ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu các thay đổi ở gen người và dộng vật tại các vùng sinh thái bị ảnh hưởng trước tiếp của chất độc màu da cam

- ứng dụng Công nghệ phân tử bao gồm Công nghệ DNA và Công nghệ protein để nghiên cứu các thay đổi gene ở người: thay đổi cấu trúc đột biến và chức năng của một số gene chọn lọc ở phả hệ

ban chỉ đạo CT 33 bộ khoa học và công nghệ

báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước

ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu các thay đổi ở gen người và động vật tại các vùng sinh thái bị ảnh hưởng

trực tiếp của chất độc màu da cam

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nông Văn hải

Viện Công nghệ sinh học Viện KHCN Việt nam

5774-M

23/4/2006

Hà Nội – 2005

Phần 1: Xuất xứ, Mục tiêu và nội dung của đề tài

1.1.Xuất xứ của đề tài

Trong thời kỳ chiến tranh tại Việt Nam, từ năm 1961 đến năm 1972, Mỹ

đã sử dụng các chất độc hóa học, bao gồm chất da cam và nhiều chất khác, có chứa một tạp chất siêu độc là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD/ Dioxin) Một lượng khổng lồ, ước tính ban đầu là 170 - 500 kg, chất dioxin (tính trên tổng lượng các chất độc hóa học) đã được Mỹ rải vào Việt Nam Theo công

bố mới đây nhất của các nhà khoa học tại Trường Đại học Columbia, Mỹ, số lượng chất độc hóa học do Mỹ sử dụng tại chiến tranh Việt Nam thực ra còn cao hơn rất nhiều, trong đó lượng dioxin có thể cao hơn từ 2 đến 4 lần so với các

công bố trước đây (Stellman et al., 2003) và con số này có thể lên tới 1000 kg

(Trần Xuân Thu, 2003)

Ô nhiễm dioxin do chiến tranh hóa học của Mỹ để lại đã và đang gây ra hậu quả hết sức nặng nề lên môi trường sinh thái và đặc biệt là đối với sức khoẻ con người Việt Nam Rất nhiều năm sau chiến tranh, các nghiên cứu cho thấy nồng độ dioxin trong cơ thể người dân sống tại những vùng sinh thái bị nhiễm

chất độc hóa học nặng, như sân bay Biên Hoà, vẫn còn rất cao (Schecter et al., 2001), cá biệt có người với nồng độ dioxin lên tới 413 pg/g mỡ (Schecter et al., 2002; Paepke et al., 2003) Đến nay, ở Việt Nam đã có các nạn nhân chất da

cam/ dioxin thế hệ thứ 2 (F1), thứ 3 (F2) (Hoàng Đình Cầu, 2002) Vấn đề cực

kỳ nghiêm trọng là các thế hệ người Việt Nam tiếp theo có thể sẽ còn phải gánh chịu những hậu quả khôn lường về sự hủy hoại sức khoẻ, bệnh di truyền, ung thư, các dị tật bẩm sinh và nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác

Từ năm 1980, Nhà nước đã thành lập một ủy ban chuyên trách về điều tra

ảnh hưởng của chiến tranh hóa học do Mỹ tiến hành tại Việt Nam (ủy ban

10/80) Hơn 20 năm qua, các hoạt động điều tra, nghiên cứu của ủy ban 10/80

cũng như của các cơ quan thuộc Bộ Y tế (Trường Đại học Y Hà Nội, các Bệnh viện…), Bộ Quốc phòng (Học viện Quân y, Trung tâm Nhiệt đới Việt- Nga…)

và các bộ, ngành khác về ảnh hưởng của chất da cam/ dioxin lên sức khỏe người

Việt Nam đã thu được rất nhiều kết quả quan trọng (Hoàng Đình Cầu et al , 2000; Phan Thị Phi Phi et al., 2000) Đặc biệt, các nghiên cứu về dịch tễ học,

bệnh lý lâm sàng… giai đoạn 1980 - 2000 là những tư liệu hết sức quý giá về

ảnh hưởng của dioxin lên sức khỏe con người Tuy nhiên, với điều kiện kinh tế nước ta trong thập kỷ 80 và 90 còn gặp nhiều khó khăn, kinh phí cho nghiên cứu rất hạn hẹp, đồng thời trình độ nghiên cứu khoa học trên thế giới vào giai đoạn này cũng chưa phát triển, nên không thể tiến hành sâu hơn các nghiên cứu ảnh hưởng của dioxin ở mức độ phân tử

Trong tình hình mới, ngày 1 tháng 3 năm 1999 Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số 33/1999/QĐ-TTg về việc thành lập Ban Chỉ đạo Quốc gia khắc phục hậu quả chất độc hóa học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam Dưới sự chỉ đạo của Ban Chỉ đạo 33, Chương trình 33 cấp Nhà nước đã và

đang được thực hiện Một trong những hướng quan trọng nhất của Chương trình

33 là nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của chất da cam/ dioxin lên sức khỏe con người và tìm ra các giải pháp khắc phục

Từ tháng 8 năm 2001, Viện Công nghệ Sinh học đã bắt đầu tham gia thực

hiện một đề mục (sau này gọi là đề tài nhánh) “Nghiên cứu phát hiện các thay

đổi gene ở nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của những

nạn nhân bị phơi nhiễm” thuộc đề tài “Nghiên cứu các biến đổi về mặt di

truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trên các đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao” do PGS TS Nguyễn Văn Tường (Trường Đại học

Y Hà Nội) làm Chủ nhiệm Vừa qua, đề tài này đã hoàn thành việc nghiệm thu cấp Nhà nước

Đồng thời, theo Quyết định số 1373/QĐ-BKHCNMT ngày 03 tháng 8 năm 2001 và Quyết định số 25633/QĐ - BKHCNMT ngày 14 tháng 11 năm

2001 của Bộ trưởng Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trường (nay là Bộ Khoa học và Công nghệ), Viện Công nghệ Sinh học đã chính thức được giao chủ trì đề

tài, với tên gọi “ứng dụng công nghệ phân tử để nghiên cứu các thay đổi gene

ở người và động vật tại các vùng sinh thái bị ảnh hưởng trực tiếp của chất độc màu da cam” (Thời gian thực hiện: 2001-2004; Chủ nhiệm: TS Nông Văn Hải)

1.2 Mục tiêu, nội dung và kết quả nghiên cứu

Đề tài đ∙ đăng ký mục tiêu, nội dung và kết quả nghiên cứu như sau (xem Thuyết minh đề tài):

- Thiết lập Ngân hàng DNA của các đối tượng người bị nhiễm chất độc hóa học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh Việt Nam để phục vụ cho các nghiên cứu khoa học lâu dài

- ứng dụng Công nghệ phân tử (bao gồm Công nghệ DNA và Công nghệ protein) để nghiên cứu các thay đổi gene ở người: thay đổi cấu trúc (đột biến) và chức năng của một số gene chọn lọc ở phả hệ của các gia đình nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ con cháu của họ Đưa ra các kết luận khoa học có tính thuyết phục cao về ảnh hưởng dioxin ở mức độ phân tử đối với con người cũng như có những kiến nghị cần thiết về biện pháp khắc phục những hậu quả lâu dài

- Nghiên cứu khả năng thay đổi một số gene ở 2 loài động vật thủy sinh (cá trắm cỏ, cá trê ) phân bố tại vùng sinh thái chịu ảnh hưởng của chất độc hóa học do Mỹ sử dụng trong chiến tranh tại Việt Nam Trên cơ sở đó, có những kết luận có giá trị khoa học cao về nguồn ô nhiễm qua chuỗi thức ăn, đưa ra định hướng và đề xuất biện pháp khắc phục

1.3 Nội dung nghiên cứu

A Nghiên cứu các thay đổi gene trên đối tượng người:

Đối tượng nghiên cứu: Các phả hệ nạn nhân trong gia đình các cựu chiến binh (CCB) và người dân đã có bằng chứng bị ảnh hưởng trực tiếp của

dioxin, và các thành viên trong gia đình họ (bố mẹ, anh, chị em ruột, con, cháu) với các chỉ tiêu như sau:

1) Nạn nhân đã từng sống và làm việc ở vùng bị rải, hoặc điểm nóng từ

6 tháng trở lên (theo Lê Bách Quang, Học viện Quân y) đã được các cơ quan

(Học viện Quân y, UB 10-80…) nghiên cứu và công bố là có bằng chứng nhiễm

độc dioxin Các nạn nhân đã có tiền sử bị phơi nhiễm, hiện nay có thể đang sống tại Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế và các

tỉnh khác Các đối tượng mới bị phơi nhiễm, chủ yếu cư trú tại khu vực sân

bay Biên Hoà và Đà Nẵng Đối chứng: là các thành viên không bị phơi nhiễm

trong các gia đình đó

2) Đã và đang có những biểu hiện bệnh lý và lâm sàng đặc trưng của 11 bệnh có liên quan dến dioxin do Mỹ đã công bố

3) Có con, cháu trong gia đình mang dị tật bẩm sinh

Ghi chú: Mẫu máu từ các phả hệ nạn nhân được sưu tập thông qua hợp

tác nghiên cứu với Học viện Quân y (PGS TS Lê Bách Quang và cộng sự) Trường ĐH Y Hà Nội (GS.TSKH Phan Thị Phi Phi, PGS TS Nguyễn Văn Tường và cộng sự, PGS TS Trịnh Văn Bảo), Viện Huyết học truyền máu- Bệnh viện Bạch Mai (GS TSKH Đỗ Trung Phấn), Bộ Y tế (BS Trần Mạnh Hùng, nguyên cán bộ UB 10-80) và các cơ quan khác

- Lập Ngân hàng DNA từ các phả hệ bị ảnh hưởng trực tiếp của dioxin

phục vụ cho các nghiên cứu lâu dài về tác động của dioxin đối với bộ gene của người Ngân hàng này bao gồm ít nhất 100 - 400 mẫu DNA (bao gồm 20 - 50 phả hệ, trung bình mỗi phả hệ trung bình 5 - 8 cá thể) Đây là vấn đề quan trọng

và cấp bách hàng đầu, vì các nạn nhân có thể chết do tuổi già hoặc bệnh nặng

- Nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế và bảo quản lâu dài DNA từ các mẫu máu

- Phân lập, tách dòng và đọc trình tự nucleotide của một số gene quan trọng ở các nhóm bệnh nhân và đối chứng như: TP53, AHR, CYP1A1, CYP1B1, hOGG1, IgG, IgM, MSH2, p27KIP1, SOD

- Phân tích đột biến và xử lý số liệu bằng các chương trình, phần mềm chuyên dụng

- Kết luận về ảnh hưởng của dioxin lên các nhóm gene chọn lọc nói trên

- Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả trên các tạp chí, hội nghị quốc tế và trong nước

B Nghiên cứu các thay đổi gene trên các đối tượng động vật:

- Thu thập một số mẫu động vật thủy sinh (cá trắm cỏ, cá trê) tại các

điểm nóng, bị ô nhiễm nặng: Các thủy vực xung quanh sân bay Biên Hoà, sân

bay Đà Nẵng); đối chứng là mẫu cá cùng loài tại các vùng khác không bị ô

nhiễm Số lượng mỗi nhóm ít nhất là 3 - 5 mẫu

- Phân lập, tách dòng, và đọc trình tự nucleotide của một số gene, như: AHR, CYP1A1, TP53 ở các mẫu cá nói trên

- Phân tích đột biến và xử lý số liệu bằng các chương trình, phần mềm chuyên dụng

- Kết luận về ảnh hưởng của dioxin lên các gene chọn lọc ở cá

- Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả trên các tạp chí, hội nghị quốc tế và trong nước

1.4 Yêu cầu khoa học đối với sản phẩm

1 Ngân hàng DNA người bị nhiễm

dioxin và đối chứng

Các chế phẩm DNA genome người từ các phả hệ bị nhiễm dioxin (100 - 400 mẫu); 0,3- 0,5

mg DNA tinh khiết/mẫu; có thể bảo quản được lâu dài

2

Bộ sưu tập các đoạn gene người

Việt Nam bị ảnh hưởng của

dioxin nằm trong vector chọn

dòng

Các plasmid (pBSKS-, vector) tinh khiết (0,5 - 1

pCRII-mg/mẫu); các chủng E coli

mang các đoạn gene AHR, CYP1A1, CYP1B1, MSH2, p27KIP1, p53, hOGG1, SOD, IgG, IgM

3

Trình tự các đoạn gene (AHR,

CYP1A1, CYP1B1, MSH2,

p27KIP1, p53, hOGG1, SOD,

IgG, IgM) trong phả hệ người bị

nhiễm chất độc dioxin

Các trình tự gene được đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gene quốc tế EMBL(EBI)/ Genbank/ DDBJ

4

Báo cáo tổng quan các nghiên cứu

về tác hại của dioxin đối với hệ

gene ở người

Phân tích đầy đủ chính xác các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước

5

Tài liệu báo cáo tổng quan các

nghiên cứu về tác hại của dioxin

đối với hệ gene trên cá trắm cỏ và

cá trê

Phân tích khoa học đầy đủ chính xác kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước

6 Báo cáo khoa học tại các Hội nghị

khoa học trong nước Kết quả khoa học có giá trị cao

7 Báo cáo khoa học tại các Hội nghị

khoa học quốc tế Kết quả khoa học có giá trị cao

8 Công bố (bài báo khoa học) trong

9 Công bố (bài báo khoa học) quốc

tế

Kết quả khoa học đạt trình độ khu vực và quốc tế

10 Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề

tài

Đưa ra được những bằng chứng

cụ thể và kết luận xác đáng về các ảnh hưởng ở mức độ gene ở người và động vật

PHần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Tác động/ ảnh hưởng của TCDD/ DIOXIN

TCDD/ Dioxin là một chất siêu độc, thường lẫn tạp trong thành phần của thuốc bảo vệ thực vật, cũng như sinh ra trong chất thải công nghiệp, các quá trình xử lý (đốt) rác thải, trong khói thuốc lá Xét về độc tính, dioxin chỉ đứng sau các chất thải phóng xạ Thời gian bán hủy của dioxin trong cơ thể người là 8 năm rưỡi, thậm chí lâu hơn

Tác động của dioxin gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với môi trường sinh thái và đặc biệt là đối với sức khỏe con người Những hậu quả trên người và

động vật do dioxin gây ra bao gồm: các bệnh ung thư, suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng thần kinh, quái thai, dị tật bẩm sinh và nhiều bệnh tật khác

Dioxin là tác nhân gây ung thư (carcinogen)!

Từ năm 1997, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer - IARC) và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) đã liệt kê dioxin vào Danh sách các chất gây ung thư nhóm 1 (nhóm cao nhất), tức là nhóm đã được xác nhận (có đủ bằng chứng)

là chất gây ung thư trên người (McGregor et al., 1998)

Dioxin là tác nhân độc phôi/ thai (teratogen)!

Các nghiên cứu trên nhiều loài động vật như gà, chuột nhắt, chuột cống, thỏ… và kể cả ở khỉ (là động vật rất gần với người về phương diện tiến hóa) đều cho thấy dioxin có tác động gây độc phôi/ thai (sảy thai, chết thai…) (Chuyên khảo độc học, 2002)

Dioxin có phải là tác nhân gây đột biến (mutagen) và độc gene (genotoxic) hay không?

Sự rối loạn về chức năng các gene đã được nghiên cứu rất nhiều Theo các

số liệu nghiên cứu từ nhiều năm của các nhà khoa học trên thế giới, dioxin tác

động trực tiếp lên tế bào chủ yếu thông qua một chất (protein) thụ cảm (thụ thể)

có tên là Aryl Hydrocarbon Receptor (AHR) Ngoài ra, có thể tồn tại cơ chế tác

động khác (không qua AHR)

2.2 Cơ chế tác động của dioxin ở mức độ phân tử

Những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử và Công nghệ gene, người ta đã và đang làm sáng tỏ được nhiều vấn đề trong cơ chế phân tử của tác động tức thời (trực tiếp) cũng như hậu quả lâu dài tiếp theo (gián tiếp) của dioxin đối với cấu trúc và chức năng của các gene và sản phẩm của chúng (protein/enzyme) Có thể phân biệt các tác động này theo 2 nhóm: rối loạn

về chức năng các gene và tác động đột biến (độc gene - genotoxicity)

2.2.1 Sự rối loạn về chức năng các gene

Cơ chế tác động của dioxin lên tế bào thông qua AHR đã được nghiên cứu rất kỹ và được khoa học thừa nhận Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin, trong tế bào xảy ra sự biểu hiện tăng cường gene mã hóa AHR kèm theo các rối loạn về sự biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã) của hàng loạt gene

tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh trưởng của tế bào (cell growth

control), cũng như các gene tham gia vào chu trình phân bào (cell cycle), như:

TGF (Transforming Growth Factor), cyclin A, c-myc

Thông qua AHR, dioxin hoạt hóa sự biểu hiện các gene như: cytochrome P4501A1 (CYP1A1), Plasminogen Activator Inhibitor-2 (PAI-2)… Trong khi

đó, nó lại làm suy giảm (ức chế) biểu hiện gene mã hóa yếu tố sinh trưởng chuyển hóa TGF-beta2 Kết quả là quá trình phân bào bị rối loạn gây nên các hậu quả tiếp theo rất đa dạng Dioxin còn làm thay đổi (ức chế, giảm biểu hiện) gene mã hóa Glucose Transporter- 4 (GLUT-4, protein vận chuyển đường glucose)

Dioxin đặc biệt nguy hiểm khi tác động lên các gene của các tế bào sinh sản Nó bám vào chất thụ cảm hormone (hormone receptor) của tế bào, làm thay

đổi chức năng và cơ chế di truyền của tế bào, gây ra hàng loạt hậu quả như: làm thay đổi biểu hiện gene mã hoá 17-20 lyase gây giảm lượng hormone của tế bào trứng như progesterone (P) và estradiol (E2) dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng; tác động lên sự phát triển của tinh hoàn (gây teo), có bằng chứng cho thấy gene mã hoá Src kinase đóng vai trò quyết định trong quá trình này Một gene mới

được phát hiện liên quan đến tác động của dioxin mã hóa cho protein có tên là 25-Dx (thuộc siêu họ protein: cytokine/ yếu tố sinh trưởng/ chất thụ cảm prolactin) có thể gắn với progesterone (P), là chất thụ cảm của hormone này Tác

động của dioxin lên các gene nhất định đôi khi còn phụ thuộc vào giới tính:

chẳng hạn dioxin làm tăng hoạt tính Tyrosine Kinase (TK) ở con đực, trong khi lại làm giảm hoạt tính này ở con cái Dioxin có thể liên quan đến sự phát sinh và phát triển của nhiều bệnh ung thư, thông qua các thay đổi ở các gene quan trọng như TP53, p27KIP1, p21/waf1, cdc2 p34 kinase và cdk4

2.2.2 Tác động đột biến (độc gene - genotoxicity)

Mặc dù vẫn chưa có bằng chứng về đột biến gene trên người, nhưng các nghiên cứu trên chuột thực nghiệm xử lý dioxin cho thấy, khi xâm nhập vào tế bào, dioxin có thể chuyển hóa, tương tác với các protein-enzyme và gene khác, gây nên thay đổi trong DNA, dẫn đến các đột biến và thậm chí tử vong sau 34 ngày

đặc biệt, thí nghiệm trên chuột còn cho thấy dioxin gây ra sự oxy hóa các bazơ nitơ trong thành phần nucleic acid, chuyển đổi Guanosine thành 8-hydroxydeoxyguanosine và quá trình sửa chữa phân tử sau đó không thành công

có thể dẫn đến sai lệch ở các vị trí của bazơ này trong gene (Shertzer et al., 1998) Tình trạng bị oxy hoá thái quá (oxidative stress) (Muskhelishvili et al., 2001; Slezak et al., 2000; Hassoun et al., 2001) có thể là một trong những cơ chế

quan trọng gây ra những thay đổi gene (biến dị và di truyền lại cho các thế hệ con cái) cần phải được tập trung nghiên cứu trên các nạn nhân bị nhiễm dioxin

Giả thuyết về cơ chế phá hủy DNA bởi dioxin thông qua việc tạo ra các gốc tự do và ảnh hưởng của quá trình sửa chữa DNA bị hỏng lên chu trình phân bào, sự phát sinh ung thư và đột biến gene được trình bày trên Hình 1 và 2

Hình 1: Tác động của dioxin lên DNA thông qua việc tạo ra các gốc tự do

Hình 2: Các ảnh hưởng của sự thay đổi DNA trong tế bào 2.3 Các bệnh có liên quan đến dioxin

Gần đây, Viện Y học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Hoa Kỳ (Catlin, 2003) đã có báo cáo tổng hợp về các bệnh có liên quan và không liên quan đến

sự phơi nhiễm dioxin như sau:

Mức 1: Có bằng chứng chính xác về sự liên quan (tổng số có 5 bệnh,

trong đó có 4 bệnh ung thư tổ chức mềm) Các bằng chứng đủ để kết luận rằng

có sự liên quan rõ ràng giữa dioxin với các hậu quả của nó trong đó đã loại trừ đi khả năng về sự may rủi, lầm lẫn hay thành kiến Dưới đây là những bệnh đã có bằng chứng chắc chắn về mối liên quan giữa sự phơi nhiễm dioxin và những hậu quả về sức khỏe sau đó

1 Ung thư bạch cầu tế bào lympho mãn tính (Chronic lymphocytic

leukemia, CLL)

2 Sarcom/ ung thư mô mềm (Soft- tissue sarcoma)

3 U lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin's lymphoma)

4 U lympho Hodgkin (Hodgkin's lymphoma)

5 Bệnh ban clo (Chloracne)

Mức 2: Có bằng chứng mang tính chất gợi ý có liên quan (tổng số có 7

bệnh, trong đó có 3 bệnh ung thư) Các bằng chứng này mang tính chất gợi ý vì chưa loại trừ một cách hoàn toàn khả năng về sự may rủi, lầm lẫn hay thành kiến Ví dụ, có ít nhất một nghiên cứu có chất lượng cao chỉ ra 1 liên quan trực tiếp, còn một số nghiên cứu khác thì chưa chắc chắn Sau đây là những bệnh đã

có bằng chứng hạn chế hay mang tính gợi ý về sự liên quan giữa dioxin với hậu quả về sức khỏe

6 Ung thư hệ hô hấp (phổi, khí quản, phế quản, thanh quản)

(Respiratory cancer of lung or bronchus, larynx, and trachea)

7 Ung thư tiền liệt tuyến (Prostatic cancer)

8 Đa u tủy xương (Multiple myeloma)

9 Bệnh thần kinh ngoại vi cấp tính và bán cấp tính thoáng qua (Acute

and subacute transient peripheral neuropathy)

10 Rối loạn chuyển hóa porphyrin (Porphyria cutanea tarda)

11 Tiểu đường không phụ thuộc insulin (typ 2) (Type 2 diabetes)

12 Nứt gai đốt sống ở con cái các cựu chiến binh (Spina bifida in the

children of veterans)

Đáng chú ý là, khi tính trên tổng số 12 bệnh ở Mức 1 và 2 (nghĩa là các bệnh có bằng chứng liên quan đến dioxin rõ ràng và tương đối rõ ràng) có 7

bệnh ung thư, chiếm tỷ lệ 58,3%

Mức 3: Có bằng chứng không đầy đủ để xác định có liên quan hay không

(tổng số có 26 bệnh, trong đó có 11 bệnh ung thư) Sau đây là những bệnh có bằng chứng nhưng chưa đủ mạnh về chất lượng, độ tin cậy và độ thỏa mãn để kết luận về sự liên quan hay không liên quan

13 Ung thư gan mật (Hepatobiliary cancer)

14 Ung thư mũi hoặc mũi hầu/ tị hầu (Nasal or nasopharyngeal

cancer)

15 Ung thư xương (Bone cancer)

16 Ung thư vú (Breast cancer)

17 Ung thư hệ sinh sản nữ (cổ tử cung, tử cung, buồng trứng) (Female

reproductive cancer)

18 Ung thư bàng quang tiết niệu (Urinary bladder cancer)

19 Ung thư thận (Renal cancer)

20 Ung thư tinh hoàn (Testicular cancer)

21 Ung thư bạch cầu (khác với CLL) (Leukemia (other than CLL))

22 Ung thư da (Skin cancer)

23 Sảy thai tự nhiên (Spontaneous abortion)

24 Dị tật bẩm sinh (Birth defects (other than spina bifida))

25 Thai chết lưu và chết sau sinh 6 tuần (Neonatal or infant death and

stillbirth)

26 Trẻ sinh thiếu cân (Low birthweight)

27 Ung thư bạch cầu cấp tính dòng tủy ở trẻ sơ sinh (Childhood

cancer in offspring, including acute myelogenous leukemia)

28 Dị dạng tinh trùng và vô sinh (Abnormal sperm characteristics and

31 Rối loạn hệ thần kinh ngoại biên mãn tính (Chronic peripheral

nervous system disorders)

32 Rối loạn chuyển hóa và tiêu hóa (thay đổi về các enzyme trong gan

và dị thường lipid, loét) (Metabolic and disgetive disorders (changes

in liver enzymes, lipid abnormalities, and ulcers)

33 Rối loạn hệ miễn dịch (ức chế miễn dịch và tự miễn) (Immune

system disoders (immune suppression and autoimmunity))

34 Rối loạn hệ tuần hoàn (Circulatory disorders)

35 Rối loạn hệ hô hấp (Respiratory disorders)

36 ứ đọng chất dạng tinh bột nguyên phát typ AL (AL-type primary

amyloidosis)

37 Lạc nội mạc tử cung (Endometriosis)

38 Tác động đến hằng định nội môi tuyến giáp (Effects on thyroid

homeostasis)

Mức 4: Có bằng chứng hạn chế hay gợi ý là không liên quan (gồm 2

nhóm bệnh ung thư) Các nghiên cứu đầy đủ trên tất cả mức độ phơi nhiễm mà con người gặp phải đã không chỉ ra một sự ảnh hưởng trực tiếp nào thì được kết luận là không ảnh hưởng

39 Ung thư hệ tiêu hóa (dạ dày, tụy, đại tràng, trực tràng)

(Gastrointestinal tumor (stomach cancer, pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer))

40 Ung thư não (Brain tumors)

2.4 Tổng quan về các gene đã chọn

2.4.1 Gene m∙ hóa TP53 - chất áp chế ung thư

Vai trò của TP53: Người bảo vệ của genome (The guard of genome)

ở người, gene mã hóa TP53 nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 17 tại vị trí 17p13 Gene này mã hóa cho TP53 có kích thước 393 amino acid (aa), với cấu trúc bao gồm: vùng gắn DNA đặc hiệu, vùng oligomer hóa và vùng phosphoryl hóa

Khi kiểm tra thấy có sự sai hỏng DNA, TP53 ngừng chu kỳ phân bào tại

các điểm kiểm soát (checkpoint) và hoạt hóa các gene mã hóa các enzyme có

chức năng sửa chữa sai hỏng DNA Nếu DNA được sửa chữa hoàn chỉnh, chu kỳ

tế bào được tiếp tục Nếu DNA không được sửa chữa, tế bào sẽ chết theo cơ chế

“chết tế bào theo chương trình” (apoptosis)

Nếu TP53 bị sai hỏng hoặc mất chức năng thì các tế bào mang DNA sai hỏng vẫn được nhân lên mang theo các đột biến có hại Đây là cơ chế gây ra ung thư Các nghiên cứu cho thấy hơn 50% trường hợp ung thư ở người là do có sự

sai hỏng của gene mã hóa TP53 Do đó, TP53 còn được gọi là chất áp chế ung

thư (Tumor suppressor)

Cơ chế cảm ứng TP53 khi có sự sai hỏng DNA

Loại đột biến DNA gây cảm ứng: gẫy DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính tại

đầu 5' hoặc 3' Đột biến mất nucleotide ở một sợi không gây cảm ứng TP53

Cơ chế tích luỹ TP53 nội bào: 1) tăng hiệu quả dịch mã của mRNA TP53

(theo cơ chế điều khiển sau phiên mã); 2) tăng độ bền (thời gian tồn tại) của

TP53 vì TP53 có thời gian bán hủy ngắn trong điều kiện bình thường (5-20 phút)

và phân hủy TP53 là một quá trình tiêu thụ năng lượng theo con đường phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin

Cơ chế TP53 ngăn cản chu kỳ tế bào tại các điểm kiểm soát: thông qua

điều khiển tăng hoặc giảm phiên mã các gene có liên quan

Điều khiển âm tính: TP53 hạn chế quá trình phiên mã một số gene thông

qua việc tương tác với các nhân tố phiên mã tạo thành các phức hệ như: phức hệ

TP53-TBP (TATA binding protein, là một tiểu đơn vị của nhân tố phiên mã

TFIID - Transcription initiation factor IID), phức hệ TP53-SP1-CBF (nhân tố bám promoter CCAAT - CCAAT binding factor)

Điều khiển dương tính: TP53 tăng cường phiên mã một số gene bằng cách

tương tác trực tiếp với vùng DNA gắn đặc hiệu với TP53 Ví dụ: gene p27KIP1,

GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage inducible gene GADD45) làm gián

đoạn chu kỳ tế bào; gene MDM2 (Mouse Double Minute 2 homolog) hoặc HDM2 (Human Double Minute 2 homolog) khôi phục chu kỳ tế bào và gây tác

dụng phản hồi ức chế TP53

Chết tế bào theo chương trình (apoptosis): Đây là một quá trình phức tạp

thông qua nhiều con đường trao đổi, kết quả là gây chết một tế bào nhất định và loại bỏ nó mà không gây các thương tổn mô và viêm nhiễm Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa mối cân bằng giữa mức sinh sản và mức tử vong của tế bào và được điều khiển bởi nhiều cơ chế khác nhau

Một trong các cơ chế gây chết tế bào là cơ chế phụ thuộc TP53 Cơ chế này có mặt ở nhiều loại mô và có tính phụ thuộc loại mô Cơ chế giả định là

TP53 ức chế sự phiên mã gene BCL2 (B-cell CLL/Lymphoma 2) - nhân tố quy

định sự tồn tại của tế bào chống lại apoptosis và đồng thời tăng cường sự phiên

mã gene BAX (BCL2-Associated X protein) - tác nhân ức chế BCL2

TP53 được tổng hợp ở tất cả các loại mô, tế bào và có tính bảo thủ cao trong quá trình tiến hóa Mặc dù không phải là phân tử thiết yếu cho sự tồn tại của tế bào nhưng TP53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì sự ổn

định tính di truyền ở mức độ tế bào Điều này là vô cùng quan trọng vì những thương tổn về di truyền sẽ gây ra sự phát triển của các khối u và gây ung thư Vai trò quan trọng của TP53 như là một chất áp chế ung thư đã được khẳng định thông qua nghiên cứu thống kê cho thấy tỷ lệ trong 6 người bị suy giảm chức năng TP53 thì 1 người bị phát triển bệnh thành ung thư

TP53 được hoạt hóa khi có sự thương tổn DNA và hoạt động như là nhân

tố phiên mã, có thể gắn với vùng DNA đặc hiệu (vùng tương tác TP53) và tăng cường sự phiên mã của các gene đích Trong trường hợp này, TP53 hoặc gây gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc cảm ứng apoptosis Cả 2 chức năng này đều bảo vệ

tế bào chống lại sự khuếch đại các đột biến DNA trong quần thể tế bào

Sự tổn thương DNA và phản ứng của TP53

Thông thường, sự gãy phân tử DNA mạch đôi có thể gây cảm ứng TP53

Điều này được chứng minh bằng thí nghiệm vi tiêm một lượng nhất định phân tử DNA vào nhân của các tế bào nuôi cấy bình thường Bằng việc sử dụng các phân

tử DNA mang những đột biến nhất định, người ta đã chứng minh rằng các đứt gãy phân tử của DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính 3’ hoặc 5’ đều có tác dụng gây cảm ứng TP53 như nhau Ngược lại, đột biến nucleotide trên một sợi đơn thì không hoạt hóa cảm ứng

Nồng độ TP53 nội bào tăng lên tương ứng với mức độ thương tổn DNA

Điều này không phụ thuộc vào quá trình phiên mã của gene mã hóa TP53 mà liên quan đến cơ chế điều hòa sau phiên mã, làm tăng hiệu quả dịch mã của các phân tử mRNA đã được tổng hợp Điều hòa sau phiên mã rất quan trọng trong

điều hòa tổng thể sự biểu hiện của gene và đặc biệt cho phép phản ứng nhanh hơn so với điều hòa phiên mã Quá trình này liên quan đến tương tác protein-mRNA nội bào nhưng cơ chế cụ thể làm tăng nồng độ TP53 thì chưa được làm sáng tỏ

Tính ổn định của TP53 cũng có thể góp phần làm tăng nồng độ protein này tương ứng với mức độ thương tổn DNA TP53 có thời gian tồn tại ngắn, và

sự phân hủy protein là một quá trình tiêu dùng năng lượng có liên quan đến con

đường phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin Điều này tương đồng với sự tăng

đột ngột nồng độ và giải thích sự tích luỹ TP53 trong các tế bào khi thiếu hụt các thành phần của con đường ubiquitin

Cảm ứng sự gián đoạn chu kỳ phân bào

Việc tăng nồng độ TP53 khởi phát hàng loạt phản ứng nội bào khi có sự thương tổn DNA Sự biểu hiện của một gene có thể được tăng cường hoặc áp chế phụ thuộc vào loại promoter điều khiển gene đó

áp chế biểu hiện gene: Các gene được điều khiển bởi các nhân tố phiên mã thì có thể bị áp chế sự biểu hiện Trong một số trường hợp, áp chế biểu hiện gene là kết quả của việc TP53 tạo phức hợp với các nhân tố phiên mã này và làm bất hoạt hóa chúng Các gene bị áp chế bởi TP53 bao gồm các gene bị điều khiển

bởi promoter TATA; TP53 gắn với TBP gây ra sự áp chế Các nghiên cứu in vitro

cho thấy tương tác TP53-TBP ngăn cản sự phiên mã của các promoter rất nhỏ Các vùng chức năng nằm phía hai đầu TP53 có thể tương tác với các vùng chức năng của TBP Protein E1A của adenovirus có thể phá vỡ mối tương tác TP53-

TBP qua đầu C của phân tử TP53 và làm hạn chế quá trình ức chế phiên mã của TP53

TP53 cũng tương tác với các nhân tố phiên mã khác như CBF và SP1 Điều này chứng tỏ TP53 áp chế sự phiên mã của những nhóm gene nhất định bằng việc phong tỏa các nhân tố phiên mã tương ứng của những gene này

Vùng bám DNA đặc hiệu

Việc bám DNA đặc hiệu và sự hoạt hóa phiên mã là vai trò cơ bản của chất áp chế ung thư - TP53 bình thường TP53 là phân tử tạo thành bởi các vùng chức năng (modular) và vùng gắn DNA đã được xác định là nằm cùng domain trung tâm phân tử Sự hoạt hóa phiên mã của TP53 được điều khiển bởi sự tương tác với nhân tố hoạt hóa đồng thời TAF40 và TAF60 (nhân tố liên kết TBP)

Vùng trình tự gắn đặc hiệu TP53 được nghiên cứu kỹ nhất là đoạn DNA chứa 2 lần lặp lại trình tự 5’PuPuPu[A/T][T/A] GpyPyPy 3’ Mỗi đoạn lặp lại

tiêu biểu cho 1 phần tương tác in vivo, mỗi nửa tương tác này có thể cách nhau

một chuỗi nucleotide mà vẫn có thể gắn với TP53 Phương pháp xác định khối

lượng bằng kính hiển vi điện tử quét (STEM – Scanning Transmission Electron

Microscope) cho thấy TP53 tương tác với vùng DNA đặc trưng thông qua

tetramer, bằng cách tạo liên kết giữa 4 phân tử TP53 đã tạo thành một vòng uốn DNA Việc tetramer TP53 gắn với DNA được chứng minh lần đầu tiên bằng các

nghiên cứu in vitro phân đoạn kích thước và phân tích sự xê dịch băng điện di trên gel (gel shift) Tuy nhiên, các diễn biến trong tế bào thực tế có thể phức tạp

hơn nhiều vì mỗi monomer TP53 đều có chức năng tăng cường phiên mã kiểu

trans mặc dù không gắn với DNA trong nghiên cứu in vitro

Sự gắn TP53 với vùng DNA đặc hiệu phụ thuộc vào cấu hình protein Dạng 1620+ (phản ứng với kháng thể đơn dòng Pab1620 phụ thuộc cấu hình) tương ứng với chức năng áp chế ung thư của TP53 và đóng vai trò quyết định

trong việc gắn in vitro với vùng DNA bảo thủ TP53-CON Các thí nghiệm đối

kháng cho thấy TP53 chuột có thể thay thế cho TP53 người (hp53) trong phức hệ TP53-DNA Điều này tương ứng với khả năng gắn của TP53 chuột cao hơn hp53 trong phức hệ TP53-DNA tại một nhiệt độ nhất định Các oligomer giữa TP53

người và chuột cũng có thể gắn in vitro với DNA và ái lực liên kết đã được xác

định vào khoảng 5x10-10M tương tự với ái lực của các oligomer của TP53 người

và chuột riêng rẽ

Đột biến mất chức năng của TP53

Cho đến nay, người ta đã biết đến 21587 đột biến khác nhau của gene TP53 (http://www.iarc.fr/p53) Một đột biến điểm vô nghĩa cũng có thể làm mất chức năng áp chế ung thư của TP53 Trong các tế bào của người bị ung thư, gene TP53 dường như cực kỳ nhạy cảm với các đột biến điểm nằm trong vùng lõi trung tâm (vùng gắn DNA) Thực tế, gene TP53 được coi là gene bị đột biến thường xuyên nhất trong quần thể người bị ung thư và không phụ thuộc loại ung thư nào

Trong các tế bào ung thư, việc mất chức năng của một allele thường liên quan đến đột biến vô nghĩa trên allele kia Mặc dù các đột biến thường tập trung chủ yếu trên 25% vùng mang mã, nhưng trong thực tế có rất nhiều các điểm nóng đột biến Các điểm nóng đột biến thì liên quan đến các loại ung thư đặc trưng Ví dụ, các codon 175, 248 và 273 là các điểm nóng đột biến thường tạo nên đột biến vô nghĩa, tuy nhiên bệnh ung thư biểu mô tế bào gan

(Hepatocellular carcinoma) khi phơi nhiễm aflatoxin B thường liên quan đến đột

biến tại codon 249 Các đột biến của gene TP53 trên tế bào dòng tinh thường liên quan đến bệnh ung thư bẩm sinh còn gọi là hội chứng Li-Fraumeni

Ngoài các đột biến, TP53 cũng có thể bị bất hoạt bởi các tương tác protein-protein đặc hiệu (ví dụ MDM2) và các protein được mã hóa bởi DNA của virus gây ung thư biến nạp vào trong tế bào Thực tế, hiện tượng này gây ra khái niệm coi TP53 là protein nội bào tạo phức hệ với kháng thể T lớn của virus SV40 gây ung thư ở người Protein E1B của các adenovirus loại 5 và E6 trong

nhóm 16 và 18 của các virus gây u sùi ở người (Human papillomavirus)

(HPV-16 và -18) cũng tương tác với TP53 kiểu dại Các protein E1B và kháng thể T lớn dường như tạo các phức hệ tương đối bền với TP53 Ngược lại, HPV E6 làm TP53 bị thủy phân nhanh chóng bởi hệ thống phụ thuộc ubiquitin

Chức năng của TP53 thường rất nhạy cảm với các đột biến vô nghĩa Điều này đã được làm sáng tỏ khi vùng chức năng lõi trung tâm, nơi đóng vai trò liên kết với DNA đích được xây dựng mô hình cấu trúc bằng phương pháp tinh thể tia

X Người ta đã xác định rõ ràng các đột biến gây mất chức năng bám DNA và các đột biến làm thay đổi cấu trúc không gian của TP53

Mô hình cấu trúc phân tử đã chỉ ra rằng vùng chức năng bám DNA của TP53 khác so với các protein bám DNA khác ở chỗ nó có cấu trúc tương đối mở,

đòi hỏi tạo thành cấu trúc kẹp kiểu sandwich B để định vị và định hướng các thành phần cấu trúc tương tác với DNA Cấu trúc kẹp B này tạo thành một nếp gấp dạng vòng-tấm-xoắn và tạo 2 vòng loop L2 và L3 Cấu trúc này được định hướng và ổn định nhờ các tương tác của các chuỗi bên và sự tương tác 4 tiểu phần dạng nguyên tố kẽm (Zn) (thông qua 3 Cysteine và 1 Histidine) Sự định hướng này có tính thiết yếu vì dạng vòng-tấm-xoắn và vòng loop L2, L3 tạo thành bề mặt gắn DNA của TP53 Việc nhận diện vùng DNA đặc hiệu liên quan

đến cả rãnh lớn và rãnh nhỏ của vùng DNA đích

Các đột biến vô nghĩa xảy ra trên khắp vùng liên kết với DNA với các

điểm nóng ở codon 175, 248 và 273 đều mã hóa Arginine Mô hình cấu trúc tinh thể đã chỉ ra rằng các tương tác chuỗi bên của Arginine 175 có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình đúng (cấu trúc không gian bậc 4) cần thiết cho việc gắn với DNA đặc hiệu Đột biến ở vị trí này làm mất tính ổn định của cấu trúc bậc 4 của TP53 dẫn đến mất khả năng bám DNA và khả năng áp chế ung thư

Đột biến thay thế Arginine 248 và Arginine 273 cũng gây mất khả năng bám DNA, nhưng trong trường hợp này không làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của TP53, chứng tỏ rằng các vị trí này là nơi tương tác trực tiếp với phân tử DNA Tóm lại,

các đột biến cấu trúc làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của TP53 nên làm mất tính bám DNA, trong khi đó các đột biến liên kết DNA không làm sai hỏng cấu trúc

không gian của TP53 mà chỉ gây sai hỏng các aa quan trọng liên kết trực tiếp với DNA

TP53 là một protein đa chức năng

Tính đa chức năng của TP53 được giải thích một phần thông qua lịch sử nghiên cứu protein này Đầu tiên, TP53 được coi là tác nhân gây ung thư nhưng cuối cùng lại là chất áp chế ung thư Trong thực tế, dạng TP53 kiểu dại có 3 dạng cấu trúc không gian khác nhau (phân biệt bằng phép lai miễn dịch) mỗi loại tương ứng với một kiểu chức năng điều khiển sự phát triển của tế bào Các dạng cấu trúc khác nhau có thể là kết quả của: 1) sự thay đổi cấu hình bổ sung, 2) sửa

đổi sau phiên mã, 3) tổ hợp khác nhau các exon trong mRNA (alternative

splicing)

Tính linh động cấu trúc không gian là các cơ chế phân tử cho phép một protein có thể thực hiện các chức năng khác nhau Đặc tính này có thể do các cơ chế điều hòa hoạt động TP53 trong các phản ứng phát triển bình thường của tế

bào và dường như đây là đặc tính cơ bản của TP53 kiểu dại Người ta cũng cho rằng có rất nhiều đột biến cấu trúc có thể giữ vững sự ổn định cấu hình của TP53

khi có phản ứng kích thích sinh trưởng tế bào Các nghiên cứu in vivo cho thấy

cấu trúc của TP53 là đối tượng tấn công của các chất độc và của nguyên tố đồng (Cu), một kim loại độc Người ta cũng giả thiết rằng các cơ chế này điều khiển các cơ chế điều hòa nội bào cấu hình TP53 để phản ứng với các tín hiệu điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và phản ứng với các thương tổn DNA

Các sửa đổi sau phiên mã chủ yếu đối với TP53 là sự phosphoryl hóa và có các vị trí khác nhau tương ứng với các kinase đặc hiệu nằm ở đầu N và đầu C của TP53 Quá trình phosphoryl hóa có thể có hiệu quả quyết định lên cấu hình protein Mặt khác, cơ chế này có thể tác động lên TP53 theo các cách khác, ví dụ như sự hoạt hóa của các hoạt tính gắn DNA đặc hiệu

Với các vị trí phosphoryl hóa phức nằm trên TP53 và bản chất động lực của phản ứng phosphoryl hóa/ dephosphoryl hóa, phân tử TP53 có các cơ chế thực hiện các chức năng là nhiệm vụ vô cùng quan trọng Người ta đã thu được những bằng chứng gián tiếp như: quá trình phosphoryl hóa liên quan đến phản ứng tế bào đối với sự thay đổi DNA và TP53 được coi là cơ chất của các enzyme kinase DNA-PK và JNK Một thí nghiệm quan trọng về hoạt tính DNA-PK liên quan đến quá trình sửa chữa những đứt gẫy của sợi kép DNA Tuy nhiên, vai trò của quá trình phosphoryl hóa phân tử TP53 vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng

Cơ chế cắt gắn luân phiên của TP53 chuột đã được nghiên cứu và cho thấy

có sự thay thế 17 aa mới tại 26 aa nằm ở đầu C của phân tử TP53 chưa cắt gắn Người ta đã xác định được 2 phân tử protein khác nhau trên tế bào biểu mô của chuột và có thể được điều hòa khác nhau tuỳ thuộc thời điểm trong chu kỳ tế bào Sự khác biệt về chức năng giữa 2 biến dị của TP53 do cắt gắn là ở chỗ phân

tử TP53 bị cắt gắn luân phiên không thể bám tốt lên sợi đơn RNA hoặc phân tử DNA

Tổng kết

TP53 kiểu dại bằng cách nào đó có tính nhạy cảm và phản ứng đối với những sai hỏng DNA Phản ứng này gây ra sự tích luỹ TP53 theo cơ chế điều khiển sau phiên mã TP53 tác động đến quá trình phiên mã của nhiều gene bằng cách tương tác với các protein liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã của gene đó hoặc bằng cách bám trực tiếp với phân tử DNA và hoạt hóa gene kiểu

trans Phân tử TP53 gây ra sự gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc gây apoptosis tuỳ

thuộc loại tế bào Bằng cách ngăn chặn sự tăng sinh của các tế bào bị sai hỏng DNA, phân tử TP53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn của DNA và áp chế ung thư

Việc mất chức năng của TP53 có liên quan đến sự phát triển của hơn nửa

số bệnh ung thư ở người, và TP53 cũng là đối tượng nghiên cứu của các liệu

pháp chống ung thư mới Một hướng nghiên cứu là sử dụng liệu pháp gene (gene

therapy) để duy trì cấu trúc kiểu dại của TP53 Lĩnh vực nghiên cứu quan trọng

trong tương lai để phát triển các liệu pháp chống ung thư liên quan TP53 là xác

định các cơ chế TP53 phản ứng được tự hoạt hóa như thế nào khi có sự thương tổn DNA, và xác định các cơ chế quyết định khi nào thì TP53 làm gián đoạn chu

kỳ tế bào, khi nào gây chết tế bào Nhiều nghiên cứu cho thấy TP53 có khả năng

áp chế ung thư Tuy nhiên, cũng có bằng chứng cho thấy TP53 là đa chức năng

và thậm chí có chức năng kích thích sự sinh trưởng của tế bào Các hiểu biết đầy

đủ về chức năng của TP53 sẽ có ứng dụng đối với các bệnh liên quan đến ung thư, tái sinh và sửa chữa mô

2.4.2 Gene m∙ hóa AHR

AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor) là một protein thuộc họ PAS

(Per-ARNT-Sim (Single Minded)), gồm 848 aa, khối lượng phân tử 96147 Da mRNA

của gene mã hóa AHR gồm 3317 ribonucleotide (Itoh, Kamataki, 2003) Gene này có 11 exon, trong đó 10 exon đã được công bố

AHR là một yếu tố phiên mã hoạt hóa bởi cấu tử (ligand-activated

transcription factor) điều chỉnh các quá trình sinh học và khử độc các

hydrocarbon nhân thơm chứa gốc halogen như dioxin (Micka et al., 1997) Các

cấu tử AHR bao gồm dioxin, benzo[a]pyrene, polychlorinated và polybrominated biphenyls, còn cấu tử nội sinh chưa biết rõ Sau khi liên kết với cấu tử, AHR sẽ hoạt hóa quá trình phiên mã các gene mã hóa enzyme chuyển hóa thuốc bao gồm các enzyme xúc tác quá trình chuyển hoá các cơ chất có tiềm năng chuyển hoá thành các chất gây ung thư vừa và mạnh và enzyme xúc tác quá trình khử độc thuốc chữa ung thư hoặc các tạp chất môi trường khác Biểu hiện gene được điều hòa bởi AHR cũng liên quan tới nhiều quá trình sống quan trọng (biệt hoá tế bào, phân bào và apoptosis) thông qua các cơ chế truyền tín hiệu

Cơ chế tác động của dioxin thông qua AHR đã được nghiên cứu rất kỹ và

được thừa nhận Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin, trong tế bào

xảy ra sự biểu hiện tăng cường gene mã hóa AHR kèm theo các rối loạn về sự

biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã) của hàng loạt gene tham gia vào quá

trình điều khiển sự sinh trưởng của tế bào, cũng như các gene tham gia vào chu

trình phân bào AHR là một trong các yếu tố cảm ứng quan trọng nhất đối với

gene CYP1A1 và nhiều gene khác (Bảng 1)

Bảng 1: Một số gene chịu sự tác động của AHR Sản phẩm gene Hướng điều khiển

Có sự điều khiển của AHR (+): hoạt hóa

(ư): ức chế

CYP1A2 + CYP1B1 +

Prostaglandin Endoperoxide H synthase 2 +

Có khả năng có sự điều khiển của AHR

Plasminogene activator inhibitor-2 +

Choline kinase +

c-fos + Jun-B + c-jun + Jun-D +

Phosphophenolpyruvate carboxykinase ư

Ngoài ra, khi bị tác động bởi dioxin, phản ứng miễn dịch phụ thuộc tế bào

T bị cũng bị kìm hãm thông qua việc hoạt hoá AHR gây ức chế sự hoạt hoá và

tăng lượng tế bào T sau khi kích thích kháng nguyên, dẫn đến làm giảm lượng tế

bào T sinh ra từ cytokine trong quá trình tạo kháng thể Trong nghiên cứu gần

đây, Ito và cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng việc hoạt hoá gen AHR cũng là nguyên

nhân dẫn đến apoptosis và kìm hãm chu trình tế bào Những thay đổi biểu hiện ở

các gene liên quan đến apoptosis và kìm hãm chu trình tế bào thông qua cơ chế

phụ thuộc các yếu tố đáp ứng chất ngoại sinh (xenobiotic response elements -

XRE) sẽ ức chế sự phát triển của tế bào T

2.4.3 Giới thiệu chung về Cytochrome P450 và gene m∙ hóa CYP1A1

Các Cytochrome P450 ở người là các enzyme chuyển hóa thuốc Các

enzyme này được sử dụng để tổng hợp các phân tử cholesterol, steroid và các

phân tử lipid quan trọng khác như prostacyclin và thromboxane A2 Hai chất này

là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp arachidonic acid Các đột biến xảy

ra trên các gene mã hóa Cytochrome P450 hoặc sự thiếu hụt protein này là tác nhân gây một số bệnh nghiêm trọng ở người Ngoài ra, việc cảm ứng một số gene Cytochrome P450 khác là nguyên nhân gây ra một số dạng ung thư vì các enzyme này tham gia chuyển hóa các chất tiền gây ung thư thành các chất gây ung thư

Do các protein này đều chứa nhân hem và có một phổ hấp thụ đặc trưng nên được gọi là Cytochrome P450 Các protein Cytochrome P450 ở động vật có

vú thường là protein bám màng Chúng được phát hiện lần đầu tiên tại thể microsome ở gan chuột Thể microsome là các thể tan đục được tạo thành khi nghiền nhỏ các tế bào và phân lập các cấu trúc màng vẫn hòa tan trong khi phần cặn tế bào và ty thể được lắng xuống Hỗn hợp này rất đục khi quan sát trên kính hiển vi quang học vì chúng rất kém tán sắc Cách duy nhất để xác định phổ hấp thụ của các chất này là sử dụng thiết bị đặc biệt với phần tiếp nhận ánh sáng rất gần với cuvette và sử dụng một nguồn sáng gián đoạn trên các kính hiển vi khác nhau Bằng cách này các tạp chất gây nhiễu xạ khác có thể được phân tách Trong hệ thống này, các thể tan có tính khử cao được phản ứng với khí CO trong cuvette sẽ cho một phổ hấp thụ tương đối mạnh ở bước sóng 450nm (do đó được gọi là P450 với P: sắc tố - pigment) Đây được gọi là phổ biệt hóa CO khử Các phân tử CO liên kết chặt chẽ với nhân hem chứa sắt sẽ cho 2 phổ hấp thụ khác nhau ở 2 cuvette khác nhau Phổ này được quan sát lần đầu tiên vào năm 1958

Các protein chứa nhân hem khác không có tính chất đặc biệt này Nguyên nhân Cytochrome P450 hấp thụ tại phổ này là do sự hình thành liên kết đặc biệt tại nhân hem chứa ion sắt (Fe) Bốn liên kết của sắt được hình thành với các nguyên tử N trong vòng hem Do đó, nguyên tử Fe còn có khả năng tạo thêm 2 liên kết nữa phía trên và dưới mặt phẳng liên kết Trong các phân tử Cytochrome P450, liên kết thứ 5 tạo thành với anion lưu huỳnh (S-) Nguyên tố S là từ Cysteine ở vị trí bảo thủ trong trung tâm hoạt động của enzyme

Cấu trúc tinh thể nhiễu xạ tia X của các phân tử P450 ở hơn 10 loại vi

khuẩn đã được xác định (CYPs 51 [Mycobacterium], 55A1, 101A1, 102A1,

107A1 [eryF], 111A1, 119A1, 121A1 [P450Mt2], 152, 175A1) Các protein này

có tính tan cao trong khi các protein P450 ở sinh vật nhân chuẩn lại liên kết với màng Cấu trúc này tương tự như các bào quan có cấu trúc màng khác và có thể các protein này có các domain bám màng Protein Cytochrome P450 đầu tiên

được làm tinh thể là từ Pseudomonas putida, một loại vi khuẩn có khả năng sử

dụng long não làm nguồn carbon duy nhất Chủng vi khuẩn này được phát hiện trên đất dưới các cây long não Các protein này có hình dạng kiểu tam giác với nhân hem ẩn sâu bên trong Cấu trúc này cho phép ngăn cản tất cả các phân tử cơ chất và sản phẩm, kể cả các phân tử nước tiếp xúc hoặc tách ra khỏi trung tâm hoạt động Do đó, người ta giả thiết rằng có những cơ chế thay đổi cấu trúc các phân tử này để có thể mở một số điểm tại các vị trí xúc tác Phần lớn các enzyme này có cấu trúc giàu xoắn α, phần còn lại có cấu trúc nếp gấp β và các cấu trúc không lặp lại khác Các phân tử P450 của động vật có vú cũng có cấu trúc bậc hai tương tự, nhưng ở đầu N có miền (domain) bám màng Khi loại bỏ đầu N khỏi phân tử protein thì nó vẫn liên kết với màng CYP2C5 ở động vật có vú đã

được tinh thể hóa sau khi loại bỏ đoạn bám màng ở đầu N và thay thế trình tự kỵ nước bên trong bằng đoạn peptide có tính tan cao hơn Cấu trúc nhiễu xạ tia X

của phân tử tinh thể này đã được xác định (Williams et al., 2000) Bản mô tả

ngắn gọn các đặc điểm chính của phân tử này đã được công bố trước đó Cấu trúc này tương đồng với các cấu trúc enzyme Cytochrome P450 tan của vi khuẩn nhưng vẫn có một số khác biệt rõ rệt

Các Cytochrome P450 xúc tác cho nhiều loại phản ứng nhưng quan trọng nhất là các phản ứng hydroxyl hóa Chúng được gọi là các enzyme oxy hóa đa chức năng hoặc các monooxygenase, vì chúng phân tách một nguyên tử oxy ra khỏi cơ chất và giải phóng nước, khác với các dioxygenase có chức năng giải phóng phân tử oxy

Các chất hóa học hoặc dược phẩm thường được gọi là các chất ngoại sinh Các Cytochrome P450 đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi các chất ngoại sinh, đặc biệt là các dược phẩm có tính kỵ nước Quá trình trao đổi của các hợp chất này thường tiến hành theo 2 pha Đầu tiên là quá trình gắn một gốc chức năng có tác dụng như một vật nối với cơ chất Phản ứng này tạo ra các chất sửa đổi có tính tan tốt hơn do đó nó có thể chiết bằng dung dịch ure Có rất nhiều P450 tham gia xúc tác phản ứng gắn gốc hydroxyl trong pha I của phản ứng trao

đổi thuốc Sau đó, các phản ứng tiếp theo trong pha II sẽ xảy ra ở vị trí gốc hydroxyl

Để có thể tiến hành các phản ứng xúc tác, các Cytochrome P450 cần nguồn cung cấp electron Việc bổ sung 2 electron (quá trình khử) vào nhân hem chứa sắt sẽ làm dễ dàng phá vỡ liên kết O-O Các electron được cung cấp bởi

một protein liên kết trực tiếp với P450 và truyền electron từ nhóm ngoại của protein Quá trình trao đổi electron giữa các protein này được gọi là chuỗi truyền

điện tử, nó tương tự như chuỗi phản ứng của phức hệ I đến phức hệ IV trong ty thể

Hình 3: Sơ đồ cơ chế hoạt động của Cytochrome P450

Phân loại họ protein P450 ở người

Các protein P450 được chia thành 18 lớp và 43 phân lớp dựa trên sự tương

đồng về trình tự Các trình tự aa giống nhau khoảng 40% thì thường thuộc cùng một lớp Các trình tự giống trên 55% thì thuộc cùng một phân lớp Hiện nay, người ta đã xác định được trên 2500 trình tự Cytochrome P450 Các lớp và phân lớp P450 bao gồm:

1 CYP1 trao đổi dược phẩm (3 phân lớp, 3 gene, 1 pseudogene)

2 CYP2 trao đổi dược phẩm và steroid (13 phân lớp, 16 gene, 16 pseudogenes)

3 CYP3 trao đổi dược phẩm (1 phân lớp, 4 gene, 2 pseudogenes)

4 CYP4 trao đổi arachidonic acid hoặc acid béo (5 phân lớp, 11 gene, 10 pseudogenes)

5 CYP5 Thromboxane A2 synthase (1 phân lớp, 1 gene)

6 CYP7A bile acid biosynthesis 7-α hydroxylase of steroid nucleus (1 thành viên phân lớp) CYP7B 7-α hydroxylase dạng đặc hiệu não (1 phân lớp)

7 CYP8A prostacyclin synthase (1 thành viên phân lớp) CYP8B bile acid biosynthesis (1 thành viên phân lớp)

8 CYP11 steroid biosynthesis (2 phân lớp, 3 gene)

9 CYP17 steroid biosynthesis (1 phân lớp, 1 gene) 17-α hydroxylase

10 CYP19 steroid biosynthesis (1 phân lớp, 1 gene) aromatase forms estrogen

11 CYP20 không rõ chức năng (1 phân lớp, 1 gene)

12 CYP21 steroid biosynthesis (1 phân lớp, 1 gene, 1 pseudogene)

13 CYP24 vitamin D degradation (1 phân lớp, 1 gene)

14 CYP26A retinoic acid hydroxylase important in development (1 phân lớp) CYP26B probable retinoic acid hydroxylase (1 phân lớp) CYP26C probabvle retinoic acid hydroxylase (1 phân lớp)

15 CYP27A bile acid biosynthesis (1 phân lớp) CYP27B Vitamin D3 1-α hydroxylase activates vitamin D3 (1 phân lớp) CYP27C không rõ chức năng (1 phân lớp)

16 CYP39 7 - α hydroxylation of 24 hydroxy cholesterol (1 phân lớp)

17 CYP46 cholesterol 24-hydroxylase (1 phân lớp)

18 CYP51 cholesterol biosynthesis (1 phân lớp, 1 gene, 3 pseudogenes) lanosterol 14-α demethylase

Cảm ứng biểu hiện enzyme P450

Các enzyme P450 có các cơ chế điều hòa biểu hiện gene khác nhau Một

số gene có thể đ−ợc cảm ứng phiên mã bởi tín hiệu hóa học Các hormone steroid đ−ợc điều chỉnh chặt chẽ bởi các tuyến nội tiết Một trong những hormone cảm ứng biểu hiện các gene P450 là hormone tuyến yêngiáp trạng

ACTH (Adrenocorticotropic Hormone) ACTH kích thích sự tạo thành cAMP,

đóng vai trò là chất truyền tin thứ hai, thông qua việc hoạt hóa các protein kinase, enzyme xúc tác cho quá trình phosphoryl hóa các protein khác làm tăng quá trình phiên mã của gene

Một dạng điều hòa gene P450 khác là thông qua các chất tăng sinh có cấu trúc peroxisome như clofibrate Các chất dược phẩm này hoạt động thông qua

một protein liên kết là PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) Khi

các chất dược phẩm liên kết với các protein này thì chúng sẽ di chuyển vào nhân,

tạo phức với thụ thể retinoid X (Retinoid X Receptor - RXR) và liên kết với trình

tự DNA đặc trưng trong vùng điều hòa của các gene cần thiết cho sự tạo thành peroxisome Gene CYP1A1 được điều hòa theo cơ chế này Các peroxisome có tác dụng oxy hóa các acid béo và enzyme này được coi là hydroxylase acid béo

Một số hóa chất khác cũng cảm ứng P450 Ethanol cảm ứng các enzyme CYP2E Phenobarbital cảm ứng các enzyme CYP2B ở chuột lên 40-50 lần thông

qua một thụ thể gọi là CAR (Coxsackie-and-Adenovirus Receptor) CAR cũng

tạo dimer với RXR như thụ thể PPAR Phức hệ này liên kết với trình tự phản ứng phenolbarbital trên phân tử DNA để hoạt hóa các gene Đặc điểm chung của quá trình cảm ứng các enzyme P450 này chứng tỏ P450 có chức năng giải độc cơ thể trước các hóa chất ngoại lai

Chức năng của các nhóm Cytochrome P450 ở người

Các cytochrome P450 là nhóm những monooxygenase Trong các thể microsome ở gan, các enzyme này cũng tham gia vào con đường vận chuyển

điện tử phụ thuộc NADPH Nó oxy hoá các dạng hợp chất không liên quan về mặt cấu trúc như steroid, acid béo và các chất ngoại sinh

Các protein trong lớp CYP1 của P450 có thể hydroxyl hóa estrogen (CYP1A2 và CYP1B1) và oxy hóa uroporphyrinogen thành uroporphyrin (CYP1A2) dưới tác dụng của nhân hem, nhưng chúng có thể tương tác với một

số cơ chất nội sinh chưa xác định Các enzyme này có chức năng hoạt hóa các chất sinh ung thư và được cảm ứng bởi một số hydrocarbon đa vòng có trong khói thuốc lá hoặc thực phẩm cháy Nồng độ cao CYP1A2 có khả năng liên quan đến bệnh ung thư trực tràng Vì CYP1A2 được cảm ứng bởi khói thuốc lá nên có thể có mối liên quan giữa khói thuốc là và bệnh ung thư trực tràng

Gene CYP2B được cảm ứng bởi các thuốc an thần ở chuột Đây là protein P450 đầu tiên được tinh sạch từ động vật có vú nhưng chức năng của nó vẫn chưa

được xác định

Protein CYP2C8 có chức năng xúc tác quá trình 6-α-hydroxyl hóa taxol

Đây là một loại thuốc đang được sử dụng để chống ung thư

Protein CYP2C19 tham gia trao đổi omerprazole, một loại dược phẩm thường dùng để chữa các vết loét Tính đa hình của gene này gây ra triệu chứng kém chuyển hóa thuốc với tần số cao ở người châu á (23%) so với người da trắng (3-5%)

Tính đa hình của các gene P450 liên quan đến khả năng chuyển hóa dược phẩm

Trong quần thể người, các điểm nucleotide đa hình chiếm khoảng 1% genome Các điểm khác biệt này có thể dẫn đến những phản ứng khác nhau đối với thuốc, trong đó, gene mã hóa Cytochrome P450 là yếu tố quan trọng trong genome người Tính đa hình của gene CYP2C19 làm thay đổi khả năng chuyển hóa mephenytoin của enzyme ở người da trắng, tính đa hình của các kiểu hình kém chuyển hóa thuốc chỉ chiếm khoảng 3% trong khi người châu á chiếm tới 23%

CYP2D6 là protein P450 được nghiên cứu kỹ nhất về đa hình trao đổi thuốc Enzyme này tham gia vào quá trình oxy hóa hơn 70 loại dược phẩm khác nhau Những người kém chuyển hóa thuốc do không có khả năng loại bỏ các dược phẩm ra khỏi cơ thể nên có thể mắc một số triệu chứng phản ứng thuốc nguy hiểm Hiện nay, người ta đã xác định được ít nhất 72 allele khác nhau của gene CYP2D6

Các cơ chất của enzyme CYP2D6 bao gồm:

Antiarrhythmics: Flecainide, Mexiletine, Propafenone

Antidepressants: Amitriptyline, Paroxetine, Venlafaxine, Trazadone,

Fluoxetine (Prozac)

Antipsychotics: Clorpromazine, Haloperidol, Thoridazine

Beta-Blockers: Labetalol, Timolol, Propanolol, Pindolol, Metoprolol

Analgesics: Codeine, Fentanyl, Meperidine, Oxycodone, Propoxyphene

oxycodone thuộc nhóm oxycontin là loại thuốc thường được sử dụng để chống nghiện

Gene CYP2E1 được cảm ứng bởi các chất có nhóm alcohol Tính đa hình của gene này chủ yếu phổ biến ở người Trung Quốc Đột biến trên gene này có

thể tăng gấp đôi nguy cơ mắc ung thư niêm mạc mũi do khói thuốc lá Đây là nhóm enzyme P450 thứ hai liên quan đến khói thuốc lá

Phân lớp CYP3A là một trong các nhóm enzyme chuyển hóa thuốc quan trọng nhất ở người CYP3A4 là protein P450 được biểu hiện với cường độ cao nhất trong gan người và đã được chứng minh là có liên quan đến quá trình chuyển hoá hơn 120 loại dược phẩm khác nhau

Một số cơ chất của CYP3A4

Taxol (thuốc chữa ung thư)

Warfarin (chất chống đông máu)

CYP5 là các enzyme thromboxane A2 synthase Thromboxane A2 là một loại acid béo trong chu trình chuyển hóa arachidonic acid Arachidonic acid có thể được chuyển hóa theo 2 con đường: con đường thẳng để tạo ra các leukotriene và con đường vòng để tạo ra prostaglandins và thromboxanes Các enzyme đầu tiên của con đường vòng này là cyclooxygenase 1 và 2 Chúng bị ức chế bởi aspirin và các thuốc chống viêm không có bản chất là steroid Aspirin sẽ acetyl hóa Serine trong enzyme và làm ngăn cản quá trình liên kết với arachidonic acid Các nghiên cứu gần đây cho thấy COX2 được cảm ứng trong quá trình viêm COX1 là thành phần bổ sung Sự khác biệt này chứng tỏ chất ức chế đặc hiệu COX2 có thể ngăn cản quá trình viêm trong khi không ảnh hưởng

đến các chức năng của COX1 như duy trì sự gắn kết của các tế bào niêm mạc dạ dày Sau phản ứng đầu tiên này, sản phẩm được phân nhánh theo hai con đường tùy thuộc vào loại enzyme Cytochrome P450 Một nhánh sẽ tổng hợp thromboxane A2 nhờ sự tham gia của CYP5, nhánh kia sẽ tổng hợp prostacyclin

nhờ CYP8A1 Thromboxane A2 gây ra sự đông tiểu cầu và đó là nguyên nhân khiến aspirin ngăn quá trình đông máu Prostacyclin lại hoạt động theo hướng ngược lại Đây là một chất chống đông máu Quá trình acetyl hóa của COX1 và COX2 trong tiểu cầu cực kỳ quan trọng vì tiểu cầu không có nhân và không thể tái tạo lại các enzyme bị ức chế

2.4.3 Gene m∙ hóa CYP41A1/ Cytochrome P450

CYP1A1 là một enzyme AHH (Aryl Hydrocarbon Hydroxylase) có trong

quá trình chuyển hóa các hợp chất nội sinh và ngoại sinh như oxy hoá các

hydrocarbon đa vòng thơm (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - PAH) Enzyme

này là chuỗi polypeptide 1 thuộc phân lớp A, lớp 1 trong họ cytochrome P450

Hildebrand et al (1985b) sử dụng cDNA cytochrome P1-450 hoàn chỉnh

của người cảm ứng bởi TCDD để nghiên cứu DNA từ tế bào lai soma và đã định

vị gene này trên NST 15 Jaiswal cộng sự (1986) chỉ ra rằng gene mã hóa CYP1A1 người nằm trên NTST 15q22-q24 và gene P3-450 (CYP1A2) cũng nằm trên NST này Gene có 7 exon Hai gene CYP1A1 và CYP1A2 bị ngăn cách bởi

một đoạn trình tự khoảng 23 kb không chứa khung đọc mở (Corchero et al.,

2001)

Các enzyme CYP1 được tìm thấy ở động vật có vú (1A, 1B), cá ngựa (1A), cá mập, cá đuối (1A) Chúng chủ yếu chuyển hóa các cơ chất nội sinh Phân lớp CYP1A có năm protein là CYP1A1, 1A2, 1A3, 1A4 và 1A5 CYP1A1 và CYP1A2 được tìm thấy ở tất cả các lớp của giới động vật Các protein này có độ tương đồng cao giữa các loài động vật có vú (CYP1A1 của người và chuột giống nhau đến 80%) CYP1A1 và CYP1A2 có mối quan hệ rất gần gũi Các thành viên trong lớp CYP1 liên quan chặt chẽ tới sự hoạt hóa quá trình chuyển hóa các tiền chất gây ung thư và các đột biến Lớp CYP1 có vai trò trong việc hoạt hóa chất độc và các chức năng nội sinh quan trọng khác

Vị trí của enzyme CYP1A1: bám vào màng tế bào và nằm trong mạng lưới nội chất Enzyme này xuất hiện nhiều ở các mô phổi, tế bào lympho và nhau thai

Khoảng 10% người da trắng (Caucasians) có dạng enzyme CYP1A1 cảm ứng cao liên quan đến nguy cơ mắc bệnh ung thư phổi ở những người hút thuốc lá Mặc dù không phải tất cả các nghiên cứu đều đưa ra kết quả dương tính, nhưng trong quần thể người Nhật Bản và một vài người trong quần thể người da

trắng, nguy cơ ung thư phổi tăng cao có liên quan đến sự đa hình CYP1A1

(Kawajiri et al., 1996; Nakachi et al., 1991; Xu et al., 1996)

2.4.4 Gene m∙ hóa CYP1B1 – Mối quan hệ giữa AHR và CYP1A1, CYP1B1

Sutter và cộng sự (1994) đã đọc trình tự toàn bộ cDNA CYP1B1 CYP1B1

có 543 aa, mRNA dài 5,1 kb và nằm trên NST số 2 Phân tích lai Southern Blot cho biết gene này là đơn gene Tới năm 1996, nhóm tác giả này đã đọc toàn bộ trình tự gene CYP1B1 Gene này dài 12177 base, có 2 intron và 3 exon nằm trên NST số 2 tại 2p21-22 Exon 1, 2 và 3 có trình tự base lần lượt là: 3070-3414, 3805-4848 và 7881-11587 mRNA bao gồm 3 exon dài 5102 base Trong đó CYP1B1 cDNA dài 1632 base, gồm 2 phân đoạn nằm trên exon 2 và 3 có thứ tự base lần lượt là 3806-4848 và 7881-8469

Khu trú của enzyme CYP1B1

Năm 2001, Muskhelishvili và cộng sự đã sử dụng phương pháp lai in situ

và phân tích hóa mô miễn dịch (Immunohistochemical Analysis) để xác định vị

trí mRNA cũng như CYP1B1 trong tế bào của một loạt mô người Protein và mRNA CYP1B1 được biểu hiện hầu hết trong các nhu mô và tổ chức nền của não, thận, tuyến tiền liệt, vú, cổ tử cung, dạ con, buồng trứng và hạch lympho Trong phần lớn các mô, CYP1B1 được phát hiện thấy ở nhân tế bào Nhưng trong các tế bào ống thận và tế bào bài tiết của tuyến vú thì CYP1B1 có mặt cả ở nhân lẫn tế bào chất

Các biến thể CYP1B1 liên quan tới ung thư

Cho tới nay các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và tìm ra mối liên quan mật thiết giữa tính đa hình CYP1B1 và nguy cơ ung thư như ung thư tế

bào vảy ở cổ và đầu ở những người hút thuốc lá (Watanabe et al., 2000), ung thư

tế bào vú và vảy ở phổi (Tang et al., 2000), ung thư tuyến tiền liệt (Goodman et

al., 2001) và ung thư buồng trứng (ovarian carcinoma) (Plasilova et al., 1999;

Bejjani et al., 2000; Kakiuchi-Matsumoto et al., 2001), bệnh tăng nhãn áp bẩm sinh nguyên phát (Murray, 2000; Murray et al., 2001; Rochat et al., 2001)

Nhiều báo cáo khác cũng tìm thấy CYP1B1 được biểu hiện tăng cao trong nhiều loại tế bào ung thư

Ung thư vú

CYP1B1 tham gia vào quá trình đồng hóa một số tiền tố gây ung thư như benzo[a]pyrene và quá trình hydroxyl hóa 17 β-estradiol tại vị trí C-4 thành 4-hydroxyestradiol độc gene Enzyme này cũng liên quan tới quá trình hoạt hóa các hydrocarbon thơm đa vòng và các amine thơm dị vòng, các chất gây ung thư

vú trong động vật thí nghiệm CYP1B1 có tính đa hình di truyền, và các biến thể của gene CYP1B1 có khả năng liên quan tới nguy cơ ung thư vú

Điểm đa hình A119S (được giả thiết là vị trí nhận biết cơ chất số 1) có liên

quan mật thiết với nguy cơ ung thư vú (Zheng et al., 2000) Nhưng đa hình

L432V không cho thấy bất kỳ một mối liên quan nào tới ung thư Ngược lại, allele đồng thời chứa cả Alanine và Leucine, chiếm tới 75% allele trong 315 người Nhật Bản đối chứng khỏe mạnh, có liên quan mật thiết tới nguy cơ ung thư

vú Khi biểu hiện cDNA tái tổ hợp, biến thể CYP1B1 này có hoạt tính 17 estradiol 4-hydroxylase thấp nhất trong 4 dạng biến thể khác nhau của CYP1B1 Như vậy, sự khác biệt giữa các cá thể trong quá trình hoạt hóa các tiền tố gây ung thư hay chuyển hóa oestrogen xuất phát từ đa hình di truyền của gene CYP1B1 có thể góp phần vào tính mẫn cảm với ung thư ở người

β-Zheng và cộng sự (2000) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP để phân tích đa hình di truyền CYP1B1 V432L trên DNA NST của 186 bệnh nhân ung thư vú và 200 mẫu đối chứng được tiến hành tại Thượng Hải từ năm 1996 đến

1998 Tần số allele Leucine ở các bệnh nhân là 53% và ở đối chứng 46% So với kiểu gene Valine/Valine, phụ nữ mang kiểu gene Leucine/Leucine có nguy cơ ung thư vú cao hơn 2,3 lần sau khi loại trừ những biến thể chưa rõ ràng Mối tương quan dương tính này ở phụ nữ mãn kinh nhiều hơn ở phụ nữ tiền mãn kinh Nguy cơ ung thư vú tăng cao có liên quan tới đồng hợp tử allele Leucine

được quan sát thấy ở hầu hết những phụ nữ mang các yếu tố gây ung thư Các kết

quả nghiên cứu này phù hợp với những phát hiện gần đây qua các thí nghiệm in

vitro và trên động vật liên quan tới vai trò tiềm ẩn của CYP1B1 trong nghiên cứu

nguyên nhân bệnh ung thư vú

Lee và cộng sự (2003) đã tiến hành một nghiên cứu có đối chứng để đánh giá sự ảnh hưởng tiềm năng của tính đa hình CYP1B1 L432V tới nguy cơ ung thư vú ở nhiều người bệnh Hàn Quốc và đối chứng âm tính Kết quả cho thấy, tính đa hình L432V dường như không có vai trò

Ung thư tế bào vảy ở cổ và đầu

Ko và cộng sự (2001) đã công bố mối liên quan giữa tính đa hình CYP1B1 codon 432 với ung thư tế bào vảy ở cổ và đầu ở những người hút thuốc lá Báo cáo này cho hay ở những người không hút thuốc lá tính đa hình CYP1B1 codon 432 giảm hẳn

Ung thư tuyến tiền liệt

CYP1B1 đồng hóa các steroid hormone, trong đó có 17 β-oestradiol (E2)

và testosterone Tang và cộng sự (2000) công bố rằng có một sự khác biệt quan trọng về tần số allele của 2 đột biến điểm trong vùng mã hóa của gene CYP1B1

ở cộng đồng người da trắng (n = 189), người Mỹ gốc Phi (n = 52) và người Trung Quốc (Linxian) (n = 109) Đột biển điểm C1666G (L432V) ở exon 3 có mặt trong cộng đồng người Mỹ gốc Phi với tần số allele V432 là 0,75, người da trắng là 0,43 và người Trung Quốc là 0,17 Đột biến điểm C1719T (D449D) ở exon 3, xuất hiện có lẽ liên quan gần với biến thể V432 Sử dụng microsome phổi của các cá thể có kiểu hình 432V/V và 432L/L cho thấy rằng biến thể V432

có thể là một allele hoạt tính cao và như vậy có thể góp phần vào sự khác biệt giữa các cá thể trong hoạt tính CYP1B1 Do CYP1B1 tham gia vào quá trình

đồng hóa hormone và chất gây ung thư, và cho tỷ lệ ung thư tuyến tiền liệt khác nhau ở các nhóm sắc tộc, các tác giả đã đánh giá được mối liên quan giữa đa hình L432V với nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt trong những nghiên cứu đối chứng Trong số người da trắng, 34% đàn ông ung thư (n = 50) đồng hợp tử đa hình V432, trong khi đó chỉ có 12% nhóm đối chứng (n = 50) có kiểu gene này Những số liệu ban đầu này cho thấy đa hình di truyền CYP1B1 có một vai trò quan trọng trong quá trình ung thư tuyến tiền liệt

Để kiểm chứng giả thuyết rằng đa hình di truyền gene CYP1B1 có thể liên quan tới nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt (CaP), tần số allele, kiểu gene và đơn bội thể của 13 SNP của CYP1B1 ở 159 bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt di truyền

(HPC hereditary prostate cancer), 245 trường hợp CaP đơn lẻ, và 222 đàn ông không bị được so sánh với nhau (Chang et al., 2003) Khi phân tích riêng từng

SNP, quan sát thấy sự khác biệt nhỏ có ý nghĩa của tần số allele giữa các trường hợp đơn lẻ và đối chứng đối với ba điểm SNP bảo thủ (-C1001T, -G263A, và -C13T, P = 0,04-0,07) Tương tự, quan sát thấy sự khác biệt nhỏ có ý nghĩa giữa các trường hợp đơn lẻ và đối chứng về tần số người mang allele khác nhau đối

với 5 SNP bảo thủ (-C1001T, -G263A, -C13T, +C142G, và +G355T, P = 0,08) Một điều thú vị là khi phân tích tổ hợp của 5 SNP này bằng đơn bội thể, tìm thấy một sự khác biệt lớn (P = 0,009) Đơn bội thể thường gặp (CGCCG của -C1001T, -G263A, -C13T, +C142G, và +G355T) gắn với nguy cơ tăng đối với CaP, trong khi đó đơn bội thể thường gặp (TATGT) liên quan tới nguy cơ giảm

0,02-đối với CaP Những phát hiện này gợi ý rằng đa hình di truyền CYP1B1 có thể

điều chỉnh nguy cơ đối với CaP

Ung thư buồng trứng

Goodman và cộng sự (2001) cũng chỉ ra rằng hoạt tính allele V432 cao của gene CYP1B1 tạo ra 4-hydroxylated catechol estrogen có liên quan tới ung thư buồng trứng Chất đồng hóa estradiol bởi CYP1B1 có sự chú ý đặc biệt do

vai trò gây ung thư nội mạc tử cung (Endometrial Cancer) Tính đa hình gene

CYP1B1 có thể báo trước nguy cơ ung thư nội mạc tử cung cao Để kiểm tra giả thuyết này, Sasaki và cộng sự (2003) đã nghiên cứu sự phân bố di truyền của 6

đa hình gene CYP1B1 khác nhau ở 113 bệnh nhân người Nhật bị ung thư nội mạc tử cung và 202 đối chứng khỏe mạnh Tác giả cũng nghiên cứu mức độ biểu

hiện của các gene thụ thể estrogen (estrogen receptors - ERα và ERβ), thụ thể

progesterone, và thụ thể androgen bị ảnh hưởng bởi kiểu gene CYP1B1 ở ung thư nội mạc tử cung Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự phân bố kiểu gene CYP1B1 tại codon 119 và 432 khác nhau đáng kể giữa bệnh nhân ung thư nội mạc tử cung và

đối chứng khỏe mạnh Nguy cơ tương đối của 119T/T và 432G/G trong ung thư nội mạc tử cung được tính là 3,32 và 2,49 so với dạng nguyên thủy 119T/T chỉ

ra mối liên hệ dương tính với ERα và ERβ 432G/G cũng chỉ ra mối liên hệ yếu

đối với dương tính ERα Tại các locus khác, intron 1, codon 48, và codon 449 không khác giữa bệnh nhân ung thư nội mạc tử cung và đối chứng khỏe mạnh

Đây là công bố đầu tiên chứng minh các đa hình hiếm tại codon 119 và 432 của gene CYP1B1 có nguy cơ cao về ung thư nội mạc tử cung và mối liên hệ dương tính với mức độ biểu hiện ERα và ERβ trong ung thư nội mạc tử cung Hoạt tính

đồng hóa estradiol là yếu tố then chốt trong ung thư nội mạc tử cung Chất chuyển hóa CYP1B1, 4-hydroxy estrogen, nhận được sự chú ý đặc biệt do vai trò gây bệnh chuyển ác tính nhiều cơ quan khác nhau trong đó có nội mạc tử cung CYP1B1 chỉ biểu hiện cao nhất trong nội mạc tử cung 4-hydroxy estrogen có thể gắn với DNA nhờ các chất đồng hóa quinone gây hư hại oxy hóa trong ung

thư nội mạc tử cung Ngoài ra, 4-hydroxy estrogen liên kết với thụ thể estrogen

và có những tác dụng estrogenic lên mô đích Sáu đa hình gene CYP1B1 được mô tả, trong đó 4 đa hình cho kết quả thay thế aa: C13T, C48G, G119T, C432G, T449C và A453G Các đa hình trên exon 2 và 3 có những ảnh hưởng quan trọng tới chức năng xúc tác của CYP1B1 Đa hình các vùng đặc biệt của gene CYP1B1 cho kết quả hoạt hóa thái quá của protein và có thể dẫn đến một sự mẫn cảm cao hơn với nguy cơ của các loại ung thư khác nhau Vì vậy, những thay đổi di truyền trong hoạt tính hydroxy hóa của CYP1B1 có thể liên quan tới những thay

đổi quan trọng trong sự đồng hóa estrogen và vì thế có thể lý giải những khác biệt giữa các cá thể trong nguy cơ ung thư nội mạc tử cung liên quan tới hình thành ung thư do estrogen

Bệnh tăng nh∙n áp bẩm sinh nguyên phát

Gene CYP1B1 đã được phát hiện là liên quan đến bệnh tăng nhãn áp bẩm

sinh nguyên phát (Primary congenital glaucoma PCG) (Stoilov et al., 1998; Bejjani et al., 2000; Plasilova et al., 1999) Cơ chất thông thường của enzyme

này hiện chưa xác định nhưng người ta cho rằng loại P450 này có thể đóng vai trò nhất định trong việc loại bỏ các phân tử truyền tin Khi thiếu hụt gene CYP1B1, cơ thể sẽ bị duy trì nồng độ cao các phân tử tín hiệu để dẫn đến bệnh tăng nhãn áp Phân tử tín hiệu có thể có bản chất là steroid

Bệnh tăng nhãn áp bẩm sinh nguyên phát là một bệnh về mắt, di truyền lặn thường xảy ra với tần số cao bất thường trong cộng đồng người Rom (Gypsie) ở Slovakia Plasilova và cộng sự (1999) đã tìm thấy mối liên quan giữa bệnh với locus GLC3A trên 2p21 Tại locus này, các đột biến của gene CYP1B1

được xác định là một yếu tố gây ra bệnh đó Tác giả thông báo kết quả sàng lọc

đột biến CYP1B1 của 43 bệnh nhân PCG từ 26 gia đình Slovak Rom Một đồng hợp tử đột biến G→A tại nucleotide 1505 trong vùng bảo thủ cao của exon 3

được phát hiện trong tất cả các gia đình Đột biến này cho kết quả thay thế E387K, mà nó có ảnh hưởng tới vùng helix K bảo thủ của phân tử Cytochrome P450 Việc xác định cơ sở đa hình CYP1B1 chỉ ra một đơn bội thể DNA thông thường trong tất cả các bệnh nhân, vì thế cho thấy đột biến E387K trong cộng

đồng Rom bắt nguồn từ một trường hợp đột biến tổ tiên duy nhất Cộng đồng Slovak Rom đại diện cho cộng đồng đầu tiên trong đó bệnh được tìm ra là kết quả của một đột biến duy nhất trong gene CYP1B1 Mối liên quan tìm thấy là lý

giải hợp lý nhất về tỷ lệ mắc bệnh rất cao Để phát hiện nhanh đột biến này họ đã

phát triển phương pháp ARMS – PCR (PCR-based Amplification Refractory

Mutation System) Nó cho phép phát hiện trực tiếp DNA, có thể chẩn đoán trước

sinh cũng như cá thể mang gene trong cộng đồng đặc biệt này Sau khi sàng lọc

158 người Rom khỏe mạnh, 17 người mang đột biến này (10,8%) đã được xác

định Điều đó cho thấy tần số PCG trong cộng đồng có thể còn cao hơn như đã xác định

Kakiuchi-Matsumoto và cộng sự (2001) cũng tìm thấy mối liên quan giữa bệnh tăng nhãn áp và đột biến gene CYP1B1 ở cộng đồng người Nhật, thí dụ thêm Guanine vào điểm 1620, hay thay thế Arginine 444 bằng Glutamine Năm

2003, Ohtake lại tiến hành một nghiên cứu khác về mối liên quan giữa đột biến

CYP1B1 và bệnh PCG (Ohtake et al., 2003; Reddy et al., 2003) 66 bệnh nhân

PCG người Nhật được sàng lọc đột biến trình tự trên gene CYP1B1 bằng phương pháp SSCP sau đó tiến hành đọc trình tự DNA 11 bệnh nhân có đột biến CYP1B1 trên cả hai allele (nhóm đột biến) và 21 bệnh nhân không có đột biến CYP1B1 (nhóm không đột biến) Các đặc tính cận lâm sàng như thời gian phát bệnh, giới tính, huyết áp và hiện tượng vỡ màng Descemet của hai nhóm bệnh

được so sánh với nhau và cho thấy không có sự khác nhau Tóm lại, trong các bệnh nhân PCG được chẩn đoán theo cận lâm sàng, thì một nhóm có đột biến gene CYP1B1 và nhóm này có thời gian phát bệnh sớm hơn các bệnh nhân không có đột biến

Để nghiên cứu đột biến trội gene CYP1B1 ở những người ấn Độ mang bệnh PCG, người ta sử dụng phương pháp PCR - đa hình chiều dài đoạn cắt hạn

chế (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) và để xác định sự

hỏng gene ở hai thế hệ của một gia đình bị bệnh Mẫu DNA của 146 bệnh nhân PCG từ 138 phả hệ được phân tích một vài điểm đột biến khác nhau của CYP1B1 bằng PCR - RFLP Kết quả sàng lọc PCR - RFLP cho thấy 30,8% bệnh nhân dương tính với một trong 6 điểm đột biến (376+A, G528A, C923T, G959A, G1449A, và C1514A), và 17,8% bệnh nhân có điểm đột biến hiếm R368H (G1449A) Tất cả các điểm đột biến đều được xác định lại bằng đọc trình tự DNA Kết quả này gợi ý sự dị hợp tử allele rộng trong bệnh nhân PCG ấn Độ, với allele trội R368H trong số 146 bệnh nhân ấn Độ được khảo sát Có thể áp dụng phương pháp này để phát hiện mầm bệnh trong các phả hệ mang bệnh PCG

và sàng lọc trong cộng đồng Đây là một phương pháp sàng lọc nhanh mầm bệnh

và các cá thể bị ảnh hưởng

Colomb và cộng sự (2003) đã nghiên cứu đột biến CYP1B1 ở 31 bệnh nhân PCG người Pháp không họ hàng Đột biến được tìm thấy ở 15 (48%) bệnh nhân Sáu trong số đó là đột biến mới Một đột biến 3979-A, gây ra dịch chuyển khung đọc bởi một stop codon ở vị trí aa 59 Hai đột biến, C4547T (Q248X) và C8167T (R444X), tạo ra một stop codon Ba đột biến khác, G4499C (G232R), T8033G (I399S), (N423Y), gây ra sự thay đổi aa quan trọng Bảy bệnh nhân, có nguồn gốc Pháp, là dị hợp tử Sáu bệnh nhân, xuất thân từ Bắc Phi và Bồ Đào Nha, mang đột biến đồng hợp tử, phản ánh nguồn gốc địa lý của họ Một điều thú vị là đột biến E229K, có mặt ở dạng dị hợp tử trong hai bệnh nhân không họ hàng gì với nhau Tóm lại, những điều tìm thấy minh chứng cho vai trò và tính

đa hình của các điểm đột biến CYP1B1 ở những bệnh nhân PCG người Pháp

Nghiên cứu mức độ biểu hiện CYP1B1 trong tế bào

Để nghiên cứu mức độ biểu hiện của gene CYP1B1, cần một phương pháp

định lượng thật chắc chắn, chính xác và đặc hiệu Người ta xử lý tế bào ung thư

vú MCF-7 của người với β-naphthoflavone (BNF; 50 àM), emodin (0,1-3 àM), trans-resveratrol (2,5-20 àM), hoặc 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) Sau đó, tách toàn bộ RNA tế bào và tiến hành phiên mã ngược Định lượng cDNA bằng phương pháp huỳnh quang và khuếch đại một hàm lượng nhất định (1 ng) trong máy chu trình nhiệt real-time DNA (LightCycler) Phân tích đường cong nhiệt

độ nóng chảy và điện di trên gel agarose các phân đoạn nhân lên cho kết quả lần lượt là một đỉnh duy nhất và một băng duy nhất Sản phẩm PCR được xác định chính là CYP1B1 qua đọc trình tự gene Real-time PCR là một phương pháp định lượng bảo đảm, chính xác, đặc hiệu và làm lại được để đo mức độ biểu hiện gene CYP1B1 trong tế bào ung thư vú MCF-7

Họ enzyme Cytochrome P450 liên quan tới pha I của sự chuyển hóa nhiều hợp chất Mặc dù một thành viên trong họ là CYP1B1 có tham gia vào việc khử

độc, nhưng sự biểu hiện quá mức của enzyme này cũng liên quan tới ung thư biểu mô ở người Bởi vậy, CYP1B1 được giả thiết là một đích mới để phát triển

các liệu pháp chống ung thư (Gibson et al., 2003) Nhóm tác giả này tiến hành

nghiên cứu mức độ biểu hiện của CYP1B1 trong 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng và so sánh với 14 mẫu mô ruột già bình thường của những bệnh nhân đang

điều trị u ruột già Mặc dù họ khẳng định rằng CYP1B1 biểu hiện ở mức cao trong ung thư biểu mô đại trực tràng nhưng họ cũng thấy CYP1B1 có mặt ở biểu mô đại trực tràng bình thường nhưng ở mức độ thấp Theo nghiên cứu này, mức

độ biểu hiện của CYP1B1 trong ung thư đại tràng không liên hệ với bước phát triển ung thư hoặc cường độ xâm lấn hạch bạch huyết Hơn nữa, ngoài sự biểu hiện ở biểu mô đại tràng, CYP1B1 còn được quan sát thấy trong mạch máu ở đại tràng Giống như với biểu mô, mức độ CYP1B1 trong mạch máu của các khối u cao hơn trong đại tràng bình thường Mặc dù những quan sát này hỗ trợ việc phát triển các trị liệu chống ung thư đích CYP1B1 nhưng chúng cũng chỉ ra sự lưu ý cần phải quan sát khi phát triển những thuốc như vậy

Các enzyme CYP hoạt hóa tiền tố gây ung thư như CYP1B1, CYP1A1 và CYP1A2 có vai trò quan trọng trong sự hình thành quá trình ung thư Tuy nhiên,

số liệu rất trái ngược nhau về mức biểu hiện CYP1B1 trong gan Mức độ biểu hiện mRNA và protein CYP1B1 được xác định trong mẫu gan của 12 cá thể (7 không hút thuốc, 4 hút thuốc, và một người đã bỏ thuốc) và so sánh với mức độ

của CYP1A1 và CYP1A2 (Carnell et al., 2004) Bằng phân tích real-time PCR,

mRNA CYP1B1 có mặt trong tất cả các mẫu và mức khác nhau giữa các cá thể

là 16 lần Mức biểu hiện trung bình ở nhóm hút thuốc lớn hơn 5 lần ở nhóm không hút thuốc (121±46 so với 26±5 phân tử/ng DNA sợi kép, p < 0,05) Khi so sánh, mRNA CYP1A1 được phát hiện ở 4 trong 7 người không hút thuốc, 3 trong 4 người hút thuốc, và 1 người đã bỏ thuốc, trong khi đó mRNA CYP1A2

được phát hiện thấy ở 5 người không hút, 4 người hút và 1 người đã bỏ thuốc Mức độ biểu hiện trung bình của mRNA CYP1A1 và CYP1A2 ở nhóm hút thuốc lần lượt lớn hơn 4 lần và 9 lần so với nhóm không hút thuốc, những sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Sự khác biệt mức biểu hiện mRNA CYP1A1 và CYP1A2 giữa các cá thể lần lượt là 26 lần và 500 lần Phân tích lai thấm miễn dịch sử dụng các kháng thể và với số mẫu lớn hơn (n = 27) của microsome gan cho thấy CYP1A1 và CYP1B1 không được phát hiện, trong khi đó CYP1A2

được phát hiện trong các mẫu và có thể định lượng ở 24 trong 27 mẫu Tóm lại, những kết quả này trên chỉ ra rằng mRNA CYP1B1 được biểu hiện trong gan và mức biểu hiện tăng cao ở nhóm hút thuốc nhưng không phát hiện ra protein

Với mục đích nghiên cứu khu trú và phân bố của CYP1B1, mức độ biểu hiện protein được nghiên cứu ở bệnh nhân được chẩn đoán bị ung thư tuyến tiền liệt so với ung thư bàng quang và xác định CYP1B1 như một đích phân tử nhằm

phát triển các phương pháp trị liệu ung thư chọn lọc kết hợp với chiếu tia, Carnell

và cộng sự (2004) đã sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho enzyme để phân tích hóa mô 33 mẫu tuyến tiền liệt với độ Gleason nhẹ (3 + 3 và 3 + 4) để xem mức độ biểu hiện CYP1B1 Đánh giá bán định lượng cường độ nhuộm màu của CYP1B1 qua quan sát mắt thường, định lượng bằng kính hiển vi ảnh phổ sử dụng

độ chênh lệch quang phổ và so sánh với ung thư bàng quang (n = 22) cho thấy CYP1B1 có mặt ở 75% ung thư tuyến tiền liệt (n = 27) so với 100% ung thư boàng quang (n = 22) Trong những trường hợp này, CYP1B1 là dị hợp tử và khu trú ở trong bào tương của tế bào ung thư nhưng vắng mặt trong mô stroma xung quanh CYP1B1 cũng được phát hiện ở tiền ung thư nội mô tuyến tiền liệt

(premalignant prostatic intraepithelial neoplasia) (n = 2, 100%), và các mô không ung thư, bao gồm quá sản tuyến tiền liệt lành tính (benign prostatic

hyperplasia) (n = 27, 82%), dị sản biểu mô tiết niệu tuyến tiền liệt (metaplastic prostatic urothelium) (n = 8, 100%) và quá sản biểu mô tiết niệu lành tính

(hyperplastic prostatic urothelium) (n = 14, 100%) Mức biểu hiện CYP1B1 ở

ung thư bàng quang cao hơn so với ung thư tuyến tiền liệt được khẳng định nhờ vào độ hấp phụ thông thường trung bình tương ứng Độ nhuộm CYP1B1 trong ung thư tuyến tiền liệt tương tự với độ nhuộm ung thư nội biểu bì tuyến tiền liệt,

u lành tuyến tiền liệt, và các mô thận dị sản và quá sản (hyper-/metaplastic

urothelial tissue) CYP1B1 không được phát hiện trong mô tuyến tiền liệt

thường Tóm lại, CYP1B1 biểu hiện trong ung thư tuyến tiền liệt với tần số cao

và có thể được phát hiện trong mô quá sản và tiền ác tính, cho thấy một mối liên quan giữa quá trình ác tính và CYP1B1 và đích thích hợp cho trị liệu

Mối quan hệ giữa AHR và CYP1A1, CYP1B1

Trước đây, khi kích thích dòng keratinocyte với dioxin người ta thấy hàm lượng mRNA của CYP1B1 tăng lên 50 lần tức là tăng sinh tổng hợp CYP1B1 Hàm lượng CYP1B1 cao trong cơ thể người có liên quan chặt chẽ tới quá trình hình thành ung thư đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh Trong những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu quan trọng công bố cho thấy mối tương quan mật thiết giữa cảm ứng dioxin với hàm lượng mRNA CYP1B1

và AHR trong các loại tế bào ung thư và tế bào người thường

Các thành viên trong họ protein CYP1 được cảm ứng bởi các hydrocarbon

có vòng thơm Sự hoạt hóa này liên quan đến AHR Protein thụ thể này liên kết