Nghiên cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam

Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhânlên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dànggiữa người với người và gia tă

NGUYỄN MẠNH KIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐƯƠNG NHIỄM

TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS LÊ THANH HÒA

2 PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG

HÀ NỘI – 2014

sắc tới các Thầy (Cô):

- PGS.TS Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,

- PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung – Trường Đại học Y Hà Nội,

đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trìnhhọc tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này

- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án,cùng các nhà khoa học trong cả nước, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoànthiện luận án của mình

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình,tôi nhận được sự giúp đỡ quí báu của Nhà trường, đơn vị công tác, tập thể, các nhàkhoa học, gia đình và bè bạn Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quátrình học tập và nghiên cứu tại trường

- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sauđại học, Trung tâm Gen và Protein – Trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Miễn dịchhọc – Viện Công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện giúp đỡ chỉ bảo tôi trong suốt quátrình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án

- Cơ quan thú y các vùng trong cả nước hết lòng ủng hộ, cung cấp mẫu bệnhphẩm và thông tin dịch bệnh giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

- Ban chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam và Thái

Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc-xin phòng chống”, trong khuôn khổ Nhiệm

vụ “Nghị định thư hợp tác nghiên cứu với Thái Lan”, đã giúp đỡ hỗ trợ tôi kinh phíthực hiện đề tài nghiên cứu của mình

- Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân, đã hỗ trợ động viêntôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày …tháng 8 năm 2014

NGHIÊN CỨU SINH

Nguyễn Mạnh Kiên

LỜI CAM ĐOAN

A/H5N1 ở Việt Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vắc - xin phòng chống” Phần kết quả trong đề tài luận án này là thành quả nghiên cứu của tập thể

mà tôi là một thành viên chính Tôi đã được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài và toàn

bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu, cho phép sử dụng phần số liệu trên vàotrong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực Mộtphần số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án đã được công bố trên các Tạp chíkhoa học chuyên ngành, với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần cònlại chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày ….tháng 08 năm 2014

TÁC GIẢ

Nguyễn Mạnh Kiên

MỤC LỤC

TrangTrang phụ bìa Lời cảm ơn

Lời cam đoan

1.1.3 Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 51.1.4 Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 71.1.5 Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 121.1.6 Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 141.2 ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ

1.2.1 Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử 161.2.2 Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch

1 3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22

1.4 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC

LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 33

2.1.3 Các bộ kit sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu 36

2.1.5 Các hóa chất sử dụng trong điện di trên gel agarose 36

2.2.1 Kỹ thuật tách chiết ribonucleic acid tổng số 382.2.2 Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu 38

2.2.5 Kỹ thuật điện di nucleic acid trên gel agarose 45

2.2.7 Giải trình tự DNA 482.2.8 Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen

3.1 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 533.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số và chuyển đổi cDNA hệ gen virus 533.1.2 Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA 543.1.3 Kết quả giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA 603.2 KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

3.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 613.2.1.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 613.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 653.2.2 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 673.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 673.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 693.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 693.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 733.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 733.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 733.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA 773.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ

PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 793.3.1 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 793.3.2 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 823.3.3 Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85

4.1 VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN

4.1.1 Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 884.1.2 Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 884.2 VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO

ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

4.2.1 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 894.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 934.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 934.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 944.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 964.2.3 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 974.3 VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1,

CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC

CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 994.3.1 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 994.3.2 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 1024.3.3 Về kết quả xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 1034.4 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI PHỨC HỢP ENZYM POLYMERASE, TỔ HỢP

CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM

4.3.1 Về đặc điểm biến đổi phức hợp enzym polymerase liên quan bệnh học vàdịch tễ học lây truyền sang người của virus cúm A/H5N1 1054.3.2 Về nguồn gốc tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA polymerase 108

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

OIE Office International des Epizooties

RT-PCR Reverse transcription - polymerase chain reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các

1.2 Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở người 171.3 Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus

cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở người 191.4 Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay 231.5 Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến

độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người 292.1 Danh sách 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng trong nghiên cứu 332.2 Danh sách 19 chủng virus cúm A/H5N1 đại diện sử dụng trong so sánh

2.3 Danh sách 31 chủng virus cúm A/H5N1 bổ sung xây dựng cây phả hệ

2.4 Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu 392.5 Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm

2.6 Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến

2.7 Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến chủng virus

2.8 Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1

và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 442.9 Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA

từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 442.10 Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid

Bảng Tên bảng Trang

3.3 Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 của

3.4 Các vị trí sai khác nucleotide trong trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi

amino acid trong protein PB1 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 683.5 Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 của

3.6 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PB1-F2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 713.7 Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự

gen PA của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 753.8 Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự gen PA của 25 chủng virus

3.9 Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PA của 25

4.1 Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase,

liên quan độc lực gây bệnh, lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người 1064.2 Nguồn gốc tiến hóa xác định theo genotype của các gen PB2, PB1 và PA

polymerase, trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và

các chủng virus tham chiếu phân lập từ năm 2003 đến nay 109

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình/

1.1 Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A 4

1.3 Sơ đồ sắp sếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các

ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A 91.4 Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA 121.5 Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi

1.6 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 131.7 Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ gen

2.2 Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giải

trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 41

2.4 Sơ đồ cấu trúc của vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen) 473.1 Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1

của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 533.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm

3.3 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm

3.4 Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm

3.5 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 57

3.6 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 583.7 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6

biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 59

3.8 Các vị trí thay đổi amino acid trong trình tự protein PB1-F2 của 25

3.9 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

3.10 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

3.11 Cây phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cúm A/H5N1 dựa trên trình tự

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm nhiều phân type (subtype) lưu

hành ở chim hoang dã, có khả năng biến đổi xâm nhiễm, lây truyền sang người vànhiều loài động vật, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử

Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, gồm 8 phânđoạn RNA riêng biệt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS, lần lượt mã hóatổng hợp 12 protein tương ứng được biết cho đến nay, đó là PB2, PB1, PB1-N40,PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 Các protein trên tham gia cấu tạohạt virus và đảm bảo các chức năng xâm nhiễm, độc lực và thích nghi lây truyềngây bệnh của virus ở các loài vật chủ Đặc biệt, phức hợp enzym polymerase củavirus cúm A không có cơ chế “đọc-sửa” bản sao trong quá trình sao chép, tổng hợpcác phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới Đặc tính cấu trúc hệ gen và enzympolymerase giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao, hình thành chủng virus mớithay đổi độc lực hoặc chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền sang nhiều loài vật chủ

và người trong quá trình lưu hành tự nhiên Trong đó, các gen PB2, PB1 và PA mãhóa tổng hợp 3 protein PB2, PB1 và PA polymerase, là các đơn vị cấu tạo phức hợpenzym polymerase, có vai trò quyết định khả năng thích nghi nhân lên và lây truyềncủa virus ở cơ thể các loài vật chủ Ngoài ra, gen PB1 còn chứa 2 khung đọc mởgen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tương ứng, tham gia biểuhiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây radịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở người (khoảng 60%), lantruyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới Trong đó, Việt Nam là quốc gia códịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiềuđợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phương, với hơn 62 người tử vong trongtổng số hơn 124 người được xác định nhiễm loại virus này Các trường hợp ngườinhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xác định là do virus xâm nhiễm trựctiếp sang người thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sửdụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh Việt Nam cùng với Indonesia và HyLạp, là các quốc gia có tỉ lệ người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất

trên thế giới, được xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngănchặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang người

Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánhclade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lưu hành phổ biến gây dịch cúmA/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ởngười, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay Gần đây,nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.3.2.1 hình thành từ năm

2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và ngườinhiễm so với các nhóm virus lưu hành trước đó, làm cho vấn đề phòng chống dịchcho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở người trở nên phức tạp hơn

Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhânlên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dànggiữa người với người và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể người, một trong cácvấn đề được quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ởgia cầm và người hiện nay Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và

PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đương nhiễm, là cơ sở khoahọc cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứuphát triển vaccine tái tổ hợp và sử dụng vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1cho người và gia cầm trong tương lai

Xuất phát từ cơ sở lí luận và thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu sự biến đổi di truyền các gen PB2, PB1 và PA polymerase của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam”

Nhằm các mục tiêu:

1- Giải trình tự, so sánh biến đổi đặc tính di truyền, tương đồng về nucleotide

và amino acid các gen PB2, PB1, PA, của một số biến chủng virus cúm A/H5N1 đương nhiễm tại Việt Nam từ năm 2007 – 2011 với các chủng A/H5N1 trên thế giới 2- Tìm hiểu nguồn gốc phả hệ các gen nói trên của các biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu với các chủng virus A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A

Virus cúm A (influenza A virus) là nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ

Mononegavirales, còn gọi là virus cúm chim (avian influenza virus, AIV) hay virus cúm giacầm Vị trí phân loại của virus cúm A trong hệ thống phân loại cơ sở (Basic Taxonomy) là:

Viruses; ssRNA negative-stranded viruses; Orthomyxoviridae; Influenzavirus A [1], [2], [3].

Nhóm virus cúm A gồm nhiều phân type (subtype), biểu hiện đặc tính khángnguyên của hai protein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) gắn trên bềmặt vỏ capsid hạt virus, cho đáp ứng kháng thể khác nhau của cơ thể nhiễm với mỗikháng nguyên này giữa các phân type virus Cho đến nay, đã phát hiện có 16 phântype HA (kí hiệu từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) của virus cúm

A lưu hành ở chim hoang dã Sự tổ hợp của các phân type HA và NA, có thể dẫnđến sự hình thành hơn 144 phân type virus cúm A khác nhau lưu hành trong tựnhiên Trong đó, 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2, đã có sựbiến đổi hình thành các chủng virus thích nghi lây truyền dễ dàng trong quần thểgây ra các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử [1], [2], [3], [4], [5], [6]

Đặc trưng virus cúm A là kí sinh nội bào bắt buộc, cấu tạo hạt virus đơn giảnvới hệ gen là phân tử RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt có khả năng

tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerasecủa virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chếđọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lâytruyền và lưu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6]

1.1.1 Cấu tạo chung của virus cúm A

Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đadiện đôi khi có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lượng phân

tử khoảng 250 triệu dalton (Da) Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồmhàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer

+ Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tếbào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong đượclót bởi một lớp màng đệm là protein M1

- Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA,

NA và M2, được gắn như những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus

Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gaimấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đường kính khoảng 4 – 6 nm Tỉ lệ phân bốkhoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1.1A) [1], [7]

Hình 1.1 Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8])

Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử 4.000.000X.

- Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trongquá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là haikháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ

sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3]

- Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-singlestranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏcapsid của hạt virus [1], [2], [7].

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A

Virus cúm A có cấu trúc hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA có khả năng tự saochép độc lập, giúp cho virus dễ dàng nhân lên và tổng hợp các thành phần của hạtvirus mới ở tế bào cảm thụ trong cơ thể vật chủ [1], [2], [9]

- Các phân đoạn RNA trong hệ gen của virus cúm A tồn tại ở dạng cấu trúcRNP (ribonucleoprotein) có tổng độ dài từ 10.000 đến 15.000 base pair (bp), chứa

khoảng 13.500 bp thông tin di truyền tùy theo chủng virus Hai đầu 5’- và 3’- củamỗi phân đoạn RNA có chứa các trình tự không mã hóa (untranslation region), gồm

12 – 15 nucleotide 5’-AGUAGAACAAGG và 3’-UCG(U/C)UUUCGUCC, có tínhbảo tồn cao giữa các phân type virus cúm A

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A (xem [8]) Ghi chú: (A): Sơ đồ các phân đoạn PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệ gen của virus cúm A.

(B): Mô hình cấu trúc một phân đoạn RNP của virus cúm A.

- Mỗi phân đoạn RNA sợi đơn âm trong hệ gen của virus cúm A được bao bọcbởi các phân tử nucleoprotein (NP) tạo thành phân đoạn RNP tương ứng, có cấutrúc xoắn đối xứng (α helix) dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm Các phân tử

NP liên kết với nhau qua cầu nối peptide và tạo thành vòm (loop) ở giới hạn cuốimỗi phân đoạn RNP, đầu tận cùng 3’- và 5’- gắn với phức hợp enzym polymerase,gồm 3 protein dưới đơn vị PB2, PB1 và PA polymerase, tạo thành một phức hệ tựsao chép độc lập trong quá trình nhân lên của virus ở tế bào nhiễm (Hình 1.2B) Các phân đoạn RNP cũng được nối với nhau bởi liên kết peptide ở cuối mỗiphân đoạn, tạo nên hệ gen 1 sợi duy nhất của virus cúm A và được đặt tên theo sốthứ tự từ 1 đến 8, hoặc protein mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M

và NS, ứng với độ dài phân tử giảm dần (Hình 1.2B)

1.1.3 Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A

Tám phân đoạn RNA gồm PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS trong hệgen virus cúm A, lần lượt mã hóa tổng hợp 10 đến 12 protein là PB2, PB1 và/hoặcPB1-N40 và PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1 và M2, NS1 và NS2 tùy theo chủngvirus

Bảng 1.1 Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các

protein của virus cúm A [10]

Gene Độ dài

(bp)

Protein virus

Độ dài (aa) Chức năng của các protein virus

PB2 2.280 PB2 759 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liênquan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.

PB1 2.274

PB1 757 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liênquan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.

PB1-F2 87 - 90 - Chỉ có ở một số chủng virus Gây apoptosis tế bàochủ, liên quan độc lực gây bệnh của virus.

PB1-N40 717 - Chưa rõ chức năng, ảnh hưởng đến chu kì nhânlên của virus ở tế bào nuôi cấy.

PA 2.151 PA 716 - Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase Liên

quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus

- Thành phần cấu tạo phức hệ RNP, liên quan đếnđộc lực, khả năng nhân lên và thích nghi vật chủcủa virus cúm A Kháng nguyên nhân phân biệt cácnhóm virus cúm A, B, C và Thogovirus

- Vận chuyển các RNP, tham gia quá trình bao gói

và nảy chồi của virus Liên quan đến tốc độ nhânlên của virus ở tế bào cảm thụ

- Kênh ion H+ nội màng, tham gia hòa màng và quátrình nảy chồi của virus Liên quan tốc độ xâmnhiễm, nhân lên và kháng Rimantadin của virus

NS2

- Vận chuyển các RNP của virus từ nhân ra bàotương tế bào nhiễm Liên quan đến tốc độ nhân lêncủa virus ở tế bào cảm thụ

Ghi chú: PB2: polymerase basic protein 2; PB1: polymerase basic protein 1; PA: polymerase acidic protein;

PB1-F2: polymerase basic protein 1–frame 2; PB1-N40: polymerase basic protein 1–none 40 amino acid; HA: hemagglutinin; NA: neuraminidase; M: matrix; M1: matrix protein 1; M2: matrix protein 2; NP: nucleoprotein; NS: non structural protein; NS1: non structural protein 1; NS2: non structural protein 2; NEP: nuclear export protein.

- Hai protein PB1-N40 và PB1-F2 được mã hóa tổng hợp từ 02 khung đọc mở(open reading frame, ORF) lồng trong khung đọc của gen PB1

- Bốn protein M1 và M2 cùng với NS1 và NS2 lần lượt được mã hóa tổng hợp

từ các khung đọc mở, hình thành bởi hiện tượng “cắt-ghép” (splicing) RNA thôngtin của 2 gen M và NS tương ứng

- Các protein virus kể trên đảm nhận chức năng khác nhau trong quá trình lưuhành và lây truyền gây bệnh của virus cúm A, được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1 Như vậy, hệ gen virus cúm A gồm 8 phân đoạn RNA được cấu tạo, tổ chứchợp lí, tương tác chặt chẽ và đa dạng về phương thức biểu hiện như: gen lồng tronggen ở gen PB1, cắt-ghép gen ở các gen M và NS, mã hóa tổng hợp 10 – 12 proteinđảm bảo các chức năng cấu tạo, xâm nhiễm, lây truyền, độc lực và biểu hiện khángnguyên, trong quá trình lưu hành của virus ở các loài vật chủ [1], [6], [9], [11]

1.1.4 Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA

* Gen polymerase basic protein 2 (PB2):

Phân đoạn PB2 của virus cúm A có độ dài tổng số 2.341 nucleotide chứakhung đọc mở có độ dài 2.280 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB2 polymerase(viết tắt là protein PB2) gồm 759 amino acid [1], [2], [6], [12]

Protein PB2 là một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzympolymerase, chịu trách nhiệm khởi đầu quá trình tổng hợp và phiên mã RNA củavirus ở nhân tế bào nhiễm Bên cạnh đó, protein PB2 còn là một trong các yếu tốquan trọng, liên quan đến khả năng chuyển nhiễm thích nghi lây truyền của viruscúm A từ gia cầm sang động vật có vú và người [1], [2], [6]

Đầu C-tận (carboxy terminal) của protein PB2 chứa các vị trí amino acid quantrọng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng phức hợp enzym polymerase, liên quanđến khả năng thích nghi vật chủ của virus cúm A Bao gồm:

- Vùng 37 amino acid đầu tiên liên kết với đầu tận cùng N (đầu tận, terminal) của dưới đơn vị protein PB1, tham gia điều hòa hoạt tính phức hợp enzympolymerase, liên quan đến khả năng nhân lên của virus cúm A trong tế bào cảm thụ

N-ở cơ thể các loài vật chủ [13], [14], [15]

- Các vùng tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal domain, NLS)tương tác với thụ thể importin-α (importin-α nuclear import receptors) trên màng

nhân, trong quá trình vận chuyển các phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A vào nhân

tế bào nhiễm Có 7 dạng cấu trúc (isoforms) khác nhau của thụ thể importin-α, kíhiệu từ importin-α1 đến importin-α7, phân bố trên màng nhân tế bào cảm thụ vớivirus cúm A ở các loài vật chủ Ở tế bào cảm thụ gia cầm có thụ thể importin-α1, ởngười là các importin-α1, 3, 5 và 7, trong khi ở tế bào cảm thụ của chuột lại có sựthiếu hụt importin-α7 [16], [18] Khả năng tương tác giữa các vùng NLS của proteinPB2 với các dạng thụ thể importin-α, liên quan đến đặc tính thích nghi xâm nhiễm,lây truyền của virus cúm A ở loài vật chủ mới [16], [17], [18]

- Bên cạnh đó, các vị trí amino acid đầu C-tận của protein PB2 còn tham giatương tác với protein NP trong phức hợp RNP của virus cúm A, làm thay đổi khảnăng tương tác giữa các vùng NLS của PB2 với thụ thể importin-α1 trên màng nhân

tế bào cảm thụ ở động vật có vú [16], [19], [20]

- Ngoài ra, vùng đầu C-tận của protein PB2 còn tương tác với vùng chuỗi nốigiữa 2 tiểu phần HA1 và HA2 của protein HA, liên quan đến biểu hiện độc lực gâybệnh của virus cúm A ở các loài vật chủ [21], [22], [23]

Như vậy, các đột biến về nucleotide xảy ra trong trình tự gen PB2, có thể làmthay đổi amino acid được mã hóa trong protein PB2, dẫn đến thay đổi hoạt tính củaphức hợp enzym polymerase liên quan đến độc lực, thích nghi lây truyền của viruscúm A giữa các loài vật chủ

* Gen polymerase basic protein 1 (PB1):

+ Phân đoạn PB1 có độ dài tổng số là 2.341 nucleotide chứa khung đọc mở2.274 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB1 polymerase (viết tắt là protein PB1)gồm 757 amino acid, một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzympolymerase của virus cúm A Bên cạnh đó, khung đọc mở gen PB1 còn chứa 02khung đọc mở của các gen PB1-N40 và PB1-F2, mã hóa 2 protein tương ứng cóchức năng khác nhau, trong quá trình nhân lên và gây bệnh của virus cúm A ở cơthể vật chủ [1], [2], [6], [12]

Trình tự nucleotide vùng đầu 5’- RNA thông tin của gen PB1 chứa đựng nhiềuchức năng phức tạp và chồng lấn, bao gồm tín hiệu bao gói RNA hệ gen của virus,thông tin xác định và điều hòa tổng hợp các protein chức năng, được mã hóa từ cáckhung đọc mở khác nhau lồng trong khung đọc mở gen PB1 Bao gồm 5 vị trí mã

khởi đầu (innitiation codon) từ -AUG1- đến -AUG5-, xác định điểm khởi đầu dịch

mã các khung đọc mở khác nhau lồng bên trong khung đọc gen PB1, được nhậndiện bởi cơ chế chuyển dịch khung đọc của ribosome Trong đó, các vị trí AUG1, 4

và 5 là mã khởi đầu của 3 khung đọc mở mã hóa cho các protein: PB1, PB1-F2 vàPB1-N40 theo thứ tự, các vị trí AUG2 và 3 là mã khởi đầu của 2 khung đọc mởngắn (short open reading frame, sORF) là sORF1 và sORF2, mã hóa các polypeptid

tương ứng (Hình 1.3) Wise et al., 2009 [11], 2011 [24]

Hình 1.3 Sơ đồ sắp xếp và trình tự vị trí codon AUG xác định điểm khởi đầu các

ORF trong vùng đầu 5’- RNA thông tin gen PB1 virus cúm A [24]

Ghi chú: (A) Vị trí mã khởi đầu –AUG– các OFR trong vùng đầu 5’- của RNA thông tin gen PB1, tương

ứng với protein được mã hóa; Số thứ tự từ 1 đến 9: các vị trí AUG1 đến AUG9 B Trình tự nucleotide và các

vị trí mã khởi đầu –ATG– trong vùng đầu 3’- xác định trên DNA của gen PB1 virus cúm A

+ Protein PB1 chịu trách nhiệm xúc tác và gắn mũ cho các phân tử RNA thôngtin, cũng như các phân đoạn RNA hệ gen của hạt virus mới được tổng hợp trongnhân của tế bào nhiễm [1], [2]

- Bên cạnh cấu trúc liên kết với đầu C-tận của protein PB2, trình tự đầu N-tậncủa protein PB1 còn chứa 48 amino acid cấu tạo nên cấu trúc anpha (α) có vùngtrung tâm gồm 12 amino acid đầu tiên, liên kết với protein PA polymerase trongphức hợp enzym polymerase của virus cúm A [14], [25], [26], [27], [28]

- Sự thay đổi thành phần amino acid trong vùng N-tận của protein PB1, làmthay đổi liên kết giữa các protein PB2-PB1-PA, dẫn đến thay đổi cấu trúc và hoạttính enzym phức hợp polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên, biểu hiện độclực và thích nghi của virus cúm A ở các loài vật chủ.

+ Protein PB1-F2 có khối lượng phân tử nhỏ, biểu hiện hoạt tính khi chứa đầy

đủ từ 87 – 90 amino acid, được mã hóa bởi khung đọc mở PB1-F2 có độ dài 273nucleotide, giới hạn từ vị trí nucleotide 95 đến 367 trên khung đọc mở gen PB1.Protein PB1-F2 trực tiếp tham gia và là yếu tố chủ yếu biểu hiện độc lực gây bệnhcủa virus cúm A ở cơ thể nhiễm [9], [13], [29], [30], [31], [32]

- Protein PB1-F2 gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), do làm thayđổi hình thái và mất điện thế màng ty thể, gây ngưng trệ chuyển hóa nội bào, kíchthích sự nhạy cảm với TNFα (α-tumor neucrosis factor) và khởi động quá trìnhapoptosis của tế bào nhiễm Qua đó, protein PB1-F2 tham gia điều biến đáp ứngmiễn dịch của cơ thể vật chủ với virus, gây tổn thương tế bào và mô, chủ yếu là các

tế bào biểu mô đường hô hấp và đại thực bào phế nang (alveolar macrophage) “bắtgiữ” virus, rút ngắn thời gian đào thải virus, gia tăng độc lực và mức độ trầm trọngcủa bệnh học cúm A [9], [33], [34], [35]

- Trong quá trình lưu hành, nhiều chủng virus cúm A có đột biến nucleotidetrong trình tự khung đọc mở PB1, làm xuất hiện một hoặc nhiều bộ ba kết thúc(stop codon), thường gặp ở các vị trí sau bộ ba mã hóa amino acid thứ 11 trong trình

tự khung đọc PB1-F2 Kết quả đột biến trên dẫn đến protein PB1-F2 được mã hóakhông đầy đủ (truncated), làm mất hoạt tính protein này và độc lực của virus trở nên

“ôn hòa” hơn [5], [9], [32], [36], [37] Có khoảng 95% virus cúm A ở chim và giacầm, 90% ở người, 76% ở lợn và 100% ở các loài động vật có vú khác, chứa proteinPB1-F2 chứa đầy đủ 87 – 90 amino acid [9], [37], [38], [39]

- Bên cạnh đó, đột biến nucleotide làm thay đổi amino acid asparagine (N)thành serine (S) tại vị trí 66 (N66S), dẫn đến tăng hoạt tính protein PB1-F2 và giatăng độc lực của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [29], [30], [31], [32]

+ Protein PB1-N40 được Wise và cộng sự (cs.), (2009, 2011) [11], [24] phát

hiện gần đây ở chủng virus A/PuetoRico/8/34(H1N1), thiếu hụt 39 amino acid đầu

tiên ở vùng N-tận so với protein PB1, chiếm khoảng 5% so với lượng protein PB1được tổng hợp trong tế bào nhiễm

- Chức năng của protein PB1-N40 chưa được biết rõ, theo nghiên cứu của

Wise và cs., (2009, 2011) cho thấy protein PB1-N40 không tham gia cấu trúc

enzym polymerase như protein PB1, nhưng sự biểu hiện của protein này có ảnhhưởng đến chu kì phát triển của virus cúm A ở tế bào nuôi cấy [11], [24]

- Hiện chưa có các nghiên cứu về protein PB1-N40 ở các subtype virus cúm Alưu hành trong quần thể các loài chim hoang dã, gia cầm, động vật có vú và người + Đặc biệt, polypeptid ngắn sOFR2 có vai trò như yếu tố điều hòa, tác độngđối nghịch trong quá trình tổng hợp 2 protein PB1-F2 và PB1-N40 Trong đó:sOFR2 là tín hiệu thông tin làm tăng tổng hợp protein PB1-F2, nhưng lại điều hòangược sự tổng hợp protein PB1-N40, qua cơ chế tái khởi đầu của ribosome bỏ qua

vị trí mã khởi đầu AUG4 (vị trí khởi đầu của khung đọc mở PB1-F2) [24]

* Gen polymerase acidic (PA):

Phân đoạn PA có độ dài tổng số 2.233 nucleotide chứa khung đọc mở 2.151nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PA polymerase (protein PA) gồm 716 aminoacid, là một đơn vị cấu tạo phức hợp enzym polymerase của virus cúm A [1], [2].+ Protein PA chịu trách nhiệm xúc tác kéo dài sự phiên mã và sao chép RNAtrong quá trình tổng hợp RNA của virus ở nhân tế bào cảm thụ Bên cạnh đó,protein PA có hoạt tính enzym endonuclease, phân cắt RNA thông tin của tế bàochủ thành các đoạn oligonucleotide, làm mồi nucleotide cho quá trình tổng hợpRNA virus, tham gia độc lực của virus cúm A ở các loài vật chủ [1], [6], [40] + Protein PA được phân cắt bởi enzym trypsin thành 2 vùng polypeptide cókhối lượng và chức năng khác nhau Phần đầu N-tận protein PA chứa 256 aminoacid, khối lượng phân tử khoảng 25 kilo Dalton (kDa), có vai trò quan trọng biểuhiện hoạt tính của phức hợp enzym polymerase và phân cắt các RNA thông tin của

tế bào chủ Phần đầu C-tận gồm 560 amino acid, có khối lượng phân tử khoảng 55kDa, chứa các vị trí amino acid K328, K539, R566 và K574 tạo thành trung tâm,liên kết với trung tâm cấu trúc α đầu N-tận của protein PB1, trong phức hợp enzympolymerase của virus cúm A (Hình 1.4) [14], [28], [40], [41], [42]

Hình 1.4 Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA [42].

Sự biến đổi thành phần amino acid của protein PA, có thể làm thay đổi hoạttính endonuclease và khả năng liên kết của protein PA với PB1 trong phức hợpenzym polymerase, ảnh hưởng đến tốc độ sao chép tổng hợp các RNA hệ gen trong

tế bào nhiễm và độc lực gây bệnh của virus cúm A ở gia cầm và người

1.1.5 Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A

+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A cấu tạo từ 3 dưới đơn vịprotein PB2, PB1 và PA, thông qua liên kết giữa vùng N-tận của protein PB1 vớivùng C-tận của các protein PB2 và PA, sau khi được dịch mã tổng hợp trong tế bàocảm thụ Trong đó, dưới đơn vị protein PB1 có vai trò như khung xương liên kết với

2 protein dưới đơn vị PB2 và PA, cấu tạo và tham gia điều hòa hoạt tính của phứchợp enzym polymerase Phức hợp này được gắn với vùng đầu tận 3’- và 5’- của cấutrúc xoắn α của mỗi phân đoạn RNP trong hệ gen virus cúm A, tạo thành cấu trúc

có khả năng tự sao chép trong tế bào cảm thụ (Hình 1.5) [1], [2], [43]

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi

phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A [43]

Ghi chú: A: Mô hình cấu trúc 3D của phức hợp polymerase; B: Vị trí gắn phức hợp polymerase trong cấu

trúc 1 phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A; Các vùng cấu trúc của protein PB2, PB1 và PA được tô màu; Màu đỏ: vùng N-tận của protein PB2; Màu xanh đậm: vùng C-tận của protein PB1; Màu xanh lá: vùng C-tận của protein PA.

+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNApolymerase phụ thuộc RNA (RNA polymerase dependant RNA, RdpR) type II,cùng với protein NP có vai trò quyết định quá trình sao chép RNA hệ gen, RNAthông tin tổng hợp các protein chức năng và thành phần cấu tạo hạt virus mới ở tếbào nhiễm [1], [2], [3], [4]

- Bên cạnh đặc tính chung của các enzym là biểu hiện hoạt tính phụ thuộc vàonhiệt độ, liên quan đến khả năng thích nghi của virus ở cơ thể loài vật chủ Đặc tính

cơ bản của nhóm enzym RNA polymerase phụ thuộc RNA là không có cơ chế

“đọc-sửa” bản sao (proof-reading), giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao trongquá trình sao chép tổng hợp hệ gen RNA của hạt virus mới [1], [2], [6]

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ [44] Ghi chú: Các ký hiệu RNP: phức hợp ribonucleoprotein (ribonucleoprotein); mRNA: RNA thông tin

(messenger RNA); vRNA: RNA hệ gen virus (viral RNA); cRNA: RNA bổ sung (complement RNA).

- Trong quá trình xâm nhiễm lây truyền ở tế bào, sau khi virus cúm A đượchấp phụ và hòa màng giải phóng hệ gen ở bào tương, các phân đoạn RNP hệ genvirus được vận chuyển vào trong nhân tế bào, nhờ sự tương tác giữa vùng NLS củaprotein PB2 với thụ thể importin- trên màng nhân tế bào nhiễm (Hình 1.6) Tại đây,với sự có mặt của NP trong phức hợp PA-PB1-PB2-NP, protein PB2 được hoạt hóa

và hoạt hóa 2 protein PB1 và PA của phức hợp enzym polymerase, khởi động quá

trình sao mã tổng hợp RNA hệ gen và RNA thông tin mã hóa tổng hợp các thànhphần của hạt virus mới Trong đó, protein PA xúc tác kéo dài sự phiên mã RNA vàprotein PB1 gắn mũ cho các phân tử mRNA của virus [1], [44].

Như vậy, hoạt tính enzym của phức hợp polymerase virus cúm A là kết quảtổng hợp tương tác giữa các protein PB2-PB1-PA trong phức hợp polymerase vàPB2-PB1-PA-NP trong cấu trúc RNP, liên quan đến tốc độ sao chép, tổng hợp cácprotein chức năng và thành phần hạt virus mới ở nhân tế bào cảm thụ Sự biến đổicủa các protein PB2, PB1 và PA, do đột biến nucleotide ở các phân đoạn tương ứng,dẫn đến thay đổi tương tác giữa các protein này trong phức hợp polymerase Kếtquả của sự biến đổi trên làm thay đổi hoạt tính enzym của phức hợp polymerase,liên quan đến khả năng nhân lên trong tế bào cảm thụ, độc lực và đặc tính thích nghigây bệnh của virus cúm A ở cơ thể loài vật chủ [13], [20], [28], [45]

1.1.6 Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A

Virus cúm A luôn biến đổi trong quá trình lưu hành tự nhiên ở các loài vậtchủ, thông qua đột biến điểm xảy ra ở mỗi phân đoạn RNA hoặc tái tổ hợp các phânđoạn trong hệ gen giữa các chủng virus khác nhau, dẫn đến làm thay đổi các đặctính lây truyền gây bệnh của biến chủng virus mới

* Đột biến điểm:

Đột biến điểm là loại hình biến đổi thường gặp xảy ra trong trình tự nucleotide

ở mỗi phân đoạn RNA hệ gen của virus cúm A, do enzym polymerase của viruskhông có khả năng “đọc-sửa” bản sao RNA, trong quá trình phiên mã và sao chépRNA hệ gen virus ở nhân tế bào nhiễm

- Các enzym sao chép phụ thuộc RNA có thể gài thêm, hoặc làm mất đi haythay thế một hoặc nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong trình tự RNAphân đoạn gen mới của virus (Hình 1.7) [6], [46]

- Đột biến điểm xảy ra thường xuyên, liên tục ở tất cả các phân đoạn trong hệgen virus cúm A, với tần suất xuất hiện khoảng 1/10.000 nucleotide (tương ứng với

độ dài hệ gen virus) trong một chu kì sao chép hệ gen của virus Hầu như mỗi hạtvirus cúm A mới được hình thành đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gencủa nó và được tích lũy qua nhiều thế hệ, làm xuất hiện biến chủng virus mới thayđổi đặc tính di truyền so với chủng virus ban đầu [2], [46], [47]

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa đặc tính biến đổi di truyền của các phân đoạn và hệ gen

virus cúm A [46]

Ghi chú: A Sơ đồ đột biến điểm; B Sơ đồ tái tổ hợp các phân đoạn gen của virus cúm A

- Ngoài ra, đột biến điểm xảy ra trong các phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP,

M và NS, còn gọi là các gen khung (internal genes), dẫn đến thay đổi đặc tính sinhhọc của các protein được mã hóa Kết quả là hình thành các biến chủng virus giatăng độc lực, lẩn tránh cơ chế đề kháng tự nhiên của cơ thể nhiễm, kháng thuốchoặc thích nghi lây truyền sang loài vật chủ mới [6], [35], [47], [48]

* Tái tổ hợp các phân đoạn trong hệ gen virus cúm A:

Khả năng tái tổ hợp các phân đoạn trong hệ gen chỉ có ở virus cúm A, tạo nên

sự đa dạng sinh học trong quá trình lưu hành tự nhiên của virus ở các loài vật chủ

- Hệ gen của virus cúm A chia tách thành 8 phân đoạn RNP riêng biệt có thểsao chép độc lập, cho phép virus hòa trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) một hoặcnhiều phân đoạn trong quá trình nhân lên và bao gói hạt virus mới, khi đồng nhiễm

2 chủng virus cúm A khác nhau trong cùng một tế bào Sự sắp xếp lại các phânđoạn trong hệ gen giữa 2 chủng virus cúm A khác nhau, tạo ra những cấu trúc hệgen khác nhau của chủng virus mới, biểu hiện các tính trạng kết hợp từ hệ gen cácvirus ban đầu (Hình 1.7) [1], [6], [46]

- Tái tổ hợp xảy ra với các phân đoạn kháng nguyên (HA và NA) tạo ra hiệntượng trộn kháng nguyên (antigenic shift), hình thành các biến chủng virus cúm Amới thay đổi đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh ở vật chủ tự nhiên hoặcxâm nhiễm loài vật chủ mới [1], [6], [46]

- Bên cạnh đó, tái tổ hợp xảy ra với các phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M

và NS, giữa các chủng virus cúm A trong tự nhiên hình thành nhiều kiểu gen(genotype) virus tái tổ hợp khác nhau Kết quả là hình thành các biến chủng viruscúm A, có thể thay đổi độc lực gây bệnh ở các loài vật chủ tự nhiên, hoặc thích nghilây truyền sang loài vật chủ mới [3], [6], [47]

Như vậy, kết quả tương tác tổng hợp của các sản phẩm đột biến gen/hệ gen,thông qua đột biến điểm và/hoặc tái tổ hợp các phân đoạn hệ gen của virus cúm A,tạo ra nhiều biến chủng virus mới thay đổi đặc tính kháng nguyên trốn thoát đápứng miễn dịch và gia tăng độc lực gây bệnh ở vật chủ tự nhiên Đặc biệt, một sốbiến chủng virus mới được hình thành qua quá trình biến đổi của virus cúm A, cókhả năng thích nghi xâm nhiễm và lây truyền gây bệnh trên nhiều loài vật chủ mớibao gồm cả người [1], [6], [46]

1.2 ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1

VÀ PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI

Vật chủ tự nhiên của virus cúm A là các loài chim hoang dã, phổ biến là chimthủy sinh (vịt trời), phần lớn virus cúm A có độc lực thấp (low pathogenic avianinfluenza) không hoặc chỉ gây bệnh cúm nhẹ, chỉ một số ít chủng virus biến đổi cóđộc lực cao (highly pathogenic avian influenza) gây bệnh dịch ở các loài này Trongquá trình lưu hành tự nhiên, virus cúm A có thể biến đổi vượt qua “rào cản loài”chuyển nhiễm, thích nghi lây truyền gây bệnh từ chim hoang dã sang gia cầm vànhiều loài động vật có vú khác bao gồm cả người [1], [2], [6], [51]

Một chủng virus cúm A mới có độc tính cao và dễ dàng lây truyền gây bệnhgiữa người với người sẽ gây ra các đại dịch cúm A ở người, khi quần thể ngườichưa có đáp ứng miễn dịch với chủng virus đó Khả năng gây bệnh của chủng viruscúm A mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể người có miễn dịch đặc hiệu với virus vàchủng virus cúm A mới trở nên thích nghi lây truyền, gây bệnh dịch cúm mùa hàngnăm ở quần thể người [1], [2], [6]

1.2.1 Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử

Trong thế kỉ XX, đã có 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2biến đổi thích nghi lây truyền trên người và là nguyên nhân gây ra các đại dịch cúmnguy hiểm, với hàng triệu người tử vong chỉ trong thời gian ngắn ở nhiều quốc giatrên thế giới trong lịch sử (Bảng 1.2) [2], [3], [4], [6]

Bảng 1.2 Tóm tắt lịch sử các đại dịch và dịch cúm A ở người [2], [3], [4], [6] Tên đại dịch/dịch cúm A

ở người

Thời gian (năm)

Số người

tử vong

Chủng virus cúm A Spanish Flu

Asian Flu

(Cúm châu Á) 1957 - 1958 1 đến 1,5 triệu A/H2N2

Hong Kong Flu

Gần đây, chủng virus A/H1N1/2009 có nguồn gốc từ lợn (swine–origininfluenza A/H1N1, S-OIV), xuất hiện ở Mexico và nhanh chóng lan truyền phổbiến, lây truyền dễ dàng giữa người với người, gây bùng phát dịch cúm A/H1N1mới ở người trên toàn cầu năm 2009 Từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2009, đã có hơn3.486 người tử vong trên tổng số 134.500 người nhiễm virus A/H1N1/2009 trongđại dịch cúm này (Bảng 1.2) [3], [52]

1.2.2 Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại

dịch cúm ở người

Các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 biến đổi thích nghi xâmnhiễm lây truyền và gây ra đại dịch cúm A ở người trong lịch sử, đều có nguồn gốchình thành từ virus cúm A lưu hành ở chim hoang dã, trực tiếp hoặc qua các loài vậtchủ trung gian có mối liên hệ gần gũi với người (gia cầm, lợn) [2], [6], [10]

Khả năng thích nghi xâm nhiễm và lây truyền ở người là kết quả tương táctổng hợp biến đổi đặc tính di truyền hệ gen virus, do sự tích lũy các đột biến điểmtrong mỗi phân đoạn và/hoặc tái tổ hợp các phân đoạn của hệ gen giữa virus cúmgia cầm với virus cúm A thích nghi ở người trước đó Trong đó, đột biến điểm và sự

tái tổ hợp của các gen PB2, PB1 và PA, có vai trò quan trọng giúp virus thay đổiđộc lực gây bệnh, thích nghi nhân lên trong tế bào cảm thụ ở người và ổn định khảnăng lây truyền dễ dàng của virus giữa người với người [51], [52], [53]

* Đột biến điểm trong các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch cúm ở người:

Các kết quả nghiên cứu phân tích so sánh cho thấy, hệ gen của các chủng viruscúm A gây đại dịch cúm ở người có nhiều đột biến khác biệt xảy ra trong các phânđoạn gen, gồm cả các gen PB2, PB1 và PA, so với hệ gen của phân type virus cúm

A tương ứng ở gia cầm [1], [2], [6]

+ Nghiên cứu của Taubenberger và cs., (2005) [45] phát hiện, có một số vị trí

khác biệt về amino acid trong các gen PB2, PB1 và PA của chủng virus cúmA/H1N1 gây đại dịch năm 1968, cùng với các virus cúm A/H1N1, A/H2N2 vàA/H3N2 thích nghi ở người, so với các gen tương ứng của virus cúm A ở gia cầm.Các vị trí sai khác được chứng minh là đột biết làm thay đổi amino acid, bao gồm: 5

vị trí (A199S, L475M, D567N, E627K và K702R) trong trình tự protein PB2, 1 vịtrí (N/S/T375S) trong trình tự PB1, cùng với 4 vị trí (D55N, V100A, E382D vàT552S) trong trình tự protein PA (Bảng 1.3)

- Các đột biến trên làm thay đổi hiệu quả tương tác giữa các protein PB2, PB1

và PA trong phức hợp enzym polymerase, góp phần thay đổi đặc tính gây bệnh vàlây truyền, tạo ra khả năng thích nghi của virus cúm A từ gia cầm sang người [17],[27], [35], [45], [54]

- Vị trí amino acid 627 trong protein PB2 được Subbarao và cs., (1993) [55]

phát hiện, như là yếu tố quan trọng xác định giới hạn loài vật chủ của virus A Theo

Massin và cs., (2001) [56], đột biến thay đổi glutamic acid (E) thành lysin (K) tại vị

trí 627 (E627K) trong protein PB2, có vai trò như chìa khóa quyết định thay đổi khảnăng thích nghi nhân lên của virus cúm A từ gia cầm sang người và động vật có vú,liên quan khác biệt về nhiệt độ cơ thể giữa các loài vật chủ nói trên Vai trò của độtbiến E627K kết hợp với trình tự các amino acid từ vị trí 362 đến 581, hoặc thay đổiaspartic acid (D) thành asparagin (N) tại vị trí 701 (D701N) trong protein PB2, cũng

được chứng minh liên quan đến hoạt tính phức hợp enzym polymerase, phụ thuộcvào nhiệt độ giữa cơ thể gia cầm và động vật có vú (bao gồm cả người) [57], [58]

Bảng 1.3 Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2, PB1 và PA, giữa virus

cúm A ở gia cầm với chủng virus A/H1N1/1918 và virus cúm A ở người [45]

Ghi chú: Các chữ cái kí hiệu quốc tế tên của các amino acid; A: Alanin; L: Leucin; D: Aspartic acid; E:

Glutamic acid; K: Lysin; N: Asparagin; S: Serin; T: Threonin; V: Valin; M: Methionin; R: Arginin

- Đột biến thay đổi amino acid threonin thành serin tại vị trí 552 (T552S) trongtrình tự protein PA, được chứng minh có vai trò quan trọng làm tăng hoạt tính phứchợp polymerase trong tế bào nuôi cấy có nguồn gốc của người và gia tăng độc lựcgây bệnh của virus cúm A ở chuột thí nghiệm [42]

+ Gần đây, Bussey và cs., (2010) [59] phát hiện đột biến thay thế threonin (T)

thành alanin (A) tại vị trí 271 (T271A) trong protein PB2, làm tăng hoạt tính của enzympolymerase của virus cúm A/H1N1/2009 trong tế bào nuôi cấy của người Đột biến thaythế glutamic acid (E) thành glycin (G) tại vị trí 158 (E158G) trong protein PB2, cũngđược chứng minh làm tăng khả năng nhân lên của virus cúm A ở chuột thí nghiệm [60].+ Bên cạnh đó, cả 3 chủng virus A/H1N1/1918, A/H2N2/1957 và A/H3N2/1968gây đại dịch cúm A ở người, đều biểu hiện protein PB1-F2 chứa 87 – 90 aminoacid, trong khi ở các chủng virus cúm A thích nghi trên người hiện nay protein nàychỉ chứa 57 amino acid [9], [36] Ngoài ra, protein PB1-F2 của chủng virus cúmA/H1N1/1918, có đột biến thay đổi amino acid từ asparagin (N) thành serin (S) tại

vị trí 66 (N66S) so với protein tương ứng của virus cúm A/H1N1 ở gia cầm, làm giatăng độc lực của virus ở cơ thể người [30], [35] Tuy nhiên, chủng virus cúm

Protein Vị trí

Virus cúm gia cầm

Chủng virus A/H1N1/1918 A/H1N1 ở người A/H2N2 ở người A/H3N2 ở người

A/H1N1/2009 có sự bảo tồn gen PB1 có nguồn gốc từ virus cúm A/H3N2 ở người

và biểu hiện protein PB1-F2 chỉ chứa 11 amino acid Đây có thể là nguyên nhângóp phần làm cho độc lực của chủng virus này “ôn hòa” hơn, so với các chủng viruscúm A gây đại dịch cúm ở người trước đó [5], [37], [39], [53]

Như vậy, bên cạnh sự biến đổi của các gen kháng nguyên HA và NA, có vaitrò quan trọng giúp cho virus cúm A thích ứng xâm nhiễm dễ dàng tế bào cảm thụ ởđường hô hấp của người, cùng với sự biến đổi của các gen M, NP và NS giúp virusnhân lên và ngăn cản các phản ứng không đặc hiệu của cơ thể chống lại virus [1],[6], [48], [61], [62] Sự biến đổi đặc tính di truyền của các gen PB2, PB1 và PAtrong hệ gen, của các chủng virus cúm A gây đại dịch cúm ở người so với virus cúmgia cầm, là cơ sở giúp virus thay đổi độc lực gây bệnh và thích nghi lây truyền từgia cầm sang người [51], [52]

* Đặc điểm tái tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA trong quá trình hình thành các chủng virus cúm A gây đại dịch cúm ở người

Cho đến nay, vẫn chưa biết rõ nguồn gốc phát sinh chủng virus cúm A/H1N1gây ra đại dịch cúm Tây Ban Nha ở người năm 1918 (A/H1N1/1918), do thiếu hụt

dữ liệu di truyền của virus này ở người và các loài vật chủ giai đoạn trước đại dịch.Tuy nhiên, dữ liệu di truyền của virus A/H1N1 thu thập được từ các mẫu mô lưugiữ của người bệnh tử vong và mẫu hóa thạch của lợn, gia cầm, chim hoang dãtrong thời gian đại dịch cho thấy, chủng virus A/H1N1/1918 có nguồn gốc biến đổitrực tiếp từ các virus A/H1N1 ở gia cầm. Hệ gen của chủng virus này tách chiết từmẫu mô của người bệnh, có sự bảo tồn hầu hết các gen bao gồm cả 3 gen PB2, PB1

và PA, chỉ biến đổi ở 2 gen H1 và NP, so với các virus A/H1N1 phân lập từ cácmẫu mô gia cầm hóa thạch (Hình 1.8) [2], [52], [63], [64]

Tiếp đó, chủng virus cúm A/H2N2 gây đại dịch cúm châu Á năm 1957(A/H2N2/1957), tái tổ hợp thu nhận gen PB1 từ virus cúm gia cầm A/H3N2 lưuhành ở châu Á, với 2 gen PB2 và PA từ virus cúm người A/H1N1 Năm 1968,chủng virus cúm A/H3N2 xuất hiện và gây ra đại dịch cúm Hồng Kông ở các quốcgia châu Á (A/H3N2/1968), có sự tái tổ hợp thu nhận gen PB1 từ virus cúm phânnhóm H3 ở gia cầm, cùng với 2 gen PB2 và PA từ virus cúm A/H2N2 clade 1 ởngười (Hình 1.8) [2], [10], [52]

Hình 1.8 Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở người [52]

Ghi chú: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS: kí hiệu các phân đoạn trong hệ gen virus cúm A Tên các

chủng virus cúm gây đại dịch cúm A ở người được in màu đỏ Tên các chủng virus cúm A thích nghi lây truyền gây bệnh cúm mùa ở người hiện nay được in màu xanh.

Gần đây, chủng virus A/H1N1/2009 gây tái bùng phát dịch cúm A mới ởngười năm 2009, cũng chứa hệ gen là kết quả nhiều lần tái tổ hợp các gen, có nguồngốc từ các virus cúm người A/H3N2, virus cúm chim A/H1N1 và A/H1N2 củachim hoang dã và lợn, trên vật chủ trung gian là lợn ở Bắc Mỹ và Âu-Á Trong đó,

hệ gen của chủng virus này chứa 2 gen PB2 và PA, từ virus cúm lợn tái tổ hợp trước

đó ở Bắc Mỹ giữa virus cúm chim A/H1N1 và virus cúm lợn A/H3N2, cùng với genPB1 có nguồn gốc từ virus cúm người A/H3N2 (Hình 1.8) [10], [52], [53]

Như vậy, ngoại trừ các gen PB2, PB1 và PA của chủng virus A/H1N1/1918chưa rõ nguồn gốc, có thể do biến đổi trực tiếp từ các virus cúm gia cầm Hệ gencủa các chủng virus cúm A/H2N2/1957 và A/H3N2/1968, đều chứa gen PB1 cónguồn gốc từ virus cúm gia cầm kết hợp với 2 gen PB2 và PA từ các virus cúm Athích nghi trên người trước đó Kết quả là hình thành tổ hợp 3 gen PB2, PB1 và PAtương tác với các gen khác trong hệ gen virus tái tổ hợp, tạo ra các sản phẩm gen

thích hợp giúp chủng virus cúm A mới, lây truyền dễ dàng và gây ra đại dịch cúm A

ở quần thể người Đặc biệt, hệ gen của chủng virus A/H1N1/2009, chứa gen PB1 cónguồn gốc từ virus cúm A/H3N2 ở người, tái tổ hợp với 2 gen PB2 và PA từ viruscúm gia cầm, so với các virus gây ra đại dịch cúm A ở người trước đó [5], [53] 1.3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1

1.3.1 Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1

* Trên thế giới:

Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza A/H5N1,HPAI A/H5N1) thuộc phân type virus cúm A/H5N1 trong nhóm virus cúm A, lần đầutiên xâm nhiễm gây bệnh ở ngỗng nuôi tại Quảng Đông (Trung Quốc) năm 1996, vàgây ra vụ dịch cúm chim (bird flu) ở gia cầm tại Hồng Kông (Trung Quốc) năm 1997[1], [6], [12]

Kể từ đó đến nay, virus cúm A/H5N1 liên tục biến đổi đặc tính kháng nguyên

và độc lực, gây bùng phát dịch cúm gia cầm A/H5N1 nguy hại tại một số quốc giachâu Á vào năm 2003, sau đó tiếp tục gây tái bùng phát dịch và lan truyền rộng rãitới hơn 60 quốc gia trên khắp các châu lục

Đặc biệt, virus cúm A/H5N1 có khả năng xâm nhiễm gây bệnh cúm cấp tínhnặng trên người với tỉ lệ tử vong cao (khoảng 60%), trong các vụ dịch cúm gia cầmA/H5N1 xảy ra ở nhiều quốc gia trên thế giới Tính đến 14/4/2012, đã có 372 người

tử vong trong tổng số 623 người nhiễm virus, ở 15 quốc gia có dịch cúm gia cầmA/H5N1 (Bảng 1.4) [3], [6], [12], [65]

Cho đến nay, có 10 clade kháng nguyên H5 từ clade 0 đến clade 9 (Hình 1.9)

và 12 genotype tái tổ hợp 6 gen khung PB2, PB1, PA, NP, M và NS, gồm các

Bảng 1.4 Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 từ 2003 đến nay

(tính đến 14/04/2013) [65]

Azerbaijan 0 0 8 5 0 0 0 0 0 0 8 5 Bangladesh 0 0 1 0 0 0 3 0 0 0 6 0 Cambodia 4 4 4 3 10 9 3 3 9 8 30 27 China 9 6 22 15 10 6 2 1 2 2 45 30

Egypt 0 0 51 23 108 32 10 5 1 1 169 61 Indonesia 20 13 121 102 42 36 8 8 0 0 191 159

Ghi chú: N: Số người nhiễm; TV: Số người tử vong Các quốc gia (Việt Nam; Indonesia; Ai Cập) có số

người nhiễm và tử vong cao do virus cúm A/H5N1 được in trên nền đậm.

Hình 1.9 Cây phả hệ minh họa sự hình thành và lưu hành xâm nhiễm gây bệnh ở

người của các clade HA(H5) virus cúm A/H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011

(http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/201101_h5n1evoconceptualdiagram.pdf)

Ghi chú: Các chữ số (0 – 9): tên các clade HA(H5); Các nhánh clade virus cúm A/H5N1in trên nền màu

hồng là các clade phát sinh lưu hành phổ biến ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh trên người.

- Gần đây, có sự hình thành các biến chủng virus cúm A/H5N1 clade 1.1 (năm2007) và clade 2.3.2.1 (năm 2009), thay đổi lớn về đặc tính kháng nguyên H5 so vớicác chủng virus lưu hành trước đó, gây tái bùng phát dịch cúm A/H5N1 tại nhiềuquốc gia châu Á và châu Âu Đặc biệt, đã có người nhiễm và tử vong do các biếnchủng virus cúm A/H5N1 mới kể trên [65], [69], [70].

Hình 1.10 Sơ đồ minh họa tái tổ hợp hình thành các genotype Z, G và V của virus

cúm A/H5N1 [73]

Ghi chú: Các năm ghi trên hình là thời gian virus A/H5N1 hình thành và xuất hiện; Các genotype in đậm

màu xanh là các genotype virus cúm A/H5N1 đang lưu hành gây bệnh trên gia cầm và xâm nhiễm trên người.Các trường hợp người nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xácđịnh là do virus xâm nhiễm trực tiếp thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải

ô nhiễm hoặc sử dụng các sản phẩm không an toàn chứa virus từ gia cầm bệnh Tuynhiên, sự liên tục biến đổi hình thành các biến chủng virus mới lưu hành lan truyềnrộng rãi của virus cúm A/H5N1, gây tái bùng phát dịch cúm A/H5N1 ở chim hoang

dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh cúm nặng làm tử vong ở người, không chỉ gâythiệt hại về kinh tế mà còn là mối lo ngại cho sức khỏe cộng đồng, được mọi quốcgia quan tâm ngăn chặn [65], [69], [70], [71] Bên cạnh đó, sự xuất hiện xâm nhiễm

gây bệnh cúm nặng và làm tử vong ở người của chủng virus cúm mới A/H7N9, tạiTrung Quốc từ tháng 03/2013 đến nay (5/2013), góp phần làm cho dịch tễ viruscúm A/H5N1 nói riêng và virus cúm A nói chung ngày càng trở nên phức tạp hơn,bởi nguy cơ tái tổ hợp giữa các virus kể trên [72].

* Tại Việt Nam:

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát và được chính thức công bố tại Việt Namvào tháng 12 năm 2003, sau đó liên tục gây tái bùng phát nhiều vụ dịch tản phát hàngnăm ở nhiều địa phương trong cả nước [74], [75], [76], [77] Gần đây (tháng 04/2013),dịch cúm gia cầm A/H5N1 vẫn đang tiếp tục xảy ra và được công bố ở các đàn chimyến tại tỉnh Bình Thuận (Thông tin Bộ Y tế 4/2013, http://www.moh.gov.vn)

Tính đến tháng 04 năm 2013, Việt Nam đã có 62 người tử vong trong tổng số

125 trường hợp xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 Trường hợp gần đây nhất(tháng 03/2013) được xác định tử vong do nhiễm virus cúm A/H5N1 là một bệnhnhi tại Đồng Tháp (Thông tin Bộ Y tế 4/2013, http://www.moh.gov.vn) Tổ chức y

tế thế giới xác định Việt Nam là 1 trong các quốc gia có người nhiễm và tử vong dovirus cúm A/H5N1 cao, và là trung tâm dịch tễ biến đổi của cúm A/H5N1 cần quantâm giám sát [68]

Các chủng virus cúm A/H5N1 lưu hành gây bệnh dịch tại Việt Nam, đều cónguồn gốc từ virus cúm A/H5N1 hình thành tại Nam Trung Quốc, do vị trí địa lí,tập quán di cư của chim di trú và trao đổi sản phẩm thương mại từ gia cầm giữa 2quốc gia Từ cuối năm 2003 đến nay, đã phát hiện 6 clade gen H5, gồm: các clade

0, 1, 2 (2.3.2 và 2.3.4), 3, 5 và 7(7.1), của các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc 3genotype Z, G và V, xâm nhập và lưu hành gây bệnh dịch tại Việt Nam [73], [75],[76], [77], [78], [79], [80] Trong đó, nhóm virus clade 1 thuộc genotype Z có sựlưu hành gây bệnh dịch phổ biến ở gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh trên người,trong cả nước giai đoạn 2003 – 2005 và sau đó tiếp tục lưu hành ở miền Nam giaiđoạn 2005 – 2007 Cùng với nhóm virus clade 2.3.4 thuộc genotype V có sự biếnđổi hình thành clade 2.3.4.3 tại Việt Nam, lưu hành gây bệnh dịch ở gia cầm và xâmnhiễm gây bệnh trên người ở duyên hải miền Trung và miền Bắc giai đoạn các năm

2007 – 2008, thay thế nhóm virus clade 1 lưu hành trước đó Các nhóm virus còn lạichỉ được phát hiện gây bệnh đơn lẻ trong các vụ dịch không điển hình ở gia cầmhoặc chim hoang dã [75], [76], [78], [80], [81], [82], [83]

- Hai nhóm virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1 cũng đã được phát hiệnxâm nhập và lần lượt gây ra nhiều vụ dịch cúm gia cầm A/H5N1, ở các địa phươngkhu vực miền Nam và miền Bắc (Việt Nam) trong các năm từ 2008 đến nay Đặcbiệt, nhóm virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 chỉ được phát hiện gây bệnh dịch cúmA/H5N1 ở gia cầm tại các địa phương duyên hải miền Trung và miền Bắc (ViệtNam) từ 2010 đến nay Nhóm virus này có sự biến đổi khác biệt về kháng nguyênH5 so với các nhóm virus cúm A/H5N1 đang lưu hành, làm giảm hiệu quả bảo vệcủa các vaccine sử dụng phổ biến và độc lực rất cao ở gia cầm, được dự báo có khảnăng gây tử vong cao cho người nhiễm [68], [84], [85], [86], [87]

Hình 1.11 Các genotype virus cúm A/H5N1 hình thành ở Việt Nam [76] Ghi chú: Các vạch màu biểu thị nguồn gốc của các phân đoạn gen trong mỗi genotype virus cúm A/H5N1.

Các kí hiệu: HK97-like, F1-like, E319-like, HK821-like, GX4016-like, GX22-like, GX604-like, FJ584-like

và chưa rõ nguồn gốc, là các nhóm virus cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen tái tổ hợp Các kí hiệu: VN1 – VN9: các genotype virus cúm A/H5N1 hình thành tại Việt Nam theo các mốc thời gian

- Bên cạnh đó, virus cúm A/H5N1 lưu hành gây bệnh dịch tại Việt Nam từ

2003 – 2008, cũng có sự biến đổi hình thành 9 genotype virus cúm A/H5N1 khácnhau, kí hiệu từ VN1 – VN9, do tái tổ hợp các gen khung giữa các biến chủng viruscúm A/H5N1 xâm nhập, cùng lưu hành ở chim hoang dã và gia cầm tại Việt Nam(Hình 1.11) [69], [76]

1.3.2 Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1

Hệ gen của virus cúm A/H5N1 cũng mang các đặc điểm chung của hệ gennhóm virus cúm A, biểu hiện kháng nguyên phân type HA là H5 và NA là N1 Các

gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 có sự biến đổi liên quan đến gia tăng độc lực

và lây truyền gây bệnh của virus ở các loài vật chủ Cụ thể:

+ Các phân đoạn gen HA, NA và NS của virus cúm A/H5N1 có đột biến về sốlượng nucleotide làm thay đổi độ dài phân tử, so với các gen tương ứng của nhómvirus cúm A, dẫn đến thay đổi về số lượng amino acid tại các vị trí liên quan tới cấutrúc và chức năng của các protein được mã hóa

- Phân đoạn gen H5 có độ dài thay đổi từ 1704 – 1707 nucleotide, mã hóa tổnghợp protein H5 gồm 567 – 568 amino acid, có trình tự vùng chuỗi nối giữa 2 tiểu phần

HA1 và HA2 chứa nhiều amino acid kiềm PQRERRRKKR/G-) hoặc PQRERRRKR/G-), biểu hiện độc lực cao của virus cúm A/H5N1 Trình tự chuỗi nốichứa nhiều amino acid kiềm cho phép protein HA(H5) được phân cắt bởi nhiều loạiprotease (trypsine, trypsine – like, furin, plasminase), có ở hầu hết các cơ quan, đặc biệt

(-là đường tiêu hóa của gia cầm và cơ quan hô hấp của người [2], [12], [74], [76], [88]

- Phân đoạn gen N1 có độ dài thay đổi từ 1350 – 1410 nucleotide, do đột biếnxóa 1 đoạn (slippage-mediated deletion) 57 nucleotide và sau đó là 60 nucleotidevùng đầu 5’-, làm thu hẹp độ dài của gen N1 ở các chủng virus phân lập gần đây[17], [75], [88] Do đó, protein NA(N1) của virus cúm A/H5N1 được mã hóa chỉchứa 449 – 469 amino acid, thiếu hụt 19 – 20 amino acid so với trình tự ban đầutrong vùng N-tận, còn gọi là phần cuống (stalk region), liên quan đến sự thích ứnggây bệnh của virus A/H5N1 trên các vật chủ khác nhau [12], [17], [74], [76], [88]

- Phân đoạn gen NS ở virus cúm A/H5N1 cũng có đột biến xóa một đoạn 15nucleotide từ vị trí 240 – 255 vùng đầu 5’-, dẫn đến thiếu hụt biểu hiện 5 amino acid(từ vị trí 80 – 85 vùng đầu N-tận) trong protein NS1, một yếu tố quan trọng liênquan đến biểu hiện độc lực cao, cũng như lẩn tránh đáp ứng miễn dịch vật chủ củavirus Đột biến thay đổi aspartic acid (D) thành glutamic acid (E) tại vị trí 92(D92E) trong protein NS1, liên quan kháng interferon và INFα, cũng đã được pháthiện ở các chủng virus A/H5N1 phân lập từ người bệnh [12], [74], [88], [89], [90].+ Phân đoạn gen PB2, PB1, PA, M và NP bảo tồn về độ dài phân tử so với cácgen tương ứng trong hệ gen của nhóm virus cúm A

- Phân đoạn gen PB2 chứa 2.341 nucleotide mã hóa cho protein PB2 gồm 759amino acid, biểu hiện đặc tính thích nghi ở cơ thể gia cầm [27], [76], [77], [78]

- Phân đoạn gen PB1 chứa 2.341 nucleotide mã hóa cho protein PB1 gồm 757amino acid và protein PB1-F2 chứa đầy đủ trình tự 90 amino acid, một trong nhữngyếu tố tạo nên độc lực cao của virus cúm A [9], [27], [30], [76], [78] Hiện chưa cónghiên cứu về biểu hiện và chức năng của protein PB1-N40 ở virus A/H5N1.

- Phân đoạn gen PA chứa 2.233 nucleotide mã hóa cho protein PA gồm đầy đủ

716 amino acid, biểu hiện đặc tính thích nghi ở cơ thể gia cầm [27], [76], [78]

- Phân đoạn gen NP chứa 1.565 nucleotide mã hóa cho protein NP gồm 498amino acid [1], [2], [12]

- Phân đoạn gen M chứa 1.026 nucleotide mã hóa đầy đủ 2 protein M1 và M2lần lượt gồm 287 và 97 amino acid Protein M2 của virus cúm A/H5N1 có đột biếnlàm thay đổi amino acid leucin (L) thành isoleucin (I) tại vị trí 26 (L26I) và serin(S) thành asparagin (N) tại vị trí 31(S31N), liên quan đến kháng thuốc amantadine

và rimantadine điều trị bệnh cúm A/H5N1 ở người [12], [74], [77], [88]

Sự tương tác tổng hợp các đặc tính biến đổi di truyền nói trên của các gentrong hệ gen virus cúm A/H5N1 lưu hành từ 1996 đến nay, giúp cho virus có độclực gây bệnh cao ở chim hoang dã, gia cầm và mở rộng khả năng xâm nhiễm sangnhiều loài động vật có vú bao gồm cả người

1.4 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘCLỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1

1.4.1 Trên thế giới

Các nghiên cứu so sánh và thực nghiệm về sự biến đổi của các gen PB2, PB1

và PA, liên quan đến gia tăng độc lực và lây truyền của virus từ gia cầm sang độngvật có vú và người cho thấy, có nhiều vị trí thay đổi amino acid trong các proteinPB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1, làm tăng khả năng nhân lên của virus ở tếbào nuôi cấy có nguồn gốc của người và chuột (Bảng 1.5) [51], [91]

Bên cạnh đó, các kết quả nghiên cứu phân tích và so sánh đặc tính di truyềncác gen PB2, PB1 và PA trong hệ gen giữa các chủng virus cúm A/H5N1, phân lập

từ người, chim hoang dã và gia cầm bệnh từ năm 1996 đến nay, cho thấy:

- Các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1, bên cạnh sự thu nhận cùngvới các gen NP, M và NS từ nguồn gen nhiều virus cúm A khác nhau, qua tái tổ hợphình thành genotype, cũng xuất hiện các đột biến liên quan biểu hiện độc lực caocủa virus lưu hành gây bệnh dịch ở các loài vật chủ (Bảng 1.5) [12], [60], [88], [92]

Bảng 1.5 Các vị trí thay đổi amino acid ở 3 protein PB2, PB1 và PA, liên quan đến

độc lực và thích nghi lây truyền của virus cúm A/H5N1 trên người [51], [91]

Protein Vị trí Virus độc lực thấp Virus độc lực

Ghi chú: Các chữ cái biểu thị kí hiệu quốc tế tên của các amino acid A: Alanin; L: Leucin; D: Aspartic acid;

E: Glutamic acid; K: Lysin; N: Asparagin; S: Serin; T: Threonin; V: Valin; M: Methionin; R: Arginin; I: Isoleucin; Y: Tyrosin; H: Histidin; Q: Glutamin.

- Hệ gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành gây bệnh dịch hiện nay, có sự bảotồn các amino acid: alanin tại vị trí 199 (A199) trong protein PB2, methionin tại vịtrí 317 (M317) trong protein PB1, serin tại vị trí 66 (S66) trong protein PB1-F2 vàthreonin vị trí 552 (T552) trong protein PA, liên quan đến biểu hiện độc lực thấp vàthích nghi lây truyền của virus ở gia cầm (Bảng 1.5) [30], [42], [91], [93]

- Hầu hết các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trên gia cầm và người bệnh từnăm 2003 - 2008, đều có chứa gen PB2 biểu hiện protein PB2 bảo tồn glutamic acid(E) tại vị trí 627 (E627) cùng với aspartic acid (D) tại vị trí 701 (D701), liên quan đếnbiểu hiện thích nghi lây truyền của virus ở gia cầm [21], [91], [94], [95], [96] Các biếnchủng virus A/H5N1 clade 2.3.2.1, được phát hiện gây bệnh ở chim hoang dã tại