1.8 Nước giải khát chanh muối

Hình 1.9 Đồ thị phương pháp chuẩn ngoại

Hình 1.10 Phương pháp đường chuẩn sử dụng nội chuẩn

Hình 1.11 Đồ thị kỹ thuât thêm đường chuẩn

Hình 3.1 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 3.06

Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 6.12

Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 12.25

Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 30.62

Hình 3.5 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 61.24

Hình 3.6 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C có nồng độ 122.49 Hình 3.7 Đường chuẩn định lượng vitamin C

Hình 3.8 Sac dé mau Chuan 1

Hinh 3.9 Sic dé mau Chuan 2

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu Trắng

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu Cam sành

Sắc đồ mẫu Hapacol kids (T1)

Sắc đồ mẫu Hapacol kids (T2)

Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (T1)

Sắc đồ mẫu TPCN Rutin-C (T2)

Sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (T1)

Sắc đồ mẫu TPCN Nam dược giải rượu (T2)

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.1

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 1.2

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.1

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 2.2

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.1

Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu 3.2

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỎ

Sơ đồ xử lý chất chuẩn

Sơ đồ xử lý mẫu Cam sành và Quýt

Sơ đồ xứ lý Thuốc và Thực phẩm chức năng

LOI CAM ON

Đề hoàn thành luân văn này, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Cô giáo TS Đinh Thị Trường Giang người đã trực tiếp hướng dẫn và

tạo mọi điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn

- Chị ThS Bùi Thị Hòa và Th§ Dương Thị Hằng với các anh chị kỹ

thuật viên của viện thực phẩm chức năng trung tâm kiểm nghiệm và hợp chuẩn,

đã tận tình hưỡng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện tốt luận văn

- Thầy giáo PGS.TS: Nguyễn Khắc Nghĩa và Thấy giáo TS Nguyễn

Trung Dũng đã dành nhiều thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn

- Thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn cao học và Ban chủ nhiệm

Khoa Hóa học trường Đại Học Vĩnh đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi

nhất cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Và xin cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi hoàn thành luận này

Vinh, thang 10 nam 2013 Người thực hiện

Thái Đại Quân

MO DAU

Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lượng lớn và các tính chất

vật lý, hoá học rất khác nhau Tác dụng của chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khác nhau nhưng đều cần thiết cho sự sống của sinh vật, nhất là đối

với người và động vật So với nhu cầu về các chất dinh dưỡng cơ bản như protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp

Vitamin được cung cấp vào cơ thê con người để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng giúp cơ thể khỏe mạnh Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin gây nên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B]), bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gây khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi Theo thống kê, chỉ riêng ở Mỹ, có tới 7/10 người phải “cầu cứu” tới vitamin, còn 3 người thì sử dụng chúng một cách có định hướng và thường xuyên Từ những năm 70, chính phú Mỹ đã cho phép

sử dụng các phụ gia thực phâm có chứa vitamin liều cao Kết quả là, hàng năm ở Mỹ, người ta tiêu tốn khoảng 4 tỉ đô la cho các loại vitamin Nhiều người còn cho rằng vitamin là thần được chữa ung thư và kéo đài tuổi thọ Hiện nay, khoa học đang tiến hành những nghiên cứu thực nghiệm trên quy mô rộng lớn về vitamin Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ cũng đưa ra một lời khuyên là, đa dạng hóa ăn uống là biện pháp tốt nhất đề đáp ứng nhu cần vitamin của cơ thể Sử dụng bồ sung các loại vitamin và các chất khoáng cần phải có mức độ Liều lượng sử dụng nhiều hay ít là vấn để có

tính riêng biệt, tùy thuộc vào lối sống, khẩu phần ăn uống, tình trạng sức khỏe

của từng người và vô số những nhân tố khác

Vitamin € có vai trò rất quan trọng Thiếu vitamin C cơ thể sẽ bị bệnh hoại huyết, ảnh hưởng tiêu cực đến sự tự vệ của cơ thể với các bệnh nhiễm

trùng khác Cơ thê chúng ta hoàn toàn không tự tông hợp được vitamin C mà phải lấy từ những nguồn thức ăn ngoài vào Vì vậy việc phân tích vitamin C trong thực phẩm là điều rất cần thiết

Tuy nhiên đây là hợp chất hữu cơ thuộc đối tượng khó phân tích, hơn nữa trong mẫu phân tích tổn tại nhiều chất hữu cơ và vô cơ ở các dạng khác

nhau, gây cản trở cho quá trình định lượng Do đó để cần phải lựa chọn phương pháp phân tích hữu hiệu nhất

Có thê phân tích vitamin C bằng các phương pháp: sắc ký giấy, cực

phố, trắc quang, hóa học, sắc kí

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã lựa chon đề tài:

“Nghiên cứu xác định vitamin C trong thuốc, thực phẩm chức năng, hoa quả và nước giải khát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Trong luận văn này, chúng tôi triển khai các nhiệm vụ sau:

- Tổng quan về vitamin C và phương pháp xác định vitamin C

- Xây dựng đường chuân của vitamin C

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích

Khảo sát độ lặp

Xác định hiệu suất thu hồi

Định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC

Phân tích, xử lý số liệu

Kết quả thực nghiệm

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu các loại quả, thuốc và sản phẩm chức năng được thu thập từ các cửa hàng bán hoa quả, nước giải khát và các đại lý bán thuốc trong thành phố Vinh

tỉnh Nghệ An Mỗi mẫu được lấy Ikg đựng vào túi nilông sạch Bao gồm:

Quả: Cam sành, Quýt

Thuốc: Hapacol kids, Ampha BC complex

Thực phẩm chức năng: Rutuin C, Nam dược giải rượu

Nước giải khát: Nước khoáng chanh muối

Phương pháp nghiên cứu

Các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành bằng thực nghiệm Phương pháp thực nghiệm được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) viết tắt (HPLC)

CHƯƠNG 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Giới thiệu về vitamin

1.11 Khái niệm

Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn có phân tử tương đối lớn Bản chất hóa học, lý học của các vitamin rất khác nhau Nhóm chất hữu cơ này có một đặc điểm chung là đặc biệt cần thiết cho mọi hoạt động sinh sống bình

thường của các cơ thể sinh vật dị dưỡng

Vitamin là những chất mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp được, Phần lớn phải đưa từ ngoài vào bằng con đường ăn uống Mặc dù lượng

vitamin có thể sử dụng ít nhưng khi thiếu một loại vitamin nào đó sẽ dẫn đến

những rối loạn về hoạt động sinh lý bình thường của cơ thé Vitamin còn cần

thiết cho cơ thể tự dưỡng như thực vật (là những đối tượng có khả năng tự

tổng hợp nên hầu hết các vitamin) Còn một số bộ phận cây xanh không có khả năng tống hợp vitamin, vì thế cần cung cấp thêm cho chúng dé dam cho

sự sinh trưởng và phát triển

1.1.2 Đặc điển chung và phân loại

1.1.2.1 Đặc điểm chưng

- Mặc dù có cấu trúc, vai trò và cách thức hoạt động khác nhau nhưng tất

cả các vitamin đều có những đặc tính cơ bản:

- Vitamin không trực tiếp sinh năng lượng như protein, lipit hay gluxit

Mà chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và sử dụng năng lượng

- Không thể thay thế lẫn nhau: thiếu một loại vitamin này không thể thay

thế được bằng một loại khác

- Vitamin ảnh hưởng tới hoạt động và quá trình phát triển của tô chức là chất xúc tác, bằng cách hoạt hoá quá trình oxi hoá thức ăn và chuyên hoá Tham gia vào thành phân cấu tạo coenzym quyết định hoạt tính đặc thù của chúng

- Khi trong thức ăn thiếu vitamin hoặc cơ thể hấp thụ kém, sẽ dẫn đến các rối loạn trao đổi chất đặc trưng và rối loạn chức năng, cơ thể sẽ xuất hiện các rối loạn bệnh lý (bệnh thiếu vitamin và bệnh thừa vitamin)

- Thuc vat va vi sinh vat co kha nang tong hop hầu hết các loại vitamin

và tiền vitamin (provitamin)

- Người và động vật không có khả năng tổng hợp mà chỉ sử dụng được

vifamin lấy từ thức ăn Một số loại vitamin (Bạ, By, acid pantotenic, acid folid ) dugc hé vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid

nicotinc được tổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này không đủ cung cấp cho nhu cầu của cơ thé

- Vitamin A va caroten - Vitamin B, (Titamin)

- Vitamin D (Canxiferol) - Vitamin B, (Riboflavin)

- Vitamin E (Tocoferol) - Vitamin Bg (Piridoxin)

- Vitamin K (Koagulation) - Vitamin B; (Acid pantoneic)

- Vitamin B;;3 ( Acid orotic)

- Vitamin P P (Acid nicotinic)

- Vitamin P ( Bioflavonoit)

- Vitamin C (Acid ascorbic)

1.2.1 Lwoc sw

Bệnh Scurvy đã ảnh hưởng đến rất nhiều bệnh nhân Ai Cập, La Mã và Thành Rome cổ đại Bệnh này gắn liền với lịch sử thế giới vì tỷ lệ cung cấp vitamin C không đầy đủ trong những chiến dịch quân sự và trong các cuộc hành trình trên biên dài ngày Đã có những giai đoạn lịch sử mà bệnh scurvy

lan tràn rộng khắp như một bệnh dịch Từ năm 1556 đến 1857 đã có 114 dịch

scurvy được báo cáo suốt trong các tháng mùa đông, lúc mà không thể cung cấp đầy đủ nguồn rau xanh Các chiến binh trên các cuộc hải trình đài ngày còn bị ảnh hưởng nặng né hơn

Một số nhà thám hiểm, như J' acques Cartier năm 1856, đã nhận thấy rằng

ăn một số loại thức ăn nào đó có thể làm giảm được tình trạng bệnh Ông đã

cùng thủy thủ đoàn ăn loại cây lá kim vân sam một số thủy thủ đoàn khác ăn

cam, chanh, chanh lá cam Năm 1742, lame Lind, một bác sĩ người Anh, đã

viết một bài thảo luận chính thức đầu tiên về khả năng gây bệnh scurvy do

thiếu hụt đinh dưỡng Theo kinh nghiệm của Lind, ông cho biết các bệnh nhân scurvy có thể phục hồi sau khi cho dùng nước cam Mặc dù có một sé

nhà thám hiểm đã ủng hộ những khám phá của Lind — như thủy thủ đoàn của thuyền trưởng lame Cook đã hoàn toàn tránh được scurvy trong 3 cuộc hành

trình dài ngày trên biên từ 1768 đến 1779 Thủy quân Anh quốc vẫn chưa chấp

nhận việc sử dụng nước cam chanh cho các thủy thủ mãi đến năm 1804 tức

62 năm sau những khám phá của Lind Xu hướng ngày nay người ta chấp

nhận chế độ dinh dưỡng toàn diện nhờ nhiều khám phá mới về vai trò quan

trọng của vitamin và khoáng chất, trong đó có vitamin C

Vitamin C được định nghĩa là “yếu tố chống scorbus” được Albert Szent- Gyorgyi phân lập năm 1928 Gần 70 năm sau các nhà nghiên cứu đã khám phá

ra nhiều lợi ích của vitamin C trên sức khỏe Ngày nay mặc dù bệnh scurvy hiểm gặp trong xã hội chúng ta, thiếu hụt vitamin C ở mức độ cận lâm sàng và mức độ giới hạn dưới cũng khá phô biến, đặc biệt là ở người già

- Tén theo IUPAC: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4- lactone-2,3-enediol hay

(R)-3,4-dihydroxy-5-((S)- 1,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-one

- Tên thông thường: acid ascorbic, vitamin C

- Tên gọi khác : L-ascorbate

- Công thức phân tu: CsHgO¢

- Khối lượng phân tử:176.13 g/mol

- Acid ascorbic (dang khử)

- Acid dehydroascorbic (dang oxy hoa)

- Dang lién két ascorbigen

+ Nó chỉ tồn tại ở đạng L trong các sản phẩm thiên nhiên

+ 14 đồng phân và đồng đẳng của vitamin C có khả năng chống bệnh

hoại huyết

+ 15 chất đồng phân không có hoạt tính

1.24 Cấu tạo của vitamin C

Công thức cấu tạo

Cấu trúc không gian của Vitamin C

Hình 1.1 Hình ảnh không gian của cấu trúc vitamin C

1.25 Ngun gốc

1.2.5.1 Nguôn gốc từ thực vật

Vitamin C hay còn được gọi là acid Ascorbic có rất nhiều trong các loại thực vật (tìm thấy nhiều nhất trong trái cây), là l vitamin hoà tan được trong

nước Vitamin C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt

động sống quan trọng của cơ thé Vitamin C được tông hợp dé dàng ở thực vật Tuy thực vật là nguồn vitamin C dồi đào thông thường lượng vitamin

C trong thức ăn có nguồn gốc thực vật phụ thuộc vào loại cây, điều kiện cuả

đất, khí hậu nơi mà thực vật đó phát triển thời gian dài hay ngắn từ lúc thực

vật đó được hái lên khỏi mặt đất, điều kiện dự trữ, và phương pháp chế biến

Bảng sau đây đưa ra giá trị xấp xi (gần đúng) sự phong phú về lượng của vitamin C trong các nguồn thực vật sống khác nhau

Bảng 1.2 Hàm lương vitamin C có trong một số thực vật

Tao ta 500 Qua viét quat 10

Cam 50 Rau diép 4

1.2.5.2 Nguén góc từ động vật

Đa số động vật, trừ chuột bạch, khỉ và người đều có khả năng tông hợp

được vitamin C Sở dĩ người không có khả năng đó có lẽ vì thiếu các enzim đặc hiệu xúc tác cho sự chuyên hóa glucoza thành vitamin C Vì thế phải bố sung bằng con đường ăn uống

Loài đê, giống như hầu hết các loài động vật khác, tự tổng hợp vitamin

C cho cơ thể của chúng Một con đê trưởng thành sẽ sản xuất được hơn

13,000 mg vitamin C mỗi ngày trong điều kiện sức khoẻ bình thường và mức

độ này tăng lên cao hơn khi đối diện với tình trạng stress

Vitamin C hiện diện nhiều nhất trong gan, và ít nhất là ở cơ Vitamin C

có mặt trong sữa mẹ và hàm lượng ít hơn trong sữa bò tươi Với sữa tiệt trùng chỉ chứa I lượng rất ít vitamin C Tất cả vitamin C thừa sẽ được bài tiết qua nước tiểu

Bảng 1.3 Hàm lương vitamin C có trong một số động vật

1.2 6 Vai trò của vitamin C trong cơ thể sống

- Tao collagnen

Collagen là thành phần protein chính của mô liên kết xương, răng, sụn,

da và mô sẹo Collagen chiếm đến protein trong cơ thể Vitamin C cần cho quá trình tạo collagen từ trocollagen Nếu thiếu Vitamin C sẽ giảm khả năng tổng hợp collagen Lúc đó, sẹo sẽ khó lành, vỡ mao mạch, khiếm khuyết trong quá trình hình thành xương và răng

- Phòng chống bệnh tim mạch

Vitamin C còn giúp thành mạch máu vững chắc, đặc biệt quan trọng đối

với mạch máu nuôi tim Giúp chuyền cholesterol thành acid mật, bằng cách giảm tình trạng cholesterol trong máu Loại vitamin này còn giúp hạn chế tăng huyết áp, chống tạo cục máu đông đề giảm thuyên tắc mạch

- Tăng cường hệ miễn dịch

Hỗ trợ sản xuất interferon là loại protein do tế bào cơ thể tạo ra để chống lại tác nhân gây bệnh, là thành phần đạm quan trọng của hệ miễn dịch Cần thiết cho các tế bào miễn dịch đó là tế bào T và bạch cầu Từ đó làm mạnh

chức năng của hệ miễn dịch, làm tăng phản ứng dị ứng

- Tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh

1.27 Nhu cầu về Vitamin C

Nhu cầu về vitamin C đối với người trưởng thành là khoảng 60 mg/ngày, đặc biệt đối với người hút thuốc cần cung cấp thêm 35 mg/ngày vì lượng vitamin C trong cơ thê họ không đủ để giúp họ giảm những độc tố do khói thuốc gây ra

Bảng sau liệt kê nhu cầu vitamin C khác nhau tuỳ theo độ tuổi:

Bảng 1.4 Lượng vitamin C cần theo độ tuổi

Luong vitamin C cần thiết theo độ tuổi

Đối tượng Độ tudi Nam (mg/ngay) | Nir (mg/ngay)

Trẻ em 1-3 tuôi 15 15

Tré em 4-8 tudi 25 25

Tré em 9-13 tudi 45 45

Tré thanh nién 14-18 tudi 75 65

Ngưởi trưởng thành | 19 tudi tré lên 90 75

Người hút thuốc 19 tuổi trở lên 125 110

Thai phụ Dưới 18 tuôi - 80

Thai phu 19- tuổi trở lên - 85

Phụ nữ cho con bi | Dưới 18 tuổi - 115

Phụ nữ cho con bú | 19 tuổi trở lên - 120

Vitamin C có vai trò rất quan trọng đối với con người, đặc biệt là đối với thai phụ và phụ nữ cho cho con bú, tuy nhiên việc lạm dụng hay thiếu hụt vitamin C đều gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của con người

1.2.7.1 Thiéu vitamin C

Triệu chứng khiếm khuyết sinh tố C tiến hành tuần tự qua 3 giai đoạn, nhanh hay chậm tùy theo mức độ thiếu hụt, trước khi bị bệnh Scorbut do thiếu sinh tố C thực sự hội đủ điều kiện thành hình:

Giai đoạn 1: mệt mỏi, căng thắng thần kinh, buồn ngủ, đau nhức cơ khớp

Giai đoạn 2: chảy máu nướu răng, dưới da, da niêm

Giai đoạn 3: biến dạng xương khớp, vết thương không lành, hư răng, bội nhiém

Phụ nữ mang thai hoặc cho con bú có thể bị thiếu vitamin C nếu không

được ăn uống đầy đủ vì nhu cầu vitamin C của họ tăng cao trong giai đoạn này Người nghiện thuốc lá cũng dễ bị thiếu vitamin C do chất nicotine có trong thuốc lá phá hủy lượng vitamin C có trong cơ thê

Trẻ em trong giai đoạn phát triển nhanh từ 6 - 24 tháng tuổi cũng dễ bị

thiếu vitamin C với các biểu hiện thường thấy như trên kèm theo mệt mỏi,

biếng ăn, giảm sức đề kháng, thiếu máu tiến triển

Khi thiếu vitamin C, da sẽ bị khô, dé bị xuất huyết đưới da (da dé bi bam

tím khi va chạm nhẹ), chảy máu cam, chảy máu lợi, vết thương chậm lành

(bệnh Scorbut )

Cách khắc phục tình trạng thiếu vitamin C: ăn các thực phẩm có chứa vitamin C hoặc uống thuốc với sự chỉ dẫn của bác sĩ sẽ khiến tình trạng sức khỏe được cải thiện rõ rệt

1.2.7.2 Thừa vitamin C

Dùng quá 500 mg vitamin C mỗi ngày không tốt cho sức khỏe Nếu dùng

trên 1000 mg/ngày, bạn sẽ bị rối loạn tiêu hóa, gây tiêu chảy, rát dạ dày, có

hiện tượng thừa sắt, giảm độ bền hồng cầu, giảm khả năng diệt khuẩn của

bạch cầu, viêm bàng quang, viêm đường tiết niệu do axit ascorbic

Nếu dùng trên 2000 mg/ngày, vitamin C sẽ gây mất ngủ, tạo sỏi oxalat,

ức chế bài tiết ¡nsulin, tăng huyết áp, tốn thương thận do tăng tổng hợp corticoid va catecholamin

Thừa vitamin C còn gây hấp thu thừa sắt giảm hấp thu đồng, niken, làm cho xương chậm phát triển, dễ biến dạng Thai phụ dùng thừa có thể gây dị

tật bẩm sinh ở trẻ

Nhiều loại vitamin C viên sủi ngoài hàm lượng 1.000 mg vitamin C, còn

có 243 mg muối ăn được hình thành sau phản ứng súi bọt Không nên dùng

nó cho người suy thận, người kiêng ăn muối (tăng huyết áp)

Một số loại viên sủi C còn chứa thêm thành phần muối khoáng canxi

500 mg, không được dùng cho người bị bệnh sói thận

Những thai phụ dùng liều cao vitamin C trong suốt thai kỳ sẽ làm tăng các men chuyên hóa ở thai nhi do hiện tượng dội ngược và gây ra bệnh lý

thiếu vitamin C ở trẻ Đặc biệt việc uống hoặc tiêm vitamin C có thé gay ra di ứng hoặc sốc thuốc ở một số người có cơ địa mẫn cảm với vifamin C hoặc

gây ra các tai biến do tiêm thuốc như nhiễm trùng

Mặt khác, việc dùng thuốc vitamin C thường xuyên có thể làm cơ thể

quen, khi không dùng sẽ cảm thấy mệt mỏi ngoài ra nếu dùng vitamin C với một lượng lớn dài ngày (quá Ig/ngày) sẽ dẫn đến viêm loét dạ dày, tiêu chảy,

sỏi thận

Gan đây một số nghiên cứu cho thấy việc dùng thừa vitamin C sé lam

“mất đi sự cân bằng vốn có của cơ thể” làm “tăng sự tích tụ” những phân tử

kép có hại, sự tích tụ này có một vai trò nhất định trong các căn bệnh như ung

thư, thấp khớp, xơ vữa động mạch Còn cần phải thu thập thêm chứng cứ nhưng đây là điều cảnh báo đáng quan tâm

Do đó, không nên coi vitamin C là một thuốc bố dùng không giới hạn,

đặc biệt là với trẻ em và phụ nữ mang thai Những trường hợp cần thiết dùng liều cao phải do thầy thuốc chỉ định và chỉ dùng trong thời gian ngắn Vitamin

€ (axit ascorbic) cũng như các loại thuốc khác vừa có tác dụng chữa bệnh vừa

có những tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe

1.3 Giới thiệu các đối tượng nghiên cứu

Các thành phần dinh dưỡng trong quýt chống lại sự phá vỡ acid uric trong máu Các loại acid hữu cơ và vitamin trong quýt điều hòa chức năng

trao đổi chất trong cơ thể đặc biệt là người già mắc bệnh tim

Vỏ quýt chứa vitamin D có thể duy trì tính dẻo của huyết quản mao mạch, phòng chống mạch máu vỡ và thấm máu Nó kết hợp với vitamin C có thé tang

hiệu quả trị liệu ðối với ngÝời mắc bệnh máu xấu Cho nên ngýời xõ cứng mạch

máu và thiếu vitamin C nên thýờng xuyên uống nÝớc vỏ quýt ngâm

Quýt chứa thành phần chống oxy hóa, có thể tăng cao khả năng miễn dich, chống sự phát triển của u bướu Ngoài ra, quýt còn có tác dụng chống lại tia bức xạ của máy tính, trong quýt chứa nhiều vitamin A và beta carotin, có thể bảo vệ da cho những người thường sử dụng máy tính

1.3.3 Thuốc HAPACOL KIDS

Tá dược vừa đủ 1l gói

(Manitol, acid citric khan, natri hydrocarbonat, đường trắng, đường

aspartam, kollidon 30, màu đỏ amaranth, bột hương cam)

DẠNG BÀO CHÉ: Thuốc bột sủi bọt

QUI CÁCH ĐÓNG GÓI: Hộp 24 gói x 1,5 g

TÍNH CHÁT: Paracetamol là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu Thuốc

tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đôi gây hạ nhiệt, tăng toả nhiệt

do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên làm giảm thân nhiệt ở người

bị sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt bình thường và giảm đau bằng

cách nâng ngưỡng chịu đau lên

Trong cơ thể, Vitamin C tham gia vào các quá trình tổng hợp, chuyên hoá các chất cần thiết cho quá trình phát triển của cơ thể và giữ vai trò quan trọng trong tăng cường chức năng miễn dịch, tăng khả năng đề kháng với nhiễm khuẩn của cơ thể

Hapacol Kids chứa 150 mg Paracetamol và 75 mg Vitamin C, được bào

chế dưới dạng bột sủi bọt, hòa tan trong nước trước khi uống, thích hợp dùng

hạ sốt - giảm đau - tăng cường miễn dịch cho trẻ em trên I tuổi Thuốc được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua hệ tiêu hóa

CHỈ ĐỊNH: Hạ sốt, giảm đau, tăng cường sức đề kháng cho trẻ trong các trường hợp: cảm, cúm, đau đầu, đau cơ - xương, bong gân, đau khớp,

nhiễm khuẩn, nhiễm siêu vi, sau khi tiêm chủng, sau phẫu thuật cắt amiđan, nhé răng, mọc răng, nhức răng,

LIEU DUNG VÀ CÁCH DUNG: Hoa tan thuốc vào lượng nước (thích

hợp cho bé) đến khi sui hết bọt Cách mỗi 6 giờ uống một lần, không quá 5 lần/ ngày Liều uống tương ứng với thành phần Paracetamol, trung bình từ 10

1.3.4, Thuéc AMPHA BC COMLEX

24 thang ké tt ngay san xuất

Không dùng thuốc đã qua hạn

BẢO QUẢN:

Đề thuốc ở nhiệt độ phòng (<30°C)

Tránh ánh sáng trực tiếp và nơi ẩm ướt

- Vitamin C có liên quan đến sư hình thành collagen và thay thế mô

- Rutin có tác dụng làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làm giãn cơ trơn, chống co thắt

Chỉ định:

Giúp tăng sức bền của thành mạch máu, phục hôi tính đàn hồi của mao mạch Hạ huyết áp, hạ cholesterol trong máu phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch Hỗ trợ trong điều trị huyết áp cao, chảy máu cam xuất huyết

Người đang bị xuất huyết hoặc có nguy cơ xuất huyết, người huyết áp cao Người dễ bị chảy máu đo tính bền của thành mạch kém như Chảy máu

cam, trĩ ra máu, xuất huyết dưới da

về Vitamin C và dẫn đến bệnh Scorbut ở trẻ sơ sinh

Bao Quan: Nơi khô, tránh ánh sáng, dưới 30°C

Liều dùng:

Uống 2 viên/ lần x 2 lần/ ngày

1.3.6 Thực phẩm chức năng: Nam dược giải rượu

Hình 1.7 Thực phẩm chức năng Nam dược giải rượu

Thành phần: Mỗi viên nang chứa:

Tác dụng:

Say rượu là nguyên nhân gây ra các bệnh cơ thê và tâm thần trầm trọng

và lâu đài khác (xơ gan, nhồi máu cơ tim, mất trí nhớ, .) Sau khi hấp thu vào

cơ thê, rượu đi vào từng tế bào và chuyên hoá thành Acetaldehyd

Acetaldehyd là một chất rất độc gây nên hầu hết các loại bệnh có nguyên nhân từ rượu và cũng là một chất gây nghiện rượu

Nam dược giải rượu là một thực phẩm chức năng có tác dụng:

- Tăng cường chuyển hoá rượu bằng cách làm chậm quá trình chuyên hoá thành Acetaldehyd

- Thúc đầy quá trình chuyển hoá Acetaldehyd thành acid acetic, rồi tao

thành COz và H;O không độc hại đối với co thé

- Do đó, sản phẩm có tác dụng ngăn chặn những tác hại do rượu gây ra đối với các cơ quan trong cơ thể con người, giảm bớt tỷ lệ nghiện do rượu Công dụng:

- Làm giảm triệu chứng “say”: Nhức đầu, khó chịu trong người, đầy

bụng, buồn nôn

- Ngăn chặn những tác hại do rượu gây nên cho cơ thê

Cách sử dụng: Uống 2-3 viên trước khi uống rượu 30 phút - 1 tiếng Bảo quản: Trong bao gói kín, ở nhiệt độ dưới 30°C

Hạn dùng: 36 tháng kê từ ngày sản xuất

Quy cách đóng gói: Vỉ 6 viên x 0,5g Hộp nhỏ l vỉ (3g) Hộp lớn 5 hộp

nhỏ (158)

1.37 Nước giải khát (Faith) nước khoáng chanh muối

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiéu nang cao HPLC

1.4.1 Gidi thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.L1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiền từ phương pháp sắc ký cột cổ điện Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiêm

nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là

công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính

và định lượng

Ưu điểm của HPLC:

Điều kiện phân tích khá dễ dàng

Dễ dàng thu hỏi chất phân tích với độ tinh khiết cao

Độ lặp lại cao

Thường không phân hủy mẫu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một

chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ phân bó, trao đối ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng M⁄4y sắc ký lóng hiệu năng cao (HPLC) HITACHI L-5000 detector DAD

1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đồi ion thì ta có Sắc ký trao đồi

ion Nếu pha tĩnh là chất long thi ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu

pha tinh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay Ray phan tir Cùng với pha tĩnh đề rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy, nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C Vào cột

phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua

cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tống hợp các tương tác F1, F2 và E3

Chất phân tích A + B + C

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi

cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó FI

và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1

là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ đi chuyên trong cột với tốc độ khác

nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

1.413 Phân loại sắc ký và ứng dụng

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo

chất tan ra khỏi cột

Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học

của chất hấp phụ của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

-_ Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC)

- Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết (LLC)

- Sắc ký trao đôi ion (IE-HPLC)

- Sắc ky ray phân tử - sắc ky gel (IG-HPLC).

Nhưng thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ)

của pha động đề kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào

tính chất động học của chất hấp phụ Trong loại này có 02 kiêu hấp phụ:

Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động

không phân cực

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn

hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,

phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.4.1.4 Cac dai lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết

được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng

thường dùng trong thực tế và cách thay đối các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký

1.4.1.4 1 Thời gian luu: Retention time (tr)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột

cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt gia tri cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau có thời

gian lưu khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy, thời gian

lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt quá lớn thì peak bị dán và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất

dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ

chính xác của phép phân tích kém Đề thay đôi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên

14142 Hệ số dung lượng KÌ

- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Thường được tính theo công thức sau:

- Hệ số dung lượng k phu thudc vao ban chất của chất phân tích, đặc

tính của pha tĩnh và pha động

f, t

Nếu KỶ nhỏ thì ty cũng nhỏ và sự tách kém K' lớn thì pic bị loãng, độ

nhạy kém Trong thực tế kÌ từ 1 đến 5 là tối ưu

14143 Độ chọn lọc œ

Độ chọn lọc z cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí Khi hai chat

A, B có K) và Kh khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị

pha tĩnh có chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một

khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập

giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động Vì vậy với

một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất

phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:

N= (§] -ssj fe =16 2.)

Trong đó: tạ là thời gian lưu của chất phân tích

'Was là độ rộng tại điểm 1⁄4 của peak

1.4145 Độ phân giải R (Resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau

trên một điều kiện sắc ký đã cho

Trong thực tế nếu các Peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu dé 2 Peak tách là R =1 Trong phép định lượng R=1,Š5 là phù hợp

Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn việc tính toán diện tích Peak sẽ

không chính xác

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ

nhạy sẽ kém Đề khắc phục ta có thể thay đối hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đối sẽ kéo theo sự thay đối đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích của các Peak

ta phân tích

Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp đáp ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích

14146 Hệ số không đối xứng T

- Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ

thu được T được tính bằng tỷ số độ rộng của hai nửa pic tại điểm 1/10 hoặc

1/20 chiều cao của pic

quan tâm ðến hệ số không ðối xứng T, khi T < 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu T > 2.5 thì điểm cuối của pic rất khó xác định Vì vậy cần thay đổi các điều kiện sắc kí để làm cho pic cân đối xứng hơn theo cách sau:

+ Làm giảm thể tích chiết, tức là đoạn nối từ cột đến Detecter

+ Thay đôi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên + Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích

hoặc giảm thê tích

142 Hệ thống HPLC

Gồm các bộ phận cơ bản sau: Degasse, Pump, Tiêm mẫu, Column,

Detector

Trong đó: có bình chứa dung môi pha động, bộ phận khử khí, bơm cao

áp bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample) cột sắc ký (Pha tĩnh) (để

ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt), detector (nhận tín hiệu) hệ thống

máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý đữ liệu, điều khiển hệ thống

HPLC và in dữ liệu

1.4.2.1 Binh đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo

tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100%

Tuy nhiên, theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 2 và 3 đường đề cho hệ

pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn, để

quá trình rửa giải Ổn định hơn

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradien dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Lưu ý:

Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tỉnh khiết và

có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích Tất cả các hóa chất dùng đề pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dung

là hóa chất tinh khiết phân tích, nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích

1.4.2.2 B6 khử khí (Degasse)

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong

dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ xảy ra

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho

thời gian lưu của Peak thay đôi

Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được

thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.4.2.3 Bom (Pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký

Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at (lat =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar) Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412

Bar Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm

có 2 pistone đề thay phiên nhau đây dung môi liên tục

1.4.2.4 B6 phan tiém mdu (injection)

Dùng đề đưa mẫu vào cột phân tích Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động(Autosample)

1.42 5 Cột sắc ky

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng

được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha

dao RP C18 (ODS), cét pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu

năng cao

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột

khoảng 10 - 30cm, đường kinh trong 1-10mm

Thông thường chất nhỏi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất trao đối ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven

column)

1.426 Đầu dò (Detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu

ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của

các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải

thoả mãn điều kiện trong một vùng nông độ nhất định của chất phân tích