nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang tóm tắt

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 CkHG4 phân lập từ gà Hậu Giang - Giải trình tự gen kháng nguyên HA và NA - Giải trình tự gen polymera

Trang 1

MỞ đẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA đỀ TÀI

Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tắnh có tốc ựộ lây

lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong ựàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân

týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ

Orthomyxoviridae gây ra Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành

chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ ựộng

vật sang người

Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần ựầu tiên tại Việt

Nam năm 2003 Trong một thời gian rất ngắn, bệnh ựã lây lan trên toàn

bộ ựất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn

cho nền kinh tế quốc dân; và từ ựó ựến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành

một vấn ựề dịch tễ phức tạp cần giải quyết tại nước ta

Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến ựổi, tái tổ hợp biến chủng và

thay ựổi cấu trúc kháng nguyên ựể thắch ứng gây bệnh Trình tự nucleotide hệ

gen là cơ sở ựể xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng

virus cúm A/H5N1 Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông

tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những biến

chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm

Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tắch trình tự nucleotide

và amino acid có thể xác ựịnh những vùng gen thường biến ựổi, vùng gen

ổn ựịnh làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1

xuất hiện từ những năm ựầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại

vaccine thắch hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm

để có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ

ựó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm

A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng

trong chẩn ựoán và phòng bệnh, chúng tôi tiến hành ựề tài: Nghiên cứu hệ

gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

MỤC TIÊU CỦA đỀ TÀI

(1) Giải mã ựược toàn bộ hệ gen gồm 8 phân ựoạn của một chủng

virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang

(2) Phân tắch ựược một số ựặc ựiểm sinh học phân tử của hệ gen

nhằm thu ựược thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine

phòng bệnh hiệu quả

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA đỀ TÀI

- đây là luận án nghiên cứu khá ựầy ựủ, có hệ thống về sinh học phân

tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang

- Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học về virus cúm A/H5N1

Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI

- Kết quả nghiên cứu của ựề tài giúp hiểu biết thêm về tắnh ựa dạng của virus cúm Trên cơ sở ựó góp phần xây dựng phương pháp chẩn ựoán

và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp

- Kết quả nghiên cứu của ựề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan

hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm ựầu tiên dịch xuất hiện ở vùng ựồng bằng sông Cửu Long

NHỮNG đÓNG GÓP MỚI CỦA đỀ TÀI

(1) Giải trình tự và nghiên cứu hoàn chỉnh, có hệ thống hệ gen của một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể ựộc lực cao (HPAI) phân lập từ

gà tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong ựợt dịch cúm gia cầm lần ựầu tiên xuất hiện ồ ạt ở Việt Nam

(2) đã phân tắch ựặc ựiểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, ựồng nhất/tương ựồng; so sánh với các chủng trong vùng và thế giới

(3) đã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 cường ựộc dòng Quảng đông (chủng CkHG4), góp phần hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và ựóng góp dữ liệu cho ựối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam (4) đã khảo sát và xác ựịnh ựược các cặp mồi sử dụng có hiệu quả ựể thu nhận và giải trình tự hệ gen của virus cúm A/H5N1 thuộc những phân dòng lần ựầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN: luận án gồm 159 trang (không kể phần phụ

lục), chia thành các phần như sau: Mở ựầu (3 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (52 trang), Chương 2: Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (66 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Các công trình ựã công bố liên quan ựến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (21 trang) Luận án có 31 bảng biểu, 28 hình minh họa Tổng số tài liệu tham khảo là 170, gồm 32 tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh (có 3 trang web)

Trang 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 đẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm (avian influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tắnh, do

nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra đây là nhóm virus

có biên ựộ chủ rộng, ựược phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa

trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus Nhóm

virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 ựến H16) và 9 phân type NA (từ

N1 ựến N9)

Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể ựộc lực cao

xuất hiện ở vùng Quảng đông, Trung Quốc năm 1996 và ựã lan ra hơn 60

nước trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi, ựược chứng minh là có

khả năng lây nhiễm từ ựộng vật sang người Bệnh cúm gia cầm A/H5N1

lần ựầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ ựó ựến nay

bệnh xảy ra liên tục, ựang là vấn ựề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều

phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta

1.2 HỆ GEN CỦA VIRUS CÚM A

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi ựơn âm, bao gồm 8 phân ựoạn gen riêng

biệt mang tên từ 1-8, mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2,

PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2)

Các phân ựoạn 1, 2 và 3 là những phân ựoạn mã hoá tổng hợp các

enzym trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có ựộ

dài ổn ựịnh và có tắnh bảo tồn cao bao gồm:

- Phân ựoạn 1 (gen PB2) mã hoá tổng hợp protein enzym PB2, có

kắch thước 2341 bp

- Phân ựoạn 2 (gen PB1) cũng có kắch thước 2341 bp, mã hoá tổng

hợp enzym PB1

- Phân ựoạn 3 (gen PA) là phân ựoạn gen bảo tồn cao, mã hoá tổng

hợp protein enzym PA, có kắch thước 2233 bp

Các phân ựoạn 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) bề mặt

capsid của virus, có tắnh kháng nguyên ựặc trưng theo từng chủng virus

cúm A, bao gồm:

- Phân ựoạn 4 (gen HA) có ựộ dài thay ựổi tùy theo từng chủng virus

cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng

1704 - 1707 bp) đây là gen chịu trách nhiệm mã hoá tổng hợp protein

HA - kháng nguyên bề mặt của virus cúm

- Phân ựoạn 6 (gen NA) là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng

nguyên bề mặt capsid của virus, có chiều dài thay ựổi theo từng chủng

virus cúm A (ở A/H1N1 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay ựổi khoảng từ 1350 -

1410 bp)

Các phân ựoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có ựộ dài tương ựối ổn ựịnh giữa các chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân ựoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), kắch

thước khoảng 1565 bp

- Phân ựoạn 7 (gen M) có kắch thước khoảng 1027 bp, mã hoá cho

protein ựệm (matrix protein) gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ựược tạo ra bởi những khung ựọc mở khác nhau của cùng một phân ựoạn RNA

- Phân ựoạn 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cấu trúc, có ựộ

dài ổn ựịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kắch thước khoảng 890 bp,

mã hoá tổng hợp hai protein là NS1 và NS2

Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen ựược cấu trúc

từ 8 phân ựoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo ựiều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các ựột biến ựiểm trong các phân ựoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao ựổi các phân ựoạn gen giữa các chủng virus cúm ựồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn ựến thay ựổi ựặc tắnh kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM

Nghiên cứu ựặc tắnh sinh học phân tử (ựịnh týp, biến ựổi di truyền và gen học tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 ựược các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng ựầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Các chuỗi gen giúp xác ựịnh phân týp H5, phân týp N1 và các gen cấu trúc ựã ựược Viện Pasteur thành phố Hồ Chắ Minh, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn ựoán thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới xây dựng các phương pháp chẩn ựoán, phát hiện nhanh virus gây bệnh, phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA và NA Các phương pháp phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng ựã ựược xây dựng Các nhà khoa học Việt Nam ựã có những ựóng góp nhất ựịnh trong lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch Những chế phẩm kháng nguyên, vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam cũng ựã ựược tạo ra

Trang 3

Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên

nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam ñã và ñang làm sáng tỏ thêm về

mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển

tiến hoá và genotype, và kháng nguyên-miễn dịch-vaccine của cúm gia

cầm tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

ðối tượng nghiên cứu của ñề tài là virus cúm A/H5N1 từ gà mắc bệnh

cúm gia cầm nuôi tại tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, phân lập năm 2005

2.2 ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

ðề tài ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam)

Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 10/2005 ñến tháng 10/2009

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)

phân lập từ gà Hậu Giang

- Giải trình tự gen kháng nguyên HA và NA

- Giải trình tự gen polymerase PB2, PB1 và PA

- Giải trình tự các gen NP, M và NS

2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả

hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới

- Phân tích thành phần nucleotide và amino acid

- Phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid

- Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu là dịch khí quản - phế quản chứa virus cường

ñộc cúm A/H5N1 thu nhận từ gà bị bệnh tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu

chủng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), viết tắt CkHG4) Bệnh phẩm ñã

ñược vô hoạt ở nhiệt ñộ 100oC trong 30 giây, ñảm bảo an toàn sinh học, bảo

quản ở -20oC cho ñến khi sử dụng ñể tách RNA tổng số

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñể tách

RNA tổng số theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.5.2 Phương pháp RT-PCR

Chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN) ñể thu

nhận các phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1

2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR

Sản phẩm RT-PCR ñược kiểm tra bằng cách ñiện di ở 100-120V, 400

mA trong 25-30 phút trên thạch agarose 1% Chỉ thị DNA sử dụng trong nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có kích thước 43 kb, ñược

cắt bằng enzym giới hạn HindIII

2.5.4 Phương pháp dòng hóa

Sản phẩm PCR/RT-PCR tinh sạch ñược dòng hóa vào vector là pCR2.1

hay pCR2.1TOPO (Invitrogen)

2.5.5 Phương pháp giải trình tự

Sản phẩm giải trình tự sau khi tinh sạch, ñược ñông khô và ñọc trình

tự trên máy tự ñộng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ)

2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản ñồ chromatogram của chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEd1.03, sau ñó sử dụng chương trình AsemblyLIGN1.9 ñể so sánh các chuỗi, phân tích thành phần nucleotide và amino acid hoặc các ñặc tính gen và polypeptide bằng hệ chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh Các chuỗi nucleotide hay amino acid ñược sắp xếp và tính toán mức ñộ tương ñồng bằng chương trình GeneDoc 2.5; phân tích và xây dựng phả hệ bằng chương trình MEGA4.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS CÚM A/H5N1 CHỦNG CkHG4

3.1.1 Giải trình tự gen H5 (HA)

ðể thu nhận gen kháng nguyên H5 (HA) của chủng CkHG4 chúng tôi sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp với khuôn là RNA tổng số có chứa RNA hệ gen của virus cúm A/H5N1

Plasmid tái tổ hợp sau khi giải trình tự chúng tôi thu ñược chuỗi gen H5 (HA) gồm 1707 nucleotide của chủng CkHG4 và ñăng ký trong Ngân hàng gen số EF051513

3.1.2 Giải trình tự gen N1 (NA)

DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự, thu nhận chuỗi DNA của gen N1 (NA) chủng CkHG4 gồm 1350 nucleotide và ñăng ký trong Ngân hàng gen số EF057803

3.1.3 Giải trình tự gen PB2

Phân ñoạn 1 của hệ gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho protein PB2 gồm 759 amino acid Do phân ñoạn 1 có kích thước 2355 bp nên không thể bằng một phản ứng RT-PCR ñể nhân lên ñược mà phải thực hiện 2 phản ứng RT-PCR thu 2 ñoạn lồng vào nhau Cặp mồi PB2F-PB2R1

Trang 4

ựược sử dụng ựể thu nhận ựoạn ựầu và cặp mồi PB2F3-PB2R dùng ựể thu

nhận ựoạn sau của phân ựoạn 1 (gen PB2) Sản phẩm cuối cùng gồm 2

ựoạn DNA: phần ựầu của phân ựoạn 1 có kắch thước khoảng 1kb (cặp mồi

PB2F-PB2R1), và phần sau của phân ựoạn 1 có ựộ dài khoảng 1,4 kb (cặp

mồi PB2F3-PB2R)

DNA plasmid tái tổ hợp sau ựó ựược giải trình tự, sắp xếp nối chuỗi và

phân tắch bằng các chương trình tin-sinh học chuyên biệt, chúng tôi thu ựược

chuỗi DNA của gen PB2 gồm 2280 nucleotide

3.1.4 Giải trình tự gen PB1

Phân ựoạn 2 (gen PB1) của chủng CkHG4 ựược nhân lên bằng phản

ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số, bằng 2 phản ứng sử dụng 2

cặp mồi PB1F1-PB1R2 và PB1F3-PB1R3 Phản ứng RT-PCR với cặp

mồi PB1F1-PB1R2 cho ựoạn DNA sản phẩm (ựầu phân ựoạn) có ựộ dài

1,7 kb Kết quả phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi PB1F3-PB1R3 cho

sản phẩm 0,75 kb (cuối phân ựoạn), tổng ựộ dài của toàn bộ phân ựoạn 2

khoảng 2,35 kb ựã ựược thu nhận

Các DNA plasmid tái tổ hợp ựược giải trình tự và chuỗi DNA của

phân ựoạn 2 chủng CkHG4 thu ựược chứa toàn bộ gen PB1 gồm 2274 bp

3.1.5 Giải trình tự gen PA

Phân ựoạn 3 (gen PA) ựược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số

bằng các phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi thiết kế cho gen PA Sản

phẩm cuối cùng của phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi PAF-PAR là phần

ựầu của phân ựoạn 3 có ựộ dài khoảng 0,75 kb; với cặp mồi PAF2-PAR2 là

phần giữa của phân ựoạn có kắch thước khoảng 1,2 kb và với cặp mồi

PAF3-PAR3 là phần sau của phân ựoạn có ựộ dài khoảng 0,73 kb; tổng ựộ

dài của toàn bộ phân ựoạn 3 thu nhận ựược là khoảng 2,23 kb

DNA plasmid tái tổ hợp của các clone ựược giải trình tự và thu ựược

chuỗi DNA của gen PA gồm 2151 nucleotide

3.1.6 Giải trình tự gen NP

Phân ựoạn 5 chứa gen NP của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4

ựược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng phản ứng RT-PCR sử

dụng cặp mồi NPF-NPR

DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng ựược giải trình tự và

chúng tôi thu ựược chuỗi DNA của phân ựoạn 5 chủng CkHG4 chứa toàn

bộ gen NP gồm 1497 nucleotide

3.1.7 Giải trình tự gen M

DNA plasmid chứa gen M1 và M2 sau khi giải trình tự, chúng tôi thu

ựược chuỗi DNA của phân ựoạn 7 gồm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294

bp)

3.1.8 Giải trình tự gen NS

Phân ựoạn 8 chứa gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 ựược nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số sử dụng cặp mồi NSF1-NSR1

DNA plasmid tái tổ hợp sau ựó ựược giải trình tự và thu nhận ựược chuỗi DNA của phân ựoạn 8 chứa 2 gen NS1 gồm 678 bp và NS2 gồm

366 bp

3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA CHỦNG CkHG4 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

3.2.1 Phân tắch gen H5

3.2.1.1 Phân tắch thành phần nucleotide và amino acid

Trình tự nucleotide và amino acid gen H5 của chủng CkHG4 ựược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Quảng đông và phân dòng Phúc Kiến của Việt Nam và thế giới phân lập trong các năm

2003-2009 Kết quả so sánh, phân tắch cho thấy:

- Gen H5 của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 có kắch thước 1707

bp, mã hóa cho 568 amino acid, khởi ựầu bằng bộ mã ATG (methionine)

và kết thúc bằng bộ mã TAA

- Chuỗi nucleotide và polypeptide gen H5 chủng CkHG4 có cùng kắch thước với gen tương ứng của các chủng thuộc phân dòng Quảng đông là 1707 bp và 568 amino acid so với 1704 bp (thiếu hụt 3 nucleotide) và 567 amino acid (thiếu hụt 1 amino acid) của các chủng phân dòng Phúc Kiến

- Chủng CkHG4 có tổng cộng 363 vị trắ sai khác nucleotide với các chủng so sánh, chủ yếu là ựột biến ựồng hoán (transition) (ựột biến xảy ra giữa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine với nhau, giữa A và G hoặc C và T)

- Gen H5 của chủng CkHG4 có 15 vị trắ sai khác nucleotide với hầu hết các chủng so sánh và 10 nucleotide sai khác so với các chủng cùng phân lập ở vùng Hậu Giang (thứ tự 2-5) tại các vị trắ 159, 415, 445, 582, 676, 677,

933, 945, 1170 và 1494

Trong tổng số 363 sai khác về nucleotide của chủng CkHG4 với các chủng so sánh có một số sai khác không làm thay ựổi amino acid, nhưng một số sai khác ựã làm biến ựổi bộ mã của amino acid dẫn ựến thay ựổi amino acid tại 104 vị trắ Do ựó có thể ảnh hưởng ựến tắnh kháng nguyên - miễn dịch và tắnh gây bệnh của các chủng ựó

- Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 có 5 vị trắ sai khác về amino acid với tất cả các chủng so sánh tại các vị trắ: F11V, I242M,

Trang 5

R275K, T325N và V512A (Bảng 3.1)

- Thành phần chuỗi polypeptide nối giữa HA1 và HA2 của chủng

CkHG4 bao gồm các amino acid RRRKK, và motif này không biến ựổi

qua các năm 2003Ờ2009 ở hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng

đông Ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến chuỗi nối này bị xóa 1

amino acid (K) do ựột biến mất ựi 3 nucleotide (AAG) trong trình tự

chuỗi nối của gen H5

Bảng 3.1: So sánh vị trắ sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5

giữa 27 chủng virus cúm

Vị trắ sai khác về amino acid Chủng

Ghi chú: Các chủng ựược ựánh số thứ tự từ 1 ựến 5 là các chủng phân lập ở

vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng thuộc phân dòng Quảng đông, 19-27 là các

chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến

- Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 và các chủng so sánh có 7

vị trắ glycosyl hóa, bao gồm 5 vị trắ trên HA1 và 2 vị trắ trên HA2 Không

có sự khác biệt về các vị trắ liên quan ựến khả năng glycosyl hóa của

chuỗi protein H5 giữa hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng đông Protein H5 của các chủng phân dòng Phúc Kiến chỉ có 6 vị trắ glycosyl hóa tương ứng với các chủng phân dòng Quảng đông đã có sự thay thế amino acid S (vị trắ 171) thành N ở các chủng phân dòng Phúc Kiến tại vị trắ thứ III (170 -172) ựể chuyển từ motif NST ở các chủng phân dòng Quảng đông tạo thành motif NNT ở các chủng phân dòng Phúc Kiến

3.2.1.2 Phân tắch sự ựồng nhất về nucleotide và tương ựồng về amino acid

Trình tự nucleotide gen H5 của 27 chủng cúm A/H5N1 so sánh

ựược ựưa vào chương trình GeneDoc2.5 ựể phân tắch sự ựồng nhất

(identity) về thành phần nucleotide và tương ựồng (homology) về amino acid Kết quả phân tắch cho thấy:

- So sánh giữa các chủng vùng Hậu Giang với nhau, tỷ lệ ựồng nhất nucleotide và tương ựồng amino acid biến ựộng ắt (96-98%) Mức ựộ ựồng nhất và tương ựồng cao nhất là 98%, thấp nhất là 96%

- So sánh các chủng phân dòng Quảng đông với nhau, tỷ lệ ựồng nhất

và tương ựồng biến ựộng rất lớn, 91-99% về nucleotide và 87-100% về amino acid, chủ yếu là do có sự biến ựộng lớn giữa các chủng phân lập năm 2003-2007 với 3 chủng phân lập năm 2008-2009

- So sánh các chủng phân dòng Phúc Kiến với nhau, tỷ lệ ựồng nhất nucleotide biến ựộng rất lớn (94-99%); tương tự, tỷ lệ tương ựồng amino acid cũng phản ánh ựúng mức ựộ biến ựổi lớn (94-100%)

- Tỷ lệ ựồng nhất nucleotide và tương ựồng amino acid của các chủng phân dòng Quảng đông so với các chủng phân dòng Phúc Kiến là rất thấp,

90-96% về nucleotide và 88-96% về amino acid

3.2.1.3 Phân tắch mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

Gen hemagglutinin HA (H5) thu nhận từ chủng CkHG4 ựược ựưa vào phân tắch phả hệ cùng với 54 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 1996-2011 (Hình 3.1)

Hình 3.1 cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở phắa Nam của Việt Nam giai ựoạn 2004-2007, ựó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05 (ISDN230180), Dk-VN-1231-05 (CY029519), Dk-VN-1771-05 (CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và một số chủng phân lập từ Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05 (FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457) điều này cho phép nhận xét,

có thể các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang, đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguồn gốc và thuộc nhóm di

Trang 6

truyền 1 (clade 1) đây là các chủng thuộc phân dòng Quảng đông,

genotype Z

Hình 3.1 cũng cho thấy, các chủng phân lập ở phắa Nam của Việt

Nam giai ựoạn 2008-2011, bao gồm VN-VL-NCVD080162-08,

Dk-VN-CT-NCVD-361-09, Ck-VN-ST-R6-2-10, Ck-VN-TG-R6-2819-11

cũng tạo thành một nhóm kháng nguyên phụ khác, ựược xác ựịnh thuộc

nhóm di truyền 1.1

Hình 3.1: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng

cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen kháng nguyên H5 về

thành phần nucleotide và amino acid

MDk-VN-OIE-559-11 Ck-VN-TG-R6-2819-11 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 Dk-VN-CT-NCVD-361-09 Ck-VN-ST-R6-2-10 Dk-VN-CaMau498-06

Dk-VN-BL-07-09-07

Ck-VN-15-07

Ck-VN-29-07

Dk-HG-07-12-07

Dk-VN-1771-05

Ck-VN-LA636-05

Dk-VN-HG680F-05

Dk-VN-1231-05

VN-CL2009-05

Ck-VN-NCVD12-05

Ck-VN-TG-023-04

Ck-VN-36-04

Ck-VN-HG4-05

Ck-VN-DT-171-04

Ck-TL-NIAH7618-04

Ck-Uthaithani-05

Ck-VN-5-03

Ck-TL-CU-354-08

Ck-VN-27-03

Ck-India-NIV96526-09 Ck-Bangladesh-418-09 Ck-HK-YU324-03

Ck-Indo-BL-03

Ck-Hunan-8-08 Ck-VN-20346-09 A-Hubei-1-10 Dk-VN-QT801-11 Ck-VN-10-05

Ck-Guangxi-3154-05

MDk-VN-1455-06

Ck-Guangxi604-05

Dk-HN-101-04

Ck-GY-3570-05

Dk-TL-KU-56-07

Dk-VN-37-07

Dk-VN-HaiPhong-208-06

Ck-Laos-1-08

Ck-Fujian-584-06

Dk-VN-50-07

VN-HN31242-07

Dk-PhuTho-07-92-07

Dk-VN-53-07

Ck-VN-Ncvd8-03

Dk-GD-07-2000

Gs-GD-1-96

A-HK-156-97

Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-135-08 Ck-VN-NCVD-016-08

96

100

97

55

100

88

100

99

54

61

100

68

71

99

90

99

70

39

30

41

98

39

47

95

72

71

90

77

42

47

86

95

85

58

96

97

39

37

35

43

99

20

32

0.01

H5

Nucleotide

7 0

5 2.3.4

2.3.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.1

2.2 1

1.1

Dk-VN-CT-NCVD-361-09 Ck-VN-ST-R6-2-10 Dk-VN-VL-NCVD080162-08 MDk-VN-OIE-559-11 Ck-VN-TG-R6-2819-11 Dk-VN-BL-07-09-07 Ck-VN-15-07 Dk-VN-CaMau498-06 Ck-VN-29-07 Dk-HG-07-12-07 Dk-VN-1771-05 Ck-VN-LA636-05 Dk-VN-HG680F-05 Dk-VN-1231-05 VN-CL2009-05 Ck-VN-NCVD12-05

Ck-VN-HG4-05

Ck-VN-TG-023-04 Ck-VN-DT-171-04 Ck-VN-36-04 Ck-Uthaithani-05 Ck-TL-NIAH7618-04 Ck-VN-5-03 Ck-TL-CU-354-08 Ck-VN-27-03 Ck-HK-YU324-03 Ck-Indo-BL-03 Ck-India-NIV96526-09 Ck-Bangladesh-418-09 Dk-VN-HaiPhong-208-06 Ck-Laos-1-08 Ck-Fujian-584-06 Dk-TL-KU-56-07 Dk-PhuTho-07-92-07 Dk-VN-50-07 VN-HN31242-07 Dk-VN-37-07 Dk-HN-101-04 Ck-GY-3570-05 MDk-VN-1455-06 Ck-Guangxi-3154-05 Ck-Guangxi604-05 Ck-VN-10-05 Ck-Hunan-8-08 Ck-VN-20346-09 A-Hubei-1-10 Dk-VN-QT801-11 Ck-VN-Ncvd8-03

Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 A-HK-156-97

Ck-VN-NCVD-093-08 Ck-VN-NCVD-016-08

93 100

91 72

99

66 98

82

51

27

40 23

39 88

65

50

32

80

58

43 61

81 65

57

21 24 31

62

74

21 79

28 31 59

60 76

61 46 35

57 23

18 56

99 17

21

0.02

H5

2.2

1

2.1

2.3.2.1 2.3.2

2.3.1 2.3.3 2.3.4

5 0

7

Dk-VN-BL-07-09-07

Ck-VN-15-07

Ck-VN-29-07

Dk-HG-07-12-07

Dk-VN-1771-05

Ck-VN-LA636-05

Dk-VN-HG680F-05

Dk-VN-1231-05

VN-CL2009-05

Ck-VN-NCVD12-05

Ck-VN-TG-023-04

Ck-VN-36-04

Ck-VN-HG4-05

Ck-VN-DT-171-04

Ck-TL-NIAH7618-04

Ck-VN-5-03

Ck-TL-CU-354-08

Ck-VN-27-03

Ck-Indo-BL-03

MDk-VN-1455-06

Dk-HN-101-04

Ck-GY-3570-05

Dk-TL-KU-56-07

Dk-VN-37-07

Ck-Laos-1-08

Dk-VN-50-07

VN-HN31242-07

Dk-PhuTho-07-92-07

Dk-VN-53-07

Ck-VN-Ncvd8-03

Dk-GD-07-2000

Gs-GD-1-96

A-HK-156-97

96

100

97

55

100

88

100

99

54

61

100

68

71

99

90

99

70

39

30

41

98

39

47

95

72

71

90

77

42

47

86

95

85

58

96

97

39

37

35

43

99

20

32

0.01

H5

Nucleotide

7 0

5 2.3.4

2.3.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.1

2.2 1

1.1

Dk-VN-BL-07-09-07

Ck-VN-15-07

Ck-VN-29-07

Dk-HG-07-12-07

Dk-VN-1771-05

Ck-VN-LA636-05

Dk-VN-HG680F-05

Dk-VN-1231-05

VN-CL2009-05

Ck-VN-NCVD12-05

Ck-VN-TG-023-04

Ck-VN-36-04

Ck-VN-HG4-05

Ck-VN-DT-171-04

Ck-TL-NIAH7618-04

Ck-VN-5-03

Ck-TL-CU-354-08

Ck-VN-27-03

Ck-Indo-BL-03

MDk-VN-1455-06

Dk-HN-101-04

Ck-GY-3570-05

Dk-TL-KU-56-07

Dk-VN-37-07

Ck-Laos-1-08

Dk-VN-50-07

VN-HN31242-07

Dk-PhuTho-07-92-07

Dk-VN-53-07

Ck-VN-Ncvd8-03

Dk-GD-07-2000

Gs-GD-1-96

A-HK-156-97

96

100

97

55

100

88

100

99

54

61

100

68

71

99

90

99

70

39

30

41

98

39

47

95

72

71

90

77

42

47

86

95

85

58

96

97

39

37

35

43

99

20

32

0.01

H5

Nucleotide

7 0

5 2.3.4

2.3.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.1

2.2 1

1.1

Ck-VN-HG4-05

Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 A-HK-156-97

93 100

91 72

99

66 98

82

51

27

40 23

39 88

65

50

32

80

58

43 61

81 65

57

21 24 31

62

74

21 79

28 31 59

60 76

61 46 35

57 23

18 56

99 17

21

0.02

H5

2.2

1

2.1

2.3.2.1 2.3.2

2.3.1 2.3.3 2.3.4

5 0

7

Ck-VN-HG4-05

Dk-GD-07-2000 Gs-GD-1-96 A-HK-156-97

93 100

91 72

99

66 98

82

51

27

40 23

39 88

65

50

32

80

58

43 61

81 65

57

21 24 31

62

74

21 79

28 31 59

60 76

61 46 35

57 23

18 56

99 17

21

0.02

H5

2.2

1

2.1

2.3.2.1 2.3.2

2.3.1 2.3.3 2.3.4

5 0

7

3.2.2 Phân tắch gen N1

3.2.2.1 Phân tắch thành phần nucleotide và amino acid

Gen N1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ựộ dài 1350 nucleotide, mã hóa cho 449 amino acid, khởi ựầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG Trình tự nucleotide và amino acid của gen N1 chủng CkHG4 ựược

so sánh với các chuỗi gen N1 tương ứng của 26 chủng Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009

Bảng 3.2: So sánh vị trắ sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1

giữa 27 chủng virus cúm

Vị trắ sai khác về amino acid Chủng

Ghi chú: Các chủng ựược ựánh số thứ tự từ 1 ựến 5 là các chủng phân lập ở vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới

Kết quả so sánh cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 262 vị trắ sai khác

về nucleotide với các chủng so sánh Các ựột biến chủ yếu xảy ra ở vùng 5Ỗ của gen N1 và hầu hết là các ựột biến ựồng hoán (A↔G hoặc C↔T) Chủng

Trang 7

CkHG4 chỉ có 4 nucleotide sai khác với phần lớn các chủng Việt Nam và thế

giới ở các vị trí: 30, 167, 748 và 867 Trong ñó, sai khác ở 2 vị trí 167 và 748

là có dẫn ñến sai khác amino acid

Các sai khác về nucleotide ñã làm biến ñổi tổng cộng 91 amino acid giữa

chủng CkHG4 với các chủng so sánh Các biến ñổi lớn chủ yếu tập trung ở

vùng tận cùng N của 80 amino acid ñầu tiên Mười một vị trí có biến ñổi lớn

về amino acid giữa các chủng so sánh ñược trình bày ở Bảng 3.2 Chuỗi

polypeptide N1 của chủng CkHG4 chỉ có 2 amino acid sai khác với phần lớn

các chủng so sánh ở 2 vị trí N56T và N250D (tương ứng với 2 vị trí sai khác

về nucleotide 167 và 784 trong gen N1)

Phân tích ñặc tính glycosyl hoá của protein N1 ở các chủng cúm

A/H5N1

Kết quả phân tích ñặc tính glycosyl hóa cho thấy, chuỗi polypeptide N1

của chủng CkHG4 và 26 chủng so sánh cùng có 3 vị trí glycosyl hóa Vị trí I

có motif là NSS (amino acid 68-70), vị trí II là NGT (amino acid 126-128)

và vị trí thứ III là NGS (amino acid 214-216) ðiều này chứng tỏ, không có

sự biến ñổi vị trí có tiềm năng glycosyl hóa trong protein N1 ở các chủng

cúm A/H5N1 phân lập trong các năm 2003-2009

3.2.2.2 Phân tích ñột biến “trượt–xoá” gen N1 qua thời gian tiến hóa

41 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trong 50 năm qua, trong ñó có

chủng CkHG4 do chúng tôi giải trình tự gen N1, ñược ñối chiếu so sánh

về thành phần nucleotide và amino acid của gen N1

Các chủng so sánh ñược phân thành 3 nhóm chính: (i) nhóm các

chủng phân lập từ 1959 ñến trước 2003; (ii) nhóm các chủng phân lập từ

gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997; và (iii) nhóm các chủng phân

lập giai ñoạn 2003-2009 từ các vật chủ khác nhau, trong ñó có chủng

CkHG4 do chúng tôi phân lập

Kết quả phân tích cho thấy, ñã có ñột biến xoá gen xảy ra trong các

chủng thuộc nhóm (ii) và (iii), nhưng bản chất của ñột biến có khác nhau

Biến ñộng ñột biến xoá nucleotide xảy ra ở vùng nucleotide có vị trí

145-213 Cụ thể:

- Các chủng cúm A/H5N1 thuộc nhóm (i) có gen N1 có ñộ dài 1410

nucleotide

- Các chủng thuộc nhóm (ii) (phân lập ở Hồng Kông năm 1997) ñã có

ñột biến xoá ñi 57 nucleotide vị trí 157-213 từ các chủng nhóm (i)

- Các chủng thuộc nhóm (iii) có chuỗi gen N1 ngắn nhất, chỉ còn 1350

nucleotide do ñã có ñột biến xoá ñi 60 nucleotide ở các vị trí 145-204

3.2.2.3 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid

Kết quả phân tích về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino acid cho thấy:

- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2005, 99% về thành phần nucleotide và amino acid

- So sánh giữa chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam, tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng có biến ñộng lớn hơn Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide

là 95-99% và tương ñồng về amino acid là 94-99%

3.2.2.4 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

Gen N1 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập ñược ñưa vào phân tích phả hệ cùng với 47 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), VN-HG-178-04 (DQ094286), VN-HG-207-05 (DQ094292), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280) ðiều này cho thấy, các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long là có cùng nguồn gốc, hoàn toàn giống như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5

3.2.3 Phân tích gen PB2

3.2.3.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid

Gen PB2 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2280 bp, mã hóa cho 759 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG Trình

tự nucleotide và amino acid của gen PB2 ñược so sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2004-2009 Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 455 nucleotide sai khác với các chủng so sánh Chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 365, 580, 2080; và cả

3 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi amino acid

Sai khác về nucleotide giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 82 vị trí Trong số ñó, mười ba vị trí sai khác lớn ñược liệt kê ở Bảng 3.3 Chủng CkHG4 có 3 amino acid sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí A122V, K194Q và L694F (Bảng 3.3), tương ứng với 3 vị trí ñột biến nucleotide

Trang 8

như ñã phân tích ở trên

Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 ñược cho là có liên quan ñến tính

thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ và ñộc lực của virus Ở virus cúm

gia cầm vị trí này là glutamic acid (E), còn ở virus thích nghi trên người

là lysin (Wasilenko và cs, 2008) [155] Các chủng virus H5N1 ñộc lực cao

ñối với ñộng vật có vú, thành phần amino acid của PB2 có chứa lysin (K) ở

vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (Li và cs, 2010) [100] Vị trí 627 ở

protein PB2 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập là glutamic acid (E)

và amino acid ở vị trí 701 là asparatic acid (D)

Bảng 3.3: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide

PB2 giữa 27 chủng virus cúm

Vị trí có thay ñổi amino acid

Chủng

Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 18 là các chủng phân lập

tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới; 1-5 là các chủng phân lập ở vùng

Hậu Giang; 10, 11, 14, 15, 18 là các chủng phân lập ở miền Bắc

Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương ñồng về amino acid cho thấy:

- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 97-99% cả 2 thành phần nucleotide và amino acid

- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-99% và tương ñồng về amino acid là 96-99% so với các chủng của Việt Nam; 93-97%

về thành phần nucleotide và 97-98% về thành phần amino acid khi so với các chủng của thế giới

Kết quả phân tích phả hệ sử dụng gen PB2 cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền Nam: Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc, tương tự như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5 và N1 trình bày ở

phần trước

3.2.4 Phân tích gen PB1 và PB1-F2

Toàn bộ gen PB1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2274 bp, mã hoá cho chuỗi polypeptide PB1 gồm 757 amino acid, bộ mã khởi ñầu là ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG Lồng vào trong chuỗi nucleotide của PB1, từ vị trí 95 ñến 367 là PB1-F2, có ñộ dài 273 bp bao gồm 90 amino acid, khởi ñầu bằng bộ ba ATG và kết thúc bằng bộ ba TGA Trình tự nucleotide và amino acid gen PB1 và PB1-F2 ñược so sánh với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009 Kết quả phân tích cho thấy, gen PB1 của chủng CkHG4 có tổng cộng

428 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh Những thay ñổi

về nucleotide dẫn ñến sai khác về amino acid ở 62 vị trí, trong ñó có 8 vị trí sai khác lớn Chủng CkHG4 có sai khác hoàn toàn 4 amino acid trên protein PB1 so với tất cả các chủng, cụ thể ở các vị trí R206G, S306N, M323T, L631F

Gen PB1-F2 của chủng CkHG4 có tổng cộng 52 nucleotide (trong ñó

có 1 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng của Việt Nam và thế giới ở

vị trí 131) và 41 amino acid sai khác với các chủng so sánh

Trang 9

Chuỗi polypeptide PB1-F2 của chủng CkHG4 chỉ có một amino acid

sai khác so với hầu hết các chủng ở vị trí K44R

Kết quả phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino

acid gen PB1 và PB1-F2 của chủng CkHG4 cho thấy:

ðối với gen PB1: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng

cao so với các chủng Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, 97-99% về

nucleotide và 98-99% về amino acid ðối với các chủng của thế giới, mức

ñộ ñồng nhất và tương ñồng dao ñộng lớn hơn, tỷ lệ tương ứng là 91-98%

và 97-99%

ðối với gen PB1-F2: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide

và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự

tương ứng là 99-100% và 100%, với các chủng Việt Nam khác là

97-99% và 93-98% Mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng thế giới

qua các năm 2003-2009 biến ñộng rất lớn: 90-99% về nucleotide và

75-97% về amino acid

Như vậy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương

ñồng về amino acid cao so với một số chủng vùng Hậu Giang phân lập

qua các năm 2004-2007 Với các chủng phân lập càng về sau, mức ñộ

ñồng nhất và tương ñồng càng giảm

3.2.4.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc

Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng A/H5N1

phân lập ở miền Nam trong các năm 2004-2005: VN-HG-207-05

(DQ138165), Ck-VN-DT-171-04 (DQ138156), VN-HG-178-04

(DQ138160), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm,

chứng tỏ các chủng virus cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và

các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc

3.2.5 Phân tích gen PA

Toàn bộ gen PA của chủng CkHG4 có ñộ dài 2151 bp, mã hóa cho

716 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG, bộ mã kết thúc là TAG

Trình tự nucleotide của gen PA này ñược so sánh với gen PA tương ứng

của 26 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới trong các năm

2003-2009 Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 có:

- Tổng cộng 425 nucleotide sai khác với các chủng so sánh, trong ñó

có 10 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở

các vị trí: 203, 205, 324, 444, 693, 1059, 1105, 1332, 2053, 2060; 11 nucleotide sai khác với 5 chủng miền Bắc và các chủng của thế giới ở các

vị trí: 51, 102, 342, 645, 808, 957, 1281, 1296, 1521, 1695, 1878

Những thay ñổi về nucleotide trên ñây dẫn ñến sai khác amino acid ở

76 vị trí, trong ñó có 5 amino acid sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: L68P, Y69N, T369A, R685G, F687Y Mặc dù chủng CkHG4 có ñến 11 nucleotide sai khác với các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng những sai khác này chỉ làm thay ñổi thành phần amino acid ở một số chủng

Nghiên cứu gần ñây cho thấy, các ñột biến T515A trong PA và Y436H trong PB1 ñã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (Hulse-Post và cs, 2007) [82], nhưng chỉ ñột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì không ảnh hưởng ñến ñộc lực của virus Trong thành phần amino acid của chủng CkHG4 và tất cả các chủng A/H5N1 lựa chọn so sánh, threonin (T) ở vị trí

515 phát hiện không biến ñổi qua các năm 2003-2009

Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino

acid cho thấy:

- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 98-99% về thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid

- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng lớn hơn khi so với các chủng của Việt Nam Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 92-99% và tương ñồng amino acid là 96-92-99%; trong ñó với các chủng miền Bắc là 92-97% và 96-98% (theo thứ tự tương ứng), với các chủng miền Nam là 98-99% (cả 2 thành phần)

- ðối với các chủng thế giới, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-97%, tương ñồng về amino acid là 96-98%

Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-VN-DT-171-04 (DQ099788), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280),

Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), chứng tỏ các chủng A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể có cùng nguồn gốc, tương tự như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ trình bày ở phần trước

Trang 10

3.2.6 Phân tích gen NP

Toàn bộ gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 1497 bp,

mã hóa cho 498 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG và bộ mã kết thúc

là TAA Trình tự nucleotide và amino acid gen NP ñược so sánh, phân

tích với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các

năm 2003-2009

Kết quả phân tích cho thấy, gen NP của chủng CkHG4 có 7

nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị

trí: 36, 105, 138, 606, 795, 816, 1269; 14 nucleotide sai khác với hầu hết

các chủng miền Bắc ở các vị trí: 51, 204, 231, 258, 273, 318, 324, 483,

507, 537, 549, 915, 1116, 1149; 1 nucleotide sai khác với các chủng

A/H5N1 vùng Hậu Giang và các chủng miền Nam khác ở vị trí 306

Chuỗi polypeptide NP chủng CkHG4 chỉ sai khác hoàn toàn 1 amino

acid với tất cả các chủng so sánh ở vị trí M265I

Như vậy, NP là gen ổn ñịnh nhất về thành phần nucleotide và amino

acid Mặc dù có những biến ñổi nucleotide, nhưng hầu hết các ñột biến

này không làm thay ñổi thành phần amino acid của chuỗi polypeptide

3.2.6.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino

acid

Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương

ñồng về amino acid cho thấy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương

ñồng với các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là 96-99%;

96-99% cũng là tỷ lệ ñồng nhất và tỷ lệ tương ñồng của chủng CkHG4

với các chủng khác của Việt Nam Nếu so với các chủng của thế giới thì

các tỷ lệ tương ứng sẽ là 92-97% và 98-99%

Xét một cách tổng thể, mức ñộ ñồng nhất về thành phần nucleotide và

tương ñồng về thành phần amino acid của gen NP chủng CkHG4 với các

chủng Việt Nam và thế giới là tương ñối cao, ñặc biệt là thành phần amino

acid

3.2.6.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc

Gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ

cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới Kết quả phân tích

cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền

Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792),

Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các

chủng A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu

Long có cùng nguồn gốc

3.2.7 Phân tích gen M

Toàn bộ gen M thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 982 bp, mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide M1 và M2 Gen M1 có ñộ dài 759 bp (từ nucleotide ñầu tiên ñến nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA Gen M2 có kích thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA Gen M1 và M2 có chung 27 nucleotide ñầu 5’ của vùng mã hóa và gen M2 ñược tạo ra do nối 27 nucleotide này với 267 nucleotide từ vị trí 716 trở về sau cho ñến nucleotide 982

Trình tự nucleotide gen M1 và M2 ñược so sánh, phân tích với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm

2003-2009 Kết quả phân tích cho thấy:

- Gen M1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 87 nucleotide sai khác với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi tổng cộng 12 amino acid trong chuỗi polypeptide M1 Gen M1 của chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 132, 502 và 615, nhưng chỉ có thay ñổi ở vị trí 502 là dẫn ñến sai khác về amino acid ở vị trí 168 (V168I) trong protein M1 Bên cạnh ñó, chủng CkHG4 còn có 3 nucleotide (246, 522, 613) sai khác với phần lớn các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng chỉ có sai khác ở vị trí 613 là làm thay ñổi amino acid ở vị trí 205 (I205V)

- Gen M2 có tổng cộng 31 nucleotide sai khác so với các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 18 vị trí trong chuỗi polypeptide M2 Trong số các sai khác về nucleotide, chỉ có 1 nucleotide là có sai khác hoàn toàn với tất cả các chủng so sánh (vị trí 127), và sai khác này ñã làm thay ñổi thành phần amino acid của protein M2 tại vị trí 43 (F43L) Ngoài ra, gen M2 của chủng CkHG4 còn có 4 nucleotide (76, 92, 190, 197) sai khác với hầu hết các chủng miền Bắc và thế giới Tất cả 4 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid ở các vị trí 26 (I26L), 31 (N31S), 64 (A64S), 66 (A66E) Protein M1 có liên quan ñến yếu tố ñộc lực của virus A/H5N1 ở ñộng vật có vú Nghiên cứu gần ñây cho thấy, amino acid asparatic acid (D) ở

vị trí 30 và alanin (A) ở vị trí 215 trong protein M1 là cần thiết ñể virus H5N1 gây chết chuột Hai loại amino acid này (D30 và A125) cũng ñã

Định dạng
Số trang	12
Dung lượng	321,51 KB