Nghiên cứu chuyển gen bar kháng thuốc trừ cỏ vào cây hoa lily thông qua vi khuẩn agrobecterium tumefaciens

Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở c ác vùng ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc b án cầu lily là một trong c ác loài hoa đẹp đang rất đợc a chuộng trên thị trờng hoa hiện nay. Với kiểu d áng đẹp sang trọng, một số chủng loại có hơng thơm quyến rũ và độ bền hoa rất cao (915 ngày), dễ thuhoạch, bảo quản trên thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoa dang thân củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thơng mại, chiếm 24% gi á trị sản phẩm hoa thơng mại (Robinson và Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay, hoa lily đã đợc trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nớc ta nh Lâm Đồng, Hà Nội và hầu hết c ác tỉnh miền Bắc và hiệu quả kinh tế rất cao, có thể xuất khẩu quy mô lớn. Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều của nơc ta đã tạo điều kiện rất thuận lợi cho c ác loài cỏ dại ph át triển đây là một trong những yếu tố hạn chế chủ yếu đến sản xuất hoa lily. Chính cỏ dại làm cho giảm n ăng xuất, phẩm chất, đặc biệt nó cạnh tranh dinh dỡng với cây. để có thể trừ bỏ cỏ thì cần tốn nhiều công lao động, để giảm bớt công lao động con ngời đã phải dùng đến c ác loại thuốc trừ cỏ nhng chính điều này đã gây ảnh hởng không nhỏ đến cây hoa lily. Để có thể vừa trừ đợc cỏ mà lại không gây ảnh hởng đến cây thì việc nghiên cứu chuyển gen kh áng thuốc trừ cỏ PPT vào cây hoa lily là đòi hỏi của sản xuất , xuất

Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở các vùng

ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc bán cầu lily là một trong các loài hoa đẹp

đang rất đợc a chuộng trên thị trờng hoa hiện nay Với kiểu dáng đẹp sang trọng,một số chủng loại có hơng thơm quyến rũ và độ bền hoa rất cao (9-15 ngày), dễthu hoạch, bảo quản trên thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoadang thân củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thơng mại, chiếm 24% giá trịsản phẩm hoa thơng mại (Robinson và Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay,hoa lily đã đợc trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nớc ta nh Lâm Đồng, Hà Nội vàhầu hết các tỉnh miền Bắc và hiệu quả kinh tế rất cao, có thể xuất khẩu quy môlớn Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều của nơc ta đã tạo điều kiệnrất thuận lợi cho các loài cỏ dại phát triển đây là một trong những yếu tố hạn chếchủ yếu đến sản xuất hoa lily Chính cỏ dại làm cho giảm năng xuất, phẩm chất,

đặc biệt nó cạnh tranh dinh dỡng với cây để có thể trừ bỏ cỏ thì cần tốn nhiềucông lao động, để giảm bớt công lao động con ngời đã phải dùng đến các loạithuốc trừ cỏ nhng chính điều này đã gây ảnh hởng không nhỏ đến cây hoa lily

Để có thể vừa trừ đợc cỏ mà lại không gây ảnh hởng đến cây thì việc nghiên cứuchuyển gen kháng thuốc trừ cỏ PPT vào cây hoa lily là đòi hỏi của sản xuất ,xuất

Hoa lily thuộc Liliaceae là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị trênthị trờng hiện nay Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gem vào cây lily

đã đợc thực hiện bởi các phơng pháp chuyển gen trực tiếp nh bắn gen (Nishihara

và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự ; 1993 ; Wilmink và cộng sự, 1995 ;Tsuchiya và cộng sự, 1996), xung điện (Miyoshi và cộng sự, 1995) và gần đây

đã tạo đợc cây Lilium longiflorum chuyển gen nhờ phơng pháp bắn gen Trongmột số năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium đã đợc công bố trên một số loài thuộc họ Liliace bao gồm:Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo vàcộng sự, 2000), Allium cepa (Eady và cộng sự, 2000), Agapanthus praecox(Suzuki và cộng sự, 2001) và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano,2002).Gần đây nhất, Y Hoshi và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình tạo câychuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium ev Acapulco bằng vi khuẩnAgrobacterium.

Các kết quả nghiên cứu đã chứng tỏ chúng ta hoàn toàn có thể tạo đợc câyhoa lily

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các đối tợng thực vật có bộ gen lớn hoặc

là mức tối đa bội lớn nh cây hoa cúc, hoa đồng tìên sẽ khó tạo đợc cây chuyểngen hơn là các loài có bộ gen hay mức tối đa bội thấp hơn (Elomaa et al, 1993;Robinson & Froozabady 1993) Hiện cha có lý giải cho hiện tợng trên tuy nhiên,

có thể do các bộ gen nhỏ hơn thì khả năng các gen lạ có thể đợc cài vào vùnghoạt động cao hơn (Elomaa et al 1993; Robinson & Froozabady 1993) Sựkhông thành công trong biểu hiện các gen đợc chuyển có thể là kết quả của sự

đông đặc của DNA (Eady et al 1995a) hoặc sự metyl hoá (Torres et al 1993) đãkhông cho phép các gen đợc cài biểu hiện, chính vì vậy việc nghiên cứu chuyểncác gen chọn lọc hoặc gen chỉ thị trớc khi nghiên cứu chuyển các gen có tìnhtrạng mong muốn cho cây hoa lily là cấn thiết và có tính gợi mở cho các nghiêncứu tiếp theo

Mục tiêu của đề tài là xây dựng đợc những khâu cơ bản trong hệ thống kỹthuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ cho cây hoa Lily nhờ vi khuẩn

Agrobecterium tumefaciens.

Để đạt đợc mục tiêu đề ra ở trên chúng tôi cần hòan thành các yêu cầusau:

1 Xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh cho cây lily

2 Xác định ngỡng gây chết của PPT đối với mẫu vảy củ, lát cắt thân và

đỉnh sinh trởng của cây hoa lily

3 Bớc đầu thử nghiệm chuyển gen bar - kháng thuốc trừ cỏ vào cây hoa

lily thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens.

Phần II Tổng quan tài liệu2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lily

Cây hoa lily là cây thân thảo, thân dạng hành có vảy Thân thờng mọc đơn

có lá Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh thân Hoa lỡng tính, kích thớc lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn, có rất nhiêu màu sắc khác nhau Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 5 thùy Quả nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt

2.1.3 Giống

2.1.3.1 - Các nhóm giống trồng trọt

Công tác tạo giống, cải tiến giống hoa lyli đợc thực hiện trên 100 năm nay

do đó nên giống rất phong phú Trên thị trờng và trong trồng trọt thờng thấy 3nhóm: dòng lyli thơm, dòng á châu lai, dòng lyli phơng đông lai

a Dòng lyli thơm lai (the longi florum hybrids)

Gồm các giống đợc sinh ra từ lyli thơm và lyli Đài Loanvà các giống tạpgiao của chúng, cây cao tứ 120 - 140cm, một số có thể đến 200cm, lá hẹp dàihoặc hình kim sẻ ra, gắn vào thân, không có cuống lá Nụ rất to dài từ 12 - 18cm,khi vơn ra thì hơi trúc xuống, nằm ngang ra, chếch lên hoặc đứng thẳng Hoa cóhình loa kèn, hoa trắng tinh khiết và có vị thơm nồng Lyli thơm từ khi bứngtrồng đến khi ra hoa khoảng 12 - 14 tuần, tuỳ theo giống và nhiệt độ không khí

có biến động nhất định Thời gian xử lý lạnh để phá ngủ với lyli thơm nói chung

từ 4 - 6 tuần nhng có thay đổi ít nhiều tuỳ theo giống và thời tiết lúc thu hoạch

củ Các giống trong nớc thờng thấy là: Hoàng hậu tuyết(Snow Queen), White

Fox, Avita, Lilium formolongi Vụ đông xuân ở Quảng Đông trồng rất nhiềudòng lai của giống này.

b Dòng á châu lai(the asistic hybrids)

Là nhóm giống đợc chọn ra từ một số bố mẹ của lyli Châu á hoặc từ cácdòng lai của chúng

các bố mẹ đó là: quyển đau xuyên bách hợp, quyển đau đại toả, hoa kèn triềutiên, sơn đan…) luôn là mong cây cao từ 80- 160(cm) lá hẹp dài hình kim sẻ ra, gắn vào thân

nụ hoa thuộc loại nhỏ nhất dài 5,5-12,5(cm)

nụ hoa vờn ra theo các hớng lến, vơn ra ngoài và rũ xuống, hình dáng hoa congcuộn lại, hình cái bát rất ít có hình hoa kèn, màu sắc rất phong phú chủ yếu làmàu vàng, màu cam, hoa không thơm, từ khi trồng đến khi ra hoa từ 8-16 tuần,giống và nhiệt độ không khí ảnh hởng đến thời gian sinh trởng , thời gian xử lýlạnh phải ủ với củ giống từ 6-8 tuần, giống và thời gian vụ thu hoạch ủ giống ảnhhởng rất lớn đến thời gian xử lý lạnh phá ngủ

các giống thờng trồng ở Trung Quốc là: trung tâm nớc(novar center) màu vàng,giống sa mạc(cordclia) màu vàng, pollyauma màu vàng, Elite màu cam, Brunellomàu đỏ cam…) luôn là mong

c- Dòng lai phơng đông(the oriental hybrids)

gồm các giống thiên hơng, lộc tử(con hơu) các giống có nguồn gốc từ hoa kènNhật Bản và các giống thuộc dòng lai giữa các giống trên với hoa kèn Hồ báocây cao 60-240cm, lá tơng đối to, hình trứng hoặc hình kim sẻ rộng, lá có cuống

rõ và khác với dòng loài hoa kèn thơm và lai á châu Độ lớn của nụ thuộc loạihoa lớn nhất đờng kính từ 15-20 cm, nụ đa số mọc thẳng rất ít nằm ngang Hoa

có hình cái bát hoặc hình sao, màu sắc hoa rất phong phú mầu đỏ, phấn hồng, vàmàu sắc trắng là chính, hoa có mùi thơm nồng từ khi trồng đến khi ra hoa 12-20tuần thay đổi tuỳ theo giống và thời vụ tính khác nhau và thời tính vụ thu hoạchcũng ảnh hởng lớn tới thời gian sử lý lạnh phải ngủ nói chung khoảng 4-8 tuần.các giống trong nớc thờng thấy là: stargazer(sao hoàng tộc), giống nguyênsoái(Acafulco), Sorbonne, Merostar, Siberiamaqssa, starfighter, và tiber…) luôn là mong

hiện nay trên thế giới đang mở rộng diện trong các giống dòng lai thơm và lai áchâu (L/A)và dòng lai thơm với phơng đông (L/O) để dung hoà u điểm của haigiống

2.1.3.2- Các giống trồng trọt chủ yếu

a-Dòng lai loa kèn thơm

Avito: trồng vào vụ đông xuân cây có thể cao 120cm, thân cứng, lá dài hẹp, màuxanh đậm, lá phía trên ngắn, thẳng lên trên hình dáng đẹp Nụ to vừa dài 13-15

cm đẫy, mập nằm ngang hoặc chếch lêu trên

Hoa hình loa kèn, mở to, đẹp mắt, cánh hoa xếp chặt, đầu cánh hơi cong rangoài, màu trắng trang nhã, là loại hoa cắt tốt, tính chống chịu kém, nhiệt độ hơicao nụ teo lại, tỷ lệ bài dục cao, thời gian sinh trởng ngắn lại, cuống hoa ngắn.SnowQueen cây cao 60-115 cm cây tơng đối cứng, lá dài hẹp, màu xanh đậm, láphía trên cuộn lại, nụ hoa dài 13-15 cm, nằm ngang hoặc hơi cong xuống, ngoạihình đẹp, hoa nở miệng to, dáng đẹp, cánh hoa xếp tơng đối tha,cánh ngoài cuộnngợc lại cánh phía trong hơi cong, màu trắng là loại hoa cắt tơn đối đẹp tínhchống chịu tơng đối yếu

White fox cây cao, trồng vào vụ đông thân cao tới 130 cm thân rất cứng lá dàihẹp, màu xanh đậm hơi trúc xuống nụ tovừa 13-15 cm, nằm ngang hơi rủ xuống,

nụ to đẫy mập, ngoại hình đẹp,hoa hình loa kèn, miệng to, hình dáng đẹp, cánhhoa xếp tớng đối khít cánh ngoài cánh trong đều cong ra ngoài màu trắng, đẹp, làgiống làm hoa cắt rất tốt, là giống rất đợc a chuộng , tính chịu nóng kém, nhiệt

độ caonụ hoa nhiều, tỷ lệ bài dục cao, phẩm chất hoa kém, giôngs này tơng đốimẫn cảm với ánh sáng yếu

Lilium formolougi là giống mới nhập vào nớc năm nay và phát triển rất mạnh có

đặc sắc là giống cắt cành trồng bằng cây con cây cao to 100-180 cm trồng vào

vụ đông có thể cao tới trên 2m , thân rất cứng, lá có nhiều dạng, từ hình kim sẻdọc đến hình trứng, màu lá từ màu xanh xám đến xanh đậm, nụ tơng đối to từ13-16 cm, đa số thẳng đứng, rất ít nằm ngang nụ to mập, dáng đẹp, hoa hình loakèn, miệng không to cánh hoa xếp đầy, cánh nghiêng ra ngoài rất ít gặp congcuộn, có khả năng chịu nắng là giống cắt cành tốt

giống này là giống lai giữa hoa kèn thơm với hoa kèn Đài loan, qua chọn lọc bồidỡng đến nay đã hình thành một nhóm nhiều giống, chia ra loại hình trồng bằngcây con, loại hình trồng bằng củ và loại hình kiêm dụng, các giống thờng thấy

là : Ngân hà , Bạch phong, bạch mã, tuyết sơn…) luôn là mong

Dòng loa kèn chịu nhiệt là dòng do trung tâm nghiên cứu khoa học viện nôngnghiệp trọng khải tạo ra mới đây có thể trồng vào vụ hè thu ở khu vực hoa nam,

tỷ lệ ra hoa và phẩm chất hoa cắt đều cao

b-Dòng lai loa kèn châu á

Nove cento: là giống trồng trong nớc nhiều năm, sinh trởng khoẻ chống bệnhmạnh không mẫn cảm với ánh sáng khả năng thích ứng rộng cây không caokhoảng 110 cm nhiệt độ, ánh sáng ảnh hớng lớn đến chiều cao cây, nhiệt độ quácao, quá thấp, ánh sáng mạnh đều ức chế phát triển chiều cao Là giống tốt trồngtrong chậu và cắt cành, thân cành rất cứng, lá dài hẹp, lá phía trên ngắn, nằmngang, màu xanh đâm Nụ to và ngắn dài 7,5-8,4 cm nhiều nụ có một số nhánhthứ hai củ nhỏ dễ ra hoa, hoa hình sao, tơng đối nhỏ, cánh hoa ngẵn và dầy hơicong ngợc lại, xếp khít nhau Hoa màu vàng kim đều hoa đẹp, thời gian sinh tr-ởng ngắn Ơ vùng đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ xuân 7-10 tuần ra hoa.-Cordelia: trồng vào vụ đông xuân cây cao 110 cm, thân cành cứng, có góc cạnh,lá hình kim xẻ, nằm ngang hơi rủ xuống, lá xanh bóng, hơi bị cháy nụ dài 8,5-

10 cm tơng đối nhiều nụ có cành cấp hai tơng đối rõ hoa hình sao, miệng rộng,cánh dầy,phía giữa và dới rộng , phía trên tơng đối dài hơi cong ngợc lại Gốccành có một ít đốm nhỏ màu nâu, từ gốc cành kéo dài đến giữa cành có vết đốmmàu vàng cam cánh hoa xếp tha, tách rời nhau, thời gian sinh trởng ngắn ở

đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân từ 10-14 tuần ra hoa không mẫncảm với ánh sáng yếu

Pollyanna: quảng đông thờng gọi là ly ly vàng dáng cây dáng hoa màu sắc hoarất giống Cordelia nhng có rất nhiều tính trạng hơn cordelia là một giống trongdòng lai châu á màu vàng đợc a chuộng nhất, có diện tích trồng lớn nhát giốngnày sinh trởng khoẻ cây cao đến 120 cm lá xanh tơi hơi hớng lên trên nụ tơng

đối to , ít nhánh thứ hai chống bệnh cháy lá và bệnh muội tro mạnh thời giansinh trởng tơng đối ngắn ở vùng đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân.sau 10-12 tuần ra hoa có sức chịu nóng nhất định

Elite: cây có thế sinh trởng khoẻ, cao 110-120 cm , thân cành cứng, lá dài, hìnhkim, màu xanh tối, mọc ngang, nụ màu cam, dài 8-10 cm, không có cuống cấphai hoa hình cốc nông, hình sao, tơng đối to, cánh hoa tơng đối dày, xếp khítnhau, cánh hoa màu đỏ cam, ở gốc có một ít đốm đen nhỏ thời gian sinh trởngngắn ở đồng bằng chu Giang trồng vào vụ đông xuân sau 10-13 tuần ra hoa.giống này ở vùng ấm và nnơi không khí bị ô nhiễm bệnh mụi tro rất nặng, có thểdẫn đến huỷ diệt rất mẫn cảm với ánh sáng yếu

Brunello: cây sinh trởng khoẻ, cao 110 cm thân to cứng, lá dài hình kím sẻ màuxanh đậm, bóng nụ dài và to màu cam, dài 8,5-11 cm có nhánh cấp hai hoahình sao to, cánh dày phía ngọn hơi cong, xếp khít nhau, cánh màu đỏ quýt sáng,

đều, không có đốm, vệt thời gian sính trởng ngắn, ở vùng đồng bằng Chu Gianggieo trồng vào vụ đông xuân sau 9-11 tuần ra hoa, dòng màu cam của giống này

có tính chống chịu mạnh không mẫn cảm với ánh sáng yếu là giống tốt cảmnhiễm bệnh muội tro nhẹ

dòng lai á châu, ngoài các giống màu vàng, màu camcòn có màu đỏ, màu phấnhồng, màu trắng và nhiều màu nh giống: Amarono, Phanro nhng ở trung quốc ítthấy

c- Dòng lai phơng đông.

Stargazer(loa kèn lửa, hoàng tộc…) luôn là mong)

cây cao 60-100 cm , thân to, cứng, lá hình kim sẻ, hình trứng dài 9-10 cm, rộng

3 cm lá chếch lên trên, nụ hoa to, dài từ 11-13 cm, mập, thẳng, dáng đẹp hoahình sao, đẹp, cánh hoa xếp tơng đối khít, cánh trong cánh ngoài cong ra phíangoài, mép lá lợn sóng từ giữa cánh trở lên có giọt nh giọt sữa nổi lên , ,màucánh đỏ, có viền trắng hẹp đây là giống cắt cành và trồng trong chậu tốt, đợctrồng rộng rãi ở phía nam trung quốc, là m,ột trong những giống chủ lực ở trungquốc tính chống chịu khá, không mẫn cảm với ánh sáng yếu.Cần lu ý hiện tợngkhô đầu lá ở Hoa nam thời gian sinh trởng từ 90-110 ngày

Akapulco: cây cao to, 100-120 cm thân cành cứng lá dài hình kim, ngọn lá kéodài,mọc ngang Thân vơn dài nhanh, khoảng cách các lá tha nụ hoa to mập dài13-15 cm Hoa hình sao hoặc hình cốc nông, đẹp, đầu ngọn cánh hơi cong rangoài, mép lợn sóng Từ giữa cánh trở lên có giọt lmàu đỏ nổi lên cánh hoa màu

đỏ sáng đều đặn Đây là giống hoa cắt tốt , nụ và hoa có dáng đẹp, màu sắc đẹp,

đợc trồng nhiều ở phía bắc Trung Quốc nhiệt độ thấp dễ làm nụ biến hình ở Hoanam trồng vào vụ thu đông thời gian sinh trởng 80-90 ngày

Siberia: cây cao 100-110 cm, thân cành cứng lá hình kim sẻ, mọc ngang hoặctrúc xuống, nụ hoa to mập, đẹp mắt dài 12-14 cm Hoa hình sao cánh cong lật rangoài, mép cánh lợn sóng cánh hoa đẹp màu trắng Giống này tính chống chịumạnh là loại giống hoa cắt cành rất quý, giá cao

Sorbone: cây cao 80-100 cm, thân cành cứng, lá dài hẹp hình kim dài 12-13 cm,rộng 3,3-3,5 cm, hớng lên phía trên, nụ hoa to dài12-13 cm, mập đẹp Hoa hìnhchén nông, miệng rộng, cánh trong, ngoài mọc ngang hoặc hơi cong ra ngoài, từgiữa cánh trở xuống có giọt sữa màu đỏ, cánh hoa màu phấn hồng, mép cánh cóvệt trắng hẹp.(bản dịch hoa lily)

2.1.4 Đặc tính sinh vật học hoa ly ly

Đặc trng hình thái.

Ly ly là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200 cm Phần dới đất làthân vẩy, màu trắng hoặc màu hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc,nên gọi là thân vẩy trần (không vỏ, thân vẩy là củ giống để trồng.)

Bộ phận trên mặt đất là thân, lá ,và hoa,quả, là phần thơng phẩm của lyli Rễ lyli

có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củgiống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thântrên mặt đất gọi là rễ thân Đa số giống sản xuất những thân vẩy( củ) mọc ra từ

rễ này làm thực liệu để nhân giống

Lá lyli thờng mọc chéo nhau , hình dài, hình trứng…) luôn là mongkhông có cuống hoặccuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống

Hoa lyli to mọc riêng rẽ mọc thành chùm hoặc thành cụm trên đỉnh ngọnthân.Mỗi củ chỉ có một cành hoa, mầm thân của lyli bị rụng đi, hoặc sau khingắt ngọn không thể mọc ra thân mới, cũngkhông thể hình thành cành hoa khác.Nếu muốn cắt hoa thì không đợc bấm ngọn, hoa có hình loa kèn, hình phễu, hìnhsao, hình cái chén nông Màu sắc hoa rất phong phú, đẹp có màu trắng, màuvàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ, màu tím và nhiều màu Màu cánhthờng là đơn sắc, hoặc có đốm màu nâu, màu tím một số ít có hơng thơm

Cánh hoa sáu cái, hai vòng, mỗi vòng ba cái, nhị đực sáu cái, vòi nhỏ dài, túiphấn to có màu tím, ,màu vàng…) luôn là mong ở giữa có trục hoa nhỏ đầu phình to

lạnh càng dài thì ra hoa càng sớm.(bản dịch hoa lily)

2.1.5 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng.

Loa kèn có hoa to màu sắc phong phú, hơng thơm - là loại hoa đợc thế giới

a thích, lả loại hoa có lợng lu thông lớn trên thị trờng thế giới, sản lợng đứnghàng thứ 4 thứ 5 của hoa cắt

Loa kèn tợng trng cho sự tốt lành, đoàn kết, mỹ mãn nên càng đợc ngờiTrung Quốc a chuộng và trở thành loại hoa phát triển mạnh, sản lợng và giá trịngày càng cao.(bản dịch hoa lily)

Hoa tơi là một sản phẩm hàng hóa đặc biệt của ngành Nông Nghiệp Hiệnnay trồng hoa đã trở thành một ngành sản xuất phát triển khắp thế giới Trong đó

hoa loa kèn đóng góp một phần không nhỏ Với u thế rất phong phú về hìnhdạng, màu sắc, hơng thơm Hoa loa ken có giá trị kinh tế cao trong sản xuất lẫnmặt tinh thần.

Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa loa kèn còn đợc sử dụng đểtách chiết và tinh chế dầu thơm phục vụ cho một số ngành công nghiệp, mỹ phẩm, bánh kẹo Đối với y học, loài này cũng có một giá trị nhất định Loài hoa bách hợp L.browniFEbrown có tác dụng chữa bệnh, có thể sử dụng làm thuốc

Với giá trị nh vậy hoa loa kèn hứa hẹn mang lại một nguồn doanh thu lớn cho ngành sẩn xuất, kinh doanh mặt hàng này Hiện nay, trên thị trờng Việt Nam, các loại hoa loa kèn đang đợc bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000

đồng/cành (theo điều tra của thời báo kinh tế) Nh vậy đầu t vốn vào phát triển kinh doanh mặt hàng này sẽ đem lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao

2.1.6 Bệnh và cách phòng trừ:

a, Phòng trừ sâu bệnh

ở trung Quốc các bệnh thờng thấy là: bệnh muội tro, sâu thờng thấy là rệp

b, Phòng trừ bệnh

Trọng điểm là bệnh khô lá và muội tro

Với bệnh khô lá: sau khi trồng 30 ngày đã bắt đầu có bệnh, bệnh tập trung

ở phần giữa lá và đỉnh ngọn làm cho lá biến nâu, sau khi khô thì cuộn lại biếnthành màu nâu đen Nụ bị hại thời kỳ đầu biến thành màu nâu vàng đến màu nâu

đen rồi bị rụng, có thể áp dụng các biện pháp để phòng hoặc giảm bệnh

Trong thời gian ra nụ dùng lới cản quang che bớt ánh sáng, hạ bớt nhiệt độ

và khống chế độ ẩm, dùng tay tách các lá bị bệnh cho nụ lộ ra để giảm bệnh lâysang nụ

Với bệnh muội tro thì phun thuốc phòng: bách khuẩn thanh, Dithan đồngthời quạt thông gió

2.2 CHUYểN GEN ở THựC VậT

2.2.1 Chuyển gen ở thực vật và những lợi ích đối với cải tạo giống cây trồng

Vào những năm đầu của thập kỉ 80, các nhà khoa học khám phá ra việc chuyển gen hay còn gọi là biến nạp gen vào thực vật để tạo ra đặc tính di truyền mới nh kháng bệnh hay vật gây hại Nhiều kỹ thuật chuyển gen ra đời, đợc hoàn thiện và áp dụng rộng rãi nh: bắn gen trực tiếp, thông qua Agrobacterium, nhờ vào xung điện hoặc hoá

học Trong đó, 2 phơng pháp đầu tỏ ra hữu hiệu hơn cả Vào năm 1983, cây biến nạp gen đầu tiên ra đời đó là cây thuốc lá kháng kháng sinh Năm 1985, một số cây chuyển gen kháng sâu, bệnh virus và bệnh nấm lần lầu tiên đợc đa ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng

Đến nay, sự biến nạp gen vào cây trồng không còn là vấn đề phải tranh cãi nữa

mà đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Đã có hơn 50 loại gen

đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loài đã đợc kiểm tra ngoài đồng ruộng Đối với các loài cây rau, chuyển gen đã thành công ở cà chua, cà rốt, khoai tây, rau diếp, cần tây, súp lơ, da chuột, dâu tây, cải xanh, cải bắp, măng tây, …) luôn là mong ở các cây trồng ngũ cốc nh lúa nớc, lúa mạch, lúa mỳ, ngô và cả những cây công nghiệp nh cây bông việc nghiên cứu chuyển gen cũng đã thu đợc nhiều kết quả khả quan [1].

Những cây trồng đợc chuyển gen vẫn giống cây trồng truyền thống nhng chúng

có thêm một số đặc điểm đợc cải thiện Vì vậy ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nhằm cải tạo giống cây trồng đã đem lại nhiều lợi ích rõ rệt trong phát triển sản xuất nông nghiệp và phục vụ đời sống con ngời Có thể điểm những lợi ích đó nh:

- Tăng sản lợng

- Giảm chi phí sản xuất

- Tăng lợi nhuận nông nghiệp

- Cải thiện môi trờng

Ngày nay, các nhà khoa học đang hớng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ

2 có đặc điểm tăng giá trị dinh dỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:

- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt

- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột

- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây

- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng

- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [no1]

2.2.2 Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc

Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên

11 triệu năm 1997, 27,8 triệu năm 1998, 39,9 triệu năm 1999 và tới hơn 44 triệu năm

2000 Các quốc gia trồng cây chuyển gen gồm có Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urgoay và Mỹ [9].

Hiện nay, những sản phẩm lơng thực, thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên thị trờng

Các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật tập trung vào một số hớng nh:

- Chịu chất diệt cỏ

Ngời ta dùng gen tổng hợp hợp EPSP chuyển vào cây trồng để chịu đợc Glyphosphat Nhiều loài thực vật đã biến nạp và đang đợc thử nghiệm nh củ cải đờng,

đậu tơng, nho cải hạt dầu, bông, cà chua và thuốc lá

Cây đậu tơng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ khống chế cỏ dại tốt hơn, góp phần nâng cao hiệu quả của các trang trại nhờ tối u hoá năng suất và sử dụng hiệu quả đất trồng trọt, tiết kiệm thời gian cho nông dân Giống mới này hoàn toàn giống các giống

đậu tơng khác về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức chế biến thành thực phẩm và thức

ăn gia súc Đợc trồng nhiều ở Achentina, úc, Braxin, Canada, EU, Nhật bản, Hàn Quốc, Mexico, Nga, Thụy Điển, Mỹ và Uruguay

Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ đợc trồng tại úc, Canada và Mỹ.

- Kháng bệnh virus

Đang nghiên cứu các gen kháng bệnh virus của thực vật Ngoài ra đang nghiên cứu khả năng kháng virus bằng biến nạp gen từ động vật.

Đu đủ đợc chuyển gen của virus mã hoá cho protein vỏ của virus đốm vòng.

Protein này tạo cho cây khả năng tự bảo vệ chống lại bệnh đốm vòng Một gen từ nguồn bệnh đã đợc sử dụng để kháng lại chính nó

Cây khoai tây đã đợc chuyển gen giúp kháng virus gây xoăn lá, cây bí chuyển gen giúp kháng virus gây bệnh

- Kháng các loài gây hại

Chuyển gen độc tố từ Bacillus thuringiensis (BT) để tạo giống chịu côn trùng có

hại Cây bông chuyển gen Bt kháng sâu đục quả và ăn lá, đợc trồng phổ biến ở nhiều

n-ớc nh Trung quốc, Nam phi, Achentina, Các cây bông, lúa mang gen chuyển này có khả năng chống chịu sâu đục thân rất tốt.

Ngời ta làm tăng hàm lợng axit béo đơn không bão hòa và các thành phần dầu thực vật Cây đậu tơng chuyển gen axit oleic có hàm lợng axit oleic cao, một axit béo

có một liên kết không no Theo các nhà dinh dỡng thì chất béo không no đợc xem là tốt hơn so với chất béo no, đợc tìm thấy ở thịt bò, lợn, phomat và một số thức ăn thờng ngày khác.

Cải dầu chuyển gen có hàm lợng Laurate cao, đợc dùng trong công nghiệp thực phẩm để làm lớp phủ ngoài kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ Đợc trồng ở Canada

và Mỹ Cải dầu có hàm lợng axit oleic cao đợc trồng ở Canada.

- Làm chậm chín quả ở cà chua

Cây cà chua mang một gen chuyển làm chậm quá trình làm mềm quả tự nhiên khi quả chín Đây là loại thực phẩm chuyển gen đầu tiê n đợc sản xuất ở các nớc phát triển Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn

Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:

- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm.

- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.

- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo.

ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải thiện giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã đợc thực hiện Đó là: (1) Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế

tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu

tryptopha; (2) Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ

thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp

bằng súng bắn gen Đến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ chuyển gen chín chậm và kháng virus đốm vòng đã đợc tạo ra Các dòng cây chuyển

gen này sẽ đợc đa vào phân tích phân tử; (3) Chuẩn bị thiết bị để tiến hành các kỹ thuật

sinh học phân tử phục vụ việc đánh giá theo dõi cây chuyển gen nh PCR, lai Southern, RFLP, AFPD Nh vậy, có thể tiến hành chuyển gen và đa kỹ thuật này vào công việc tạo giống cây trồng ở Việt Nam [1].

2.3 Nghiên cứu tái sinh và chuyển gen trên cây hoa lily 2.3.1 Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K Kamo, 2004 J Transgenic Plants of Eastr lily (Lilium longiflorum) with Phosphinothricin Resitance J Plant Biotechnology (2004) Vol 6 (1).pp.9-13.

Tóm tắt

Qúa trình chuyển gen và biểu hiện của gen uidA đợc sử dụng trong nghiên

cứu tối u hoá các thông số khi chuyển gen bằng súng bắn gen cho huyền phù tếbào của hoa Easter lily, Lilium longiflorum Sử dụng hạt vàng cho sự biểu hiệncủa gen uidA cao hơn so với hạt đạn bằng tungsten Tiền xử lý dung dịch huyềnphù tế bào trớc 3 giờ bằng osmoticum (0.125M) cho hiệu quả biểu hiện của uidAtăng 1.5 lần Sử dụng áp lực 1550psi, khoảng cách 6cm có kết quả tốt nhất so vớicác áp lực 1100,1200,1800 psi Sự biểu hiện tạm của uidA xuất hiện ở 493 tếbào/đĩa petri Để chuyển gen bền vững, huyền phù tế bào của Lilium longiflorum

đợc bắn với plasmid bao gồm cucumber mosaic virus (CMV) replicase đợc điềukhiển bởi Act/ promoter và gen bar đợc điều khiển bởi CaMV promoter, 10 câytái sinh đã đợc phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây đã đợc khẳng định chuyển gennhờ lai Southern, 2 cây chuyển gen đợc chuyển độc lập trong đó có 1 cây manggen bar một cây mang cả hai gen bao gồm CMV replicase và bar gen Các câynày đã đợc xác định là có khả năng kháng PPT ở nồng độ 1000 mg/l ở giai đoạn

nở hoa chứng tỏ gen bar đã đợc biểu hiện ở toàn bộ lá khi đợc điều khiển bởiCaMV 35 S promoter

2.3.2 Y.Hoshi, M Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi, 2004 Production of transgenic lily plants by Agrobacterium- mediated transformation, Plant Cell Rep (2004) 22:359-364

Tóm tắt

Hệ thống tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho câyOriental hybrid lily Lilium cv Acapulco đã đợc nghiên cứu Callus xuất phát từống phấn đợc đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium dòng EHA101/plG 121

Hm, chứa véc tơ mang các gen nptH, hygr  , uidA trong vùng T-DNA Đãthu đợc 6 dòng kháng hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thơng callus vớigiấy ráp (sandpaper) trớc khi đồng nuôi cấy, callus đợc đồng nuôi cấy trên môitrờng MS không có NH4NO3, sử dụng Hyg trong môi trờng chọn lọc Các dòngtái sinh kháng hyg tạo chồi sau đó phát triển thành cây khi chuyển sang môi tr-ờng MS không bổ sung chất điều tiết sinh trởng Tất cả các cây đợc kết luậnchuyển gen nhờ GUS histochemical assay và phân tích inverse PCR

2.3.3 Sakae SUZUKI anh Masaru NAKANO, 2002, Mediated transformation in Liliaceous ornamental plant JARQ 36(3), 119- 127(2002) http://www.jircas.affrc.go.jp

Agrobacterium-Tóm tắt

Đã nghiên cứu chuyển gen cho 3 giống cây thuộc họ Liliace, Liliumformosanum, Agrobacterium đã đợc sử dụng, cả ba dòng đuểu cha binary vectormang gen nptII, hpt và gus trong vùng T-DNA Với Lilium formosanum, khôngthu đợc mô hoặc cây chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩnAgrobacterium mặc dù có sự biểu hiện tạm của gen gus trong callus trong quátrình đồng nuôi cấy Tuy nhiên, đã thu đợc một số cụm tế bào có khả năng khánghygromycin của giống Agapanthus praecox ssp Orientalis và Muscarriarmeniacum trên môi trờng có bổ sung hygromycin, Callus kháng hygromycin

đã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng đợc xác

định là cây chuyển gen dựa trên phép thử GUS histochemical assay và phân tíchPCR Bằng lai Southern đã phát hiện đợc 1-5 copy của gen trong bộ gen của câychuyển gen của 2 giống trong đó hầu hết là có 1 hoặc 2 copy Hệ thống chuyểngen vào Muscarri armeniacum và Agapanthus praecox ssp Orientalis có thể làmột công cụ để phát triển trong các nghiên cứu về sinh học phân tử

2.3.4 A.Mercuri, L De Benedetti, S Bruna, R Begliano, C Bianchini, G.Foglia, T.Schiva Agrobacterium- Mediated transformation with rol genes of Lilium longìlirum Thunb ISHS Acta Horticluturae 612

Tóm tắt

Đã nghiên cứu thành công hệ thống chuyển gen cho Lilium longiflorum

Thunb giống " Snow Queen" Callus phát sinh phôi xuất phát từ vòi nhuỵ vàcuống đã đợc cấy và đồng nuôi cấy trong 7 ngày với huyền phù của vi khuẩnAgrobacterium LBA 4404 mang binary vectơ pBin 19 bao gồm nptH gen đợc

điều khiển bởi nos promoter và các đoạn giới hạn T-DNA EcoRI 15, bao gồmORFs 10,11 và 12 tơng ứng với rol A, B và C đợc cắt từ Agrobacteriumrhizogenes pRi 1855 Các chồi chuyển gen đã đợc tái sinh trên môi trờng chọnlọc và dễ dàng nhân nhanh, ra rễ và chuyển ra đất Có sự đa dạng về kiểu hìnhcủa các dòng chuyển gen

2.3.5 A Lipsky, A Cohen, R Barg, S Shabtai, Y Salts, V Gaba, K Kamo, A Gera và A Watad Development of Lilium longiflorum cell cultures of high competence for transformation by particle bombarment and of high embryogenic capacity

Tóm tắt

Để có thể tạo đợc cây chuyển gen bền vững cho Lilium longiflorum

Thumb.vn Snow Queen cần thiết lập hệ thống tái sinh để có đợc callus (xuấtphát từ các đoạn vảy củ) có độ đồng đều về hình thái cao trong môi trờng lỏng.Callus xuất phát từ vảy củ có độ đồng đều thấp sau 6 tháng cấy chuyển Nghiêncứu chuyển gen đã đợc thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finertypebombardment trên callus có 3 hoặc 10 tháng đợc duy trì trong môi trờng lỏng ở

điều kiện bóng tối Các hạt vàng đợc bọc bới plasmid pUBQ3 gen GUS bao gồmgen uidA đợc điều khiển bởi UBQ3 promoter Thí nghiệm đợc lặp lại 3 lần mỗilần một đĩa, 10000 đến 15000 điểm biểu hiện của gen gus Callus nuôi cấy trênmôi trờng lỏng cho phép thu đợc cây chuyển gen bền vững cao hơn từ 50-70 lần

so với môi trờng đăc Đã tái sinh đợc 81.6+3.7 cây/ 1g callus tơi từ callus nuôicấy trong môi trờng lỏng lắc có chiếu sáng ở đầu giai đoạn tái sinh có sự hìnhthành phôi soma ở mức độ cao Kanamycin có hiệu quả chọn lọc tốt hơn so vớibialaphos Đã thu đợc 10 cây chuyển gen bền vững của Lilium longiflorumThumb cn Snow Queen Gần đây nhất, các tác giả đã sản xuất đợc hàng trămcây chuyển gen khác nhau sử dụng pCAMBIA2301 bao gồm gen rol B dới sự

điều khiển của Lat 52 promoter để chống lại sự phát triển của phấn hoa Gen gus

đã đợc biểu hiện rất mạnh trong các cây chuyển gen Các phân tích về gen củanhững cây này đang đợc tiến hành

2.4 kỹ thuật chuyển gen vào thực vật.

2.4.1 khái niệm về chuyển gen

kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đã đợc thiết kế ởdạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ ở cây trồng nói riêng và ở các vi sinh vật nóichung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng Plasmid tái tổhợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ các gen này hoạt độngtổng hợp nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơthể chuyển gen

2.4.2 Sự tái sinh cơ thể thực vật – cơ sở thành công của chuyển gen cơ sở thành công của chuyển gen 2.4.2.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh của thực vật

a, Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902), lần đầu tên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ củamột cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiêm tàng để phát triển thành một cơthể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đãphân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó

Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thểhoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào tính toàn năng của tế bào màHaberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thựcvật Cho đến nay con ngời đã hoàn toàn chứng minh đợc khả năng tái sinh củamột cơ thể sinh vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [0.1 G.C.Philips, 1997].

b, Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơquan chức năng khác nhau, đợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuynhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợptử) ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bàophôi sinh cha mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ tế bào phôisinh này chúng đợc tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho cácmô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào môchuyên hóa, đảm nhệm các chức năng khác nhau Ví dụ: mô dậu làm nhiệm vụquang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫnlàm chức năng dẫn nớc và dinh dỡng

Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

Quá trình phân hóa

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa

Quá trình phản phân hóaTuy nhiên khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không là hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trờng hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phânchia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngợc lại với

sự phân hóa tế bào về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đợc hoạt hóa (mà vốn trớc nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen lại bị đình chỉ hoạt động, điều này sảy ra theo một chơng trình đã đợc mã hóa trong cấu trúc của một tế bào khiến quá trình sinh trởng phát triển của cơ thể thực vật luôn đợc hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối cơ thể thờng bị ức chế bở các tế bào xung quanh khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thớc của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất

là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào kỹ thuật nuôi cấymô tế bào cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tác rời trong điều kiện vô trùng) một cách định hớng dựa vào sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bàothực vật Điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngời ta thờng bổ xung vào môi trờng nuôi cấy cả hai nhóm chất điều tiết sinh trởng thực vật là auxin và cytokinin

Tùy theo mục đích nghiên cứu đặt ra nh tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ, tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà môi trờng thích hợp là cần thiết nhất (Bajaj và cộng sự, 1975)

2.4.2.2 Vai trò của việc xây dựng hệ thống tái sinh.

Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì những đối tợng thờng

đợc sử dụng để chuyển gen là: Mô lá, mô thân, mô callus hay những tế bào tách rời những vật liệu này sau khi đã đợc biến nạp thành công, các tế bào đã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho các tế bào này tái sinh đợc thành cây hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào môi trờng tái sinh phù hợp Nếu nh,

sự tái sinh này thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu

đã đợc biến nạp đó sẽ trở nên vô nghĩa Chính vì vậy sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào do vây, việc lựa chọn và điều chỉnh môi trờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng, mang tính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiên biến nạp, bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng (potrykus, 1991)

JamesF.thutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Piter Waterhouse, (2000) nhận thấy: Để có thể tạo đợc giống mới nhờ cải biến ditruyền một cách có hiệu quả thì phải đảm bảo 4 yêu cầu sau:

*Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh đợc cây đã chuyển gen:

*Hệ thống vecter thích hợp để có thể đa đợc các gen vào DNA:

*Các gen thích hợp đã đợc nhân rộng và xác đinh các đặc tính: