Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt trong các mẫu sinh học trên các thiết bị phân tích tại phòng thí nghiệm

Ví dụ, nồng độ ngưỡng của sarin là 0,0025 mg/lít/phút, độ nhạy của phương pháp phát hiện phải đạt là 1.10-6 mg/lít Các tiêu chuẩn để lựa chọn phương pháp phân tích gồm: + Độ nhậy + Thờ

Bộ quốc phòng

học viện quân y

Báo cáo tổng kết Đề tài nhánh kc.10-13.04

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt trong các mẫu sinh học trên các thiết bị

phân tích tại phòng thí nghiệm

Chủ nhiệm ĐTN: PGS TSKH Nguyễn Bằng Quyền

thuộc đề tài cấp nhà nước M∙ số kc 10.13

“ xác định nguyên nhân, xây dựng biện pháp dự phòng

BKHCN HVQY

Bộ khoa học công nghệ

Học Viện Quân y

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài nhánh KC.10.13.04

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện chất độc

có khả năng gây NĐHL trong các mẫu sinh phẩm

trên các thiết bị tại phòng thí nghiệm

phục vụ cho chẩn đoán điều trị nhiễm độc

Lời mở đầu

Nước ta là một nước nông nghiệp đang phát triển, từng bước hiện đại hoá và công nghiệp hoá Cùng với sự phát triển về kinh tế là sự bất ổn của tình hình chính trị khu vực và toàn cầu, nguy cơ xẩy ra những vụ NĐHL là không thể

dự đoán trước

Việc xử trí nhiễm độc và NĐHL đòi hỏi nhiều biện pháp khác nhau, từ việc dự báo phát hiện sớm nguyên nhân đến công tác dự phòng và xử trí Các biện pháp đó cần được thực hiện theo những quy tắc và trình tự nhất định

Vì thế, đề tài KC.10.13.04: ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt trong các mẫu sinh phẩm trên các thiết bị tại phòng thí nghiệm phục vụ cho chẩn đoán, điều trị nhiễm độc ” được giao nhiệm vụ thực hiện mục tiêu cụ thể sau đây:

Tạo quy trình phát hiện các loại chất độc trong các vụ NĐHL trong các mẫu sinh phẩm trên các thiết bị tại phòng thí nghiệm phục vụ cho chẩn

đoán, điều trị nhiễm độc

Để hoàn thành nhiệm vụ đặt ra, đề tài tập trung thực hiện các nội dụng chính sau đây:

- Xây dựng phương tiện và quy trình lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Xây dựng phương tiện và quy trình phát hiện nhanh chất độc trong các

mẫu sinh học

Chương I Tổng quan

1.1 Nguyên nhân của các vụ NĐHL

Nhiễm độc hàng loạt có thể xẩy ra do các nguyên nhân sau đây:

+ Sự cố hoá học

Hiện nay, có rất nhiều loại chất hóa học được sản xuất, bảo quản và vận chuyển Các chất hoá học này có thể là sản phẩm hoàn chỉnh nhưng cũng có thể

là các tiền chất sử dụng trong công nghiệp hoá chất Do đó, những tai nạn hoặc sự

cố trong quá trình sản xuất, bảo quản và vận chuyển hoá chất có thể xẩy ra bất ngờ gây tổn hại về sinh mạng, môi trường và tài sản Mức độ nguy hiểm của các loại hoá chất khi bị rò rỉ phụ thuộc vào các yếu tố sau đây:

Trong các dạng hoá chất có thể gây nguy hiểm trong các vụ tai nạn, chất dạng khí nguy hiểm hơn cả, trong đó có các chất như: clo, sulfua dioxid, oxid cacbon, amoniac, acid clohydric, oxid nitơ… Các loại khí này có độc tính tưong

đối cao khi bị rõ rỉ hoặc phát tán, gây nhiễm độc qua đường hô hấp nên dễ xẩy NĐHL, khối lượng sản xuất, dự trữ và vận chuyển lớn

+ Do khủng bố

Các thế lực khủng bố tìm mọi cách để gây hiệu quả sát thương về sinh mạng dân thường và cơ sở vật chất lớn nhất Do vậy, các phương tiện sử dụng để khủng bố có thể gồm các loại sau đây:

- Chất nổ

- Chất độc hoá học

- Tác nhân sinh học

Tháng 8 năm 2002, Mỹ bắt được một nhóm Hồi giáo cực đoan tinh chế ricin ở phía bắc Irắc Đầu năm 2003, cảnh sát Anh ở Luân đôn đã bắt được một nhóm người cất giữ chất độc ricin và có ý định đầu độc ở các ga tầu điện ngầm Ngoài ra, ở Nga và Pháp cũng thu giữ được những chứng cứ về việc tàng trữ chất

độc ricin

Ngày 20-02-2002 cảnh sát Italia bắt được 4 người đàn ông Marốc mang khoảng 4kg chất độc cyanua (kaliferocyanua) có ý định đưa vào đưòng ống nước dẫn vào sứ quán Mỹ ở thủ đô Rom Chất này có độc tính không cao nhưng có khả năng tạo thành acid cyanhydric (HCN)

Ngày 26 tháng 4 năm 2004, cảnh sát Gioóc-đa-ni bắt được một nhóm khủng bố thuộc mạng lưới An Ke-đa âm mưu dùng xe tải chở 20 tấn thuốc nổ cùng hoá chất độc tấn công vào trụ sở cơ quan tình báo nước này

Vụ khủng bố bằng chất độc hoá học điển hình nhất là do giáo phái Aum ở Nhật Bản tiến hành Ngày 27-7-1994, tại thành phố Maxumoto, bọn khủng bố sử dụng chất độc sarin làm 7 người chết và 114 người nhiễm độc Ngày 20-3-1995, bọn khủng bố cũng dùng chất độc sarin ở 5 tuyến tầu điện ngầm Tokyo làm 5000 người nhiễm độc và 12 người chết

ở Việt Nam tuy chưa xẩy ra khủng bố, nhưng một số kẻ xấu đã sử dụng chất độc của Mỹ để lại sau chiến tranh để gây hoảng loạn trong dân chúng ở

Đắc Lắc năm 2001 làm 911 học sinh và giáo viên bị nhiễm độc

Sau chất nổ, chất độc hoá học là phương tiện được ưu tiên lựa chọn để khủng bố vì các đặc điểm sau đây:

- Có thể gây sát thương hàng loạt, gây hoang mang, sợ hãi trong dân chúng

- Có thể sử dụng bằng nhiều phương pháp và nhiều dạng khác nhau, làm cho đối phương bất ngờ, khó đối phó: gây ô nhiễm nguồn nước, không khí, lương thực thực phẩm bằng chất độc dạng lỏng, dạng hơi, dạng khí dung, dạng bột

- Chất độc có khả năng tồn tại ở môi trường trong thời gian nhất định

- Công nghệ và nguyên liệu sản xuất chất độc hoá học tương đối đơn giản, dễ kiếm, có thể sử dụng quy trình sản xuất trong công nghiệp thông thường và rẻ tiền hơn so với chất phóng xạ và chất nổ Có ý kiến cho rằng, các nhóm khủng bố khó có khả năng về mặt công nghệ để sản xuất chất độc hoá học Nhưng theo một báo cáo của CIA, việc sản xuất các tác nhân hoá học và sinh học có thể gây sát thương nhiều người không khó hơn sản xuất heroin và các chất gây mê

- Việc phát hiện, chẩn đoán và xử trí NĐHL gặp nhiều khó khăn

Tuy nhiên, sử dụng chất độc hóa học để khủng bố cũng có một số khó khăn và hạn chế:

- Khó tạo được nồng độ chất độc cao để sát thương được nhiều người

- Cần phải có những phương tiện phun rải chất độc thích hợp và giữ được

bí mật bất ngờ

- Mục tiêu tấn công cần những điều kiện nhất định: tập trung đông người, ở những địa điểm chất độc không bị phân tán quá nhanh

+ Do chiến tranh có sử dụng vũ khí hoá học (VKHH)

VKHH bắt đầu được sử dụng như một loại vũ khí sát thương hàng loạt (Weapon of Mass Destruction-WMD) trong Đại chiến Thế giới lần thứ nhất Ngày 22-4-1915 quân đội Đức sử dụng khí clor để tấn công liên quân Anh-Pháp tại làng Ypres (thuộc Bỉ) làm 5000 người chết và 15000 người nhiễm độc Tổng

số chết trong cuộc Đại chiến Thế giới lần thứ nhất là 92.000 người và hơn 1,5 triệu người nhiễm độc

Trong đại chiến Thế giới lần thứ hai có nhiều nước trang bị vũ khí hoá học

và xuất hiện loại chất độc mới, chất độc thần kinh Trong thời kì “chiến tranh lạnh” cuộc chạy đua vũ trang giữa hai phe đã làm gia tăng kho vũ khí hoá học tàng trữ trên thế giới Trong những năm 60 của thế kỉ trước, Mỹ đẩy mạnh việc

nghiên cứu phát triển các loại chất độc hoá học mới Trong đó có vụ thử nghiệm chất độc VX ở vùng Dugway (Bang Utah) đã làm 6000 con cừu bị chết Năm

1984, quân đội Irắc dùng chất độc sarin và yperit tấn công vào thành phố Halabja của người Cuốc làm hơn 5000 người bị nhiễm độc với tỉ lệ tử vong 15%

+ Do ô nhiễm môi trường:

Đã xẩy ra nhiều trường hợp NĐHL do môi trường bị ô nhiễm, sau đây là một số vụ điển hình:

- Nguồn nước ở Bangladesh bị nhiễm asen là nguyên nhân gây NĐHL lớn nhất trong lịch sử Có khoảng một nửa dân số nước này bị nhiễm độc asen (35 triệu trong số 77 triệu dân)

- Năm 1958 ở vịnh Minamata (Nhật Bản), xuất hiện một loại bệnh lạ trong cư dân địa phương và sau đó nguyên nhân được xác định là do ô nhiễm methyl thuỷ ngân Bệnh này sau đó được đặt tên là “ bệnh Minamata”

-Trong hai năm 1971-1972, việc sử dụng thuốc diệt nấm hại hoa mầu có chứa methyl thuỷ ngân ở Irắc đã làm 6530 người nhiễm độc và 500 người chết

+ Do thực phẩm, thuốc và các sản phẩm sinh hoạt trong đời sống bị nhiễm độc:

Lịch sử đã ghi nhận nhiệu vụ NĐHL do thực phẩm, thuốc và các sản phẩm sinh hoạt bị nhiễm chất độc vì nhiều lý do khác nhau Sau đây là một số ví dụ:

- Vụ nhiễm độc dầu ăn ở Tây Ban Nha: 1981, 1000 người chết và 25.000 người bị nhiễm độc được coi là vụ nhiễm độc thực phẩm rất nghiêm trọng trong lịch sử châu Âu hiện đại Nguyên nhân là do dầu ăn bị nhiễm hoá chất trừ sâu

- Tháng 10-1992, 49 trẻ em ở một trường học thuộc tiểu bang New Jersey (Mỹ) xuất hiện các biểu hiện nhiễm độc sau bữa ăn trưa Xét nghiệm cho thấy hàm lượng MetHb trong máu của các trẻ em này đều rất cao và hàm lượng nitrit trong món súp lên tới 459ppm

- Năm 1996, ở Haiti xẩy ra vụ 76 trẻ em chết do uống paracetamol nhưng

có lẫn diethylenglycol

- Năm 2002, một số trẻ em ở thành phố New York (Mỹ) bị nhiễm độc thuốc diệt chuột Trung Quốc

1.2 biện pháp dự phòng và xử trí NĐHL

Mặc dù đã xẩy ra nhiều vụ NĐHL nhưng việc nghiên cứu và kế hoạch sẵn sàng ứng phó với các thảm hoạ hàng loạt do chất độc hoá học các vẫn chưa được các nước quan tâm đúng mức Sau vụ 11-9, nguy cơ khủng bố bằng các loại vũ khí sát thương hàng loạt nói chung, chất độc hoá học nói riêng đã tăng lên rõ rệt Vì vậy, nhiều quốc gia đã tiến hành hoạch định các phương án đối phó khi NĐHL xẩy ra

Theo một điều tra ở bang Georgia (Mỹ) do Richard B tiến hành cho thấy 73% bệnh viện không có phương án chuẩn bị xử trí thảm họa hàng loạt do chất

độc hoá học và phóng xạ, 73% số bệnh viện có bố trí một vị trí dành cho việc xử

lý vệ sinh, chỉ có 13% số bệnh viện có quy trình xử lý vệ sinh, 3% bệnh viện có kho thuốc dự trữ thuốc chống độc, 25% số bệnh viện” thỉnh thoảng” có tập huấn

về xử trí sự cố hàng loạt Bản điều tra kết luận: tất cả các bệnh viện đều không sẵn sàng để xử trí các sự cố hàng loạt

Nguyên nhân của tình hình đó có thể là do: quan niệm cho rằng điều đó không thể xẩy ra, thiếu hiểu bíêt về sự cố hàng loạt, không có kinh phí và thiếu phương tiện, trang bị

1.3 Phát hiện chất độc trong các vụ NĐHL

Phát hiện và xác định chất độc gây ra NĐHL trong các mẫu sinh học là một trong những nhiệm vụ quan trọng Mục đích của công việc này là nhằm phát hiện sớm các tác nhân gây ngộ độc để sử dụng các thuốc chống độc đặc hiệu và các biện pháp thích hợp cấp cứu và cứu sống nhanh nhất các nạn nhân

Công việc này bao gồm các vấn đề:

- Phát hiện sớm các dấu hiệu của một vụ NĐHL và thông báo kịp thời

- Sử dụng các phương pháp phát hiện nhanh, có tính chất định tính

- Lấy mẫu, vận chuyển, bảo quản

- Xử lý mẫu

- Tiến hành các kỹ thuật phân tích

- Xử lý và báo cáo kết quả

Để thông báo kịp thời các thông tin về việc sử dụng VKHH của đối phương, các phương pháp phát hiện phải cho kết quả rất nhanh và với độ nhậy

cao Ví dụ, với nồng độ 0,0005mg/lít sarin có thể gây nhiễm độc sau 5 phút tiếp xúc Như vậy, chất độc cần được phát hiện trong khoảng 2-3 phút để có thể thông báo kịp thời Tuy nhiên, trong các vụ NĐHL, yêu cầu này khó có thể thực hiện

được Trong vụ khủng bố ở Tokyo năm 1995, phải mất 4 giờ, mới có kết quả phân tích xác định là do sarin Trong khí đó, căn cứ vào dấu hiệu lâm sàng, các nhân viên y tế là những người đầu tiên khẳng định nguyên nhân và quyết định sử dụng thuốc chống độc đặc hiệu

Phương pháp phát hiện phải có khả năng xác định được chất độc ở nồng

độ thấp hơn mức có thể gây nhiễm độc (nồng độ ngưỡng) Ví dụ, nồng độ ngưỡng của sarin là 0,0025 mg/lít/phút, độ nhạy của phương pháp phát hiện phải đạt là 1.10-6 mg/lít

Các tiêu chuẩn để lựa chọn phương pháp phân tích gồm:

+ Độ nhậy

+ Thời gian tiến hành

+ Độ đặc hiệu

+ Chi phí

Ngoài ra, cần ưu tiên chọn phương pháp phát hiện các chất độc nguy hiểm,

có độc tính cao và gây nhiễm độc nhanh

1.3.1 Phương pháp lấy mẫu:

+ Lấy mẫu sinh học

Lấy mẫu sinh học trong phân tích độc chất phải tuân theo bốn nguyên tắc chính sau đây:

- Thời gian: phải lấy đúng thời gian thích hợp

- Khối lượng mẫu: Phải đủ lượng mẫu cần thiết để phân tích

- Bảo quản mẫu: Mẫu phải được bảo quản đúng cách, tránh phân huỷ

và nhiễm bẩn mẫu

- Vị trí lấy: Lấy tại vị trí tiếp xúc trực tiếp với chất độc (da, niêm

mạc, dịch dạ dày) Lấy mẫu ở những bộ phận hấp thu, chuyển hoá

và thải trừ chất độc (máu, nước tiểu, dạ dầy, gan, thận) và những bộ phận tích luỹ chất độc (não, mô mỡ, xương…)

1.3.2 Các phương pháp xử lý mẫu

Việc phân tích chất độc trong trong các mẫu sinh học (máu, nước tiểu, mô, dịch dạ dày…) rất khó vì chúng có nồng độ quá bé và nền mẫu rất phức tạp Vì vậy, quá trình xử lý mẫu là rất cần thiết nhằm làm giầu mẫu vượt qua ngưỡng giới hạn của các thiết bị phát hiện và loại bỏ các thành phần ảnh hưởng của nền mẫu Quá trình xử lý mẫu đối với các thể tích lớn thường rất phức tạp và bị ảnh bởi rất nhiều yếu tố

Các phương pháp xử lý các mẫu gồm chiết pha lỏng và chiết pha rắn

1.3.2.1 Chiết pha lỏng

+ Chiết lỏng – lỏng

Chiết lỏng-lỏng thường được sử dụng để làm sạch hoặc tách các loại cấu tử

ra khỏi mẫu mẹ Do các độ phân cực của các dung môi nằm trong một khoảng rộng nên rất thuận lợi cho việc tách Điểm bất lợi là việc sử dụng một thể tích lớn dung môi hữu cơ độc hại và đắt tiền, dụng cụ cồng kềnh, hiệu suất thu hồi kém Theo I.H Suffet, để đạt hiệu suất cỡ 90% thì tỷ lệ dung môi mẫu phải có tỷ lệ 1:5

+ Chiết lỏng - rắn

Chiết lỏng rắn được áp dụng để tách các chất phân tích rắn ra khỏi mẫu vật rắn bằng dung môi thích hợp Chất phân tích trong mẫu rắn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn vì vậy cần phải nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và chất phân tích Tuỳ thuộc vào độ phân cực của chất cần tách mà ta lựa chọn dung môi chiết Phương pháp này chủ yếu được áp dụng cho các mẫu rắn như đất, thực vật

1.3.2 2 Chiết pha rắn (SPE)

Ra đời từ giữa những năm 1970, phương pháp chiết pha rắn đã dần thay thế cho phương pháp chiết pha lỏng và được sử dụng rất nhiều trong các lĩnh vực phân tích Chiết pha rắn là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch các chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp thụ lên một cột hoặc đĩa pha rắn, sau đó chất phân tích được giải hấp bằng hệ dung môi thích hợp

ưu điểm của phương pháp chiết pha rắn là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch và làm giàu chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, có khả năng tương thích với phân tích sắc ký, tiết kiệm dung môi và là một phương pháp an toàn, đơn giản

dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt do đó tiết kiệm được thời gian

+ Vi chiết pha rắn:

Một kỹ thuật mới của chiết pha rắn là vi chiết pha rắn bao gồm một sợi thuỷ tinh silic chịu nhiệt phủ phim mỏng pha tĩnh được nhúng vào dung dịch hoặc không gian hơi để hấp lưu các chất cần phân tích sau đó đưa trực tiếp sợi này vào injectơ của máy sắc ký khí để giải hấp nhiệt hoặc bộ ghép nối với máy sắc ký lỏng cao áp để phân tích Kỹ thuật này được áp dụng đầu tiên vào vào phân tích lượng vết của các chất hữu cơ dễ bay hơi Gần đây, phương pháp này đã được

áp dụng rộng rãi để phân tích lượng vết các chất với hiệu quả cao

1.4 Phương pháp phân tích độc chất trong các mẫu sinh học trong phòng thí nghiệm

Đến nay có rất nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau đã và đang được ứng dụng Các kỹ thuật này được chia thành hai nhóm đó là phân tích hoá học và kỹ thuật phân tích công cụ Các phương pháp phân tích hoá học có ưu điểm là đơn giản, không cần đòi hỏi các máy móc phức tạp, đắt tiền, nhưng đòi hỏi nhiều thời gian, thao tác tỉ mỷ cẩn thận, nhưng chỉ cho phép xác định được các chất với hàm lượng lớn hơn 0,1%

Các kỹ thuật phân tích công cụ hiện đại dùng trong các phòng thí nghiệm nói chung và các phòng phân tích độc chất nói riêng có rất nhiều loại khác nhau Mỗi loại đều dựa trên các tính chất nhất định của các chất phân tích để xác định chúng Dựa theo phép đo, các phương pháp này được chia thành 5 nhóm:

+Phổ nguyên tử: do sự chuyển mức năng lượng của các điện tử hoá trị của

nguyên tử bị kích thích tạo ra, gồm có: phổ phát xạ nguyên tử (AES và ICP-AES); phổ hấp thụ nguyên tử(AAS); phổ huỳnh quang nguyên tử (AAS)

+Phổ của nguyên tử: do các điện tử nội (lớp K và L) của nguyên tử khi

kích thích mà sinh ra, gồm có: Phổ phát xạ và nhiễu xạ tia X; phổ huỳnh quang tia X (đây là hai nhóm phổ của nguyên tử tự do ở trạng thái khí)

+ Phổ của phân tử: do các điện tử hoá trị nằm trong trạng thái liên kết

của phân tử khi bị kích thích sinh ra, gồm có: phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS); phổ hấp thụ hồng ngoại (IR); phổ tán xạ Raman (RS)

+ Phổ khối lượng (MS): do các mảnh khối lượng của chất (nguyên tử

hay nhóm nguyên tử) của chất phân tích khi bị ion hoá tạo thành và chúng sinh ra phổ theo độ lớn của khối lượng

+ Phổ cộng hưởng từ: do sự cộng hưởng từ của điện tử hay của hạt nhân

nguyên tử tạo ra Loại phổ này gồm hai kiểu: Cộng hưởng từ hạt nhân (NMRS) và cộng hưởng từ điện tử (EMRS)

Các phương pháp phân tích theo phổ có ưu điểm như: nhanh, xét nghiệm hàng loạt, nồng độ phân tích thấp, có thể định tính và định lượng, có phương pháp phục vụ được cả xác định cấu trúc phân tử

Đối với việc nghiên cứu và phân tích các chất độc trong các phòng thí nghiệm, các phương pháp phổ có nhiều ưu việt, được sử dụng phổ biến hiện nay

1.4.2 Phương pháp điện di

Điện di là hiện tượng chuyển động của các phần tử nhỏ hay các phần tử mang điện trong một chất giá dưới ảnh hưởng của điện trường Sự phát hiện hiện tượng này đã có từ lâu, nhưng mãi đến năm 1809 mới được mô tả chi tiết lần đầu bởi nhà Bác học Nga Reuss

Trong những năm gần đây, điện di đã phát triển trở thành kỹ thuật rất có tiềm năng Lúc đầu, điện di được ứng dụng chủ yếu vào phân tích sinh học, nhưng gần đây, kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hoá học Do điện di có khả năng phân tách nhanh và có hiệu quả các hợp chất dạng ion, ion hoá và các hợp chất trung tính và dựa trên một kỹ thuật phân tác khác với sắc ký khí và sắc ký lỏng nên nó là một kỹ thuật rất có giá trị và có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký hiện đại để phân tích một số độc chất, khi các chất đó không thể phân tích được bằng các phương pháp sắc ký

1.4.3 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là một kỹ thuật vật lý và hoá lý để tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp Cơ sở của sự tách sắc ký là có sự phân bố các chất giữa hai pha: một pha cố định (pha tĩnh) và một pha di động (pha động) theo các tính chất hoá

động Căn cứ vào pha động hoặc hình dạng giá tựa của pha tĩnh người ta chia sắc

ký thành nhiều nhóm: Pha động là khí là sắc ký khí, pha động là lỏng là sắc ký lỏng Hay - sắc ký cột, sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký điện di…

Một số loại sắc ký thông dụng thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích độc chất là: Sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng và các loại sắc ký lỏng, sắc ký khí ghép khối phổ

+ Sắc ký lớp mỏng (TCL)

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được phát triển từ những năm 1950 và ứng dụng rộng rãi vì đây là phương pháp đơn giản, rẻ tiền

Ngày nay với sự cải tiến về kỹ thuật và có sự kết nối trực tiếp sắc ký lớp mỏng với các phương pháp phổ và các phương pháp phân tích khác Sắc ký lớp

mỏng đã phát triển thành một kỹ thuật phân tích công cụ có thể tự động hoá, được ứng dụng trong các phòng phân tích độc chất hiện đại

Thiết bị GC gồm nhiều bộ phận, nhưng có 2 bộ phận quan trọng nhất là cột tách và detector Nhờ hệ thống khí mang, mẫu phân tích được bơm vào buồng bơm mẫu và sau đó được dẫn vào cột tách Các cấu tử trong hỗn hợp mẫu sẽ rời

bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau và lần lượt đi vào detector, sự có mặt của từng cấu tử được chuyển thành tín hiệu điện, khuyếch đại, ghi lại và thu được kết quả là các sắc đồ Có nhiều loại cột tách khác nhau và cần đạt các yêu cầu sau:

- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh;

- Có độ thấm cao;

- Có khả năng tải trọng và hoà tan cao các cấu tử trong pha tĩnh;

- Có khoảng cách sử dụng nhiệt độ lớn, làm việc được ở nhiệt độ cao Cột tách sử dụng trong GC có thể là cột nhồi hoặc cột mao quản Cột nhồi

được chế tạo từ thuỷ tinh hoặc thép không gỉ, bên trong cột nhồi chứa chất mang, trên bề mặt chất mang được tẩm một lớp pha lỏng tương ứng Cột mao quản được chế tạo từ thuỷ tinh thông thường hoặc thuỷ tinh thạch anh với pha lỏng được tẩm trên thành trong của ống mao quản Cột mao quản có khả năng tách tốt, độ nhậy cao

Detector là một bộ phận rất quan trọng trong GC, dùng để phát hiện các cấu tử trong hỗn hợp nghiên cứu Detector phải có khả năng phát hiện mọi cấu tử

ở nồng độ thấp Hiện nay, các detector đã có khả năng phát hiện lượng chất ở mức độ ppb, ppt

Có nhiều loại detector như:

- Detector dẫn nhiệt TCD: Nhận biết các chất theo nguyên lý so sánh độ

dẫn nhiệt của khí mang tinh khiết và khí mangcó chứa cấu tử cần tách Detector TCD thường dùng để phân tích các khí vô cơ

- Detector ion hoá ngọn lửa FID: Nhận biết các chất dựa trên sự biến đổi

độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trường khi có chất cần tách chuyển qua Nhờ nhiệt độ ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ bị bẻ gẫy mạch, bị ion hoá để trở thành các ion trái dấu Các ion tạo thành được chuyển về các bản cực trái dấu có hiệu điện thế cao nằm ở 2 phía của ngọn lửa Dòng ion tạo nên sự sụt giảm hiệu điện thế, độ sụt áp được ghi lại và khuyếch đại để ghi nhận sự có mặt của các cấu tử cần tách

Độ nhậy của detector FID cao hơn TCD nhiều lần ( 100- 1000 lần) Tuy nhiên, detector FID chỉ thích hợp để phát hiện các hợp chất hữu cơ đơn thuần

- Detector cộng kết điện tử ECD: Detector ECD có chứa một nguồn phóng

xạ β được phát ra từ nguồn phóng xạ Ni63 bắn phá các phân tử khí mang, tạo ra các ion dương và các điện tử sơ cấp Nhờ tác dụng của điện trường tạo ra sẵn trong detector, các điện tử và ion dương chuyển động về các bản điện cực trái dấu tạo thành dòng điện nền Nếu dòng điện khí mang chứa mẫu là những chất mà phân tử của chúng có khả năng cộng kết điện tử thì các điện tử sơ cấp sẽ bị các nguyên tử hoặc phân tử này bắt giữ, làm sụt dòng điện nền, tạo thành tín hiệu tương ứng Các peak tín hiệu có độ lớn tương ứng với lượng chất có trong mẫu Detector ECD có các đặc trưng sau: nhậy cảm với nồng độ, giới hạn phát hiện

10-14 g/giây, khoảng động học 10-4 - 10-5 và có độ ổn định khá cao Detector ECD chọn lọc với các hợp chất ái điện tử, ví dụ: các hợp chất hữu cơ chứa các nguyên

tố phân nhóm 5,6,7 như N; P; 0; S và halogen

- Detector nhiệt ion hoá ngọn lửa FTD ( thường gọi là NPD): Chọn lọc

với các hợp chất chứa nguyên tố nitơ, photpho

+ Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được công nhận như là một kỹ thuật có

độ chính xác và độ nhạy cao để áp dụng cho phân tích lượng vết và siêu vết, vì sắc ký khí là một phương pháp rất hiệu quả trong việc tách rất nhiều cấu tử nhưng lại khó khăn trong việc định tính các chất có trong hỗn hợp phức tạp đó Ngược

đoán và làm sáng tỏ cấu trúc của các chất lạ từ những thông tin thu được của khối phổ đồ Như vậy hệ liên hợp sắc ký khí - khối phổ là một kỹ thuật ghép nối nhằm mục đích đạt được những chức năng ưu việt của hai thiết bị riêng rẽ

Trong kỹ thuật khối phổ có hai phương pháp ion hóa: bắn phá điện tử (EI)

và ion hóa bằng hóa học (CI) Kỹ thuật EI được sử dụng phổ biến hơn trong phân tích các chất độc chiến tranh Sự gắn kết GC và hai MS liên tiếp tỏ ra có nhiều hiệu quả và được rất nhiều nghiên cứu đề cập khi tiến hành phân tích các chất độc chiến tranh đặc biệt là các chất độc nhóm lân hữu cơ

Phương pháp GS-MS là phương pháp rất phổ thông trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về các chất độc Borrett và cộng sự đã dùng phương pháp này với cả hai kỹ thuật ion hóa để nghiên cứu xác định khoảng 60 chất độc khác nhau của nhóm các chất độc lân hữu cơ, tìm được các ion mảnh đặc trưng của chúng Sokolowski và Witkiewicz sử dụng GC-MS làm công cụ nghiên cứu sự phân hủy của chất độc sarin trong các loại ancol mạch thẳng [53] D’agostino và Provost đã

sử dụng kỹ thuật GC-EI-MS nghiên cứu quá trình thủy phân của một số chất nhóm lân hữu cơ, sử dụng dung môi dichloromethane để chiết

Nhìn chung phương pháp GC-MS cho phép xác định các chất độc ở giới hạn tương đối thấp khoảng ng trong các mẫu có thành phần nền phức tạp D’agostino đã nghiên cứu gắn hai lần MS đã cho phép có thể phát hiện từ 30-70

pg các chất độc nhóm này, trong đó chất độc sarin định lượng ở số khối từ 99-79 m/z [53]

Phương pháp GC-MS đã được dùng phân tích các mẫu thực tế thu tại làng người Kurd ở phía bắc Irắc, giáp biên giới Iran khi quân đội dùng để đàn áp người Kurd Từ các mẫu như đất, mảnh bom, tấm thảm đã tìm thấy 21 chất khác nhau Phương pháp này được dùng để phân tích các mẫu huyết thanh của các nạn nhân trong vụ khủng bố bằng chất độc sarin năm 1995 ở Tokyo và nhận thấy nồng độ chất độc sarin trong các mẫu huyết thanh của nạn nhân từ 0,2-4,1 ng/ml [63]

Black và các cộng sự đã sử dụng phương pháp GC-MS và GC-MS-MS phân tích các chất độc chiến tranh bằng kỹ thuật SIM (chọn lọc ion), xác định các chất trong các mẫu như đất, mẫu quần áo, mảnh kim loại Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 6 mẫu đất nghiên cứu tác giả đã tìm thấy chất độc sarin và các sản phẩn chuyển hóa của chúng Với kỹ thuật này cho phép phát hiện nồng độ của các chất này trong mẫu môi trường tương đối thấp từ ppm-ppb

+ Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)

Hiện nay phương pháp này được phát triển rất nhanh đặc biệt là kỹ thuật ghép nối hai lần khối phổ Phương pháp này cho phép mở rộng việc phân tích đối với các chất độc chiến tranh, đặc biệt đối với các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong những mẫu có thành phần nền phức tạp Từ những năm 1980, rất nhiều kỹ thuật LC-MS được nghiên cứu nhưng liên quan đến các chất độc chiến tranh thì

kỹ thuật TS-MS (ion hóa bằng phun nhiệt) được ứng dụng nhiều hơn cả ngay từ những năm đầu 1990 Một số tác giả nghiên cứu và nhận thấy tính ưu việt của kỹ thuật này khi phân tích các chất độc chiến tranh

Kỹ thuật TS-MS rất tiện dụng, đơn giản đã được các tác giả ứng dụng phân tích xác định chất độc sarin và các chất nhóm độc thần kinh cũng như các sản phẩm phân hủy của chúng Nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật TS-MS-MS để xác định các chất phân hủy của nhóm lân hữu cơ trong các mẫu nước Các phổ ion thu được cho các dữ liệu để xác định các chất, ngoài ra tỷ lệ các tín hiệu nhiễu cũng được tăng lên Nhìn chung kỹ thuật ghép hai lần khối phổ được sử dụng để tăng độ chính xác khi xác định một chất chuyển hóa trên nền mẫu có thành phần phức tạp

Có một số kỹ thuật ion hóa khác cũng được ứng dụng để xác định các sản phẩm chuyển hóa như ES-MS-MS với ion âm tỏ ra có hiệu quả hơn ion dương Black và Read đã dùng kỹ thuật LC-APCI-MS để phân tích các sản phẩm thủy phân của các chất độc thần kinh và của chất độc loét da yperit Đặc biệt đã ứng dụng LC-MS trong phân tích các sản phẩm phân hủy của các chất độc thần kinh trong các mẫu sinh học Noort và cộng sự đã dùng kỹ thuật micro-LC-ES-MS-MS

để kiểm tra IMPA - một sản phẩm thủy phân của chất độc sarin trong các mẫu môi trường cũng như trong mẫu sinh học Phương pháp cho phép phát hiện IMPA trong huyết thanh của các nạn nhân tại Tokyo, kết quả cho thấy hàm lượng IMPA trong huyết thanh của các nạn nhân có hàm lượng từ 1-135 ng/ml

D’Agostino và các cộng sự dùng kỹ thuật LC-ESI-MS để xác định chất

độc sarin, soman và các chất chuyển hóa của chúng bằng kỹ thuật chiết siêu tới hạn, với cột mao quản để phân tích, có sự so sánh với phương pháp GC-MS đối với các mẫu đất khác nhau

+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

Sắc khí lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích hiện đại và được ứng dụng rất rộng rãi Với những ưu điểm riêng của mình, nó đã tỏ ra rất có hiệu quả không những trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản mà còn trong nhiều lĩnh vực khác HPLC bổ xung cho sắc ký khí vì nó cho phép phân tích các hợp chất không ổn định nhiệt, không bay hơi và độ phân cực cao HPLC thích hợp với việc phân tích lượng vết các hỗn hợp chất có độ phân cực khác nhau lớn

Pha tĩnh trong HPLC theo các kỹ thuật phân tách sau: sắc ký hấp phụ, sắc

ký pha đảo, sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử Trong đó sắc ký pha đảo

được sử dụng thông dụng nhất

Các loại pha động được lựa chọn dựa vào cả các chất phân tích và kiểu tách, kiểu xác định

Sự phân tách các chất thường sử dụng kiểu pha động gradien thành phần giữa nước và một dung môi hữu cơ thích hợp, thường là metanol và acetonitril Một dung môi hữu cơ thứ ba có thể sử dụng, như tetrahydrofuran cũng được sử dụng nhưng với hàm lượng thấp hơn Ngoài ra một số muối vô cơ thỉnh thoảng cũng được thêm vào pha động

Các detectơ của HPLC thường là UV, huỳnh quang (FLD), điện hoá Có nhiều loại detectơ như: detectơ hấp thụ quang phân tử UV-Vis, detector huỳnh quang, detector khối phổ, detector đo chiết suất, detector đo độ dẫn

+ REMIDi HS (Rapid Emergency Drug identification– High Sensitivity)

REMIDi HS của hãng BIO-RAD (Mỹ) là một thiết bị kết hợp giữa HPLC với một hệ thống xử lý mẫu tự động có thể tách, chiết lượng vết các chất phân tích từ mẫu sinh học và một số nền mẫu đơn giản khác Bên cạnh đó, hệ thống REMEDi HS được trang bị sẵn phần mềm tự động nhận dạng chất dựa vào 1 thư viện gần 1000 chất độc thường gặp và có thể bổ xung các chất mới vào thư viện nhận dạng

REMIDi HS được chế tạo với chức năng chính là sàng lọc (screening) vì nhiều trường hợp nhiễm độc do nhiều loại chất độc kết hợp và không dự đoán trước được chất gây nhiễm độc Tuy nhiên, hệ thống này cũng có thể dùng để

định lượng

Khác với các thiết bị phân tích sắc ký khác (sắc ký khí, sắc ký lỏng cao

áp…) hệ thống REMIDi HS không cần phải dự đoán trwớc chất cần tìm để lựa chọn các điều kiện phân tích và xử lý mẫu thích hợp Quá trình chuẩn bị mẫu

đ−ợc đơn giản hoá tối đa Quá trình tách chiết mẫu đ−ợc tự động hoá, có thể đo

50 mẫu cùng một lúc, rút ngắn thời gian phân tích

Độ nhạy của hệ thống khá cao: ng−ỡng phát hiện của REMIDi HS đối với hầu hết các thuốc là 100ữ 300ng/l

Do đó REMIDi HS có thể phục vụ đợc rất nhiều các chuyên ngành khác nhau nh−:

- Cấp cứu nhiễm độc

Cấu tạo của Biosensor gồm có:

• Thành phần sinh học: Vi khuẩn, mô, thụ thể, enzym, kháng thể, acid

nucleic

• Transducer: Điện cực, sợi quang học, tinh thể áp điện, bán dẫn

Khi chất cần phân tích tác dụng với thành phần sinh học sẽ tạo nên một phản ứng sinh học, tín hiệu này sẽ được bộ phận transducer tiếp nhận và chuyển

đến bộ phận điện tử để chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu vật lý, sau đó ghi lại

Sử dụng biosensor có các ưu điểm sau:

- Độ nhậy và độ đặc hiệu cao

- Quy trình tiến hành đơn giản, công việc xử lý mẫu không phức tạp

- Thời gian tiến hành nhanh, có thể thực hiện trong điều kiện dã ngoại

- Giá thành tương đổi rẻ so với các phương pháp phân tích truyền thống

- Thiết bị đo đơn giản, không phức tạp như sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao Thiết bị đo sử dụng biosensor phát hiện kim loại nặng chỉ là một máy

đo cường độ ánh sáng

Ngày nay, biosensor được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như:

- Y học: Ví dụ: biosensor phát hiện đường, insulin trong máu

- Dược: Kiểm nghiệm thuốc

- Môi trường: biosensor phát hiện kim loại nặng asen, thuỷ ngân, chì trong nước,đất

- An toàn thực phẩm: biosensor phát hiện chất độc trong rau quả, thịt, cá

- Công nghiệp mỏ: phát hiện các loại khí độc

- Kiểm tra an ninh sân bay: biosensor phát hiện thuốc nổ, ma tuý

- Quân sự và chống khủng bố: Biosensor được dùng để phát hiện chất độc quân sự Mỹ đã chế tạo được biosensor phát hiện chất độc thần kinh

Bộ môn độc học và Phóng xạ quân sự Học viên Quân y trong khuôn khổ

đề tài nhà nước KC10-13 đã nhập biosensor phát hiện asen, thuỷ ngân và áp dụng

trong thực tế

Hình 1.2: Nguyên lý phát hiện kim loại nặng bằng phương pháp biosensor Nguyên lý phát hiện kim loại nặng bằng phương pháp biosensor

1 Trong mẫu thử không có kim loại nặng: quá trình tổng hợp luciferase bị ức chế, làm cho mức độ phát sáng của vi khuẩn thấp

2 Trong mẫu thử có kim loại nặng: Quá trình tổng hợp luciferase được hoạt hoá, làm vi khuẩn phát sáng ở mức độ cao

Xét nghiệm asen (Arsenic Biotest for detection of Arsenic compounds) của hãng Aboatox sử dụng vi khuẩn Escherichia coli MC 1061 Khi có mặt của asen trong mẫu thử, vi khuẩn sẽ tăng cường độ phát sáng và sử dụng thiết bị đo cường độ ánh sáng Aboatox 1253 để phát hiện asen

Kỹ thuật này có giới hạn phát hiện thấp (với asen là 2-4ppb; thuỷ ngân là 0,05-2ppb), độ chính xác và độ nhạy cao, tiến hành đơn giản hơn so với các xét nghiệm kim loại truyền thống như quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), điện hoá, trắc quang Thời gian xét nghiệm nhanh, có thể tiến hành hàng trăm xét nghiệm trong ngày Thiết bị nhỏ, gọn, có thể xét nghiệm ngay tại hiện trường, giá thành

- Xác định hoạt tính của enzym cholinesterase

Phương pháp xác định hoạt tính enzym cholinesterase (ChE) được ứng dụng phổ biến để phát hiện hợp chất lân hữu cơ và cacbamat Vì cơ chế của hợp chất lân hữu cơ và cacbamat là ức chế ChE, làm ngừng phản ứng thuỷ phân acetylcholin thành acid acetic và cholin, người ta đã sử dụng việc xác dịnh hoạt tính enzym nay để định tính và định lượng loại chất độc này:

ChE ↓

Acetycholin Acid acetic + cholin

Việc xác định hoạt tính enzym ChE bằng cách đánh giá tốc độ phản ứng thuỷ phân acetylcholin thông qua sự hình thành các sản phẩm của phản ứng là acid acetic và cholin Có nhiều phương pháp xác định hoạt tính ChE Phương pháp kinh điển là đo số lượng acid acetic tạo thành như một thước đo cho hoạt tính enzym ChE Phương pháp xác định hoạt tính ChE phổ biến hiện nay là phương pháp Ellman

Tác giả Ammon đưa ra khái niệm” đơn vị ChE” là lượng enzym trong 1

giờ, ở nhiệt độ 370 C và pH 7,4 thuỷ phân10-6 M acetylcholin

Đã có nhiều loại phương tiện phát hiện CĐTK dựa trên nguyên lý xác định hoạt tính ChE như:

- Giấy thử CĐTK,

- Kit phát hiện nhanh CĐTK

Ngoài ra còn có rất nhiều các phương pháp khác được sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích, như:

- Phương pháp miễn dịch,

- Phương pháp phân tích đồng vị phóng xạ…

Chương II

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu sinh học ( máu, nước tiểu, dịch nôn )

Hoá chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Silicagel 60 (kích thước hạt 0,063 - 0,200 mm) của Merck

- Catridge BONDII ODS-C18 loại 200 mg hãng ACCU;

- Kít hoá chất và dung môi chạy máy chuyên dùng cho thiết bị REMIDi HS do hãng Biorad (Mỹ) cung cấp

Các hoá chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu và phân tích asen đều là loại hoá chất tinh khiết không lẫn asen gồm:

- Máy quang phổ tử ngoại UV-VIS 3010 Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiếm CAMSPEC M350 (Anh)

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AA6501S

Bộ phận tạo hydrua HVG-1

Đèn catot rỗng

- Lò vi sóng ETHOSD Microwave Labstation Milestone

- Máy ly tâm Rotofix 32, ALC 4232 Cetrifuge

- Máy ly tâm phù hợp với các cột 16 ì 125mm, với lực ly tâm tối đa

- ống lọc (0,22àm) (BIO-RAD chuyên dùng cho hệ thống REMIDi HS)

- Thìa xúc hoá chất (kim loại)

- Các ống nghiệm lấy máu

- Cốc betxe nhựa chia vạch

- Chai đựng hoá chất nhựa

- Giấy thử pH

- Lọ đựng mẫu dùng cho GC: 2ml

- Bình định mức các loại dung tích: 10 ml, 25 ml 50 ml và 100 ml

- Bộ pipetman: 10àl-5 ml

- ống ly tâm 15 ml, 50 ml thuỷ tinh hoặc polypropylen có nắp đậy

- Chén nung teflon dung tích 100 ml có nắp đậy

- Cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 100, 250 ml

- Các dụng cụ phụ trợ khác

+ Vật liệu nghiên cứu

- Các HCBVTV chuẩn chuẩn do Cục BVTV, Bộ NN&PTNT cung cấp, bao gồm: methamidophos, methyl parathion, điazinon, dimethoat, fenitrothion, fenobucarb, isoprothiolan, lindan, endosulfan, atrazin

- Chất chuẩn As (III) và As (V) của Merck

- Chất chuẩn natri cyanua; kali cyanua và kali thiocyanua của Merck

2.2 Phương pháp nghiên cứu

+ Cyanua: sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis trong quá trình

nghiên cứu phân tích, xác định và xây dựng quy trình phát hiện

+ Asen: Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) và

phương pháp biosensor trong quá trình nghiên cứu phân tích, xác định asen; mẫu sinh học (nước tiểu, dịch nôn)

+ Các HCBVTV:

-Sử dụng REMIDi HS trong quá trình nghiên cứu nhận dạng sự có mặt của các HCBVTV (chủ yếu là nhóm cơ photpho, một nhóm được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam)

- Sử dụng phương pháp sắc ký khí-khối phổ trong quá trình nghiên cứu phân tích, xác định và xây dựng qui trình phát hiện trong mẫu sinh học

- p-nitrophenol: Sử dụng phương pháp HPLC trong quá trình nghiên cứu

phân tích xác định và xây dựng qui trình phát hiện trong mẫu sinh học

+ Xác định hoạt độ cholinesterase: Sử dụng phương pháp “Xác định hoạt độ

của Cholinesterase Standard Method 94’- Mỹ” trong quá trình nghiên cứu phân

tích xác định và hoàn thiện thường qui xác định hoạt độ của cholinesterase

2.3 Thực nghiệm

2.3.1 Phân tích cyanua trong các mẫu sinh học

- Nguyên lý:

Thường quy kỹ thuật này áp dụng định lượng CN-trong mẫu nước tiểu thông qua việc định lượng hàm lượng thiocyanat

Thiocyanat trong mẫu phân tích được oxy hoá bằng kali permanganat trong môi trường acid ở nhiệt độ thích hợp, giải phóng ra acid cyanhydric Acid cyanhydric tạo thành phản ứng với picrat tạo ra một dung dịch có màu và được xác định bằng quang phổ kế tại bước sóng 510nm Cơ chế của phản ứng như sau: 6MnO4- + 5SCN- + 13H+ = 6 Mn2+ + 5 HCN + 5 SO42- + 4 H2O

3HCN + picrat izopurpurin + HCNO (dung dịch có màu)

+ Pha dung dịch chuẩn

Kali thiocyanat được sấy đến khối lượng không đổi ở 60oC

Dung dịch gốc thiocyanat (10%): Cân chính xác 1g SCN- vào bình định mức 10ml, thêm nước cất hai lần đến vạch mức

Dung dịch chuẩn thực nghiệm: được pha từ dung dịch gốc thành các dung

dịch có nồng độ 1000ppm, 100ppm

Các dung dịch gốc và chuẩn thực nghiệm được đựng trong chai thuỷ tinh nâu nút mài và bảo quản trong tủ lạnh

Chuẩn bị giấy tẩm picrat:

Ngâm giấy lọc vào dung dịch axit picric bão hoà trong nước trong 30 phút, sau đó lấy ra phơi, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Ngâm tiếp giấy trên vào dung dịch natri cacbonat 10% trong 30 phút, sau đó lấy ra, ép vào giữa hai tờ giấy lọc khác,

để khô tự nhiên như trên khi khô, cắt nhỏ giấy lọc thành các mảnh có kích thước 1,5ì1,5 cm

+ Xây dựng quy trình xác định cyanua trong mẫu nước tiểu

- Khảo sát tác nhân oxy hoá thiocyanat

Dung dịch thioxyanat được phản ứng với KMnO4, K2Cr2O7và Ce(SO4)2trong môi trường H2SO4 trong lọ kín có chứa giấy tẩm picrat Sau khi ổn nhiệt

300C trong 6giờ, giấy được rửa giải trong 3,5ml nước cất trong 20 phút và được

- Khảo sát nồng độ và thể tích các tác nhân oxy hoá thiocyanat

Để lựa chọn điều kiện phản ứng oxy hoá thiocyanat trong môi trường nước tiểu chúng tôi đã khảo sát sát nồng độ dung dịch KMnO4 với các nồng độ sau: 1ữ2M và thể tích của dung dịch từ 0,5-2 ml và H2SO4 với các nồng độ sau: từ 1ữ2M

và thể tích của dung dịch từ 0,5-2ml ở nhiệt độ 30oC trong 8h Theo dõi độ hấp thụ của từng loại dung dịch

- Khảo sát nhiệt độ và thời gian tiến hành phản ứng

Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng từ 3ữ 6giờ và nhiệt độ phản ứng từ 30 ữ

600C Theo dõi độ hấp thụ của từng loại dung dịch

+ Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn ngoại suy định lượng cyanua và xác định độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp

Khoảng tuyến tính được khảo sát với các dung dịch có độ pha loãng khác nhau từ dung dịch gốc, theo dõi độ hấp thụ của các dung dịch

- Xây dựng đường chuẩn

Dựa vào kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định khoảng tuyến tính của phương pháp ở trên, đường chuẩn được xây dựng với các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính

- Xác định độ chính xác của phương pháp

Xác định độ chính xác của phương pháp được tiến hành bằng cách định lượng các dung dịch có các lượng thiocyanat chính xác được thêm vào

+ Cách tính kết quả định lượng

Hàm lượng cyanua được tính theo công thức sau

1

2 )

(

V

V C K ppm

Trong đó:

Cx: là hàm lượng thiocyanat có trong mẫu được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính

K: là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng thiocyanat sang hàm lượng cyanua theo phương trình phản ứng (K= 0,45)

Thỏ không phân biệt giống, có trọng lượng 1,8 - 2,2kg được tiêm một liều 1mg KCN/kg khối lượng duy nhất vào tĩnh mạch tai thỏ Khi thỏ xuất hiện triệu chứng, nhanh chóng cấp cứu bằng Na2S2O3 10%, kết hợp hô hấp nhân tạo cho đến khi thỏ trở về trạng thái bình thường Nuôi thỏ trong chuồng có hệ thống hứng nước tiểu để lấy mẫu Nước tiểu thỏ được phân tích tại các thời điểm 0; 1; 5; 10; 24; 30; 40; 48 và 60 giờ sau nhiễm độc

2.3.2 Asen

Phân tích asen bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

+ Pha dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc

Dung dịch chuẩn gốc của As (III) (1000 ppm):

Cân chính xác 1,3200 g As2O3 đã sấy khô ở nhiệt độ 110 0C trong thời gian 1 h vào cốc có dung tích 250 ml, thêm 50 ml HCl (d=1,19), khuấy cho tan hết Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức có dung tích 1000 ml, định mức bằng dung dịch HCl 3N, lắc đều Bảo quản trong điều kiện mát

Dung dịch chuẩn gốc của As (V) (1000 ppm):

Cân chính xác 1,5339 g As2O5 đã sấy khô ở nhiệt độ 110 0C trong thời gian 1 h vào cốc có dung tích 250 ml, thêm 50 ml HCl (d=1,19), khuấy cho tan

hết Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức có dung tích 1000 ml, định mức bằng dung dịch HCl 3N, lắc đều Bảo quản trong điều kiện mát

- Dung dịch làm việc:

Để có dung dịch As (III) và As (V) có các nồng độ nhỏ hơn, bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn gốc tương ứng với dung dịch HCl 4N Các dung dịch này thường dùng ngay khi pha, bảo quản trong điều kiện mát

- Các loại dung dịch khác

Dung dịch KI 20 % (g/ml):

Cân 50 g KI vào cốc có dung tích 250 ml, cho vào cốc 100 ml nước cất, khuấy cho tan hết Cho dung dịch vào bình định mức 250 màu nâu, dùng nước cất tráng sạch cốc, rồi định mức tới vạch Bảo quản dung dịch chỗ tối, trong điều kiện mát Dung dịch có thể dùng trong 1 tuần

+ Tối ưu hóa điều kiện phân tích

Qua hướng dẫn của nhà sản xuất đối và tham khảo các tài liệu chúng tôi rút ra một số điều kiện khi tiến hành phân tích As đối với máy quang phổ hấp thụ nguyên tử loại AA 6501S như sau:

- Bước sóng dùng để đo là 197,3 nm

- Độ rộng của khe sáng là 0,5 nm

- Chiều cao đèn nguyên tử hóa là 10 nm

- Cường độ dòng đèn catot rỗng là 10 mA

- Lưu lượng khí C2H2 và không khí là 1,2 l/ph và 6,2 l/ph tương ứng

Ngoài một số thông số này, còn một số thông số rất quan trọng cho quá trình phân tích As trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử mà các nhà sản xuất cũng như qua các tài liệu chúng tôi nhận thấy có sự sai khác đáng kể Xuất phát

từ vấn đề đó chúng tôi đã tiến hành chọn các thông số này qua nghiên cứu thực nghiệm

- Khảo sát nồng độ các chất tham gia tại buồng phản ứng

Chuẩn bị các dung dịch của NaBH4 và HCl cho phản ứng tạo asin, điều chỉnh tốc độ dẫn các dung dịch này và mẫu vào buồng phản ứng bằng cách chỉnh tốc độ của bơm nhu động

- Khảo sát nồng độ của NaBH 4 và HCl

Để khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaBH4 ta cố định nồng độ của dung dịch HCl là 4 N và khảo sát sự thay đổi của nồng độ NaBH4 ảnh hưởng đến

độ hấp thụ nguyên tử với các nồng độ khác nhau từ 0,1-1,0 %

Khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ HCl ta cố định nồng độ của NaBH4 theo kết quả vừa khảo sát, nồng độ HCl được khảo sát từ 0,5-8,0 N

- Khảo sát điều kiện khử

Nồng độ KI cho phản ứng khử:

Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ KI từ 0,4-3,2% trong thời gian 40 phút trên bếp cách thủy

Thời gian cho phản ứng khử:

Tiến hành khảo sát trong khoảng thời gian từ 10-60 phút, phản ứng khử

được đun trên bếp cách thủy

- Tách và làm giàu As bằng cộng kết với La(OH) 3

Khảo sát sự ảnh hưởng của một số nguyên tố có trong mẫu lên hiệu suất thu hồi của phương pháp khi dùng La(OH)3 làm tác nhân cộng kết Các nguyên tố chọn nghiên cứu là Cu, Ni, Co, và Zn có hàm lượng khoảng 50 mg cho mỗi nguyên tố

Dùng 4 ml dung dịch LaCl3 3,8% thêm vào 200 ml dung dịch có chứa các nguyên tố trên trong môi trường NH4OH có pH ~ 9, trong điều kiện này As kết tủa cùng La(OH)3 Lọc, rửa và hòa tan hoàn toàn kết tủa bằng axit HCl 4N, dung dịch thu được đem đun trên bếp cách thủy trong 20 phút, để nguội và đo hấp thụ

- Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn ngoại suy của phương pháp phân tích định lượng As được xây dựng đối với các dung dịch chuẩn có các nồng độ 2; 5; 10 và 20 ppb

- Đánh giá sai số và giới hạn phát hiện của phương pháp

Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp

Dùng dung dịch 0,5 ppb để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp

- Av là độ hấp thụ của nồng độ Cmin

Đánh giá sai số của phương pháp

Chúng tôi chọn 05 cấp nồng độ khác nhau nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn, mỗi cấp nồng độ lặp lại 05 lần các kết quả thí nghiệm được xử

Trong đó: - X: Hàm lượng As trong mẫu, tính bằn ppb

- Am: Độ hấp thụ của dung dịch mẫu, tính bằng ABS

- Ac: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn, tính bằng ABS

- Khảo sát lựa chọn dung dịch vô cơ hóa

Với 2,5 gram mẫu cơm đã được nghiền nhỏ cho lần lượt các dung dịch sau

- Khảo sát nhiệt độ và thời gian tiến hành vô cơ hóa

ảnh hưởng của thời gian

Sau khi có kết quả nghiên cứu dung dịch vô cơ hóa ta tiến hành khảo sát thời gian cần thiết để vô cơ hóa triệt để mẫu Thời gian được khảo sát từ 5-15 phút

ảnh hưởng của công suất lò vi sóng (nhiệt độ)

Chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của công suất lò từ 140-160 W

+ áp dụng qui trình tiến hành phân tích As trong một số mẫu môi trường thực tế

Một số mẫu trong thực tế giám định đã được chúng tôi tiến hành phân tích theo phương pháp này tại phòng thí nghiệm Hóa Pháp lí, Viện Khoa học Hình sự trong thời gian từ năm 2002 đến nay

- Để 18giờ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Sử dụng trong ngày, không cần bảo quản

Chất nền Luxiferin

- Thêm 6,1ml nước tinh khiết vào lọ chứa chất nền Luxiferin

- ổn định tại nhiệt độ phòng trong 5phút

- Sau khi pha, chất nền phải được để trong bóng tối, tại nhiệt độ phòng

và sử dụng trong vòng 8giờ sau khi pha

Pha dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc: các dung dịch chuẩn gốc của Asen (III) và (V) 75ppm được cung cấp kèm theo kit

Dung dịch làm việc: Để có dung dịch As (III) và As (V) có các nồng độ nhỏ hơn, bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn gốc tương ứng

Mẫu nước là các mẫu nước mặt được phân tích tích ngay hoặc bảo quản ở

40C đến khi phân tích

+ Khảo sát khoảng tuyến tuyến, xây dựng đường chuẩn ngoại suy định lượng asen và xác định độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp

Khoảng tuyến tính được khảo sát với các dung dịch có độ pha loãng khác nhau từ dung dịch gốc, theo dõi cường độ phát sáng của các dung dịch

- Xây dựng đường chuẩn

Dựa vào kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định khoảng tuyến tính của phương pháp ở trên, đường chuẩn được xây dựng với các dung dịch có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính

- Xác định độ chính xác của phương pháp

Xác định độ chính xác của phương pháp được tiến hành bằng cách định lượng các dung dịch có các lượng asen chính xác được thêm vào

Đánh giá sai số của phương pháp

Chúng tôi chọn 05 cấp nồng độ khác nhau nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn, mỗi cấp nồng độ lặp lại 05 lần các kết quả thí nghiệm được xử

Trong đó: K: hệ số quy nạp của mẫu

Li: Cường độ ánh sáng trong dung dịch chuẩn

Kết quả mẫu dương tính (có asen) khi K > 2

- Định lượng

Hàm lượng asen được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính Phải

lập các đường chuẩn riêng ứng với mỗi bộ kit khác nhau

+ Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật phân tích As trong mẫu nước

Mẫu thu hồi được tiến hành bằng cách thêm các lượng mẫu chuẩn xác

định khác nhau vào nều mẫu nước đã được xác định không có asen, rồi tiến hành

phân tích như quy trình

+ Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật phân tích As trong mẫu nước tiểu

Mẫu thu hồi được tiến hành bằng cách thêm các lượng mẫu chuẩn xác

định khác nhau vào nều mẫu nước tiểu đã được xác định không có asen, rồi tiến hành phân tích như quy trình

+ Xử lý chất thải

- Tất cả các mẫu có chứa asen phải được thu gom và xử lý thích hợp

- Các chất thải chứa vi khuẩn phải được tiệt trùng bằng nồi hấp, bất hoạt vi khuẩn bằng cách dùng cloramin B 10%

+ Khảo sát một số mẫu thực tế

-Mẫu nước tiểu (Nghiên cứu invivo)

Thỏ có trọng lượng: 2kg + 0,2kg Trước và sau nhiễm độc, thỏ được nuôi dưỡng trong điều kiện ăn uống và vệ sinh của động vật thí nghiệm

Đánh độc thỏ bằng asen vô cơ: Sử dụng dụng cụ chuyên dùng đưa một

liều duy nhất 8mg/kg trọng lượng chất độc dinatri arsenat vào dạ dầy thỏ

Với asenic hữu cơ: Sau khi cạo lông khu vực đánh độc, bôi vào da thỏ chất

độc quân sự lewisite với một liều duy nhất 2mg/kg thể trọng

Toàn bộ nước tiểu của từng con thỏ được thu hồi theo từng thời điểm: trước nhiễm độc và sau nhiễm độc 5, 7, 12, 24, 30, 48 giờ Xác định hàm lượng asen như quy trình đã mô tả trên

- Mẫu nước

Các mẫu thực tế là các mẫu nước được lấy tại khu vực Sơn Tây và Thanh trì

- Hà Nội Tổng số 122 mẫu, gồm 82 mẫu tại Sơn Tây: 14 mẫu nước giếng đào, 36 mẫu nước giếng khoan, và 32 mẫu nước máy Tại Thanh - Trì Hà Nội 40 mẫu giếng khoan Thời gian thực hiện: tháng 11 năm 2003

2.3.3 Phân tích hoá chất bảo vệ thực vật trong mẫu sinh hoc

+ Pha dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc đơn của mỗi chất được pha bằng cách cân 10mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 ml dùng aceton định mức tới vạch (nồng độ

1000 ppm)

Hỗn hợp dung dịch chuẩn thực nghiệm với các nồng độ 10 ppm và 20 ppm

được pha từ dung dịch chuẩn gốc đơn của mỗi chất như sau: lấy 100 àl mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn của các chất sau: diclovos; dimethroat; atrarin; cacbaryl; simarin; metolaclo; fenthion; parathion; clopyriphos; metylparathion và lấy 200àl của diuron; diazinon; malathion và fenitrothion vào bình định mức 10ml thêm etyl axetat đến vạch chuẩn

+ Chuẩn bị cột chiết

1,5g nhựa XAD-4 (Merck) được nhồi đầy các cột nhồi là các ống plastic của Supelco có thể tích 6ml Đặt các miếng lót bông thuỷ tinh lên phía trên và phía dưới lớp hấp phụ

+ Thu mẫu:

Mẫu huyết thanh:

Lấy 10 ml máu không chống đông, tiến hành ly tâm 10.000vòng/phút trong 5 phút thu huyết thanh

Mẫu huyết thanh được phân tích ngay hoặc bảo quản 2ữ80C cho đến khi phân tích

Mẫu nước tiểu:

Lấy 100 ml nước tiểu không sử dụng chất bảo quản, tiến hành ly tâm 4000vòng/phút trong 5 phút loại bỏ cắn

Mẫu được phân tích ngay hoặc bảo quản 2ữ80C cho đến khi phân tích

+ Chuẩn bị mẫu và chiết

- Mẫu huyết thanh: 5ml được hoà loãng bằng 5ml nước cất, khuấy nhẹ bằng đũa thuỷ tinh, để ổn định tại nhiệt độ phòng trong 60phút Mẫu được đưa lên cột chiết và để chảy tự nhiên cho đến hết, tráng cột bằng 5 ml nước cất Dùng bơm chân không hút khô cột trong thời gian khoảng 20 phút Sau đó dùng các hệ dung môi để rửa giải

- Mẫu nước tiểu: 50ml được đưa lên cột chiết và để chảy tự nhiên cho đến hết, tráng cột bằng 5 ml nước cất Dùng bơm chân không hút khô cột trong thời gian khoảng 20 phút Sau đó dùng các hệ dung môi để rửa giải

+ Các khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình

Các mẫu huyết thanh của quá trình khảo sát được chuẩn bị bằng cách lấy 5ml huyết thanh hoặc 50ml nước tiểu được thêm 200àl hỗn hợp chuẩn thực nghiệm Lắc kỹ trong 1phút để ổn định trong 10 phút và thực hiện như trong quy trình

+ Cách tính kết quả

- Định tính:

Thời gian lưu và các ion mảnh đặc trưng của các cấu tử được sử dụng để nhận diện bằng cách so sánh với thời gian lưu và các số khối của các ion mảnh

đặc trưng của các cấu tử xác định để nhận diệm với chất chuẩn

- Định lượng

Nồng độ của HCBVTV trong mẫu nước được tính theo công thức:

V

V C ppm

+ Điều kiện phân tích đa dư lượng các HCBVTV trên GC-MS

Để đảm bảo các kết quả phân tích được chính xác, cần tiến hành tối ưu hóa

điều kiện phân tích trên GC-MS Đầu tiên thiết bị MS được đặt ở chế SCAN để xác định về mặt định tính và thời gian lưu trên cột Điều kiện chạy tối ưu của máy GC-MS để phân tích các HCBVTV trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.4

được trình bày sau đây:

Bảng 2.4: Các thông số tối ưu cho quá trình phân tích đa dư lượng các

HCBVTV trong nghiên cứu các mẫu sinh học

Nhiệt độ (0C)

Thời gian giữ

REMIDi HS (Rapid Emgency Drug indentification) là một loại thiết bị có

khả năng nhận dạng, phân tích nhanh với độ nhạy cao và khả năng sàng lọc diện

rộng Máy có thể phát hiện nhiều loại chất cùng các chất chuyển hoá của trong cơ

thể chỉ bằng một lần xét nghiệm duy nhất Nhờ vào chức năng sàng lọc này nên

có thể phát hiện được nhiều loại hoạt chất mà không cần có sự dự đoán trước

+ Lập thư viện nhận dạng các HCBVTV lân hữu cơ

Các HCBVTV lân hữu cơ thường được sử dụng trong nông nghiệp, được

khảo sát trong các mẫu nước và mẫu nước tiểu và huyết thanh với nồng độ

10ppm Các mẫu này được bơm vào thiết bị REMIDi HS để kiểm tra và lập thư

viện nhận dạng