nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang

TT Tên bảng Trang1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo 3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thàn

TRẦN QUANG VUI

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Ng­ êi

Hà Nội - 2012

TRẦN QUANG VUI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y

Mã số: 62 62 50 10

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS LÊ THANH HOÀ

2 TS NGUY ỄN BÁ HIÊN

Hà Nội - 2012

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Nghiên cứu sinh

Trần Quang Vui

Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- PGS.TS Lê Thanh Hòa và TS Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.

- Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đã

hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.

- Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu.

- Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án.

- Th.S Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ về kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu.

Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu

- đã động viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đình đ ể tôi dành thời gian cho nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Nghiên cứu sinh

Trần Quang Vui

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA VI DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH XI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đại cương về bệnh cúm gia cầm 4

1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 4

1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới 5

1.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam 7

1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh 9

1.1.5 Cơ chế sinh bệnh 13

1.1.6 Triệu chứng lâm sàng 15

1.1.7 Bệnh tích 16

1.1.8 Chẩn đoán bệnh 18

1.1.9 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 20

1.2 Sinh học phân tử virus cúm A 24

1.2.1 Hệ gen của virus cúm A 24

1.2.2 Protein của virus - cấu trúc và chức năng 26

1.2.3 Cơ chế phân tử quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36 1.2.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A 38

1.3 Tiến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 42

1.3.1 Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 42

1.3.2 Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 vào Việt Nam 44

1.3.3 Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam 47

1.5 Một số nghiên cứu về sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 tại Việt

Nam 50

1.6 Tầm quan trọng của việc giải mã hệ gen virus cúm A/H5N1 54

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

2.1 Đối tượng nghiên cứu 56

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 56

2.3 Nội dung nghiên cứu 56

2.3.1 Giải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4) phân lập từ gà Hậu Giang 56

2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 56

2.4 Vật liệu nghiên cứu 56

2.4.1 Nguyên liệu 56

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị 57

2.4.3 Hóa chất 57

2.4.4 Các dung dịch và môi trường 57

2.5 Phương pháp nghiên cứu 58

2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 58

2.5.2 Phương pháp RT-PCR 59

2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR 63

2.5.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 63

2.5.5 Phương pháp dòng hóa 64

2.5.6 Phương pháp giải trình tự 67

2.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 69

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70

3.1 Kết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5 N1 chủng CkHG4 70

3.1.1 Kết quả tách RNA tổng số 70

và NA (N1) 71

3.1.2.1 Giải trình tự gen H5 (HA) 71

3.1.2.2 Giải trình tự gen N1 (NA) 73

3.1.3 Kết quả giải trình tự các gen polymerase 75

3.1.3.1 Giải trình tự gen PB2 75

3.1.3.2 Giải trình tự gen PB1 76

3.1.3.3 Giải trình tự gen PA 77

3.1.4 Kết quả giải trình tự các gen NP, M và NS 79

3.1.4.1 Giải trình tự gen NP 79

3.1.4.2 Giải trình tự gen M 79

3.1.4.3 Giải trình tự gen NS 80

3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 83

3.2.1 Phân tích gen H5 84

3.2.2 Phân tích gen N1 93

3.2.3 Phân tích gen PB2 102

3.2.4 Phân tích gen PB1 và PB1-F2 106

3.2.5 Phân tích gen PA 112

3.2.6 Phân tích gen NP 117

3.2.7 Phân tích gen M 120

3.2.8 Phân tích gen NS 124

3.3 Thảo luận chung 131

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 136

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHỤ LỤC

Ký hiệu Tiếng Anh Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa

tiếng Việt

lập từ gà Hậu Giang năm 2005

protein

trình tự

Assay

Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym

vi khuẩn

NA Neuraminidase Enzym phân giải sialic

Chain Reaction

Phản ứng PCR ngược

(-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic

Acid

ARN sợi đơn âm

TT Tên bảng Trang

1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo

3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và

3.3 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5

đồng về amino acid (dưới đường chéo) gen H5 giữa các chủng

3.5 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen

3.7 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1

đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen N1 giữa các

giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần

3.10 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB2 chủng CkHG4

3.11 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2

3.12 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụn g gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh

3.13 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4

3.16 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần

3.18 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA

3.19 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần

3.20 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NP chủng

giới được sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen

3.22 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen M1 và M2

3.23 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới được sử dụng gen NS trong phân tích so sánh thành phần

TT Tên hình Trang

1.7 Sự biến đổi amino acid chuỗi nối HA 1 và HA 2 (điểm cắt của

1.9 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng

3.1 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số, sản phẩm RT-PCR và

3.2 Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen

3.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid

N1 (NA) chủng CkHG4 74

3.12 Phân tích diễn giải thành phần nucleoti de và amino acid của gen

3.13 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen

kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid bằng

3.14 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen

N1 về thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người.

Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3] Trong một thời gian rất ngắn, bệnh cúm gia cầm đã lây lan trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân ; và từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành một vấn đề dịch tễ phức tạp cầ n giải quyết tại nước ta.

Virus cúm A là loại virus có hệ gen RNA sợi đơn âm, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 -8 (hay được gọi theo tên p rotein mà chúng mã hoá tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA,

và cs, 2006) [126], được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008) [55]

H5N1 là một phân týp thuộc nhóm virus cúm A, loại hình phân týp kháng nguyên bề mặt HA là H5 và NA là N1, có độc lực cao gây nhiễm và gây bệnh nặng

nề ở gia cầm và cả trên người (Murphy và Webster, 1996) [113].

Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến đổi, tái tổ hợp biến chủng và thay đổi cấu trúc kháng nguyên để thích ứng gây bệnh (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7] Trình tự nucleotide hệ gen là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng virus cúm A/H5N1 Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những

biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.

Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và amino acid có thể xác định những vùng gen thường biến đổi, vùng gen ổn định làm

cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm đầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm.

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng trong chẩn đoán và

phòng bệnh, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1

phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang.

Mục tiêu của đề tài

(1) Giải mã được toàn bộ hệ gen gồm 8 phân đoạn của một chủng virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang.

(2) Phân tích được một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu được thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine phòng bệnh hiệu quả.

Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Đây là luận án nghiên cứu khá đầy đủ, có hệ thống về sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang.

- Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học về virus cúm A/H5N1.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hiểu biết thêm về tính đa dạng của virus cúm Trên cơ sở đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm đầu tiên dịch xuất hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.

Những đóng góp mới của đề tài

(1) Giải trình tự và n ghiên cứu hoàn chỉnh, có hệ thống hệ gen của một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm

2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong đợt dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện ồ

ạt ở Việt Nam.

(2) Đã phân tích đặc điểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, đồng nhất/tương đồng ; so sánh với các chủng trong vùng và thế giới.

(3) Đã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 cường độc dòng Quảng Đông (chủng CkHG4), góp phần hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và đóng góp dữ liệu cho đối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam.

(4) Đã khảo sát và xác định được các cặp mồi sử dụng có hiệu quả để thu nhận và giải trình tự hệ gen củ a virus cúm A/H5N1 thuộc những phân dòng lần đầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm (avian influenza) đúng hơn là cúm loài chim, là bệnh truyền nhiễm cấp tính của loài chim, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008) [55] Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11], (Horimoto và Kawaoka, 2005) [78] Sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân týp

HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân týp khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh

Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể độc lực cao xuất hiện

ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 và đã lan ra hơn 60 nước trên thế giới

ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Duan và cs, 2008) [59] , gây nhiều thiệt hại kinh tế

do gia cầm bị chết hoặc tiêu huỷ nhằm kiểm soát dịch, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7] Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục, đang là vấn đề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta (Nguyen và cs, 2008) [116], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11] Virus cúm A/H5N1 đang lưu hành ở nhiều nước, thường xuyên gây bệnh cho gia cầm và người, là nguy cơ gây đại dịch trên toàn thế giới.

1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gà (avian influenza) còn có tên là dịch hạch gà (Fowl Plague) lần đầu tiên được phát hiện ở Ita lia vào năm 1878 Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 1955 mới xác định được chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus

cúm týp A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 (Lê Văn Năm, 2004) [18]

Đại dịch giống như cúm được xác nhận lần đầu tiên vào năm 1580 Từ đó trở đi, trên toàn thế giới đã có 31 đại dịch được ghi nhận (Nguyễn Văn Thanh và cs, 2007) [24], (Bùi Quý Huy, 2007) [12] Trong thế kỷ XX đã xảy ra các đạ i dịch cúm

trên người như dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 – 1919 do virus cúm A/H1N1,

dịch cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm Hồng Kông

năm 1968 – 1969 do virus cúm A/H3N2, và dịch cúm Nga năm 1977 do virus cúm A/H1N1 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) [9]

Ở Việt Nam bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 được phát hiện năm

2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]

1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới

Cúm A/H5N1 là một loại virus có độc lực cao và gây bệnh trên n gười trong các đợt dịch cúm gia cầm những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ

được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể gọi chủng virus này là virus cúm A/H5N1 cổ điển Từ đó đến nay, cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch của H5 và N1 đã có nhiều thay đổi (Horimoto và Kawaoka, 2006) [79] Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), Hồng Kông (1997) với những biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện (de Jong và Hien, 2006) [54] Đặc biệt từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 gây ra dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11], (Duan và cs, 2008) [59] Virus cúm A/H5N1 giai đoạn 2003-2008, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên-miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác

với nhiều biến chủng H5N1 trước đây (Subbarao và Luke, 2007) [140], (Zhao và cs, 2008) [164] Từ đầu năm 1997 đến tháng 5 năm 2005, virus cúm A/H5N1 chỉ giới

khi lây nhiễm cho chim hoang dã ở vùng hồ Thanh Hải (Qinghai Lake), Trung Quốc bắt đầu lan truyền sang phía Tây, lan sang một số nước vùng Trung Á, trong

đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc - Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và Nigiêria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Salzberg và cs, 2007) [129]

Tính đến 2008, tổng số có trên 60 nước và vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm gia cầm, hàng trăm triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế (Duan và cs, 2008) [59], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

Ghi chú: N: số người nhiễm; C: số người chết; Số ca mắc bệnh bao gồm cả các ca tử vong.

WHO chỉ ghi nhận những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới – WHO (tính đến tháng 7/2012)

http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_ar chives/en/index.html

Số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 mỗi năm một cao hơn, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người nhiễm cúm gia cầm H5N1 giai đoạn 2003-7/2012 là 607 trường hợp, trong đó, 358 trường hợp đã tử vong chiếm tới 58,97% Indonesia, Ai Cập và Việt Nam là 3 quốc gia có số người nhiễm

và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất thế giới ( Bảng 1.1 ) Trong số 15 nước có người nhiễm cúm gia cầm, Indonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia

“điểm nóng”, có thể có các điều kiện thuận lợi để virus cúm A/H5N1 tiến hoá thích

nghi lây nhiễm và trở thành virus của người (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

1.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, chỉ trong một thời gian ngắn dịch đã nhanh chóng lây lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11] Hàng năm, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát tại nhiều địa phương trong

cả nước Có thể phân chia dịch cúm gia cầm ở Việt Nam thành các đợt dịch lớn như sau:

- Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gà và thuỷ cầm mắc bệnh, chết và thiêu huỷ hơn 4 3,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm Đặc biệt,

có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này

là 84.078 con Số người mắc bệnh do virus cúm A/H5N1 trong đợt dịch này là 27 người, trong đó có 9 trường hợp tử vong (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]

- Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gia cầm xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy

ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005 (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].

- Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các đàn gia cầm trong cả nước, c ùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]

- Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007.

- Trong năm 2008, dịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng 3/2008, sau đó lan sang 21 tỉnh thành phố trong cả nước (Lê Thanh Hòa

và cs, 2008) [11] Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 60.090 con, trong

đó có 23.498 gà và 36.592 con thủy cầm (Văn Đăng Kỳ, 2008) [14] Các ổ dịch thường xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam và trên cả 3 vùng: Vùng núi, trung

du và đồng bằng, chủ yếu xảy ra trên đàn gia cầm không tiêm phòng vaccine và ở loại hình trang trại gia đình hoặc hộ chăn nuôi nhỏ lẻ Ở loại hình chăn nuôi hỗn hợp, các ổ dịch thường phát ra trên đàn thủy cầm trướ c, sau đó lây nhiễm cho gà

- Từ năm 2009 đến nay, dịch bệnh cúm gia cầm H5N1 vẫn thường xuyên tái phát tại nước ta Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở các tỉnh: Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng, Bắc Ninh, Phú Thọ, Nghệ An, Quảng Trị, Đắk Lắk, Quảng Ngãi, Bình Định, Tiền

quả phân tích mẫu virus từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám sát virus cúm cho thấy clade virus mới (clade 2.3.2) lưu hành ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, duyên hải miền Trung và Tây Nguyên Riêng clade virus cũ (clade 1) vẫn lưu hành

ở một số tỉnh phía Nam (từ thành phố Hồ Chí Minh đến Cà Mau) (Nguyễn Ngọc

Tiến và cs, 2011) [29]

- Từ đầu năm đến hết tháng 5 năm 2012, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 61 xã/phường của 42 quận/huyện thuộc 14 tỉnh/thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 74.811 con (Văn Đăng Kỳ, 2012) [15]

Như vậy, dịch cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam hiện nay đã có sự xuất hiện của nhiều clade virus mới làm cho tình hình dịch tễ và định hướng phòng chống dịch trở nên phức tạp hơn.

1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh

1.1.4.1 Phân loại và danh pháp của virus cúm

1.1.4.1.1 Phân loại

Virus cúm được phân loại chủ yếu dựa theo đặc tính kháng nguyên của virus Virus cúm A gây bệnh cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống

Orthomyxoviridae được phân thành các nhóm virus cúm A (influenza A virus), virus cúm B (influenza B virus), virus cúm C (influenza C virus) và nhóm Thogotovirus dựa vào sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên trong nucleoprotein (NP) và matrix (M1) protein của chúng Virus cúm B và C không phân loại thành các phân týp (subtype) Tất cả virus cúm gia cầm (avian influenza virus) được xếp vào týp A Virus týp A được chia ra các phân týp dựa vào tính kháng nguyên của glycoprotein bề mặt ở hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Cho đến nay, tổng số phân týp chia theo cấu trúc chuỗi nucleotide (HA) là 16 (HA1-16) và theo protein NA là 9 (N1-9) Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong các phân týp là kết quả tái tổ hợp của 16 HA và 9 NA Vì vậy, virus cúm A được đặt tên là HxNy (x có giá trị từ 1 đến 16 và y có giá trị từ 1 đến 9) (Murphy và Webster, 1996) [113], (Nguyễn Tiến Dũng, 2008) [5]

1.1.4.1.1 Danh pháp

Tổ chức Y tế thế giới quy định thống nhất danh pháp lưu trữ hệ gen của các chủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ

liệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), theo thứ tự ký hiệu: Tên týp virus (serotype)/Loài động vật bị nhiễm/Vùng địa lý phân lập/Số hiệu đăng ký chủng virus/Thời gian phân lập/Loại hình phân týp (HA(H) và NA(N)) Ví dụ:

trên người bệnh, thì bỏ qua phần động vật bị nhiễm trong danh pháp (WHO, 2008) [159] Ví dụ: A/Vietnam/1203/04(H5N1) ( Hình 1.1B ).

Hình 1.1: Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm (WHO, 2008) [159]

(A: Phân lập ở các loài động vật; B: Phân lập trên người)

1.1.4.2 Hình thái và cấu trúc của virus cúm A

Hạt virus cúm A (virion) có hình cầu, đường kính 80 -120 nanomet (nm), đôi khi có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da lton (Da) Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm: màng bao ngoài (envelope), vỏ (capsid) và lõi là RNA sợi đơn âm (negative single strand) (Murphy và Webster, 1996) [113] ( Hình 1.2 ).

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng nguyên sinh chất của tế bào nhiễm được đặc hiệu hoá gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 -14

nm có đường kính 4-6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA ( matrix antigen) và các dấu ấn khác của virus (Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Zhou và cs, 2007) [165] Có sự phân bố

protein kháng nguyên vỏ có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và lây nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996) [113], (Wagner và

Hình 1.2: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus

cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng

nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của virus).

C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept

Pathology, University of Cambridge ) Thành phần hoá học của virus cúm A bao gồm: RNA chiếm 0,8-1,1%, protein 70-75%, lipid 20-24% và 5-8% carbohydrate Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glycolipid Carbohydrate

gồm các loại men galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamine Thành phần protein chủ yếu của virus là glycoprotein (Murphy và Webster, 1996) [113]

1.1.4.3 Độc lực, khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus cúm A

1.1.4.3.1 Độc lực của virus

Dựa vào các tiêu chuẩn di truyền phân tử và sinh bệnh học cụ thể virus cúm

A được chia làm hai loại: loại độc lực thấp (LPAI) và loại độc lực cao (HPAI), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên (Kelly và cs, 2008) [88]

- LPAI: là loại virus cúm A khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm (Webster, 1998) [156]

- HPAI: là loại virus có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng

48 giờ sau nhiễm Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng (Webster, 1998) [156]

1.1.4.3.2 Khả năng gây bệnh của virus cúm A

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng (Webster, 1998) [156], (Nicholson và cs, 2003) [118] Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của

chúng (Suzuki, 2005) [143]) Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân týp H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất (de Wit và Fouchier, 2008) [55]

1.1.4.3.3 Sức đề kháng

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lý hay ho á học Virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh (Fang và cs, 2008) [61] Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: phenol, formaldehyde, β-propiolacton, natri hypoclorid, acid loãng và hydroxylamine Virus

bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày dưới ánh sáng thường Tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100 o C và ở

60 o C/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70 o C) Trong phủ tạng gia cầm (40 o C), virus tồn tại 25-30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7-8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37 o C) Trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30 o C (Murphy và Webster, 1996) [113], (Webster, 1998) [156].

1.1.5 Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus cúm tiếp cận tế bào đích (chủ yếu là tế bào biểu mô đường hô hấp) và bắt đầu quá trình nhân lên Kết quả là số lượng virus tăng lên nhanh, tải lượng virus cao làm cho tế bào nhiễm bị phá hủy hàng loạt do bị dung giải trực tiếp hoặc mất trạng thái cân bằng vốn có của chúng, gây tổn thương không chỉ đường hô hấp trên mà còn gây tổn thương sâu ở các phế nang và phế quản nhỏ dẫn đến suy giảm hô hấp khiến sức đề kháng của cơ thể giảm sút rõ rệt, làm kế phát các bệnh vi khuẩn, virus khác, từ đó có thể gây tử vong nhanh (Cinatl

và cs, 2007a) [48], (Korteweg và Gu, 2008) [90], (de Jong và cs, 2005a) [52] Sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 ở động vật được quyết định bởi khả năng nhân lên nhanh của virus và khả năng tác động đến nhiều loại mô bào của vật chủ (Maines và

cs, 2005) [106], (Govorkova và cs, 2005) [69] Sinh bệnh học của virus cúm ở người phụ thuộc chủ yếu vào các yếu tố như: sự tương tác của virus với các hàng rào sinh học, loại tế bào đích, quá trình viêm và sự rối loạn điều hòa miễn dịch (Cinatl và cs, 2007a) [48].

Có nhiều yếu tố liên quan đến sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 (Korteweg và Gu, 2008) [90] Sự kết hợp giữa các yếu tố đó sẽ quyết định mức độ tổn thương mô bào và sự trầm trọng của bệnh, và rối loạn điều hòa cytokine và chemokine có thể là một trong những cơ chế chủ yếu trong sinh bệnh học của virus cúm A/H5N1 Cơ chế sinh bệnh của virus cúm A/H5N1 được tóm lược và trình bày

1.1.6 Triệu chứng lâm sàng

Khi gia cầm bị phơi nhiễm virus, tùy thuộc vào độc lực của chủng virus cảm nhiễm mà chúng có thể không mắc bệnh, bị bệnh nhẹ hoặc rất trầm trọng Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm thay đổi và bị chi phối bởi độc lực của virus, loài vật cảm nhiễm, tuổi, thời gian tác động, kế phát do vi khuẩn và điều kiện môi trường (Beard, 1998) [40]

Thời gian nung bệnh từ vài giờ đến 21 ngày, có trường hợp kéo dài đến 28 ngày Gia cầm bệnh sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ (Hình 1.4).

Hình 1.4: Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cúm gia cầm Ghi chú: A: Xuất huyết

da chân; B: Mào, tích sưng, xuất huyết Nguồn: Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương

Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hoá, hô hấp, sinh sản và thần kinh Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức

ăn, gầy yếu Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, mệt lả, rối loạn thần kinh,

ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường Những triệu chứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ (Tô Long Thành, 2004) [25] Trong trường hợp quá cấp tính, gây chết đột ngột, như các vụ dịch năm 2004 –

2005 tại Việt Nam, triệu chứng lâm sàng đã không biểu hiện và gia cầm chết chỉ sau vài giờ khi có sự tác động của mầm bệnh Toàn bộ các ca bệnh cấp tính hoặc quá cấp tính đều bị chết, có khi lên đến gần 100% Trường hợp cấp tính gia cầm chết

xuất hiện chỉ 24 giờ sau khi có triệu chứng đầu tiên và thường kéo dài trong khoảng

48 giờ Trứng đẻ ra sau khi gia cầm nhiễm bệnh thường không có vỏ cứng phía ngoài Một số gà mái đẻ có thể khỏi bệnh nhưng rất hiếm khi đẻ trứng bình thường trở lại.

Đối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày trung bình là khoảng 3 ngày Lúc đầu bệnh nhân sốt cao 39 o C và kéo dài từ 1 đến 3 ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho sổ mũi, nhức đầu, có thể tiến tới khó thở rồi ngạt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỷ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người, người có thể nhiễm cả đường hô hấp trên và dưới (Hui, 2008) [81] Trong trường hợp không xảy ra những biến chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong vòng một tuần Tuy nhiên, nếu trường h ợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong, đó là trường hợp bị biến chứng

đi kèm viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai (Bauer và cs, 2006) [39], (Gambotto và cs, 2008) [65]

1.1.7 Bệnh tích

1.1.7.1 Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đại thể ở các loài khác nhau có biểu hiện khác nhau ( Hình 1.5 ) Đối với gà bệnh tích thường gặp gồm mào, tích sưng to, phù quanh mí mắt Thể nhẹ bệnh tích ở các xoang trong cơ thể đặc trưng bởi viêm cata, lắng đọng fibrin, có mủ hoặc hình thành casein Có thể phù ở niêm mạc khí quản với dịch thẩm xuất khác nhau từ thanh dịch đến casein Viêm xoang bụng cata hoặc fibrin, có thể viêm dính buồng trứng với xoang bụng Ống dẫn trứng ở gà mái đẻ thường xuất huyết nặng Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ Xuất huyết điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng Xuất huyết hầu hết toàn bộ đường tiêu hoá, đặc biệt thấy rõ ở manh tràng, dạ dày tuyến Tụy thường sưng to, có những vạch vàng hoặc đỏ sẫm theo chiề u dọc Túi Fabricius ở gà xung huyết và xuất huyết Bệnh tích này rất giống với bệnh tích của bệnh Newcastle (Lê Văn Năm, 2004) [18], (Alexander, 1999) [35] Các biến đổi bệnh lý đại thể của bệnh

cúm gia cầm trên ngan và vịt về cơ bản cũng giống như trên g à Tuy nhiên tần suất biến đổi tập trung chủ yếu ở phổi, túi khí, tim, buồng trứng, xương lồng ngực, cơ quan sinh sản và đường ruột (Lê Văn Năm, 2004) [18]

Ở người, virus xâm nhập niêm mạc phế nang phế quản, nhân lên gây huỷ hoại biểu mô túi khí, gây xung huyết, xuất huyết và tràn dịch phổi ở bệnh nhân Mặt khác, virus có khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não, và có thể xuyên qua nhau thai xâm nhập bào thai Mất cân bằng điều hoà miễn dịch do hiện tượng tăng cytokine không kiềm chế gọi là “bão cytokine” (cytokine storm) thường xảy ra dẫn đến cơ thể bị suy sụp và tử vong (Korteweg và Gu, 2008) [90]

não và một số cơ quan khác Mạch quản của các cơ quan như mào, tích, lách, gan, phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não và một số cơ quan khác bị giãn rộng và thâm nhiễm

tế bào xung quanh mạch quản (Beard, 1998) [40]

1.1.8 Chẩn đoán bệnh

1.1.8.1 Chẩn đoán dựa vào các yếu tố dịch tễ

Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ như bệnh lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vaccine c úm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt ở mức thấp.

1.1.8.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích

Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và biểu hiện bệnh tích để chẩ n đoán, lưu ý tới một số đặc điểm chính như gia cầm mắc bệnh c hảy nhiều nước mắt, viêm xoang mũi, mào, tích và chân tái xanh, phù đầu và mí mắt, lông cổ dựng ngược, ỉa chảy và có triệu chứng thần kinh.

Căn cứ vào những bệnh tích điển hình như phổi, gan, th ận, lách sưng to, hoại

tử màu vàng hoặc màu xám Xuất huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata và xuất huyết.

Ở gà mái đẻ ống dẫn trứng viêm, vỡ trứng non Xuất huyết dạ dày cơ, đôi khi xuất huyết dạ dày tuyến giống với bệnh Newcastle, xuất huyết điểm ở ruột, sưng hạch ruột Túi Fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết Xuất huyết và hoại tử tuyến tụy, tuyến tụy chuyển sang màu vàng, có các vệt sẫm màu Phù keo nhầy và xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối), da chân xung huyết đỏ sẫm Chảy máu lỗ

[40] Trong trường hợp gia cầm chết do bệnh ở thể quá cấp tính thì biểu hiện bệnh tích thường không điển hình.

1.1.8.3 Chẩn đoán phi lâm sàng

Bệnh cúm gia cầm có triệu chứng rất đa dạng, nếu chỉ dựa trên các đặc điểm lâm sàng thì chẩn đoán không thỏa đáng, trừ trường hợp trong giai đoạn xảy ra dịch.

Muốn chẩn đoán chính xác bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm ở người cần phải thực hiện chẩn đoán phòng thí nghiệm Các xét nghiệm phát hiện sự hiện diện của virus cúm trong cơ thể bệnh, đó là các phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu ( HI ), test chẩn đoán nhanh (ví dụ, Capillia Flu A/B test), hoặc các chẩn đoán xác định dựa vào các xét nghiệm huyết thanh học và phân lập virus (Nicholson và cs, 2003) [118], (OIE, 2005) [169]

Có thể sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng ELISA để tìm kháng thể trong máu gia cầm Tuy nhiên, trong điều kiện thực tế hiện nay, sử dụng các phản ứng này để chẩn đoán là không còn phù hợp, vì khi xác định đượ c trong huyết thanh chẩn đoán có kháng thể kháng virus cúm gia cầm nhưng có thể do gia cầm đã đáp ứng miễn dịch với vaccine hoặc đã có sự xâm nhập của mầm bệnh vào cơ thể gây đáp ứng miễn dịch nhưng mầm bệnh đã bị đào thải khỏi cơ thể (FAO, 2004) [62] Vì vậy, để xác định bệnh một cách chắc chắn cần phải xác định

sự có mặt của căn nguyên gây bệnh cúm gia cầm Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm rất hiệu quả và có độ chính xác cao là phân lập virus Nhưng trở ngại đối với phương pháp này là đòi hỏi kỹ thu ật tương đối nghiêm ngặt: phôi gà từ gà mái chưa có miễn dịch, thường là gà nuôi ở trạng thái cô lập bệnh đặc hiệu (gà SPF) (FAO, 2004) [62] nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được.

Các phương pháp Real-time PCR và reverse transcription-PCR (RT-PCR),

kể cả PCR đa gen (multiplex-PCR), trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A

và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm, gần đây đã được đưa vào ứng dụng, cho phép chẩn đoán xác định và phân biệt sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh,

có độ chính xác và tin cậy cao chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm (OIE, 2005) [169], (Wu và cs, 2008a) [160] Đây là những phương pháp phát hiện virus phổ biến nhất hiện nay và rất nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam đã có khả năng thực hiện.

Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.

- Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine) là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gia cầm giống chủng gây bệnh trên thực địa (Swayne và Suarez, 2000) [144]

- Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thự c địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản

xuất nhờ sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ các vùng “gen độc” Các loại vaccine này

hoặc đang được nghiên cứu hoặc đã đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:

- Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: Loại vaccine này sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp hai gen H5 và N1 phòng chống virus týp H5N1 và H7N1 (Qiao và cs, 2006) [125] Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất

vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2),

sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.

- Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine (Peyre và cs, 2008) [123], (Prel và cs, 2008) [124]

- Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vaccine phòng

gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Tian và

cs, 2005) [147], (Suguitan và cs, 2009) [141] Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y

tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG -14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp

A/Vietnam/1203/2004(H5N1) (Nicolson và cs, 2005) [119] Trung Quốc cũng là nước sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y Cáp-Nhĩ-Tân đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô hoạt n hũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại phân týp H5N2 có độc lực yếu; hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu (Tian và cs, 2005) [147], (Qiao và cs, 2006) [125] Các loại vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến nay.

Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống virus vaccine nhược độc thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xoá gen bằn g công

nghệ gen, được lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics – based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà (Marsh và Tannock, 2005) [107] Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG -14 được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, M, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm

(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) (Tian và cs, 2005) [147] Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột

biến điểm ở các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3 amino acid tại

vùng gây độc Mặc dù virus được xử lý làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên (Peyre và cs, 2008) [123], (Doherty và cs, 2006) [57]

1.1.8.2 Hóa dược liệu sử dụng phòng chống bệnh cúm gia cầm

Một số loại hóa dược sử dụng trong các thuốc ức chế virus không đặ c hiệu

có tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm (ức chế NA), hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói của virus do ức chế kênh vận chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhân lên của virus trong tế bào nhiễm (Basler, 2007) [38] Các loại hóa dược sử dụng phổ biến trong phòng chống virus cúm A bao gồm:

Hóa dược ức chế kênh vận chuyển ion M2

Nhóm Adamatane gồm có Amantadine và Rimantadine là những loại hóa dược chống virus cúm được cấp phép đầu tiên (Hayden, 2006) [75] Cả hai loại thuốc này đều có tác dụng ở mức liều thấp chống lại các phân týp virus cúm A khác nhau nhưng không có tác dụng đối với virus cúm B Adamatane hướng đến vùng xuyên màng (transmembrane domain) trong protein M2 của virus cúm A, ức chế sự

xâm nhập của dòng proton vào trong virus, và sau đó là ức chế sự giải phóng RNP khỏi M1 (quá trình “cởi áo”) - là quá trình cần thiết để vận chuyển RNP vào trong nhân Adamantane còn có tác động chống virus ở các giai đoạn sau của quá trình nhân lên của virus, khi tế bào nhiễm chủng virus cúm gia cầm H5 và H7, do tương tác với hoạt động chuyển vận ion của M2 trong quá trình vận chuyển ngoại bào (Cinatl và cs, 2007b) [49]

Tuy nhiên, hiện nay virus cúm A đã đề kháng với Amantadine và Rimantadine Đột biến t hay thế serin bằng asparagin ở vị trí 31 trong protein M2 đã làm cho virus cúm A/H5N1 kháng với Amantadine (Tosh và cs, 2011) [148] Sự kháng thuốc xuất hiện nhanh sau khi điều trị bệnh nhân nhiễm virus cúm A bằng Amantadine Virus kháng Amantadine có đầy đủ độc lực và khả năng lây truyền (Cinatl và cs, 2007b) [49]

Hóa dược ức chế NA

2006) [75] Chúng được đưa vào sử dụng trong thực tiễn lâm sàng năm 1999 và Oseltamivir (một loại thuốc uống) đã nhanh chóng trở thành loại thuốc được lựa chọn chủ yếu trong điều trị bệnh cúm và dự phòng cho các đại dịch (Moscona, 2005) [111]

NA của virus thủy phân acid sialic của sialoglycan, thúc đẩy giải phóng virus vừa được tạo thành ra khỏi tế bào nhiễm bằng cách phá hủy thụ thể trên tế bào chủ

và của chính virus, tiếp đến là chu trình nhân lên của virus trong tế bào Các thuốc

ức chế NA tương tác với quá trình này và ức chế sự giải phóng virus cúm mới hình thành khỏi tế bào nhiễm Sử dụng các thuố c ức chế NA trong điều trị có thể ức chế hiệu quả các bước khởi đầu trong quá trình nhân lên của virus cúm Do vậy, để có hiệu quả điều trị cao, việc sử dụng sớm thuốc ức chế NA cho bệnh nhân mắc bệnh cúm là rất cần thiết (Cinatl và cs, 2007b) [49]

Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza) là hai loại thuốc ức chế NA chính được sử dụng trong lâm sàng Oseltamivir là dạng thuốc uống, trong khi Zanamivir là thuốc bột dùng để ngửi nhờ một thiết bị hỗ trợ thở Cả hai loại thuốc

đều có hiệu quả đối với tất cả các phân týp NA nên được sử dụng để điều trị tất cả các chủng virus cúm (Moscona, 2005) [111] Do virus cúm nhân lên trong đường

hô hấp đạt đỉnh trong khoảng 24-72 giờ sau khi xuất hiện bệnh nên các thuốc ức chế

của các thuốc ức chế NA so với các thuốc ức chế kênh chuyển vận ion M2 là khó tạo ra các chủng virus cúm kháng thuốc (Monto, 2006) [110] Các nghiên cứu gần đây cho thấy đột biến H252Y trong NA làm cho virus có tính khán g Oseltamivir cao (Shu và cs, 2011) [135]

Có thể sử dụng Oseltamivir để dự phòng trong vòng 48 giờ sau tiếp xúc với mầm bệnh và là loại thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/H5N1, tuy nhiên thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghi nhận nh ư gây rối loạn tâm thần và có thể gây độc sau khi điều trị liều cao (Aoki và cs, 2007) [36]

Điều trị cúm A/H5N1 có thể đạt kết quả tối ưu khi sử dụng phối hợp hai thuốc ức chế NA với nhau, hoặc một thuốc ức chế NA với một thuốc nhóm Adamantane (nếu kiểu gen của loại virus cúm đang lưu hành mẫn cảm với Adamantane), hoặc một thuốc ức chế NA kết hợp với Ribavirin (Cinatl và cs, 2007b) [49] Các nghiên cứu cho thấy, phối hợp Adamatane với thuốc ức chế NA trong điều trị có thể làm giảm sự xuất hiện các biến chủng virus cúm kháng thuốc (Ilyushina và cs, 2006) [83]

1.2 SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A

1.2.1 Hệ gen của virus cúm A

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1-8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử (hay được gọi theo tên protein mà chúng mã hoá tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) (Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan và cs, 2006) [126] ( Hình 1.3B ) Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50-100 nm, đường kính 9-10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) - bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc RNP Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase (PA,

PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus ( Hình 1.3C ) Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000-15.000 bp (tùy theo từng chủng virus cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kilobase thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus Hai đầu 5’- và 3’- sợi RNA hệ gen virus có gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các phân týp là: 5’-

[113]

Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hoá tổng hợp các enzym trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao (Murphy và Webster, 1996) [113] , bao gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hoá tổng hợp protein enzym PB2, có kích thước

2341 bp.

- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2341 bp, mã hoá tổng hợp

enzym PB1.

- Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hoá tổng hợp

protein enzym PA, có kích thước 2233 bp.

Các phân đoạn 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng vir us cúm A

(ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp) Đây là gen chịu trách nhiệm mã hoá tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt của virus cúm.

- Phân đoạn 6 (gen NA) là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên

bề mặt capsid của virus, có chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) Các nghiên cứu gần đây cho thấy gen NA của các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn 1996-2003 có hiện tượng đột biến xóa đi 57 nucleotide, còn ở các chủng phân lập