Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, nhân hạt tạo trong nhân nhanh một số cây có giá trị kinh tế

Kết quả và thảo luận - Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các giống cây hồng môn lên cảm ứng tạo callus từ mô lá - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất nhóm auxin với

bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn

viện di truyền nông nghiệp

báo cáo tổng kết đề tài kc 04.19

nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong nhân nhanh một số cây

danh sách những người thực hiện đề tài kc 04-19

được giao

A PGS.TS Đỗ Năng Vịnh Viện Di truyền Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài

B Cán bộ tham gia nghiên cứu

1 PGS TS Trần Văn Minh Viện SH Nhiệt Đới CN đề tài nhánh

2 TS Dương Tấn Nhựt TT KH Đà lạt CN đề tài nhánh

3 TS Nguyễn Thị Lý Anh Trường ĐH NN I CN đề tài nhánh

4 TS Đoàn Duy Thanh Viện Di truyền Nông nghiệp

5 PGS.TS Lê Huy Hàm Viện Di truyền Nông nghiệp

6 ThS Cao Thị Huyền Trang Viện Di truyền Nông nghiệp

7 TS Hà Thị Thuý Viện Di truyền Nông nghiệp

8 KS Chu Bá Phúc Viện Di truyền Nông nghiệp

9 CN Dương Minh Nga Viện Di truyền Nông nghiệp

10 CN Đỗ Minh Phú Viện Di truyền Nông nghiệp

11 CN Phạm Thị Kim Hạnh Viện Di truyền Nông nghiệp

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Bài tóm tắt

Mở đầu

I Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong

nhân nhanh cây lily

1 Tóm tắt sản phẩm KHCN thu được ở đối tượng lily

2 Tổng quan tài liệu về lily

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

- Qui trình công nghệ tạo củ nhỏ và siêu nhỏ ở lily

- Qui trình tạo hạt nhân tạo

- Qui trình tạo củ siêu nhỏ trong bioreactor

4 Kết quả và thảo luận

- Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các giống cây hồng môn lên cảm ứng tạo callus từ mô lá

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất nhóm auxin với cytokinin đến phản ứng tạo callus của các loại mô in vitro

- Nghiên cứu tái sinh chồi bất định qua nuôi cấy lỏng và nuôi cấy lỏng lắc kết hợp nuôi cấy đặc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và chất điều tiết sinh trưởng đến tạo phôi vô tính và nảy mầm phôi

- Nghiên cứu nhân phôi bằng nuôi cấy bioreactor

- Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo

- Nghiên cứu giá thể cho cây vườn ươm giai đoạn sau in vitro

III Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong

nhân nhanh cây sa nhân

1 Tóm tắt sản phẩm KHCN thu được ở đối tượng sa nhân

2 Tổng quan tài liệu về sa nhân

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

- Hoàn thiện qui trình nhân nhanh sa nhân in vitro

- Tạo củ siêu nhỏ từ cây sa nhân in vitro

- Nghiên cứu tạo, tái sinh mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính ở sa nhân

- Nghiên cứu nhân sinh khối callus phôi hoá sa nhân

- Nghiên cứu khả năng phát sinh phôi vô tính của sa nhân

- Các nghiên cứu giai đoạn vườn ươm

VI Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong

nhân nhanh cây gỗ tếch

1 Tóm tắt sản phẩm KHCN thu được ở cây tếch

2 Tổng quan tài liệu về cây tếch

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

- Tạo vật liệu nuôi cấy in vitro cây tếch

- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các loại mô nuôi cấy khác nhau

ở cây tếch

- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá ở cây tếch

- Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá

- Quy trình tạo hạt tếch nhân tạo

- Hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây tếch

- Quy trình kỹ thuật chăm sóc tếch sau nuôi cấy in vitro

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các lát cắt thân và lá non Bạch

đàn

- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá ở Bạch đàn

- Nghiên cứu tạo phôi mầm từ lát cắt mỏng thân chồi Bạch đàn in vitro

- Quy trình tạo hạt Bạch đàn nhân tạo

- Quy trình kỹ thuật chăm sóc Bạch đàn sau nuôi cấy in vitro

VI Nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính, hạt nhân tạo trong

nhân nhanh cây Trầm hương

1 Tóm tắt sản phẩm KHCN thu được ở Trầm hương

2 Tổng quan tài liệu về cây Trầm hương

3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

4 Kết quả và thảo luận

- Tạo vật liệu nuôi cấy in vitro cây Trầm hương

- Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá từ các loại mô nuôi cấy khác nhau

ở cây Trầm hương

- Nghiên cứu nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá và tạo phôi vô tính

- Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy phát sinh phôi mầm Trầm hương

- Quy trình tạo hạt nhân tạo từ phôi mầm Trầm hương

- Hoàn thiện quy trình vi nhân giống Trầm hương

- Quy trình kỹ thuật chăm sóc Trầm hương sau nuôi cấy in vitro

VII Nghiên cứu áp dụng công nghệ Bioreactor trong nhân nhanh

một số cây có giá trị kinh tế

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3 Kết quả và thảo luận

- Nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá thông qua hệ thống

Tài liệu tham khảo

Phụ lục1 Khóa luận sinh viên và luận văn tốt nghiệp

Phụ lục 2 Các bài báo có liên quan đến đề tài KC 04-19 Phụ lục 3 Các hợp đồng đào tạo và chuyển giao công nghệ liên quan đến đề tài KC 04-19

C¸c ch÷ viÕt t¾t

α-NAA α- Naphtalene acetic acid

2,4-D 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid BAP Benzyl amino purine

C§HST ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng

GA3 Giberrelin

Mở đầu

Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng hoàn thiện quy trình tạo phôi vô tính ở quy mô thí nghiệm và trong các

bioreactor

- Xây dựng được quy trình tạo hạt nhân tạo

- Xây dựng quy trình công nghệ sau in vtrro, xác định được giá thể và điều kiện môi

trường thích hợp cho hạt nhân tạo và củ siêu nhỏ Tạo được một trăm nghìn cây khoẻ

Mục tiêu dài hạn: Mở rộng ứng dụng công nghệ mới cho các cây lâm đặc sản và

cây trồng quý hiếm khác

Nội dung nghiên cứu

1.1 Tạo phôi vô tính

• Nghiên cứu ảnh hưởng của các mô nuôi cấy khác nhau lên quá trình phát sinh, phát triển và nhân nhanh phôi vô tính ở các đối tượng nghiên cứu của đề tài (Cây lâm nghiệp: Dòng bạch đàn U6, tếch, cây Trầm hương; Cây dược liệu: sa nhân, Các cây hoa: hồng môn và hoa loa kèn thơm - Lily thơm)

• Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đối với sự phân hoá, sinh sản và sinh trưởng của phôi vô tính trong điều kiện nuôi cấy đặc, lỏng lắc và Bioreactor

• Xây dựng quy trình nhân phôi vô tính ở quy mô thí nghiệm và quy mô sản xuất trong

các Bioreactor

1.2 Tạo củ siêu nhỏ - Micro

• Nghiên cứu quá trình phát sinh củ siêu nhỏ ở cây Loa kèn và cây sa nhân trong các môi trường và phương thức nuôi khác nhau (môi trường đặc tĩnh, lỏng lắc, Bioreactor)

• Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự phát sinh, số lượng và chất lượng của củ micro ( khả năng nảy mần của củ)

1.3 Công nghệ hoá quá trình nhân giống bằng Bioreactor

• Xây dựng quy trình công nghệ bioreactor nhằm sản xuất phôi vô tính, củ nhỏ và siêu nhỏ

1.4 Tạo hạt nhân tạo

• Nghiên cứu tạo các màng bọc hạt nhân tạo từ các chất liệu khác nhau và một số chất

bổ sung thích hợp cho bảo quản và nảy mầm của hạt nhân tạo (gồm phôi vô tính và củ)

• Nghiên cứu quy trình sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính và củ siêu nhỏ

1.5 Công nghệ vườn ươm

• Nghiên cứu các kỹ thuật vườn ươm thích hợp cho nảy mầm của hạt nhân tạo và củ siêu nhỏ trong điều kiện nhiệt đới nước ta

• Nghiên cứu chế tạo và sản xuất giá thể từ vật liệu hữu cơ và khoáng vật sẵn có ở nước

ta Nghiên cứu các mẫu khay chậu trồng cây thích hợp cho số lượng cây sống khoẻ

mạnh tối đa / m2

1.6 Xây dựng mô hình:

• Nghiên cứu xây dựng mô hình trồng thử các cây của đề tài

nghiên cứu áp dụng công nghệ phôi vô tính,

hạt nhân tạo trong nhân nhanh lily

Sản phẩm của đề tài:

A Các giống tuyển chọn

- Viện Di truyền Nông nghiệp tuyển chọn 12 giống lily (thứ tự 1 đến 12)

- Trường đại học Nông nghiệp I tuyển chọn 4 giống (thứ tự 13 đến 16)

- Phân viện sinh học Đà Lạt sử dụng 2 giống (thứ tự 17, 18)

18 giống trên đều là những giống cho hoa đẹp, hấp dẫn, màu sắc đa dạng, có khả năng thương mại hoá cao, đặc biệt nhiều giống sinh trưởng tốt, thích hợp với khí hậu nhiệt đới

Bảng 1 Danh sách 18 giống tuyển chọn làm vật liệu nghiên cứu

Đốt thân, vảy củ

13 Lilium Oriental Hybrid “ StaGazer” chồi in vitro, lá non, đoạn thân mang mắt

ngủ, cánh hoa, bầu quả, bao phấn, đế hoa

14 Lilium Asiatic Hybrid “Conecticut King”

15 Lilium LA Hybrid “Royal Trinial”

chồi in vitro thu được từ protocorm

16 Lilium Oriental Hybrid “Siberia” Vảy củ in vitro

17 Lilium longiflorum 'nellie white' Vảy củ in vitro và ex vitro, đế hoa, thân non

18 Lilium Oriental Tiber đế hoa, thân non

1 2 3 5

Lilium longiflorum Thunb Lilium Oriental Sorbone

Lilium Oriental Tiber Lilium longiflorum 'nellie white'

Hµ néi, trang 875-879

+ NguyÔn Th¸i Hµ, D−¬ng Minh Nga, Hµ ThÞ Thuý, Lª Thu VÒ, Lª Huy Hµm, §ç N¨ng VÞnh (2003) Nghiªn cøu kh¶o nghiÖm vµ nh©n nhanh mét sè gièng Lilium nhËp néi, Th«ng tin C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp

+ Nghiªn cøu t¹o cñ lily in vitro vµ sù sinh tr−ëng cña c©y trång tõ cñ

in vitro T¹p chÝ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n sè 1/2005

+ NguyÔn ThÞ Thanh HiÒn, Mai ThÞ Ngäc H−¬ng, TrÇn Ngäc Thuû Tiªn, Phan Xu©n Huyªn, D−¬ng TÊn Nhùt, §ç N¨ng VÞnh (2003) B−íc ®Çu nghiªn cøu viÖc t¹o h¹t nh©n t¹o vµ øng dông trong nh©n gièn v« tÝnh vµ b¶o qu¶n B¸o c¸o khoa häc, Héi nghÞ CNSH toµn quèc, Hµ néi, trang 935-938

+ D−¬ng TÊn Nhùt, NguyÔn Quèc ThiÖn, NguyÔn Thµnh H¶i, §oµn ThÞ Quúnh H−¬ng, NguyÔn ThÞ Thuý H»ng, NguyÔn Ngäc Kim Vy, NguyÔn V¨n B×nh, Phan Xu©n Huyªn, NguyÔn ThÞ DiÖu H−¬ng, §ç N¨ng VÞnh (2004) Nu«i cÊy láng vµ nu«i cÊy tho¸ng khÝ trong viÖc gia t¨ng sù t¸i sinh chåi vµ n©ng cao chÊt l−îng c©y hoa lily ( Lilium longiflorum) T¹p chÝ CNSH 2 (4): 487-499

+ D−¬ng TÊn Nhùt, TrÇn Ngäc Thuû Tiªn, Mai ThÞ Ngäc H−¬ng, NguyÔn ThÞ Thanh HiÒn, Phan Xu©n HuyÒn, Bïi V¨n LÖ, §ç N¨ng VÞnh (2004) Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ h¹t nh©n t¹o cña hoa lily (Lilium spp.), T¹p chÝ CNSH, 2 (3): 359-370

+ D−¬ng TÊn Nhùt, NguyÔn ThÞ HuyÒn Tr©m, NguyÔn Thµnh H¶i, Phan Nh· Uyªn, Hµ ThÞ Thuý, §ç N¨ng VÞnh (2006) ¶nh h−ëng cña kiÓu gen hoa lily lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh tõ nu«i cÊy líp máng tÕ bµo c¾t ngang th©n non vµ v¶y cñ T¹p chÝ CNSH §· chÊp nhËn ®¨ng

+ Duong Tan Nhut, Nguyen Thi Huyen Tram, Truong Kim Phuong, Nguyen Thi Dieu Huong, Phan Xuan Huyen, Nguyen Tri Minh, Tran Linh Thuoc, Bui Van Le, Do Nang Vinh (2005) Effect of explant age

on direct somatic embryogenesis by culturing young stem transverse thin cell layers of Lilium longiflorum Proceedings of Vietnam-Korea International symposium on Biotechnology and Bio-system engineering Nong Lam University, pp 139-144

+ Quy tr×nh TBKT:

§−îc Bé NN vµ PTNT c«ng nhËn t¹m thêi (Q§ 2215Q§/BNN-KHCN 22/8/04: BiÖn ph¸p kü thuËt nh©n nhanh gièng hoa lilium b»ng nu«i cÊy m« T¸c gi¶: §ç N¨ng VÞnh vµ céng sù: NguyÔn Th¸i Hµ, D−¬ng Minh Nga, Hµ ThÞ Thuý, Lª Thu VÒ, Lª Huy Hµm

Chương i Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu về chi Lilium

1.1.1 Phân loại

Chi Lilium thuộc họ Liliaceae, bộ Liliales, phân lớp Liliidae, lớp

Liliopsida (Võ Văn Chi, 1977) Họ Liliaceae là một trong những họ thực vật

lớn nhất với 200 chi và hơn 3000 loài Chi Lilium gồm khoảng 220 loài, trong

đó một số loài được trồng cách đây tới 3000 năm Sau năm 1950, khoảng

1000 giống lily mới đã được lai tạo và đăng ký trên thế giới với nhiều giống

lai có nguồn gốc từ hai loài Nhật Bản L auratum và L speciosum (Pelkonen,

2005)

Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia các loài thuộc chi Lilium

thành 7 nhóm như sau (Woodcock and Stearn, 1950):

Bảng 1.1 Phân loại các loài thuộc chi Lilium

Nhóm Loài

1 Nhóm Martagon L distichum, hansonii, martagon, tsingtauense

2 Nhóm American a) L bolander, columbianum, kelloggii, humboldtii, rubescens,

washingtonianum b) L maritimum, nevadense, occidentale, pardalinum, parryi, parvum, roezlii c) L canadense, grayi, iridollae, michauxii, michiganense, superbum d) L catesbaei, philadenphicum

3 Nhóm Candidum L bulbiferum, candidum, carniolicum, chalcedonicum, monadelphum,

polyphyllum, pomponium, pyrenicum

4 Nhóm Oriental L auratum, brownii, japonicum, nobilissimum, rubellum, speciosum

5 Nhóm Asiatic a) L davidii, duchartrei, henryi, lancifolium, lankogense, leichtlinii,

papilliferum b) L amabile, callosum, cernuum, concolor, pumilum c) L bakerianum,

6 Nhóm Trumpet a) L leucanthum, regale, sargentiae, sulphureum

b) L formosanum, longiflorum, neilgherrense, philippinense, wallichianum

Dựa vào kiểu nảy mầm, người ta chia lily

thành hai nhóm chính: nhóm nảy mầm trên mặt đất

và nhóm nảy mầm dưới mặt đất (hình 1.1) Theo

kiểu thứ nhất, hạt nảy mầm ngay sau khi gieo,

không có ngủ nghỉ và cây con không bị ức chế sinh

trưởng Ngược lại, kiểu nảy mầm thứ hai thường bị

kiểm soát bởi ngủ nghỉ, ngủ nghỉ chỉ được giải

phóng sau khi xử lý hạt và củ ở nhiệt độ thấp

Kiểu nảy mầm đóng vai trò quan trọng trong

tiến hoá do nó có tính di truyền và tính đặc hiệu loài Hầu hết các loài lily Eurasian và American đại diện cho kiểu nảy mầm gián đoạn dưới mặt đất trong khi phần lớn các loài Asiatic đại diện cho kiểu trên mặt đất không gián

đoạn (Pelkonen, 2005)

1.1.2 Phân bố

Lilium phân bố chủ yếu ở châu á, châu Âu và Bắc Mỹ (hình 1.2) Trung

Quốc là trung tâm phát sinh chủ yếu của lily, chiếm khoảng 50% các loài lily trên thế giới, trong đó có 30 loài và 18 giống nguyên bản (Zhao et al., 1996) Khu vực Bắc Mỹ đóng góp 20 loài được phân thành loài phương Đông và phương Tây Chưa tìm thấy loài lily nào có nguồn gốc từ bán cầu Nam (Pelkonen, 2005)

Như vậy, hầu hết các giống Lilium đều thích hợp với khí hậu khô, mát

mẻ, đặc biệt trên các vùng núi cao Ngoài ra, có một số giống chịu nhiệt thường tập trung ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt, trong đó có 3 loài quan

trọng là L neilgherense từ Nam ấn Độ, L formosanum từ Đài Loan, Trung Quốc và L longiflorum từ Nam Nhật Bản và Đài Loan Những loài này đều có

đặc điểm là cây khoẻ, chịu nhiệt, ra hoa sớm và thích hợp ra hoa quanh năm (Woodcock and Stearn, 1950)

Hình 1.2 Bản đồ phân bố địa lý của các loài

lily nguyên bản

a) Các loài Eurasian phân bố từ Đại Tây Dương qua Địa Trung Hải và Trung Âu tới dãy núi Caucasus và Uran b) Hầu hết các loài American phân bố từ Đại Tây Dương

đến Trung Tây Sự phân bố của các loài phương Đông

bị giới hạn bởi dãy núi Rocky và Thái Bình Dương

c) Hầu hết các loài lily nguyên bản đều có nguồn gốc

Đông á, phân bố từ Thái Bình Dương đến dãy núi Uran

và Caucasus, Bắc ấn, Burma ở phía Nam và Siberia ở phía Bắc

1.1.3 Đặc điểm sinh học của chi Lilium

a) Cấu trúc cơ quan

Hầu hết các thành viên thuộc chi Lilium là những cây lưu niên, có cơ

quan dự trữ dạng củ, hoa lưỡng tính nhưng thường có tính tự bất hoà hợp Hình 1.3 cho thấy cơ quan chính của cây lily trưởng thành bao gồm rễ chính,

củ và cành hoa Kích thước, hình dáng của các cơ quan này thay đổi rất nhiều trong cùng một chi Củ thường không có lớp vỏ bảo vệ, đĩa gốc củ là thân, còn vảy củ là lá chuyên hoá chứa nước và dinh dưỡng

dự trữ Mô phân sinh đỉnh tạo ra cành hoa trong

khi mô phân sinh nách sẽ tiếp tục sinh trưởng và

tạo ra các củ bên sau khi chồi chính chết đi Hoa

mọc cách hoặc đối xứng toả tròn trên đỉnh cành

Hoa lily đẹp, hấp dẫn với nhiều kích thước, màu

sắc khác nhau và là hình mẫu cho cấu trúc hoa của

cây một lá mầm (Võ Văn Chi, 1977; Pelkonen,

2005)

b) Cấu trúc hệ gen

Lily là một trong những thực vật có kích

thước hệ gen lớn nhất và thay đổi giữa các loài Ví

dụ, hệ gen ADN của L henryl có tới 32 tỷ cặp Hình 1.3 Cấu trúc cơ quan ở lily

basơ và ở một số loài có thể tới 100 tỷ Kích thước lớn một phần là do các trình tự lặp lại liên tiếp trong NST, các trình tự này vẫn tồn tại qua hàng triệu năm tiến hoá, chứng tỏ tính bảo thủ cao trong cấu trúc hệ gen lily (Suzuki and Nakano, 2002) Hệ gen được cấu tạo bởi các NST tâm giữa và tâm cận mút lớn Số lượng NST lưỡng bội bình thường (2n=24) chiếm ưu thế ở các loài và giống lai, cũng như các giống tuyển chọn, chỉ có một số rất nhỏ là dạng tam bội (3n=36) bất thụ Ngoài ra, dạng tứ bội cũng được tìm thấy trong tự nhiên

và những loài này thường hữu thụ Số lượng NST bất thường cũng có thể quan sát được ở các loài nghiên cứu nhưng sự tồn tại của chúng rất hiếm (Pelkonen, 2005)

1.1.4 Chi Lilium- một chi có giá trị kinh tế cao

Lily, tulip và fressia là ba cây có củ quan trọng nhất, chiếm 24% thị

trường hoa thế giới (Nhut, 2001a) Lilium đứng hàng thứ bảy về sản lượng hoa

cắt và cũng là cây trồng chậu rất phổ biến, chủ yếu nhờ hoa lớn, đẹp, có hương thơm ngọt ngào với nhiều màu sắc hấp dẫn (Suzuki and Nakano, 2002)

Tuy nhiên, đây là loại cây được trồng bằng củ nên nguồn củ giống đóng vai trò quyết định đến tình hình sản xuất lily trên quy mô thương mại Năm

2002, sản lượng củ Lilium chiếm 19% tổng sản lượng củ thế giới, chỉ đứng sau Tulipa (39%) và tương đương với Narcissus (20%) (De Hertogh and Le Nard,

2003) Trong đó, Hà Lan là nước đứng đầu về xuất khẩu củ với thị trường tiềm năng nhất là Mỹ, tiếp theo là Đức, Nhật, Anh, Italy, Pháp và Canada (Trim , 2005) Hàng năm, Hà Lan sản xuất tới một tỷ củ giống lily cho hoa cắt xuất khẩu, đạt giá trị khoảng 300 tỷ guider (Van Tuyl, 1997) Hiện nay, thị trường hoa tại Mỹ, Đức và Nhật Bản đang phát triển mạnh Đặc biệt, Nhật Bản được

đánh giá là quốc gia có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất về nhập khẩu và tiêu thụ hoa trên thế giới Ngoài ra, các nước châu á như Trung Quốc, Hàn Quốc,

ấn Độ cũng đóng góp đáng kể vào ngành công nghiệp này (Cut Flower Production in Asia, FAO, 1998)

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất hoa lily ở một số nước

TT Nước Năm 89/90/ha Năm 97/98/ha Năm 99/2001/ha

đặc biệt là những giống có hương thơm (Ly and Linh, 2004)

Với các điều kiện thuận lợi đó, ngành trồng hoa Việt Nam đang có những bước chuyển biến mạnh mẽ như đầu tư, mở rộng diện tích trồng hoa, nâng cao sản lượng và chất lượng hoa xuất khẩu tại các trang trại lớn ở Lâm

Đồng và một số tỉnh miền Bắc Hiện nay, công ty Dalat Hasfarm là nhà xuất khẩu hoa lily chính ở nước ta

Quy trình vi nhân giống Lilium spp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

đã và đang được xây dựng hoàn thiện sẽ là nguồn cung cấp củ giống với số lượng lớn, chất lượng cao, đồng nhất và ổn định Qua đó, giúp các nhà trồng hoa giảm chi phí nhập củ giống từ nước ngoài cũng như chủ động về nguyên liệu sản xuất trong nước cho hoa cắt và cây trồng chậu

Như vậy, tiềm năng sản xuất hoa lily ở nước ta là rất lớn, cùng với sự phát triển của các quy trình vi nhân giống hiện nay, chắc chắn ngành trồng hoa Việt Nam sẽ có những bước tiến vững chắc hơn trong thời gian tới

1.2 Nghiên cứu nhân giống vô tính trên đối tượng lily

Nhân giống vô tính lily theo phương pháp truyền thống

Nhân giống truyền thống ở lily gặp nhiều khó khăn do những trở ngại chính trong việc điều khiển ngủ nghỉ của củ Mặt khác, thời gian ngủ nghỉ rất khác nhau giữa các giống lily gây bất lợi cho sản xuất hoa trên quy mô thương mại (Vũ Văn Vụ, 1997; Okubo, 2000)

Củ lily có thể tái sinh bằng các phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung: ở phần nách vảy hoặc nách lá (phần tiếp xúc giữa vảy và đĩa gốc hoặc giữa gốc lá và thân) có một mắt ngủ, sau này sẽ phát triển thành củ bên Trong đó, phương pháp phổ biến nhất của sản xuất củ truyền thống là kỹ thuật tách vảy sinh đôi (twin-scaling) Củ cái được loại bỏ lá, rễ và cắt dọc thành 4- 16 mảnh tuỳ theo kích thước của củ, mỗi mảnh được cắt thành các mảnh nhỏ hơn gồm 2 vảy gắn với đĩa gốc Từ một củ lớn có thể thu 30- 60 vảy

đôi, những vảy này được vùi trong giá thể ẩm, thoáng khí như cát hoặc đất pha

và tạo củ nhỏ sau 2-3 tháng (Meerow, 2001)

Nhõn giống bằng hạt cú nhiều ưu điểm như cú thể thu được nhiều hạt trong một thời gian ngắn từ một vài cõy mẹ cú chất lượng cao, đặc biệt là ở

Lilium thỡ virus khụng thể nào lõy lan từ cõy mẹ sang cõy con bằng hạt Do

vậy, mức độ nhiễm virus của cỏc cõy nhõn giống bằng hạt là khỏ thấp

Tuy nhiờn, ngoài những thuận lợi trờn thỡ hầu hết cỏc giống Lily đều được nhõn giống vụ tớnh vỡ cỏc cõy nhõn giống hữu tớnh từ hạt thường khụng đồng nhất, thường xuất hiện những biến dị di truyền Sau đõy là một vài phương phỏp nhõn giống vụ tớnh cõy hoa Lily:

a Tạo củ từ thõn

Nhiều loài cú giỏ trị thương mại quan trọng đều tạo củ từ phần phớa dưới của thõn Cỏc củ này cú nguồn gốc từ nỏch của cỏc lỏ giống như lỏ bắc (Blaney và Roberts, 1966) Số lượng và tốc độ tăng trưởng của củ cú rất nhiều

khác biệt, phụ thuộc vào điều kiện trồng như chiều sâu bên dưới đất của củ

mẹ, cách cắt chồi hoa

b Tạo củ từ thân khí sinh

Củ từ thân ký sinh được tạo thành từ nách của những thân mọc bên trên mặt đất Sự cắt chồi hoa thúc đẩy sự tăng trưởng của các củ con này Những

giống Lily không tự tạo củ bằng cách này, chẳng hạn như L longiflorum, có

thể được cảm ứng bằng cách phun lên lá hợp chất cytokinin (tetrahydropyrany-2-yl)-9H-purine (PBA) (Nightingale, 1979)

6-benzylamino-9-c Tạo củ bất định từ vảy củ

Khi tách vảy củ khỏi củ mẹ thì từ vảy củ đó có thể tạo thành củ bất định hướng vào vị trí gần với vết thương dưới những điều kiện thích hợp Các củ này có nguồn gốc từ sự phân chia của các tế bào biểu bì và bên trong biểu bì (Godden và Watson, 1962) Nhiều loài Lily có thể được nhân giống vô tính theo cách nêu trên và phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sản xuất một

số lượng lớn các cây sạch bệnh và có chất lượng Tất cả các vảy củ, ngoại trừ vảy củ nhỏ nhất nằm phía bên trong củ, đều có thể sử dụng được (Rees, 1972)

Sau khi đã được bảo vệ khỏi sự tấn công của nấm (bằng cách ngâm vảy trong dung dịch Benlate, Difolatan, hay những hợp chất diệt nấm khác) thì

các vảy củ có thể trồng trực tiếp ngoài đất trồng (như trường hợp của L longiflorum) hoặc có thể ủ ở nơi cát ẩm hay vermiculite đã bão hòa nước

trong những túi polyethylene trước khi mang ra trồng trong đất (Hartmann và Kester, 1975) Nồng độ oxygen trong túi phải đủ cao, đặc biệt trong 7 tuần đầu

Củ có thể lấy vảy vào bất kỳ thời điểm nào trong năm, tuy nhiên khoảng thời gian đầu tiên ngay sau khi hoàn tất sự ra hoa được cho là tốt nhất (Emsweller, 1957) Trong thực tế thì củ thường được lấy vảy vào sau vụ thu

hoạch hố muộn hoặc vào thu Vảy từ những củ đó qua xử lý đụng lạnh (3-5 thỏng ở 10oC đối với L longiflorum Hinomoto hoặc 2 tuần ở 0oC đối với giống Enchantment) thỡ ra nhiều củ hơn (Matsuo và Arisumi, 1979)

Nói chung, các kỹ thuật nhân giống vô tính thông thường có một số nhược điểm: hệ số nhân rất thấp, thường chỉ tạo được một củ nhỏ từ mảnh vảy

củ với thời gian cảm ứng ngủ nghỉ kéo dài (2- 3 tháng), tốc độ sinh trưởng

chậm và chỉ giới hạn ở một số giống Lilium, lây lan bệnh trong quá trình nhân giống (Nhut, 1998)

Nuôi cấy mô tế bào ở Lilium spp

Nuôi cấy mô tế bào được xem là phương pháp hiệu quả nhất để tạo củ giống chất lượng cao, sạch bệnh với số lượng lớn, ổn định, đồng nhất về mặt di truyền, đáp ứng mục đích sản xuất củ trên quy mô thương mại ở nhiều giống

Lilium (Gamborg, 2002; Nhut, 1998; Pelkonen, 2005) Các củ lily in vitro có

thể được sản xuất thông qua hai con đường: phát sinh cơ quan (củ) và phát sinh phôi

1.2.1 Nuụi cấy mụ phõn sinh

Hiện tại thỡ cú đến 9 loại virus ảnh hưởng đến cõy hoa Lily, trong số đú thỡ LSV là loại virus thường thấy nhất Những cố gắng để tạo cỏc cõy sạch bệnh LSV được bắt đầu vào những năm 1970 ở Mỹ và sau đú là tại Hà Lan Kỹ thuật được sử dụng là nuụi cấy mụ phõn sinh Mụ phõn sinh được dựng để nuụi cấy cú kớch thước thay đổi từ 0,2-0,4 mm (Nishizawa và Nishi, 1996)

đến 0,5-2,0 mm (Asjes et al., 1974) Cỏc cõy con phỏt sinh từ nuụi cấy mụ

phõn sinh sống tốt sau khi chuyển sang đất trồng Tuy nhiờn, bằng cỏc phương phỏp kiểm tra miễn dịch học, huyết thanh học hoặc bằng cỏch soi cỏc

tế bào dưới kớnh hiển vi điện tử, người ta cũng phỏt hiện rằng cỏc cõy từ con đường nuụi cấy mụ phõn sinh vẫn cú thể mang virus (Walkey, 1978)

1.2.2 Tạo củ in vitro thông qua con đường tái sinh trực tiếp

Củ lily có thể được tái sinh in vitro trực tiếp từ vảy củ hoặc đốt thân

Đặc điểm chung của các phương pháp này là tạo củ bên từ những cơ quan vốn

được xem là trung tâm phát sinh củ (đĩa gốc, đốt thân) và củ hình thành thường không có hiện tượng biến dị (Nhut, 1998)

Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật nuôi cấy lát cắt của các cơ quan, bộ phận

mà thông thường không tạo củ cũng rất được chú trọng trong nhân giống

Lilium như nuôi cấy lát cắt vảy củ không chứa đĩa gốc, lá và các thành phần

của hoa… với hệ số nhân rất cao gấp 5-7 lần so với phương pháp tách vảy thông thường (Teixeira da Silva, 2003) Kỹ thuật này đã được tác giả Trần Thanh Vân gọi là nuôi cấy lớp mỏng tế bào, công bố lần đầu tiên trên tạp chí Nature năm 1973 (Nhut et.al., 2001a) Đây là kỹ thuật tạo cơ quan bất định, liên quan đến việc điều khiển kích thước mẫu ban đầu để cảm ứng và tối ưu hóa quy trình tái sinh ở thực vật (Phillips, 2004) Đến nay, nuôi cấy lớp mỏng

tế bào đã trở thành một công nghệ đầy hứa hẹn trong nhân nhanh thương mại

Lilium spp cũng như nhiều giống cây trồng khác do có hệ số nhân cao và ổn

định về mặt di truyền (Nhut et.al., 2001a)

1.2.1.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến tái sinh củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ

in vitro

a) ảnh hưởng của vật liệu khởi đầu nuôi cấy

Vật liệu khởi đầu đóng vai trò quan trọng trong phản ứng tạo củ, bao gồm giống, loài, tuổi mẫu, vị trí, kích thước mẫu và hướng đặt mẫu trong môi trường (Nhut et al., 2003)

Theo Zaidi và cộng sự (2000), các cơ quan ở cây một lá mầm có củ và căn hành được chia làm hai vùng: vùng trên mặt đất và vùng ngầm; cơ quan thuộc vùng ngầm có khả năng tái sinh củ mạnh hơn nhiều so với vùng trên mặt đất, trong đó tần số tạo củ từ lát cắt vảy củ là 29% nhưng từ đỉnh chồi và chồi hoa chỉ có 10% Củ lily đã được tạo ra từ tất cả các loại cơ quan (trừ rễ)

như lát cắt từ củ mẹ (Varshney, 2000), củ in vitro (Nguyễn Thị Lý Anh và

cộng sự, 2005; Nguyễn Thái Hà và cộng sự, 2003; Chang et al., 2000; Lian et

al., 2003; Nhut D.T., 1998), lá (Bacchetta, 2003), đốt thân (Nhut, 1998), mô phân sinh (Mei-Lan et al., 2003), hoa (bầu nhụy , đế hoa) (Nhut et al., 2001c)

ở nhiều giống Lilium: L longiflorum Thunb và một số giống lai Lilium Oriental Trong số các cơ quan này, mẫu lát cắt vảy từ củ in vitro được sử

dụng nhiều nhất trong nhân nhanh các giống lily do hiệu suất tạo củ cao Các lát cắt tế bào sử dụng cho mục đích này thường có kích thước từ vài micromét

đến một vài milimét, ví dụ ở L longiflorum Thunb., lát cắt ngang vảy củ in vitro có độ dày từ 1- 3 milimét đều cho phản ứng tạo củ tốt (Nhut et al.,

2003)

b) ảnh hưởng của CĐHST

Chúng ta biết rằng ngủ nghỉ ảnh hưởng mạnh mẽ đến phát sinh hình thái của các cây dạng củ Thông thường cây ở giai đoạn ngủ nghỉ chỉ hình thành những vảy củ và không ra lá (Vũ Văn Vụ, 1997) Với mục đích tạo củ

từ lát cắt tế bào, việc cảm ứng ngủ nghỉ đóng vai trò rất quan trọng Nhiều nghiên cứu cho thấy các CĐHST là nhân tố thiết yếu trong cảm ứng ngủ nghỉ Takayama và Misawa (1979) đã chỉ ra mối tương tác giữa auxin (NAA) và cytokinin (kinetin) đối với sự hình thành củ và rễ, tỷ lệ auxin/ cytokinin cao làm tăng sự hình thành rễ, ngược lại tỷ lệ này thấp làm tăng sự hình thành củ (Pelkonen, 2005) Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2000) lại đề cập đến vai trò

độc lập của IBA trong tái sinh củ và cây con ở L longiflorum do IBA có tác dụng tích cực đối với phản ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ in vitro

Như vậy, CĐHST là yếu tố hết sức quan trọng, ảnh hưởng mạnh tới cân bằng giữa CĐHST ngoại sinh và nội sinh, qua đó gây cảm ứng ngủ nghỉ làm

phát sinh củ in vitro

c) ảnh hưởng của đường

Ngoài việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các CĐHST, đường cũng có vai trò quan trọng trong quá trình này do nó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của môi trường tức là tác động vào áp lực nước đối với mô tế bào đang biệt hoá và kích

thích chúng phát triển (Kumar et al., 2005) Nồng độ đường dao động từ 2- 6%, tuỳ thuộc loài và loại mô nuôi cấy (Pelkonen, 2005)

Tuy nhiên theo nhiều báo cáo, nồng độ đường thích hợp cho phản ứng tạo củ có thể cao hơn, khoảng 9- 12% Đặc biệt, sucrose có vai trò như một

loại đường vận chuyển quan trọng nhất ở các cây có củ: Lilium, Narcissus; và

hàm lượng đường cao có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành củ và sinh trưởng phát triển của củ (Mei-Lan, 2003; Staikidou et al., 2005) Hàm lượng

đường 90 g/l tỏ ra thích hợp nhất trong giai đoạn tạo củ và tăng trọng lượng

củ, chủ yếu do làm tăng tích luỹ chất khô (Nhut et al., 2001b) Nghiên cứu

của Staikidou và cộng sự (2005) ở Narcissus cũng cho thấy vai trò quan trọng

của đường sucrose trong phản ứng tạo củ, việc bổ sung các loại đường rượu: manitol, sorbitol hay các monosaccharide: glucose, fructose vào môi trường nuôi cấy có 30 g/l sucrose đều không cho hiệu quả tốt bằng việc sử dụng mức sucrose 90 g/l

d) ảnh hưởng của than hoạt tính và môi trường khoáng

Than hoạt tính đã được báo cáo về khả năng hấp thụ các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy, vì vậy có tác dụng kích thích sự phát triển của củ

in vitro Hàm lượng than hoạt tính thích hợp thường từ 0,5- 2 g/l (Nhut et al.,

e) ảnh hưởng của yếu tố vật lý

Điều kiện chiếu sáng là yếu tố vật lý quan trọng nhất kích thích sự hình

thành củ in vitro Nói chung, để tạo củ, điều kiện tối tỏ ra thích hợp hơn trong

khi củ ra lá cần ánh sáng hơn Nhiều báo cáo cho thấy trong điều kiện tối, số

củ hình thành trên một mẫu nhiều hơn, kích thước củ lớn hơn so với khi trồng

trong điều kiện chiếu sáng liên tục (Kumar et al., 2005) Ngoài ra, vai trò của

chất lượng ánh sáng đối với sự biệt hoá in vitro cũng đã được nghiên cứu ở

một số cây có củ Tuy nhiên chưa có báo cáo nào đề cập đến vấn đề này trong nuôi cấy mô lily (Pelkonen, 2005)

Tóm lại, con đường tạo củ trực tiếp từ lát cắt tế bào chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nguồn mẫu, CĐHST, đường, ánh sáng… Nhưng điều quan trọng là lựa chọn vật liệu ban đầu và môi trường nuôi cấy thích hợp nhằm xây dựng các quy trình nhân giống cho hệ số sản xuất củ cao nhất

1.2.1.2 Những thành tựu nổi bật trong nghiên cứu tạo củ in vitro trực tiếp

từ lát mỏng tế bào ở Lilium spp

Cũng giống như hầu hết các cây dạng củ (bulbous) và căn hành

(cormous) khác, Lilium là cây một lá mầm tương đối khó nuôi cấy in vitro hơn

so với cây hai lá mầm do những trở ngại chính trong việc điều khiển ngủ nghỉ

của củ (Nhut et al., 2001a) Nuôi cấy in vitro ở lily đã được Robb báo cáo lần

đầu tiên vào năm 1957 sử dụng mẫu vảy củ Lilium speciosum Thunb Năm

1966, Kohl và Nelson đã nuôi cấy thành công mô phân sinh đỉnh chồi ở

Lilium spp (Pelkonen, 2005; Van Tuyl, 1997) Cho đến nay, sau gần 50 năm phát triển, các kỹ thuật nuôi cấy mô ở Lilium đã không ngừng được cải tiến

nhằm mục đích xây dựng và tối ưu hoá các quy trình nhân nhanh, cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu chất lượng cao cho sản xuất hoa trên quy mô thương mại (Pelkonen, 2005) Trong đó, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng tế bào, hạt nhân tạo và công nghệ bioreactor (hệ thống phản ứng sinh học) đã và đang trở thành những công nghệ mũi nhọn trong ngành công nghiệp củ giống lily Đây cũng chính là những thành tựu nổi bật, có tính chất đột phá trong nhân giống lily cũng như nhiều loài cây khác (Teixeira da Silva, 2003)

* Tạo củ trực tiếp từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở quy mô nhỏ

Trong các nghiên cứu về lớp mỏng tế bào ở Lilium, nổi bật là các công

trình của nhóm tác giả Dương Tấn Nhựt và cộng sự trên đối tượng mô hình

Lilium longiflorum Thunb Năm 2001, nhóm này đã sử dụng những lát cắt

ngang bầu nhụy có kích thước từ 1- 5 mm để tạo củ và thấy rằng các lát cắt có kích thước 3- 4 mm cho phản ứng tạo củ tốt nhất, từ 30- 40 củ trên 1 lát cắt (Nhut et al., 2001c) Trong một nghiên cứu khác, tác giả sử dụng mẫu thân non và tạo ra các lát cắt có độ dày từ 0,5- 3 mm, kết quả cho thấy hiệu quả tạo

củ cao nhất trên các lát cắt 1 mm với tỷ lệ mẫu sống sót là 100% (Nhut et al., 2001b) Như vậy, việc xác định kích thước mẫu phù hợp dường như là yếu tố then chốt trong công nghệ lớp mỏng tế bào để thu được phản ứng tạo củ tốt nhất (Nhut et al., 2001a; Teixeira da Silva, 2003)

Bên cạnh đó, việc kết hợp nuôi cấy lớp mỏng tế bào và công nghệ hạt nhân tạo cũng đang được chú trọng (Chandler, 2005; Gamborg, 2002) Thông thường người ta sử dụng phôi soma để bọc hạt nhân tạo nhằm bảo quản hạt lâu dài, tiết kiệm chi phí lao động, đồng thời tăng sức sống và độ nảy mầm của phôi để thu được cây con có chất lượng cao hơn Nhưng hiện nay, với những thành công của kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào thì các cấu trúc khác phôi

tỏ ra là nguồn vật liệu đầy hứa hẹn để bọc hạt nhân tạo như các lát cắt từ vảy

củ siêu nhỏ, từ chồi và đốt thân…, làm giảm thiểu những biến dị dòng soma

có thể xảy ra trong quá trình phát sinh phôi (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2004; Phillips, 2004) Nhóm tác giả Dương Tấn Nhựt đã có một số nghiên cứu

về hạt nhân tạo theo hướng mới này ở hoa lily, trong đó vảy củ và thể tròn tương tự như chồi non (protocorm- like body) đã được bọc thành hạt nhân tạo, sau ba tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng, hạt nhân tạo vẫn duy trì được sức sống với khả năng tái sinh cao (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2004)

* Sản xuất củ quy mô lớn thông qua các hệ thống bioreactor nuôi cấy tự động

Nhu cầu củ giống Lilium cho sản xuất thương mại ngày càng tăng, đòi

hỏi các nhà sinh lý thực vật phải có những bước cải tiến mạnh mẽ về quy trình

vi nhân giống in vitro để đạt được hệ số nhân cao nhất Vì vậy, việc sử dụng

những hệ thống nuôi cấy có thể điều khiển các thông số môi trường một cách

dễ dàng như bioreactor là giải pháp hợp lý cho vấn đề này (Phillips, 2004) Bioreactor là bình nuôi cấy mô tế bào thực vật, có dung tích từ vài lít đến vài nghìn lít để tạo ra sinh khối thực vật lớn trong một thời gian ngắn Đây là

những hệ thống nuôi cấy tự động hoàn toàn, tiết kiệm chi phí lao động và dễ dàng tăng quy mô nhân giống (Đỗ Năng Vịnh, 2002)

Tuy nhiên, vấn đề quan trọng nhất hiện nay là việc thiết kế các bioreactor cho nuôi cấy mô tế bào thực vật phải đảm bảo thông khí và giảm tối

đa các tổn thương cơ học (khuấy, thông khí) đối với mô tế bào đó (Lian et al., 2003; Mei-Lan et al., 2003) Trong lĩnh vực này, các nhà nghiên cứu Hàn Quốc là những chuyên gia thiết kế bioreactor cho nuôi cấy thực vật Đặc biệt nhóm tác giả Paek, Chakrabarty và Hahn thuộc Đại học Quốc gia Chungbuk

(Hàn Quốc) đã có nhiều báo cáo nổi bật về nhân giống thương mại Lilium

trong bioreactor Những bioreactor được thiết kế theo kiểu bình dạng bóng

đèn nhằm loại bỏ hiện tượng tạo bọt, phù hợp cho nuôi cấy liên tục hoặc nuôi cấy tạm thời (không liên tục) Kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy hệ thống thứ hai (nuôi cấy không liên tục) có ảnh hưởng tích cực đến tạo củ và chất

lượng củ in vitro Sau đó, nhóm này đã cải tiến loại bioreactor nuôi cấy liên

tục bằng cách đổi mới môi trường dinh dưỡng hai lần trong quá trình nuôi cấy,

do đó cho kết quả tốt hơn so với nuôi cấy tạm thời Theo một số tác giả, hệ thống liên tục thường gây ra tính mọng nước ở thực vật nhưng cho đến nay, chưa có báo cáo nào về hiện tượng này ở lily (Lian et al., 2003; Mei-Lan et al., 2003; Phillips, 2004)

Nói chung, với những ưu điểm vượt trội, công nghệ nuôi cấy lớp mỏng

tế bào kết hợp với bioreactor sẽ là công nghệ nhân nhanh in vitro đầy hứa hẹn trong sản xuất củ thương mại ở Lilium cũng như cung cấp cây con số lượng

lớn ở nhiều loài thực vật khác (Đỗ Năng Vịnh, 2002; Paek, 2005)

1.2.3 Tạo củ in vitro thông qua con đường phát sinh mô sẹo phôi hoá và

phôi soma

Phát sinh phôi soma là kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro quan trọng,

cung cấp công cụ hữu ích cho các nghiên cứu cơ bản về sự phát triển phôi cũng như nhiều khía cạnh liên quan đến sinh lý thực vật (Komamine et al., 2005; Neumann, 2000)

Vậy phát sinh phôi soma là gì ? Phát sinh phôi soma hay phôi vô tính là quá trình sản xuất phôi hay cấu trúc giống phôi từ các tế bào soma mà không phải từ giao tử hoặc sản phẩm của quá trình kết hợp giao tử Trong quá trình này, phôi soma trải qua các giai đoạn tương tự như phát sinh phôi hợp tử (Merkle et al., 1995; Pierik, 1987; Yeung, 1995) Quá trình này đã được Strasburger mô tả đầu tiên vào năm 1878 Tuy nhiên, mãi đến năm 1958, nghiên cứu về phát sinh phôi soma mới được thực hiện thành công lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Reinert và Steward dựa trên báo cáo của Levine năm

1947 khi nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cà rốt Daucus carota (Pierik, 1987)

Cho đến nay, sự phát triển nhanh chóng của các nghiên cứu tái sinh phôi soma đã mở ra những tiềm năng ứng dụng đầy hứa hẹn trong cải tiến và nhân giống thực vật trên quy mô thương mại (Neumann, 2000) Tuy nhiên, phát sinh phôi soma là một quá trình khá phức tạp, vì vậy những hiểu biết cơ bản về nguyên lý, cơ chế và những sự kiện xảy ra trong quá trình này là hết sức cần thiết

1.2.2.1 Cơ sở khoa học của quá trình phát sinh phôi soma

Chúng ta biết rằng, tất cả tế bào thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết để tạo ra một thực vật mới hoàn chỉnh Về mặt cơ chế phân tử thì sự phát sinh hình thái là một quá trình biểu hiện phức tạp của các gen và

được điều hòa nghiêm ngặt, đảm bảo cho các hệ thống, cơ quan trong cơ thể sống biệt hóa đúng thời điểm cần thiết trong quá trình phát triển cá thể (Merkle et al., 1995; Yeung, 1995)

Vì vậy, việc cảm ứng phát sinh phôi cần trải qua những sự kiện: kết thúc biểu hiện của các gen đang hoạt động và thay thế bằng chương trình biểu hiện gen phôi hóa để hình thành phôi soma Nguyên lý này được Sharp và Evans đề xuất đầu tiên vào năm 1983 trên tạp chí Plant Cell Report Hai ông

đã sử dụng thuật ngữ “IEDC” (Induced Embryogenic Determined Cell- tế bào

được xác định có khả năng phôi hóa do cảm ứng) để mô tả tế bào phôi hóa có

sẵn chương trình biểu hiện gen phôi hóa được gọi là PEDC (Pre-Embryogenic Determined Cell- tế bào được xác định có khả năng tiền phôi hóa) Vì vậy, tùy theo từng kiểu tế bào mà có hai con đường phát sinh phôi soma (Merkle et al., 1995; Pierik, 1987; Yeung, 1995) Tuy nhiên, dù là kiểu phát sinh nào, cả hai loại tế bào IEDC và PEDC đều có chức năng như nhau và được gọi chung là EDC (Embryogenic Determined Cell- tế bào được xác định có khả năng phôi hóa) hay đơn giản là EC (Embryogenic Cell- tế bào phôi hóa) (Merkle et al., 1995)

Thứ nhất là con đường phát sinh phôi soma trực tiếp, trong đó phôi hình thành từ tế bào hoặc mô mà không qua giai đoạn tạo callus, các tế bào này chính là PEDC Vật liệu khởi đầu nuôi cấy phôi như vậy là các mô đã tái trẻ

hóa như mô nucella ở Citrus có xu hướng hình thành đa phôi hoặc tế bào thịt

lá của trụ dưới lá mầm ở một số loài

Thứ hai là con đường phát sinh phôi gián tiếp qua callus và các tế bào chuyển thành phôi chính là IEDC (Pierik, 1987) Phôi soma điển hình thường xuất hiện từ các cụm tế bào gồm một vài đến hàng chục tế bào nhỏ có khả năng phôi hoá Ngoài ra, phát sinh phôi thứ cấp hay sản xuất phôi từ phôi soma ban đầu là một trường hợp đặc biệt của con đường này

Trong hai con đường trên, kiểu phát sinh gián tiếp là phương pháp phổ biến hơn để sản xuất phôi soma, đáp ứng nhiều mục đích khác nhau và đã

được mô tả ở hàng trăm loài thực vật Nguyên tắc chung của phương pháp này

là đưa các tế bào đã biệt hóa trở về trạng thái chưa biệt hóa rồi tái biệt hóa thành phôi, trong đó auxin đóng vai trò quan trọng để cảm ứng cho quá trình phản biệt hóa xảy ra (Pierik, 1987; Yeung, 1995)

1.2.2.2 Quá trình phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus

a) Sự hình thành callus

Về cơ bản, callus là mô ung thư, ít hoặc nhiều chưa cơ quan hóa và thường hình thành từ vết thương của các mô cơ quan đã biệt hóa (Pierik, 1987)

Theo Pierik (1987), quá trình phản biệt hóa đóng vai trò rất quan trọng

để tế bào trưởng thành có khả năng được tái xác định (tái định hình đường hướng phát triển của tế bào) Trong quá trình này, các tế bào trưởng thành có thể chuyển từ trạng thái trưởng thành sang trạng thái trẻ hóa và hệ quả tất yếu

là tế bào được cảm ứng phân chia mạnh hơn, có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn

và tạo ra callus, một loại mô biệt hóa kém và chưa cơ quan hóa Tuy nhiên, callus thường không đồng dạng do chúng được hình thành từ hai loại mô: biệt hóa và không biệt hóa, tức là chúng sẽ có khả năng phát sinh phôi soma khác nhau

Như vậy, để con đường phát sinh phôi gián tiếp xảy ra, điều kiện quan trọng nhất là callus phải có khả năng phôi hóa, hình thành phôi và cây hoàn chỉnh (Merkle et al., 1995; Pierik, 1987) Nhiều nghiên cứu đã báo cáo quá trình phát sinh phôi soma ở thực vật nhưng việc xác định những đặc trưng của

tế bào phôi hóa (EC- Embryogenic Cell) và chưa phôi hóa (NEC- Non- Embryogenic Cell) vẫn còn rất hạn chế Bảng so sánh dưới đây được tập hợp

từ một số báo cáo trên cho thấy sự khác nhau cơ bản giữa hai loại tế bào này

Bảng 1.2 So sánh tế bào phôi hóa (EC) và chưa phôi hóa (NEC)

Kích thước nhỏ, tế bào chất đậm

đặc, chứa nhiều hạt tinh bột nhỏ và các cơ quan tử

Tế bào lớn, chứa ít hạt tinh bột

Merkle et al., 1995

Pierik, 1987

Xuất hiện cầu sinh chất (plasmodesmata) giữa các EC và giữa EC với NEC

Không có cầu sinh chất giữa các NEC

Merkle et al., 1995

Đặc điểm EC NEC TL tham khảo

Sinh trưởng nhanh, trao đổi chất tích cực

Sinh trưởng chậm Yeung, 1995

Pierik, 1987 phát triển

Tạo thành cây thông qua phát sinh phôi soma

Tạo chồi hoặc rễ thông qua cơ quan hóa

Mặt khác, những điểm khác nhau giữa EC và NEC trên đây có thể thay

đổi tùy từng đối tượng thực vật Thông thường các nhà nghiên cứu sử dụng cà

rốt Daucus carota làm mẫu hình chuẩn để tìm hiểu quá trình phát sinh phôi

gián tiếp ở thực vật (Komamine et al., 2005) Ngoài ra, một số báo cáo cũng

tập trung vào củ cải đường Beta vulgaris L Gần đây, Moghaddam và Taha

(2005) đã quan sát những điểm khác biệt giữa EC và NEC ở đối tượng này, thấy rằng callus thu được có hai loại: NEC có mức độ đa bội hóa cao, có mật

độ lưới nội chất thô, polysome, nhân con lớn hơn, vách tế bào không hoàn chỉnh và bất thường hơn so với EC

Tóm lại, để quá trình hình thành phôi xảy ra thì sự kiện quan trọng đầu tiên là sinh khối tế bào chưa cơ quan hóa với không bào trung tâm lớn phải chuyển thành các tế bào giàu sinh chất, có khả năng phôi hóa dưới ảnh hưởng của yếu tố cảm ứng (auxin) Những tế bào này tiếp tục phân chia tích cực và

sẽ phát triển thành phôi khi loại bỏ yếu tố cảm ứng đó ra khỏi môi trường nuôi

cấy (Merkle et al., 1995)

b) Sự tái sinh phôi

Phôi soma có thể hình thành từ các tế bào callus phôi hóa Để phân biệt

với phôi hợp tử phát triển từ các tế bào trứng đã thụ tinh, người ta còn gọi phôi

soma hay phôi vô tính dưới nhiều cái tên như cấu trúc giống phôi, phôi phụ

hoặc thể phôi (Pierik, 1987)

Quá trình phát sinh phôi soma đã được báo cáo ở cả cây một lá mầm và

hai lá mầm với đặc điểm chung là đều bắt đầu từ giai đoạn phôi hình cầu và có

phân cực hóa dẫn đến xuất hiện tiền lá mầm và tiền rễ, đây là những dấu hiệu

quan trọng trong biệt hóa tế bào phôi (Merkle et al., 1995) Trong đó, phôi

hình cầu đánh dấu sự khởi đầu biệt hóa cấu trúc phôi, tiếp theo là thiết lập trục

phôi với sự xuất hiện của các protein đặc hiệu không gian ở nửa bán cầu trên

và dưới của phôi, từ đó hình thành cực rễ và cực chồi tại các nửa tương ứng

(Yeung, 1995) Tuy nhiên, tùy thuộc vào bản chất là thực vật một hay hai lá

mầm, quá trình phát sinh phôi có sự khác nhau ở mỗi giai đoạn phát triển và

được tóm tắt như sau:

Bảng 1.3 Quá trình phát sinh phôi ở cây một lá mầm và hai lá mầm

Tái sinh phôi soma qua 3 giai đoạn:

Hình cầu→ Hình khiên → Lá mầm

lớn

Tái sinh phôi qua 4 giai đoạn: Hình

cầu→ Tim→ Thủy lôi→ Hai lá mầm

Merkle et al., 1995

Komamine et al.,

Giai đoạn hình khiên: Phôi có dạng

đặc trưng với tiền lá mầm và bao lá

mầm bao quanh nó

Giai đoạn hình tim và thủy lôi: Đánh

dấu sự xuất hiện tiền lá mầm

Yeung, 1995

Komamine et al.,

2005

Firoozabady & Moy, 2004

Giai đoạn lá mầm lớn: Phôi gồm

một lá mầm lớn bao lấy mô phân

sinh đỉnh và một cực rễ

Giai đoạn hai lá mầm: Phôi gồm hai lá

mầm lớn với mô phân sinh chồi ở giữa

Như vậy, phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus là quá trình phổ biến,

được sử dụng như một công cụ hữu ích để nhân nhanh và cải tiến giống cây

trồng ở nhiều loài thực vật, đặc biệt là cây một lá mầm dạng củ và căn hành

Những thành công trong nghiên cứu quá trình phát sinh phôi trên các đối

tượng này có ý nghĩa về mặt lý luận và thực tiễn, đóng góp vào sự hiểu biết

còn tương đối hạn chế về hiện tượng phức tạp nhưng lý thú này ở thực vật

(Neumann, 2000; Phillips, 2004)

1.2.2.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi soma gián

tiếp qua callus

a) ảnh hưởng của vật liệu khởi đầu

Qua nhiều nghiên cứu trên đối tượng Lilium, có thể khẳng định quá

trình phát sinh phôi đã được thực hiện thành công từ hầu hết các mô của loại

cây này như mô vảy củ, đốt thân, lá, mô phân sinh đỉnh đến mô hoa như nhụy

(đầu nhụy, vòi nhụy, bầu nhụy), chỉ nhị, đế hoa và phôi chưa chín ở L

longiflorum Thunb., L speciosum và nhiều giống lai (Famalaer et al., 1996;

Hoshi et al., 2004, Nhut et al., 2002; Pelkonen, 2005, Tribulato et al., 1997)

Trong đó, báo cáo về tái sinh phôi gián tiếp qua callus chiếm đa số, chứng tỏ

về cơ bản quá trình phát sinh phôi soma có thể xảy ra trong nuôi cấy mô ở bất

kỳ mô nào nhưng sinh khối tế bào callus hay được sử dụng cho mục đích này

Đồng thời sự phát sinh phôi trực tiếp ở Lilium dường như khó hơn phụ thuộc

chặt chẽ vào giống, loài và kiểu gen ban đầu (Nhut et al, 2002)

Nhìn chung, mô sinh sản và mô non trẻ như phôi chưa chín, các bộ

phận của hoa và cây con thường được sử dụng để tạo callus với khả năng phôi

hoá cao Famelaer và cộng sự (1996) đã tạo callus từ phôi trưởng thành và củ

in vitro ở một số giống lily lai Trong một nghiên cứu khác, Tribulato và cộng

sự (1997) đã thu được callus xốp từ vòi nhụy và cuống hoa ở L longiflorum Snow Queen và Lilium Oriental Star Gazer Ngoài ra, có thể hình thành callus phôi hoá và tái sinh cây từ chỉ nhị và vảy củ in vitro ở L longiflorum Thunb

(Nhut et al., 2001a)

Như vậy, những báo cáo về phát sinh phôi vô tính ở Lilium cho thấy vật liệu khởi đầu như vảy củ in vitro và các thành phần của chồi hoa (nhị, nhụy,

đế hoa) cho hiệu quả cao nhất trong tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp Mẫu lá ít

được sử dụng cho mục đích này do khả năng tái sinh thấp (Nhut et al., 2003)

b) ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Khả năng phát sinh phôi in vitro phụ thuộc chặt chẽ vào giống, loài và

vật liệu khởi đầu, song một yếu tố ảnh hưởng cũng hết sức quan trọng là điều kiện nuôi cấy, trong đó CĐHST đóng vai trò chủ yếu Nhiều báo cáo đã đề cập

đến vai trò của auxin trong giai đoạn khởi đầu tạo callus và phôi Nồng độ auxin cao cần thiết cho sự cảm ứng hình thành phôi, song để phôi tiếp tục phát triển thì auxin cần có nồng độ thấp hơn hoặc trong một số trường hợp, phải loại bỏ hoàn toàn auxin khỏi môi trường nuôi cấy (Komamine, 2005) Nguyên nhân của hiện tượng này chủ yếu do auxin là một nhân tố sinh trưởng, kích thích sự giãn nở của vách tế bào, làm tế bào tăng trưởng về kích thước (Moghaddam, 2005) Ngoài ra, auxin còn là một yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh phôi, đóng vai trò quan trọng trong kênh thông tin tế bào, làm tế bào biến đổi tới trạng thái cuối cùng đã được chương trình hóa để tạo thành phôi soma (Yeung, 1995)

Trong các auxin, 2,4-D và NAA có ảnh hưởng tích cực đến tạo callus ở

hầu hết các loài Lilium, nhưng những callus này thường cứng và khó tái sinh

Nếu kết hợp với một CĐHST khác (thường là cytokinin như BAP, TDZ, kinetin), hiệu quả tạo callus tăng lên rõ rệt, callus thu được có dạng xốp rời rạc với khả năng tái sinh cao (Nhut, 2002) Theo thống kê của Zaidi và cộng

sự (2000), ở các cây có củ và căn hành, 75% mẫu được nuôi cấy để tạo phôi

trên môi trường MS hoặc MS cải tiến, trong đó tỷ lệ phát sinh phôi theo cả hai con đường trực tiếp và gián tiếp trên môi trường có 2,4-D là 83,3% và thấp hơn (33,3%) khi có mặt NAA Nồng độ thích hợp đối với từng CĐHST là 2,4-

D từ 0,1 đến 6 mg/l và NAA 0,075 đến 10 mg/l Bên cạnh đó, ở nhiều loài, gibberelin và ethylene lại có ảnh hưởng ức chế phát sinh phôi

1.2.2.4 Thành công trong nghiên cứu quá trình phát sinh phôi soma ở

Lilium spp

Theo nhiều báo cáo, Sheridan (1968) là tác giả đầu tiên công bố sự hình

thành phôi và củ nhỏ từ callus của mô phân sinh đỉnh chồi ở Lilium longiflorum Thunb Đến nay, sự tái sinh cây thông qua phát sinh phôi gián

tiếp đã được thực hiện thành công và mang lại những ứng dụng quan trọng ở

nhiều loài Lilium (Nhut, 2002; Pelkonen, 2005; Tribulato et al., 1997)

Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã chứng minh khả năng tái sinh phôi

trực tiếp ở Lilium và quá trình này phụ thuộc chặt chẽ vào loài, kiểu gen hoặc

loại mô sử dụng Trước đây, người ta cho rằng cây một lá mầm là vật liệu khó

nuôi cấy in vitro, đặc biệt ở các họ Liliaceae, Iridaceae và Amarylidaceae do

tỷ lệ tái sinh thấp, đồng thời hiện tượng phản biệt hoá ở những đối tượng này càng hiếm gặp hơn (Zaidi et al., 2000) Trong nỗ lực tìm kiếm câu trả lời cho vấn đề này, TS Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2002) lần đầu tiên công bố sự

tạo phôi trực tiếp từ lát cắt ngang vảy củ in vitro, sau đó tái sinh cây thành công trên đối tượng L longiflorum Thunb Công trình này chứng tỏ củ có thể hình thành thông qua con đường phát sinh phôi trực tiếp ở Lilium hay nói cách

khác các mẫu đã biệt hoá có khả năng tái sinh trực tiếp thành phôi không qua giai đoạn callus Những callus, phôi soma và củ nhỏ này có thể sử dụng trong nhân nhanh các giống lily và là nguồn vật liệu có giá trị cho công nghệ hạt nhân tạo, nghiên cứu cải tiến giống bằng các kỹ thuật chuyển gen qua

Agrobacterium, dung hợp tế bào trần và bảo quản nguồn phôi mầm in vitro

(Famelaer, 1996; Pelkonen, 2005; Tribulato et al., 1997)

Trong số các báo cáo trên đối tượng lily, nổi bật là các công trình nghiên cứu phát sinh hình thái của ba nhóm tác giả: Van Tuyl, Tribulato, Famelaer (Trung tâm nghiên cứu sinh sản và lai tạo giống thực vật CPRO-PLO- Hà Lan); Takayama và Misawa (Trường đại học Kagawa- Nhật Bản); và Dương Tấn Nhựt và cộng sự (Viện Sinh học Đà Lạt- Việt Nam)

Nghiên cứu của ba nhóm tác giả này cũng như nhiều tác giả khác là những đóng góp có giá trị về mặt lý luận- thực tiễn trong việc điều khiển con

đường phát sinh phôi từ những nguồn vật liệu khác nhau ở lily

1.2.2.5 ứng dụng quá trình phát sinh phôi soma trong nhân nhanh và cải

tiến giống Lilium spp

* Trong nhân nhanh in vitro

Callus và phôi soma đã được sử dụng trong nhân nhanh các giống

Lilium do đây là những tế bào nhỏ, đồng nhất về mặt sinh trưởng và có khả

năng tăng sinh vô hạn (Nhut, 2001a) Tuy nhiên, quá trình này thường xuất hiện các biến dị, đặc biệt ở giai đoạn phản biệt hoá tạo callus Nhưng nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng lily là cây một lá mầm ổn định nhất về mặt di truyền do số lượng nhiễm sắc thể vẫn được duy trì, thậm chí sau 2-3 năm nuôi cấy callus (Hoshi, 2004; Watad, 1998) Đặc biệt, những tế bào callus và phôi nhỏ có thể ứng dụng để nhân sinh khối lớn trong các hệ thống bioreactor điều khiển tự động, đáp ứng mục đích nhân nhanh thương mại ở lily (Paek K.Y., 2005)

Đồng thời, phôi soma cũng là nguồn vật liệu thích hợp để bọc hạt nhân tạo nhằm tăng cường sức sống cho phôi và cây con trước khi đem ra trồng trong điều kiện tự dưỡng bên ngoài Đây là một hướng nghiên cứu mới, làm giảm chi phí đầu tư cho cây nuôi cấy mô trong việc bảo quản giống cũng như

đảm bảo cây sinh trưởng tốt và đồng đều khi chuyển ra vườn ươm (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2004; Neumann, 2000)

* Trong nghiên cứu chuyển gen

Nhiều quy trình tạo phôi soma ở Lilium đã được ứng dụng trong cải tiến

giống, chủ yếu bằng hai phương pháp chuyển gen:

Thứ nhất là sử dụng huyền phù tế bào callus làm vật liệu khởi đầu cho phân lập và dung hợp tế bào trần phục vụ chuyển gen, lai tạo giống mới Công trình của Famelaer và cộng sự (1996) đã gây được tiếng vang lớn khi thiết lập

thành công hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào ở L longiflorum và một số

giống lai Tác giả đã tế bào trần từ huyền phù callus có nguồn gốc phôi và mô phân sinh đỉnh ở các giống lai Oriental và Asiatic, để sản xuất con lai soma giữa chúng Một số báo cáo của các tác giả khác như Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2002), Tribulato và cộng sự (1997) cũng đã xây dựng thành công các

hệ thống tái sinh đáp ứng mục đích này ở lily

Thứ hai là chuyển gen qua trung gian Agrobacterium, chủ yếu bằng súng bắn gen Trước đây, chuyển gen bằng Agrobacterium đã được báo cáo ở

một số loài lily theo phương pháp đồng nuôi cấy nhưng các tác giả chưa thu

được cây mang gen nào (Hoshi, 2004) Gần đây, bắn gen tỏ ra là phương pháp thích hợp để xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả ở các cây một lá mầm vốn là đối tượng khó tiếp nhận gen ngoại lai (Pelkonen, 2005; Suzuki and Nakano, 2002) Watad và cộng sự (1998) dường như là nhóm tác giả đầu tiên nhận được các chồi mang gen kháng thuốc diệt cỏ và biểu hiện ổn định bằng

phương pháp bắn gen ở L longiflorum Thunb mặc dù hiệu suất chuyển gen

rất thấp (< 0.2%) Năm 2002, Suzuki và Nakano đã thu được cây chuyển gen

từ ba loài lily: L formosanum, Agapanthus praecox ssp Orientalis và Muscari armenianum Gần đây, Pelkonen (2005) đã báo cáo việc xây dựng hệ thống tái

sinh qua callus và chuyển thành công các gen chức năng để tạo giống mới

* Trong bảo quản chất mầm in vitro

Người ta có thể bảo quản chất mầm in vitro ở các loài lily trong thời

gian dài, đặc biệt với những loài đang có nguy cơ tuyệt chủng Phương pháp này thường được sử dụng để bảo quản nguồn phôi lâu dài, giảm chi phí đầu tư cho việc đổi mới môi trường nuôi cấy thường xuyên và hạn chế những rủi ro (nhiễm tạp, biến dị di truyền) do cấy chuyển nhiều lần mang lại Điển hình là

hai tác giả Godo và Mii (2001) đã bảo quản in vitro 21 loài lily bằng cách

nuôi callus ở nhiệt độ thấp trên môi trường bổ sung 1 mg/l picloram trong thời gian trên 1 năm

Như vậy, quá trình tái sinh phôi đã được ứng dụng hiệu quả trong nhân

nhanh và cải tiến giống ở Lilium ssp Tuy nhiên, đây là các quá trình phát sinh

hình thái đặc biệt và phức tạp, bị chi phối bởi nhiều yếu tố, trong đó kiểu gen, loài, giống, vật liệu khởi đầu nuôi cấy và CĐHST đóng vai trò quan trọng Cho

đến nay, các nghiên cứu về quá trình này ở lily vẫn còn rất hạn chế, đòi hỏi sự quan tâm hơn nữa của các nhà sinh lý thực vật

1.3 Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo

Trong nhân giống vô tính in vitro việc tạo hạt nhân tạo từ các phôi vô tính, tiểu chồi là hướng tiên tiến và có khả năng công nghiệp hóa cao Công nghệ hạt nhân tạo là phương pháp tạo một dạng mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh dưỡng được bọc trong một lớp Alginate có chứa chất dinh dưỡng (không đường) Phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh (K.Redenbaugh, 1987)

Khái niệm về phôi sinh dưỡng được biết tới đầu tiên là vào năm 1958 nhưng cho đến cuối năm 1970 Murashige mới dưa ra khái niệm hạt nhân tạo - phôi sinh dưỡng có vỏ bọc vỏ nhân tạo Trong các năm tiếp theo đã không có một kết quả đáng kể nào ngoài việc xem xét khả năng sống sót của phôi được thực hiện trên cây carrot do Kitto và Janick (1982-1985) Năm 1975, Bingham

và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên cây cỏ linh lăng và đã chứng minh

được sự phát triển phôi sinh dưỡng thành cây Năm 1981 Robert Laurence, năm 1991, K.Redenbaugh và cộng sự đã tiến hành tạo phôi vô tính thành công trên cây cần tây và rau diếp

Hạt nhân tạo khác với hạt giống tự nhiên ở chỗ hạt nhân tạo bao gồm phôi soma hay phôi sinh dưỡng được nằm trong một lớp vỏ bảo vệ (nhân tạo)

Có hai kiểu hạt nhân tạo đó là hạt nhân tạo khô và hạt nhân tạo ướt:

- Hạt nhân tạo ướt: là những phôi soma được bọc trong lớp màng gel ướt làm bằng Natri-alghinat Hạt này có thể nảy mầm được trong đĩa petri hoặc có thể chuyển trực tiếp ra đất để nảy mầm

- Hạt nhân tạo khô: được tạo bằng cách bọc vỏ phôi soma bằng dung dịch resin hoà tan trong nước hay polyethylene glycol hoặc làm khô phôi không cần có vỏ bọc

Ưu điểm của hạt nhân tạo:

- Trong quá trình nuôi cấy có thể sử dụng làm sạch virus để tạo cây sạch bệnh

- Có thể đưa vi khuẩn cố định đạm vào lớp vỏ để tạo cây có khả năng cố

định đạm

- Có thể trộn thêm chất dinh dưỡng thích hợp vào lớp vỏ làm cho cây sau này sinh trưởng tốt hơn

- Có thể nạp gene lạ vào hạt nhân tạo dễ dàng hơn để tạo giống mới

- Có thể sản xuất hàng loạt, vận chuyển dễ dàng hơn hạt thật, lại không phụ thuộc thời tiết, thời vụ…

- Có thể đưa một lượng thuốc trừ sâu, trừ cỏ dại vào vỏ hạt để cây sau này không bị sâu và cỏ dại phá hoại

Quá trình tạo hạt nhân tạo :

- Tạo phôi soma hoặc tiền chồi:

+ Phôi soma được tạo ra từ một số bộ phận của cây như bào tử, phôi non, phôi chín, mầm lá, lá mầm, mô biểu bì, hoặc rễ…và toàn bộ mô tế bào sinh ra từ tế bào nuôi cấy và cả từ tế bào trần

+ Tiền chồi được hình thành từ phôi soma hoặc tiền callus trong nuôi cấy mô Tiền chồi riêng lẻ có thể sinh trưởng một cách dễ dàng bởi chúng có khả sử dụng các chất hoá học trong môi trường nuôi cấy

- Tạo vỏ hạt:

+ Vỏ hạt là một hydrogel có nguồn gốc tự nhiên mà bản chất là: tảo biển (Agar Carageenan hoặc Alginat); các cây (Arabic và Tragacanth); chất keo của một số loại hạt (Guar, Locust…); hoặc từ vi sinh vật (Dextran,

Gellan, Xanthangum), những hỗn hợp này sẽ thành gel khi được thả vào một chất điện phân CuSO4, CaCl2, muối amôni… Trong thí nghiêm này chúng tôi chọn Na-alginat,là chất được chiết suất từ tảo nâu làm vỏ gel bao bọc hạt nhân tạo Chất này có đặc tính là khi dùng rất dễ tạo thành vỏ hạt lại ít độc với phôi

- Tiến hành tạo hạt:

+ Trước tiên ta phải chọn những phôi hoặc tiền chồi đủ tiêu chuẩn làm hạt nhân tạo, rồi chuyển phôi đó sang môi trường tạo vỏ bọc hạt Tiếp theo các phôi đã được bao bọc bởi lớp vỏ nhân tạo sẽ được hút lên bằng một pipet (quyết định kích thước hạt) và được nhỏ từng phôi một xuống

bể chứa các muối canxi tạo thành chuỗi hạt soma rắn, trong suốt có vỏ bọc.Vỏ gel cứng có tác dụng bảo vệ phôi khi vận chuyển, dự trữ, gieo trồng Vỏ bọc gel còn là nguồn dự trữ dinh dưỡng, là nội nhũ nhân tạo

để nuôi phôi sinh 08.htm)

trưởng.(http://www.sp.edu.sg/schools/cls/bioline-ở Việt Nam, Viện sinh học nhiệt đới đã sản xuất thành công hạt nhân tạo cà phê từ phôi soma với vỏ bọc alginate (Nguyễn Văn Uyển, 1996), bước

đầu đã đánh dấu sự thành công trong phương pháp tạo hạt nhân tạo ở Việt Nam.Tuy nhiên phương pháp nhân giống bằng kĩ thuật tạo hạt nhân tạo mới chỉ là những nghiên cứu mang tính chất thăm dò và qui trình tạo hạt nhân tạo mới ở giai đoạn thử nghiệm

1.4 Nuôi cấy bioreactor

Nuôi cấy bằng Bioreactor là phương pháp nuôi các mô tế bào, cụm tế bào hoặc các tế bào đơn trong môi trường dịch lỏng Với các yêu tố liên quan được khống chế nhằm điều khiển sự phân hoá theo ý muốn

Mỗi một mẻ sản xuất, được coi như là một quy trình hoàn thiện Từ khâu

đưa mẫu vào cho đến khi kết thúc, sản phẩm cuối cùng phải đạt được theo yêu cầu Ví dụ như ta đưa các mô tế bào (đốt thân cây Têch; củ siêu nhỏ Lily; Vảy

củ, lát cắt vảy củ Lily ) thì sản phẩm cuối cùng phải là các cây Têch hoàn