Nghiên cứu phát triển các biện pháp an toàn với môi trường để phòng trừ bệnh hại trong đất trên một số cây trồng có hiệu quả kinh tế cao

Do vậy mục tiêu của đề tài là phát triển và ứng dụng các biện pháp an toàn đối với môi trường để nâng cao sức đề kháng của cây, chủ động phòng ngừa bệnh HXVK, héo vàng do nấm Fusarium ở

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC BIỆN PHÁP AN TOÀN VỚI MÔI TRƯỜNG ĐỂ PHÒNG TRỪ BỆNH HẠI TRONG ĐẤT TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ HIỆU QUẢ KINH TẾ CAO

Lời cảm ơn

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn tới Bộ nông Nghiệp PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ, Vụ Quan hệ và Hợp tác quốc tế, Viện Khoa hoc Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chúng tôi xin chân thành cám ơn tới TS Kuyng Seok Park - Viện Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Quốc Gia - Hàn Quốc, Th.S Trần Thu

Hà - Bộ môn Vi sinh - Viện Nông hóa Thổ nhưỡng đã nhiệt tình hợp tác nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học với chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện

Chúng tôi cũng chân thành cám ơn tới các đồng chí cán bộ HTX, các

bà con nông dân ở HTX Song Phương - Hoài Đức - Hà Tây, HTX Hà Hồi - Thường Tín - Hà Tây, HTX Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc và Phường Nghĩa Trung - TX Gia Nghĩa - Đăk Nông đã tạo điều kiện giúp đỡ chúng tôi thực hiện tốt các thí nghiệm, mô hình trong đề tài

Thay mặt nhóm thực hiện đề tài

TS Đoàn Thị Thanh

D2-3-DSTG

DANH SÁCH TÁC GIẢ CỦA ĐỀ TÀI KH&CN CẤP NHÀ NƯỚC (DANH SÁCH NHỮNG CÁ NHÂN ĐÃ ĐÓNG GÓP SÁNG TẠO

CHỦ YẾU CHO ĐỀ TÀI

ĐƯỢC SẮP XẾP THEO THỨ TỰ ĐÃ THOẢ THUẬN)

(Kèm theo Quyết định số 13/2004/QĐ-BKHCN ngày 25/5/2004

của Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ)

1 Tên Đề tài: Nghiên cứu phát triển các biện pháp an toàn đối với môi trường

để phòng trừ bệnh hại trong đất trên một số cây trồng có hiệu quả kinh tế cao

Mã số:

2 Thuộc Chương trình (nếu có): KHCN theo Nghị định thư

3 Thời gian thực hiện: 2006-2007

4 Cơ quan chủ trì: Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

5 Bộ chủ quản: Bộ khoa học và Công nghệ

BẢNG CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CSB Chỉ số bệnh

Hình 2 Phân lập mẫu VSV gây bệnh trên môi trường (7/2006) 23

Hình 3 Các chế phẩm sinh học đã ức chế với VSV gây bệnh 27

Hình 4 Mối tương quan giữa tỷ lệ bệnh HXVK, héo vàng với năng

suất cà chua khi thử nghiệm các chế phẩm

35

Hình 5 Mối tương quan giữa tỷ lệ bệnh HXVK, héo vàng với năng

suất khoai tây khi thử nghiệm các chế phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV gây bệnh (2006) 22

Bảng 2 Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng bệnh trên

Bảng 6 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến khả năng nảy mầm và

sinh trưởng của hạt giống cà chua Balan 27 Bảng 7 Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học đến tỷ lệ bệnh HXVK (%)

Bảng 8 Hiệu quả của các chế phẩm sinh học đến bệnh héo vàng ở cà

Bảng 9 Ảnh hưởng của các chế phẩm đến sự phát triển của cà chua 30

Bảng 10 Hiệu quả của các chế phẩm đối với bệnh HXVK (%) trên khoai

Bảng 11 Ảnh hưởng của các chế phẩm đến sự sinh trưởng và mức độ bị

bệnh chết nhanh trên hồ tiêu (thí nghiệm nhà lưới 2006) 32 Bảng 12 Hiệu quả của các chế phẩm sinh học đối với bệnh HXVK

và héo vàng trên cà chua ở Hoài Đức, Hà Tây (7-12/2006) 33 Bảng 13 Hiệu quả của các chế phẩm sinh học đến tỷ lệ bệnh HXVK

và héo vàng trên cà chua ở Vĩnh Phúc (7-12/2006) 34 Bảng 14 Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học đến sự sinh trưởng và

Bảng 15 Ảnh hưởng của các chế phẩm đến tỷ lệ bệnh HXVK ở khoai tây

(giống KT3) vụ đông 2006, tại Thường Tín, Hà Tây 36

Bảng 16 Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học đến sự sinh trưởng và

năng suất của khoai tây (KT3) tại Thường Tín, Hà Tây (2006) 36

Bảng 17 Tình hình bị bệnh chết nhanh trên vườn hồ tiêu

Bảng 18 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến sự phát triển của chồi

Bảng 19 Ảnh hưởng của chế phẩmEXTN-1 đối với bệnh chết nhanh,

sự phát triển và năng suất của cây hồ tiêu (2006) 39

Bảng 20 Hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh HXVK và héo

vàng ở cà chua tại HTX Song Phương, Hà Tây (trồng 7/2007) 40

Bảng 21 Sự sinh trưởng và năng suất cà chua ở mô hình so với ruộng đại

trà (Hoài Đức, Hà Tây và Mê Linh, Vĩnh Phúc - 2007) 41

Bảng 22 Hiệu quả mô hình xử lý chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh HXVK,

héo vàng trên khoai tây ở Thường Tín, Hà Tây 41

Bảng 23 Sự sinh trưởng và năng suất khoai tây ở mô hình so với ruộng đại

Bảng 24 Hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 đối bệnh chết nhanh trên hồ

Bảng 25 Sự sinh trưởng và năng suất hồ tiêu ở trong mô hình và

ruộng đại trà tại TX Gia Nghĩa, Đắc Nông (2007) 44

Bảng 26 Tổng chi phí của mô hình cà chua so với ruộng đại trà 45

Bảng 27 Lãi suất cho 1ha cà chua ở mô hình so với ruộng địa trà 46

Bảng 28 Tổng chi phí của mô hình khoai tây so với ruộng đại trà 47

Bảng 29 Lãi suất cho 1ha khoai tây trong mô hình so với đại trà 47

Bảng 30 Tổng chi phí của mô hình hồ tiêu so với ruộng đại trà 48

Bảng 31 Lãi suất cho 1ha hồ tiêu trong mô hình so với đại trà 49

Bảng 32 Kết quả ức chế của các chế phẩm sinh học và các isolates VSV

đối kháng với các VSV gây bệnh ở invitro (2006) 54

Bảng 33 Hiệu quả của chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK trên cà

Bảng 34 Hiệu quả của các chế phẩm đối với bệnh héo vàng trên cà chua 57

Bảng 35 Hiệu lực của các chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK trên

Bảng 42 Kiểm tra hoạt tính của chế phẩm BE, BC sau 5 tháng sản xuất 65

Bảng 43 Khả năng ức chế của chế phẩm BE, BC đối với VSV gây bệnh 66

Bảng 44 Hiệu lực của chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK và héo vàng

TÓM TẮT

Ở Việt Nam, bệnh héo vàng do nấm Fusarium solani (F.solani), bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) do Ralstonia solanacearum (Smith) (R.solanacearum) và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici (P.capsici) là 3 bệnh hại nguy hiểm dưới đất và gây thiệt hại lớn trên chuối,

khoai tây, cà chua, hành ta, hồ tiêu và nhiều cây trồng khác Các biện pháp phòng trừ bệnh bằng hoá học và một số biện pháp khác không đem lại hiệu quả mong muốn đối với bệnh HXVK Bệnh héo vàng và chết nhanh cũng rất khó phòng trừ bằng biện pháp hoá học Do vậy mục tiêu của đề tài là phát triển và ứng dụng các biện pháp an toàn đối với môi trường để nâng cao sức đề

kháng của cây, chủ động phòng ngừa bệnh HXVK, héo vàng do nấm Fusarium ở cà chua, khoai tây và nấm Phytopthora ở hồ tiêu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm và thử

nghiệm ở Việt Nam Các phương pháp nghiên cứu trong đề tài sử dụng các phương pháp của trường Đại học Damstadt, Đức và trường đại học Quốc gia, Seoul, Hàn Quốc, các phương pháp của các nhà khoa học nước ngoài khác và theo phương pháp quyển I, II và III Bảo vệ thực vật (BVTV), viện BVTV Đề tài đã thu thập và phân lập được 100 isolates VSV gây bệnh trong đó

có 60 isolates vi khuẩn R.solanacearum, 36 isolates nấm F solani và 4 isolates nấm P.capsici có

độc tính cao làm vật liệu nghiên cứu Thu thập chọn lọc được 100 mẫu VSV đối kháng từ rễ cây trồng và phân lập được 49 ioslates VSV đối kháng ở mức chủng và loài bằng sequence bởi giải

mã RNA So sánh hoạt tính giữa chế phẩm BE, BC với chế phẩm EXTN-1 nhập nội từ Hàn Quốc cho thấy: Chế phẩm BE, BC có hoạt tính gần bằng chế phẩm EXTN-1, kích thước đường

kính vòng vô khuẩn giữa EXTN-1 với 3 tác nhân gây bệnh (R.solanacearum, F.solani, P.capsici)

cao hơn không đáng kể so với đường kính vòng vô khuẩn giữa BE, BC với 3 tác nhân gây bệnh này Qua các thí nghiệm trên cà chua, khoai tây ở nhà lưới cho thấy các chế phẩm mới sản xuất ở Việt Nam (BE, BC) có hiệu quả hạn chế bệnh HXVK và héo vàng gần tương đương với chế phẩm EXTN-1 nhập ngoại

Hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 trong mô hình về kỹ thuật có hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh từ 39-51% đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua, khoai tây và chết nhanh trên hồ tiêu ở ngoài đồng Hiệu quả kinh tế của chế phẩm EXTN-1 trong mô hình đã lãi 24 triệu đồng ở cà chua, 15 triệu đồng ở khoai tây và 8,5 triệu đồng ở hồ tiêu so với sản xuất đại trà Chế phẩm cũng an toàn cho cây trồng, con người và thân thiện với môi trường Cử 5 cán bộ sang tham quan và học tập ở Hàn Quốc trong đề tài Hướng dẫn được 3 lớp kỹ thuật về cách nhận biết bệnh và phòng trừ sinh học các bệnh hại cà chua và khoai tây Có 2 chuyên gia của viện Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Quốc gia Hàn Quốc sang tư vấn và kiểm tra tiến độ của đề tài Nghiên cứu, sản xuất chế

phẩm mới BE – Bacillus vallismortis và chế phẩm mới BC – Bacillus subtilis tại Việt Nam Mỗi

chế phẩm đã sản xuất thử được hơn 250 kg chế phẩm chất lượng cao ở mật độ 108 CFU/1g chế phẩm tương đương với 2,5 tấn chế phẩm phân bón vi sinh vật (mật độ 106 /1g chế phẩm) Thử nghiệm chế phẩm BE, BC ở nhà lưới và ngoài động diện hẹp đều cho kết quả cao, hạn chế bệnh HXVK, héo vàng ở cà chua và khoai tây so với đối chứng Trên cơ sở đó đề xuất 1 qui trình sản xuất thử chế phẩm BE chất lượng cao, 1 qui trình sử dụng chế phẩm BC trong phòng trừ bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua (bón lót với lượng 130-150kg/ha) và 1 qui trình sử dụng chế phẩm BE trong phòng trừ bệnh HXVK và héo vàng trên khoai tây (bón lót với lượng 250-300kg/ha tuỳ thuộc vào đất và mức độ bị bệnh HXVK)

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nhiệm vụ hợp tác 1

2.1 Mục tiêu chung 1

2.2 Mục tiêu trực tiếp của phía Việt Nam 2

3 Các nội dung thực hiện của nhiệm vụ hợp tác 2

4 Kết quả cần đạt của phía Việt Nam trong thực hiện nhiệm vụ hợp tác 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu chung ngoài nước 4

1.1.2 Về chế phẩm EXTN-1 7

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU – TRIỂN KHAI 2.1 Mục tiêu của nhiệm vụ 12

2.2 Nội dung hợp tác giữa hai nước 12

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.2.1 Phương pháp điều tra, thu thập và phân lập mẫu bệnh và VSV đối kháng 16

2.3.2.2 Phương pháp và kỹ thuật sử dụng để thử nghiệm các chế phẩm EXTN-1, BE, BC ở nhà lưới, ngoài đồng đối với 3 bệnh trên 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học BE, BC 20

2.5 Phân tích đất 20

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU – TRIỂN KHAI 3.1 Điều tra, thu thập, phân lập VSV gây bệnh và VSV đối kháng năm 2006 21

3.1.1 Điều tra thu thập và phân lập mẫu VSV gây bệnh 21

3.1.1.1 Điều tra thu thập VSV gây bệnh trên cà chua, khoai tây và hồ tiêu 21

3.1.1.2 Phân lập VSV gây bệnh 22

3.1.2 Thu thập mẫu, phân lập và chọn lọc VSV đối kháng tại Việt Nam 23 3.1.2.1 Thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng năm 2006 23 3.1.2.2 Tiếp tục thu thập mẫu và chẩn đoán VSV đối kháng mức phân tử 24

3.2 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học hạn chế 3 bệnh ở invitro và nhà lưới 26

3.2.1 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với 3 bệnh ở invitro 26 3.2.2 Thử nghiệm các chế phẩm EXTN-1 đối với VSV gây bệnh ở nhà lưới 27 3.2.2.1 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng

của hạt cà chua 27 3.2.2.2 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với bệnh HXVK và héo vàng trên cà

chua ở nhà lưới 28 3.2.2.3 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh HXVK trên khoai tây ở nhà

lưới 30 3.2.2.4 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh chết nhanh trên hồ tiêu ở nhà

lưới 31 3.3 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với VSV gây bệnh ở diện hẹp ngoài

đồng năm 2006-2007 32 3.3.1 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với bệnh HXVK và héo vàng trên cà

chua ở ngoài đồng 32 3.3.2 Thử nghiệm các chế phẩm đối với bệnh HXVK và héo vàng trên khoai tây

diện hẹp ở ngoài đồng 35 3.3.2.1 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 trên khoai tây ở Thường Tín, Hà Tây 37 3.3.2.2 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 trên khoai tây ở Chương Mỹ, Hà Tây 37 3.3.3 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh chết nhanh trên hồ tiêu ở

ngoài đồng 37 3.4 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 ở mô hình 1 ha năm 2007 39 3.4.1 Hiệu quả về kỹ thuật trong mô hình 39 3.4.1.1 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 ở mô hình đối với bệnh HXVK

và héo vàng trên cà chua 39 3.4.1.2 Hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 ở mô hình đối với bệnh HXVK và héo

vàng trên khoai tây 41 3.4.1.3 Mô hình hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh chết nhanh trên hồ

tiêu 42 3.4.2 Hiệu quả kinh tế trong mô hình khi sử dụng chế phẩm EXTN-1 44 3.4.2.1 Hiệu quả kinh tế trong mô hình khi sử dụng chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh

HXVK và héo vàng trên cà chua 44 3.4.2.2 Hiệu quả kinh tế khi thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh HXVK và

héo vàng ở khoai tây 46 3.4.2.3 Hiệu quả kinh tế trong mô hình khi sử dụng chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh

chết nhanh ở hồ tiêu 48 3.4.3 Hiệu quả sử dụng chế phẩm đối với môi trường 49 3.5 Đào tạo cán bộ và hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân tham gia mô hình và

thử nghiệm chế phẩm 50 3.5.1 Đào tạo cán bộ khoa học của Việt Nam ở Hàn Quốc 50 3.5.2 Hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân tham gia mô hình và thử nghiệm chế

phẩm 50 3.5.3 Chuyên gia Hàn Quốc sang hợp tác nghiên cứu 50 3.6 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học của NIAST, Hàn Quốc để sản

xuất chế phẩm BE, chế phẩm mới BC ở Việt Nam và thử nghiệm ở mức

nhỏ 51 3.6.1 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm mới 51 3.6.2 Khả năng hạn chế bệnh HXVK và héo vàng của các isolates VSV đối kháng

và các chế phẩm sinh học ở invitro, nhà lưới 53 3.6.2.1 Thử nghiệm khả năng hạn chế VSV gây bệnh của các isolates VSV đối

kháng và các chế phẩm sinh học ở invitro 53 3.6.2.2 Thử nghiệm khả năng hạn chế bệnh HXVK và héo vàng của các chế phẩm

sinh học trên cà chua và khoai tây ở nhà lưới 55 3.6.3 Thử nghiệm chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua

và khoai tây ở ngoài đồng 58 3.6.3.1 Hiệu quả của chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua

ở diện hẹp ngoài đồng 59 3.6.3.2 Thử nghiệm chế phẩm BE, BC đối với bệnh HXVK, héo vàng trên khoai tây 61 3.6.4 Kiểm tra hoạt tính của chế phẩm BE, BC sản xuất tại Việt Nam sau 5 tháng

sản xuất 63 3.7 Đề xuất quy trình sản xuất thử và sử dụng chế phẩm BE trong nhà lưới đối

với bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua, khoai tây 66 3.7.1 Đề xuất quy trình về sản xuất thử chế phẩm BE tại Việt Nam 66 3.7.2 Đề xuất quy trình về sử dụng chế phẩm BE trong phòng trừ tổng hợp bệnh

HXVK và héo vàng trên cà chua, khoai tây 71 3.7.2.1 Đề xuất quy trình về sử dụng chế phẩm BE trong phòng trừ tổng hợp bệnh

HXVK và héo vàng trên khoai tây 71 3.7.2.2 Đề xuất quy trình về sử dụng chế phẩm BE trong phòng trừ tổng hợp bệnh

HXVK và héo vàng trên cà chua 73

3.8 Danh mục các sản phẩm của đề tài giao và thực hiện 76

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.2 Kiến nghị 78

V TÀI LIỆU THAM KHẢO

5.1 Tiếng Việt 79 5.2 Tiếng Anh 80

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, bệnh héo vàng do nấm Fusarium, bệnh HXVK do Ralstonia

solanacearum (Smith) và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora là 3 bệnh hại nguy

hiểm dưới đất và gây thiệt hại lớn trên chuối, khoai tây, cà chua, hành ta, hồ tiêu và nhiều cây trồng khác Nhiều năm dịch bệnh này đã gây tổn thất rất lớn đến sản xuất

Bệnh HXVK nguyên nhân do Ralstonia solanacearum (R.solanacearum) gây bệnh trên

200 loài thực vật Ở Việt Nam, bệnh gây hại khoảng 20-40% diện tích các vùng trồng cây khoai tây, 25-45% trên cà chua, 20-30% trên lạc, bệnh gây hại ở cà bát, gừng, thuốc lá và vừng Các biện pháp phòng trừ bệnh bằng hoá học và một số biện pháp khác không đem lại hiệu quả mong muốn Chọn giống chống bệnh HXVK trên là hướng đi có hiệu quả nhưng chỉ đối với cây lạc, cà chua, còn cây khác thì rất khó khăn

do lai tạo và nhiều yếu tố khác Nấm Fusarium là một trong những loài nấm gây bệnh

héo vàng hại trên nhiều loại cây trồng ở Việt Nam như cà chua, khoai tây, chuối, lúa, hành ta, ngô…Bệnh héo vàng đã nhiều năm gây thất thu tới hàng tỷ đồng Bệnh chết

nhanh nguyên nhân chủ yếu do nấm Phytophthora đã gây thiệt hại lớn cho hầu hết các

vùng trồng hồ tiêu ở Bắc Trung Bộ, Trung Nam Bộ, miền Nam Bộ, Tây Nguyên và đảo Phú Quốc, do đó gây thiệt hại rất lớn đến xuất khẩu hồ tiêu ở nước ta Đối với bệnh do

nấm Fusarium và Phytophthora cũng rất khó phòng trừ bằng biện pháp hoá học Hiện

nay chương trình sản xuất rau sạch, thực phẩm an toàn đang được quan tâm và phát triển để hội nhập WTO nên cần có các sản phẩm sạch bệnh Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu và ứng dụng một số chế phẩm sinh học để phòng trừ các bệnh trên bằng biện pháp sinh học bền vững để đáp ứng sản xuất các sản phẩm nông nghiệp an toàn,

đề tài đã thực hiện năm 2006, năm 2007 là tiếp nối các nội dung của đề tài cần thực hiện

2 Mục tiêu nhiệm vụ hợp tác

2.1 Mục tiêu chung

Phát triển và ứng dụng các biện pháp an toàn đối với môi trường để nâng cao sức

đề kháng của cây, chủ động phòng ngừa bệnh hại trên một số cây họ cà gồm bệnh

HXVK, héo vàng do nấm Fusarium ở cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh ở hồ tiêu,

xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm và thử nghiệm ở Việt Nam

2.2 Mục tiêu trực tiếp của phía Việt Nam

- Giúp các nhà khoa học Việt Nam tiếp thu các phương pháp và kinh nghiệm nghiên cứu của Viện Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Quốc Gia – Hàn Quốc trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm kích kháng, nhằm chủ động phòng ngừa bệnh hại cây trồng

- Sử dụng công nghệ để nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học trong nước,

nhằm hạn chế bệnh héo xanh do vi khuẩn R.solanacearum, bệnh héo vàng do nấm

Fusarium trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici trên

hồ tiêu

3 Các nội dung thực hiện của nhiệm vụ hợp tác

3.1 Thu thập và chẩn đoán VSV gây bệnh và đối kháng trong hệ rễ cây trồng ở các vùng có bệnh hại Phân lập, chọn lọc nguồn bệnh có độc tính cao làm vật liệu cho nghiên cứu Phân lập, chọn lọc các isolates VSV đối kháng có triển vọng trong phòng trừ bệnh

3.2 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 ở nhà lưới đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh trên hồ tiêu

3.3 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm EXTN-1 ngoài đồng ruộng ở diện nhỏ đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh trên hồ tiêu 3.4 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm EXTN-1 ngoài đồng ruộng ở mô hình 1ha đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh trên hồ tiêu 3.5 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ để sản xuất thử chế phẩm ở mức nhỏ

3.6 Thử nghiệm khả năng hạn chế của các chế phẩm mới đối với bệnh HXVK, héo vàng trên cà chua, khoai tây trong nhà lưới

3.7 Đào tạo và hướng dẫn kỹ thuật

• Đào tạo cán bộ khoa học của Việt Nam ở nước ngoài

Cử các cán bộ Việt Nam sang Hàn Quốc đào tạo về kỹ thuật công nghệ phân lập, chọn lọc VSV; Công nghệ ứng dụng và sản xuất các chế phẩm sinh học

• Hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân tham gia mô hình

Hướng dẫn cho nông dân kỹ thuật về nhận biết các bệnh trên đồng ruộng và kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh

4 Kết quả cần đạt của phía Việt Nam trong thực hiện nhiệm vụ hợp tác

4.1 Định danh được các chủng VSV đối kháng

4.2 Xác định được hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh héo xanh do vi

khuẩn R solanacearum, héo vàng do nấm Fusarium trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora capsici trên hồ tiêu ở sản xuất

4.3 Nghiên cứu sản xuất 1-2 chế phẩm mới có hiệu quả phòng trừ các bệnh trên 4.4 Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm mới; quy trình sử dụng chế phẩm

4.5 Đào tạo cán bộ khoa học của Việt Nam và hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân

4.6 Có các bài báo đăng về kết quả nghiên cứu đã đạt được của đề tài

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.1.1 Tình hình nghiên cứu chung ngoài nước

Trên thế giới các cây trồng có 3 bệnh hại chính trong đất và gây thiệt hại lớn đến kinh tế là bệnh HXVK, bệnh héo vàng một trong những nguyên nhân là do nấm

Fusarium solani (Mart.) Appel & Wollenr [28], bệnh chết nhanh hồ tiêu một trong

những nguyên nhân chính gây ra là nấm Phytophthora capsici (Leonian,1992),

emend.A.Alizadeh và P.H.Tsao (1998); Mchau and Cofey (1995) [36] Bệnh HXVK

nguyên nhân do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum (E.F.Smith) gây ra, đến năm

1972 hội nghị quốc tế lần thứ hai về chiến lược đối với bệnh vi khuẩn héo xanh, các

nhà khoa học đã thống nhất đổi tên là Ralstonia solanacearum (Smith) theo Kelman

A.(1997) [49] Theo E.F.Smith (1986) [66] bệnh HXVK đã gây hại lớn đến kinh tế của nhiều loài cây trồng họ cà, vừng, gừng, dâu tằm, lạc, Có nhiều nhà khoa học đã phân

loại vi khuẩn R.solanacearum ở mức nòi và biovar và xác định trên thế giới có 5 nòi và

5 biovar của vi khuẩn R.solanacearum [26], [37] Bệnh HXVK gây thiệt hại lớn nhất

trên khoai tây ở Peru, Malaysia, Mỹ, Trung Quốc, Brazil, Ấn Độ, vv có vùng trồng khoai tây ở Brazil, Mỹ hầu như mất trắng (Elphinstone và cs., 1998 [38]; Frech E.F,

1986 [40] Bệnh HXVK còn gây hại hầu hết các vùng trồng khoai tây và cà chua ở Châu Á như Phillippin, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, vv theo J.G.Hawkes, 1982 [46]; G.J Perley và cs.,1982 [42] Ở Trung Quốc theo Liung Z.C và cs.(1982) [57] đã

tìm thấy các dòng R.solanacearum gây hại trên nhiều loại cây trồng đặc biệt trên dâu

tằm Các nhà khoa học xác định bệnh HXVK gây thiệt hại nhiều đến kinh tế của nhiều cây trồng nhưng sử dụng thuốc hoá học không đem lại hiệu quả mong muốn (Vesey, J.K., 2003 [68]; (L.Ciampi và cs., 1989 [53]) Theo French E.F (1988) [38] và J.Kempe và L.Sequeira (1983) [47] đã thông báo phòng trừ bệnh HXVK hiệu quả nhất

là sử dụng chế phẩm sinh học kết hợp các biện pháp khác trong phòng trừ tổng hợp như chọn giống, vệ sinh đồng ruộng, xử lý nguồn nước ô nhiễm, vv Biện pháp hoá

học không có hiệu quả trong phòng trừ bệnh HXVK Bệnh héo vàng do nấm F.solani

gây hại trên nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây, đậu tương, ngô vv, và đã nhiều nơi thất thu đến hàng ngàn ha cây trồng và cũng rất khó phòng trừ (C.E.Windels

và cs.,2004 [32]) và (Burgess L.W và cs., 1994 [28]) Bệnh chết nhanh nguyên nhân

do nấm P.capsici gây hại trên hồ tiêu, ớt, cà bát, ca cao, cà chua, bông và nhiều cây

trồng khác ở nhiều nước trên thế giới (Donal C.Erwin và cs., 1996 [36]) Bệnh chết

nhanh do nấm Phytophthora capsici cũng rất khó phòng trừ vì thường kết hợp với nấm

Fusarium và tuyến trùng gây hại dưới đất [27]

Do vậy biện pháp phòng trừ sinh học là biện pháp hữu hiệu, an toàn cho sản phẩm và thân thiện với môi trường

Trên thế giới đã có nhiều nước nghiên cứu trong lĩnh vực chế phẩm sinh học để hạn chế bệnh hại cây trồng như ở trường Đại học Hannover, Đức đã sử dụng axit salicylic để kích kháng cà chua kháng bệnh HXVK Giáo sư W Zeller và cs (2001) ở trường ĐH Darmstadt, CHLB Đức đã sử dụng chế phẩm BioZell-2000B chiết xuất từ tinh dầu cây bạc lý hương để kích kháng cây táo chống bệnh đốm vi khuẩn, chống

bệnh HXVK và Fusarium ở cà chua và khoai tây (theo Lapa, S.V, 2006 [54]) và

Lemessa F., Zeller W(2006) [56] Trường Đại học Gent, Vương quốc Bỉ đã sử dụng

hooc môn axit của cây thảo dược và dòng IC14 của Serratia plymuthica có khả năng

kích kháng cây lúa chống bệnh bạc lá Ở Trung Quốc có chế phẩm kích kháng Sasa được sử dụng để hạn chế bệnh bạc lá lúa Viện INRA ở Pháp và Nepal đã sử dụng

K2HPO4 để kích kháng cây lúa chống lại bệnh đạo ôn [57] Đặc biệt là ở Hàn Quốc có nhiều cơ sở nghiên cứu lĩnh vực này như viện NIAST sử dụng EXTN-1, axit phốt phoric phòng trừ một số bệnh virus, nấm và HXVK Trường Đại học Quốc gia Seoul,

Hàn Quốc đã sử dụng B16 (Bacillus subtilis) kích kháng cà chua chống bệnh HXVK,

vv [30] Ở Trung Quốc theo thông báo của G.C.Wall và J.L.Sauchez (1993) [41] và I.W Budenhagen và A.Kelman (1964) [44] cũng đã sử dụng một số chế phẩm sinh học

như Bacillus, thảo mộc đã hạn chế được bệnh HXVK trên khoai tây, cà chua và dâu

tằm Ở Nhật Bản theo Murakoshi R và cs.(1984) [58] và Chae Gun Phae và cs.(1992)

[29] đã sử dụng Bacillus subtilis NB22 và một số dòng Bacillus khác đã hạn chế được

bệnh HXVK ở cà chua Các nhà khoa học như J.M.Enfinger (1983) [48] và Kloepper, J.W và sc.,(1980) [50] và Ciam L và cs., (1988) [31] đã sử dụng một số chủng

Pseudomonas fluescent và Bacillus để phòng trừ bệnh HXVK ở cà chua và khoai tây

có hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh 30-32% để hạn chế bệnh HXVK trên cà chua ở Mỹ [48]

Ở Pháp, Lapa, S.V (2006) [54] cũng đã sử dụng Bacillus subtilis phòng trừ nấm gây

hại cây cà chua, lạc và vừng Ở Mỹ giáo sư Tim Momol và cs.(2003) [67]; Vessey, J.K (2003) [68] đã sử dụng tinh dầu cây bạch lý hương, VSV đối kháng Actigard và một số chất kích kháng khác để hạn chế bệnh HXVK và bệnh đốm lá vi khuẩn W.G Burton(1966) [69] và J.G.Hawkes (1982) [46] và Elphinstone và cs (1998) [39] cũng thông báo rằng bệnh HXVK đã ảnh hưởng làm chậm quá trình trao đổi dinh dưỡng trong cây khoai tây Ở Canada và Nam Mỹ theo Idriss, E.E và cs.(2002) đã sử dụng

Bacillus amyloliquefaciens FZB45[45] kích kháng cà chua, khoai tây, lạc, vv hạn chế

bệnh gây hại

Các nhà khoa học cũng đã sử dụng kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán và phân loại VSV gây bệnh trên cây trồng để phân loại các nòi, biovar của vi khuẩn

R.solanacearum (Larry Snyder và cs., 2002 [55] và Phillipp Gerhardt và cs.1994 [62]),

R.A.Lelliot và cs., 1987 [63]; và S.E.Seal và cs., 1982 [64]) Đối với chẩn đoán nấm

F.solani theo Burgess L.W và cs., 1994 [28] đã phân loại các loài nấm Fusarium ở

mức các nòi Với nấm Phytophthorai theo Donald và cs., 1996 [36] cũng đã phân loại tới mức nòi như nấm P.capsici

Hiện nay hướng đi mới và an toàn cho cây trồng, con người và thân thiện với môi trường là sử dụng các biện pháp sinh học để hạn chế các bệnh, đặc biệt là bệnh HXVK

là hướng phòng trừ chính Do vậy rất nhiều nhà khoa học đã sử dụng phân loại và chẩn đoán mức phân tử (RNA, PCR vv, ) để kịp thời đưa các chế phẩm, các sản phẩm sinh học phục vụ kịp thời trong sản xuất nông nghiệp theo Sambrook, J.và D.Russell (2001) [65]

Hiện nay Bộ môn Bệnh cây, Ban Sinh vật nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp và Công nghệ Hàn Quốc (NIAST) đã nghiên cứu thành công và phát triển các chế phẩm sinh học như EXTN-1, B16 đã làm tăng tính chống chịu của cây lúa, cà chua, dưa chuột, rau diếp, vv (K.S.Park, 2003 [51] và 2007 [52]; Chong Hoe Kim và K.S Park, 2001[30] Viện NIAST, Hàn Quốc có chế phẩm sinh học rất tốt với tên

thương phẩm là EXTN-1 có nguồn gốc vi khuẩn Bacillus vallismortis có tác dụng trừ

một số bệnh hại nguy hiểm ở trên 20 loại cây trồng như hồ tiêu, cà chua, dưa chuột, khoai tây Chế phẩm EXTN-1 có phổ tác dụng phòng trừ bệnh rộng đối với các bệnh

virus, vi khuẩn, nấm, an toàn với môi trường và cộng đồng Chế phẩm sinh học

EXTN-1 được tạo ra từ năm 2000 và thương mại hoá từ năm 2003 ở NIAST, Hàn Quốc Do vậy bạn đã có rất nhiều kinh nghiệm trong sử dụng và ứng dụng VSV này ở sản xuất EXTN-1 đã duy trì, có hiệu quả và ổn định phòng trừ nấm, virus và vi khuẩn ở Hàn Quốc trong 5-6 năm qua Sản phẩm EXTN-1 đã thương mại hoá bởi công ty Dongbu-Hannong Chemical Co ở Hàn Quốc (Kyungseok Park và sc., 2007[52]

1.1.2 Về chế phẩm EXTN-1

Chế phẩm EXTN-1 là do quá trình phân huỷ vi khuẩn tạo nốt sần của rễ cây ớt, EXTN-1 có tác dụng thúc đẩy quá trình phát triển rễ cây, làm màu mỡ đất đai đồng thời ngăn cản sự phát sinh bệnh thông qua hệ thống tự phòng chống của thực vật

a, Đặc điểm và hình thái của vi khuẩn EXTN-1

Tên vi khuẩn là Bacillus vallismortis (EXTN-1)

• Vật chủ ký sinh phân huỷ từ: Rễ cây ớt

• Đặc trưng sinh lý: Hình thành bào tử nội sinh

• Đặc trưng hình thái: Vi khuẩn hình que

• Dài: 2,5- 3µm

• Khả năng: Tăng cường hệ thống đề kháng (ISR), thúc đẩy sự tăng trưởng của cây (PGPR)

• Nhiệt độ thích hợp phát triển: 280C

b, Quá trình nghiên cứu chế phẩm EXTN-1

- Cơ quan nghiên cứu và tìm ra EXTN-1 là Viện Khoa học công nghệ Nông nghiệp Quốc Gia, Cục Nông nghiệp và phát triển nông thôn của Hàn Quốc

- Các cơ quan phối hợp nghiên cứu và sản xuất chế phẩm EXTN-1: Khoa phát triển kỹ thuật Nông Lâm của bộ Nông Lâm (trong vòng 3 năm 1999-2002), Viện Khoa học công nghệ Nông nghiệp Quốc Gia + công ty hoá học DongbuHannong + Nghiên cứu cộng đồng Kongchude

- Sản phẩm EXTN-1 gồm vi sinh vật đối kháng- B.vallismortis (dạng viên và dạng

lỏng), nếu dạng viên kết hợp với than bùn non

- Giấy phép có liên quan: Viện cấp giấy phép (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (RDA) + Viện nghiên cứu cộng đồng Dongu Hannong năm 2004) với số đăng ký

là 16-12-2

c, Hiệu quả của chế phẩm EXTN-1 đối với bệnh và phát triển của cây trồng

Dựa theo tài liệu công bố của Kyung seok Park tác giả của chế phẩm EXTN-1[51],

[51], [61]

1- Thúc đẩy sự sinh trưởng trên mặt đất của thực vật: hệ thống biến đổi chất dinh

dưỡng giúp thực vật có thể sử dụng hết các thành phần trực tiếp hấp thụ từ đó thúc đẩy quá trình sinh trưởng, như nâng cao số lượng, tăng cường màu sắc cho quả và lá cây Thúc đẩy sự phát triển rễ cây Tăng cường hấp thụ chất vô cơ bài tiết chất hoạt động sinh lý Hoạt dụng hoá chức năng quan trọng của thực vật

2- Nâng cao hệ thống tự phòng bệnh của thực vật: EXTN-1 là vi khuẩn vùng rễ

sống ở khu vực xung quanh rễ thực vật nhờ cơ cấu nâng cao hệ thống tự phòng ngừa bệnh của vi sinh vật có tác dụng hạn chế bệnh lây nhiễm và ngừa các bệnh nguy hiểm EXTN-1 có khả năng ngăn ngừa được hơn 80% đối với bệnh thán thư ở dưa chuột, cà

chua, ớt và bệnh HXVK, Fusarium spp ở cà chua, khoai tây, ớt, bệnh đạo ôn ở lúa 3- Cưỡng chế sự phát sinh bệnh cho cây: bởi ức chế một cách phức tạp với virut, vi

khuẩn, nấm, đặc biệt hiệu quả ngừa bệnh virut ở dưa chuột mà cho đến tận bây giờ hầu như chưa có loại thuốc nông dược nào có khả năng đó

- An toàn với cây trồng và thân thiện với môi trường: Mở rộng phạm vi đối tượng cây nông nghiệp và tạo tính năng an toàn Là sản phẩm sử dụng vi khuẩn vùng rễ tồn tại trong mặt đất nên an toàn với môi trường, hiệu quả tích cực đối với môi trường sinh thái nông nghiệp

- Đặc trưng vượt trội của EXTN-1 so với các vi khuẩn vùng rễ khác là trong các khả

năng ứng dụng các loại vi khuẩn vùng rễ, nó có cơ chế thúc đẩy tăng trưởng và nâng cao sức đề kháng của thực vật

4, EXTN-1 tác dụng tăng sức đề kháng cho cây do có các hoạt chất sau:

- EXNT- 1 được phân tích bởi sự bài tiết vật chất hoá học của rất nhiều chủng loại

Đặc biệt, chất kết hợp của 2 loại chất sau được coi là vật chất tăng cường kháng bệnh mạnh nhất:

Cyclo dipeptide Cyclo depsipeptide

(L- Tyrone+ L- Proline+ 1:1)

- EXTN-1 chứa chất đạm phòng bệnh (Pr- protein): Pr- protein là một ví dụ về sức đề kháng tiêu biểu nhất bởi chất đạm được phát hiện trong tế bào thực vật có khả năng ngăn ngừa dịch bệnh đã có mặt khi sử dụng EXTN-1 cho cây Các Pr- protein có

sự hoạt động của kháng thể vi sinh vật (anti-microbial activity) có tác dụng ngăn cản men sinh vật gây bệnh thâm nhập vào thực vật Trong các loại Pr- protein thì Pr-1a là chất đạm có sức đề kháng tiêu biểu nhất

5, Tăng cường sức đề kháng vật lý của EXTN-1:

Tác dụng ngăn cản cảm nhiễm phát sinh trong thời kỳ đầu cảm nhiễm của bệnh thán thư, virut ở dưa chuột, HXVK ở cà chua, khoai tây, ớt, và đạo ôn ở lúa

Cơ cấu kháng bệnh vật lý

+ Thúc đẩy hình thành Callus

+ Ngăn chặn lây lan bào tử vi rút, vi khuẩn và nấm gây bệnh

+ Phòng ngừa sự hình thành vi khuẩn gây bệnh phụ

Tế bào hình thành Callus dầy và Ligin kết hợp lại làm cho cường độ tế bào nâng cao sẽ chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh ở tế bào biểu bì

Bản thân vật chất phát sinh trong quá trình hình thành Ligin có độc tính trong vi khuẩn gây bệnh và các bệnh lây nhiễm kèm theo

Mặt khác, một số nước cũng như ở viện NIAST, Hàn Quốc đã sử dụng axit photphoric để kích kháng cây chống chịu một số bệnh đồng thời không độc cho cây mà còn kích thích cây phát triển tốt, tăng năng suất và an toàn đối với môi trường

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bệnh HXVK, héo vàng do nấm Fusarium và bệnh chết nhanh do nấm

Phytophthora gây ra trên nhiều loại rau màu và các cây trồng quan trọng ở Việt Nam

(Mai Thị Phương Anh, 1996 [1], Lê Lương Tề, 1977 [14] Trên cà chua bệnh HXVK

và héo vàng là hai bệnh gây hại quan trọng và rất khó phòng trừ (Nguyễn Thư, 1980 [18]; Nguyễn Văn Viên, 1999 [24]) Đặc biệt trên khoai tây bệnh HXVK và héo vàng

đã gây thiệt hại lớn các vùng trồng khoai tây trong cả nước (Hà Minh Trung, 1980 [19]; (Đoàn Thị Thanh, 1998 [15] và 2006 [16]), Nguyễn Xuân Tùng, 1986 [60]) Bệnh

với tuyến trùng và nấm Fusarium gây chết cây trồng trên hồ tiêu, cà phê, cao su vv…

(theo V.P.Izrainxki, 1988 [20]; Đặng Vũ Thanh và cs., 2004 [33]) Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, 1998 [25] đã dựa vào phản ứng hoá oxy hoá 3 loại rượu mạch

vòng, 3 loại đường 6 các bon đã phân lập nòi và Biovar của vi khuẩn R.solanacearum

nguyên nhân gây bệnh HXVK trên lạc; Đoàn Thị Thanh, 1998 [13] đã phân lập nòi, biovar trên khoai tây, cà chua và một số cây ký chủ khác (Lê Như Kiểu, 2004 [8] và Lê

Thị Ánh Hồng, 2002 [6]) đã phân lập biovar của bệnh HXVK trên cà chua

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm sinh học đã được nhiều nhà khoa

học công bố Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội sử dụng Streptomycine

arabicus 112 và chế phẩm sinh học Pseudomonas fluorecens (Nguyễn Lân Dũng,

Phạm Văn Tỵ và cs., 1975) [10] hạn chế bệnh HXVK Trường Đại học Sư phạm I- Hà

Nội đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomycine V6 có khả năng chống bệnh HXVK

(Nguyễn Hoàng Chiến và cs., 2001) [10] Viện Di truyền Nông nghiệp đã thông báo một số chủng VSV như VK58, VK48 đối kháng có khả năng chống bệnh HXVK (Lê Như Kiểu và cs., 2004) [8] Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội sử dụng VSV đối kháng P16 có khả năng hạn chế bệnh HXVK từ 30-32% ở cà chua (Đỗ Tấn Dũng, 2002) [5] Phạm Văn Chuông, 2005 [4] bước đầu sử dụng một số chế phẩm sinh học

BS (Bacillus subtilis), Exin 4,5HP để hạn chế bệnh HXVK trên cà chua

Về sử dụng VSV kích kháng và tác nhân kích kháng: Hứa Quyết Chiến đã đề xuất các muối của axit salicylic sản xuất chế phẩm (Exin, Phytoxin) để phòng trừ HXVK và một số bệnh (Đái Duy Ban và cs., 1994 [2].TrầnVũ Phến, PhạmVăn Kim và cs.(2003)

đã phát hiện ra chủng nấm Colletotrichum sp nguồn gốc từ nước ngoài có khả năng

kích kháng giúp cho cây lúa giảm bệnh đạo ôn từ 58-72% Phạm Văn Kim và cs (2003) đã nghiên cứu và thông báo khả năng sử dụng clorua đồng, oxalic axit và natri silicat là những tác nhân kích kháng chống bệnh đạo ôn [10]

Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu khá sâu về bệnh HXVK, héo vàng do nấm

Fusarium và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora là những bệnh hại nguy hiểm

trong đất trên nhiều cây trồng quan trọng ở Việt Nam (Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1998 [59] Đã có thông báo về một số chế phẩm đa chức năng và phân bón hữu cơ vi sinh vật chức năng có tác dụng hạn chế bệnh HXVK, bệnh héo vàng đối cây trồng cạn (Phạm Văn Toản và cs., 2004) [36] Nguyễn Thị Vân và cs (2003) [23] đã sử dụng vi

khuẩn Pseudomonas fluorescens kết hợp với lân, Exin 4.5 HP đã làm giảm tỷ lệ bệnh

HXVK ở giai đoạn sớm và kích thích cây phát triển tốt Một số thuốc hoá học không độc có khả năng kích kháng như muối của Axit Salisilic, Bo cũng được thử nghiệm

và có kết quả Ngô Vĩnh Viễn và cs (2004) [33] đã sử dụng thuốc Phosacide 200

không độc, tiêm để phòng trừ bệnh Phytophthora palmivora trên sầu riêng và hồ tiêu

Báo cáo hội nghị quốc tế về vi khuẩn học hại cây trồng và phòng trừ sinh học bệnh vi khuẩn hại cây trồng lần thứ nhất tại CHLB Đức (2005) tác giả Đoàn Thị Thanh và Trần Thị Thu Hà, 2005 [36] đã có báo cáo về sử dụng một số chế phẩm sinh học B16, VK58 trong phòng trừ bệnh HXVK trên cà chua và lạc Trong nghiên cứu phân loại các chủng, loại VSV đối kháng và bệnh học cũng đã được nghiên cứu bước đầu ở Việt Nam bởi sử dụng kỹ thuật PCR, RNA của Bùi Chỉ Bửu và cs., 2005 [3], GS.TS Đái Duy Ban và cs., 2004 [2]; Nguyễn Thị lang, 2002 [11] để phân biệt mối quan hệ giữa các bệnh và VSV khác Đoàn Thị Thanh và cs., 2006 [16] đã kết hợp với cơ quan khác

đã sử dụng kỹ thuật RNA để phân loại VSV đối kháng ở mức chủng để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh HXVK và héo vàng

hoá và một chế phẩm trừ được nhiều bệnh

Để các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại này phát huy hiệu quả tốt và có tính ổn định cao cần nghiên cứu, tiếp thu kinh nghiệm của các nước tiên tiến trong đó

có Hàn Quốc là nước đã gặt hái nhiều thành công trong ứng dụng các kết quả nghiên cứu KHCN theo hướng này Đề tài được thực hiện các cán bộ Việt Nam sẽ học tập về kinh nghiệm phân lập, xác định các chủng VSV có khả năng kích kháng cao của Hàn Quốc Cán bộ Việt Nam cũng sẽ tiếp thu công nghệ sản xuất chế phẩm dễ bảo quản, dễ

sử dụng, có tính ổn định và hiệu lực cao của bạn Đây là hướng đi mới và cần thiết của nhiệm vụ để hạn chế các bệnh hại trên và an toàn với môi trường ở nước ta

CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU – TRIỂN KHAI 2.1 Mục tiêu của nhiệm vụ

Phát triển và ứng dụng các biện pháp an toàn đối với môi trường để nâng cao sức

đề kháng của cây, chủ động phòng ngừa bệnh hại trên một số cây họ cà gồm bệnh HXVK, héo vàng ở cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh ở hồ tiêu Xây dựng qui

trình công nghệ sản xuất và thử nghiệm chế phẩm sinh học ở Việt Nam

2.2 Nội dung hợp tác giữa hai nước

• Phía Việt Nam

1 Thu thập VSV gây bệnh, VSV đối kháng và phân lập chẩn đoán được các

isolates của 3 bệnh làm vật liệu nghiên cứu ở các vùng có bệnh hại nặng như Hà Tây,

Hà Nội, Vĩnh Phúc và Đắc Nông Phân lập, chọn lọc nguồn bệnh có độc tính cao làm vật liệu nghiên cứu

2 Đánh giá và thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm EXTN-1 để phòng trừ các bệnh

trên cây cà chua (HXVK và héo vàng), khoai tây (HXVK) và hồ tiêu (bệnh chết nhanh)

3 Cử 5 cán bộ sang NIAST, Hàn Quốc đào tạo về kỹ thuật và công nghệ sử dụng

chế phẩm sinh học và sản xuất ở Việt Nam

4 Áp dụng công nghệ của NIAST, Hàn Quốc tìm các dòng VSV đối kháng mới để

sản xuất chế phẩm sinh học ở Việt Nam và thử nghiệm ra sản xuất

• Phía Hàn Quốc

1 Xác định, thử nghiệm các tác nhân sinh học để phòng trừ 3 bệnh hại trên trong

đất đối với cây họ cà, các cây khác và cung cấp chế phẩm cho Việt Nam

2 Đào tạo và chuyển giao công nghệ phân lập, chọn lọc dòng VSV đối kháng và

kích kháng, sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ 1-3 bệnh trên cho cán bộ khoa học Việt Nam

3 Cử cán bộ của NIAST, Hàn Quốc sang Việt Nam hàng năm để tham gia nghiên

cứu về công nghệ sản xuất, ứng dụng chế phẩm EXTN-1 và xác định chiến lược phòng

trừ bệnh tổng hợp đối với các bệnh trên ở Việt Nam

• Kế hoạch hợp tác

+ Về đào tạo nước ngoài: Chia làm 2 đoàn: Năm thứ nhất là 2 người gồm chủ

nhiệm đề tài sang thảo luận về nội dung và kế hoạch hợp tác và 1 cán bộ sang học về

kỹ thuật và công nghệ sử dụng chế phẩm EXTN-1 Năm thứ hai: 3 người gồm chủ nhiệm đề tài sang tổng kết đề tài, 2 cán bộ sang học về kỹ thuật và công nghệ phân lập VSV đối kháng và công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học

+ Năm thứ nhất

- Chủ nhiệm đề tài và các cán bộ chủ chốt của dự án sẽ sang Hàn Quốc đàm phán

về kế hoạch và tiến độ thực hiện dự án

- Cán bộ KHCN của NIAST, Hàn Quốc sang Việt Nam cùng cán bộ Việt Nam đánh giá, thu thập VSV để mang sang Hàn Quốc phân lập, chọn lọc nguồn VSV đối

kháng có triển vọng phòng trừ 1-3 bệnh trên

- Cử cán bộ Việt Nam (1 cán bộ trong kế hoạch được đào tạo năm đầu tiên) sang Hàn Quốc đào tạo về Khoa học Công nghệ để ứng dụng thử nghiệm chế phẩm đó ở Việt Nam, và 1 cán bộ sang Hàn Quốc để học công nghệ phân lập, chọn lọc VSV đối kháng và kích kháng

- Phía Hàn Quốc: Cung cấp chế phẩm và cùng cán bộ Việt Nam khảo sát bệnh và thử nghiệm tác nhân VSV phòng trừ bệnh tại Việt Nam

- Phía Việt Nam: Đánh giá và thử nghiệm tác nhân VSV để phòng trừ 3 bệnh trên

- Cán bộ Hàn Quốc có kế hoạch sang Việt Nam kiểm tra tiến độ thực hiện kế

hoạch, nội dung hợp tác và bổ sung tư vấn cho cán bộ Việt Nam

- Thử nghiệm hiệu lực chế phẩm EXTN-1 diện lớn (1ha/cây) ở ngoài đồng đối với 3 bệnh trên ở cà chua, khoai tây và hồ tiêu

- Chủ nhiệm dự án sang tổng kết dự án

- Ứng dụng chế phẩm để phòng trừ bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua, khoai

tây ở Hà Nội/Hà Tây và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora trên hồ tiêu ở Đăk

Nông

- Đề xuất dự thảo qui trình sản xuất chế phẩm VSV mới ở Việt Nam

- Đề xuất dự thảo 2 qui trình công nghệ sử dụng chế phẩm mới đối với bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua, khoai tây ở Việt Nam

- Nghiệm thu và tổng kết dự án ở Việt Nam và Hàn Quốc

• Nội dung thực hiện 2006-2007

1 Thu thập VSV gây bệnh và VSV đối kháng ở các vùng có bệnh hại nặng như

Hà Tây, Hà Nội, Vĩnh Phúc và Đắk Nông Phân lập, chọn lọc nguồn bệnh có độc tính cao làm vật liệu nghiên cứu Phân lập VSV đối kháng có hoạt tính cao, hạn chế bệnh

HXVK (R solanacearum), héo vàng (Fusarium sp.) với vòng ức chế >1cm để thử

nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

2 Thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 ở nhà lưới: Qui mô mỗi thí nghiệm 10-15

cây/lần nhắc, nhắc lại 3 lần, 3-5 TN/bệnh/cây/vụ để thăm dò thời vụ sớm - muộn và liều lượng thích hợp để sử dụng chế phẩm EXTN-1 (cà chua- 2 vụ, khoai tây -1 vụ) đối

với bệnh HXVK, héo vàng và 3TN/năm, hồ tiêu với bệnh chết nhanh do Phytophthora

capsici 1TN/năm

3 Thử nghiệm đồng ruộng hiệu lực của chế phẩm EXTN-1 ở diện nhỏ: Cà chua

(HXVK và héo vàng), khoai tây (HXVK) và hồ tiêu (chết nhanh do Phytophthora

capsici)

- Thử nghiệm diện nhỏ (500m2/thí nghiệm), điểm thử nghiệm đối với bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua ở Hà Tây, Vĩnh Phúc (2vụ/năm), trên khoai tây (1vụ/năm) và bệnh chết nhanh trên hồ tiêu ở Đắk Nông (1vụ/năm) ở năm 2006

4 Đánh giá hiệu lực của EXTN-1 ở diện lớn (1ha) với 2 bệnh HXVK và héo vàng

trên cà chua (vụ xuân hè và vụ đông 2007) ở Hà Tây, Vĩnh Phúc và bệnh chết nhanh trên hồ tiêu ở Đắk Nông năm 2007

5 Đề xuất qui trình công nghệ

- Đề xuất qui trình sản xuất chế phẩm EXTN-1 mới/chế phẩm mới: Dạng dung dịch hoặc bột

- Đề xuất 2 qui trình thử nghiệm chế phẩm EXTN-1 mới/chế phẩm mới để phòng

trừ 2 bệnh trên cây cà chua và khoai tây ở Việt Nam

6 Đào tạo và hướng dẫn kỹ thuật

- Đào tạo cho cán bộ khoa học của Việt Nam ở nước ngoài: Cử 5 cán bộ Việt

Nam sang NIAST đào tạo về kỹ thuật công nghệ để phân lập, chọn lọc 1 dòng VSV đối kháng có triển vọng để phòng trừ sinh học, ứng dụng công nghệ để sản xuất các chế phẩm sinh học và sử dụng ở Việt Nam

- Hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân tham gia mô hình: Hướng dẫn kỹ thuật cho

nông dân về cách nhận biết các bệnh trên và kỹ thuật sử dụng chế phẩm EXTN-1 để hạn chế 3 bệnh trên (3 lớp)

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

+ Các giống cà chua, khoai tây và hồ tiêu: Gồm các giống trồng phổ biến trong

sản xuất: Giống cà chua mẫn cảm (Balan) và giống PT18, giống cà chua Mỹ 2004 là giống chống chịu bệnh HXVK và héo vàng Khoai tây với giống Ackersegen, Diamand (khá mẫn cảm), giống KT3 là giống chống chịu HXVK; hồ tiêu với giống tiêu Sẻ trồng phổ biến ở sản xuất

+ Các chế phẩm sinh học: Chế phẩm sinh học EXTN-1 (Viện NIAST, Hàn Quốc)

và phân hữu cơ vi sinh vật chức năng Nhuệ Giang (phân HCVSVCN) do bộ môn Vi sinh vật, Viện Nông hoá thổ nhưỡng cung cấp - so sánh dương Sử dụng chế phẩm BE

dạng bột nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus vallismortis của Hàn Quốc nhưng sản xuất tại

Việt Nam có mật độ 108 CFU/1g Chế phẩm BC (Bacillus subtilis)- dạng bột do bộ

môn Bệnh cây nghiên cứu và sản xuất với mật độ 108 CFU/1g

+ Nguồn bệnh và VSV đối kháng: Gồm các isolates của vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh HXVK, nấm Fusarium solani (F.solani), nấm Phytophthora, và các isolates

của VSV đối kháng phân lập từ đất và rễ ở miền Bắc Việt Nam

+ Các môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar), TZC (Triphenyl Tetrazolium

Chloride) để phân lập vi khuẩn R.solanacearum Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) cho nấm F solani và King’B (King et.al., 1954), LB (Luria- Bertani) để nuôi cấy và nhân nhanh vi khuẩn đối kháng Bacillus

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Phương pháp điều tra, thu thập và phân lập mẫu bệnh và VSV đối kháng

* Phương pháp điều tra, thu thập và phân lập mẫu VSV gây bệnh

- Phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn học và nấm học của trường đại học Damstadt, CHLB Đức, trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc và Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc

- Phương pháp điều tra cơ bản và phân lập VSV gây hại theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV, tiêu chuẩn Bảo vệ thực vật (quyển 1) [20]

+ Phương pháp phân lập VSV gây bệnh

- Phân lập vi khuẩn R solanacearum theo phương pháp của Kelman A., 1954 [26]

Mẫu bệnh lấy từ thân cây bị bệnh có triệu chứng héo rũ xanh đột ngột, ở gốc nhổ lên có màu nâu đen, cò mùi Mẫu bệnh được khử trùng rồi lấy dịch cấy lên môi trường TZC Sau 24 - 48h chọn khuẩn lạc đơn có tâm màu hồng và xung quanh có màu trắng ngà,

rìa mép hơi nhầy là đặc trưng của vi khuẩn R solanacearum Sau đó thử phản ứng siêu

nhạy trên cây thuốc lá và thử lại trên cây khoai tây để kiểm tra triệu chứng đặc trưng cho bệnh HXVK

- Phân lập nấm F solani theo phương pháp của B.W.Burgess, B.A Summerrell,

et.al., 1994 [28] Mẫu bệnh lấy từ phần thân, lá và gốc cây bị bệnh héo vàng Sau đó khử trùng rồi lấy dịch cấy trên môi trường PDA Sau 24 - 48h lấy bào tử quan sát, chọn

bào tử đặc trưng của nòi nấm F solani, soi lên kính để chọn bào tử đơn đặc trưng cho

nghiên cứu

- Phân lập nấm Phytophthora bằng bẫy du động bào tử trong dung dịch đất, sử

dụng mồi bẫy là cánh hoa theo phương pháp của giáo sư David I.Get và Andre Drenth (2004) [27] như sau: Lấy mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thủy tinh, để đất lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm) Cắt cánh hoa có màu sắc 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên Để cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ phòng Quan sát cánh hoa sau 1,2,3 ngày thấy cánh hoa bị mất màu đem lên

kính hiển vi soi, quan sát thấy bào tử nấm Phytophthora Làm thuần cánh hoa đem cấy

lên môi trường: CA, CMA, PCA

+ Phương pháp thu thập mẫu, phân lập VSV đối kháng: Theo phương pháp

nghiên cứu về vi khuẩn học và nấm học đối kháng của trường đại học Damstadt, CHLB Đức, Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc Vi sinh vật - phương pháp đánh giá

hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn R solanacearum Smith

(10TCN 714-2006); vi sinh vật - phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn (10TCN 867-2006); theo phương pháp về VSV đối kháng

và phân bón của tập III Tiêu chuẩn phân bón, tuyển tập Phân bón tiêu chuẩn nông nghiệp Việt Nam, 2001 [22]

+ Định danh VSV gây bệnh: Đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum theo phương pháp của Kelman A, 1954 [26]; nấm Fusarium solani theo phương pháp của L.W Burgess và cs., 1994 [28] Nấm Phytophthora capsici phân lập theo phương pháp

của Andre Drenth và David I.Guest, 2004 và Donald C Erwin và Olaf K.Ribeiro, 2004 [27], [36] Phân lập VSV gây bệnh cũng theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển

I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV

+ Định danh VSV đối kháng theo phương pháp của trường Đại học Quốc gia

Seoul, viện NIAST (2002) [51], [52]; Viện phòng trừ sinh học của trường Đại học Darmstadt, Công hoà Liên Bang Đức, 2006 và phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học của Nguyễn Lân Dũng và cs., 1972 [9], [54]

2.3.2.2 Phương pháp và kỹ thuật sử dụng để thử nghiệm các chế phẩm EXTN-1,

BC, BE ở nhà lưới, ngoài đồng đối với 3 bệnh trên

Thử nghiệm các chế phẩm EXTN-1, BC, BE ở nhà lưới, ngoài đồng và lây nhiễm nhân tạo VSV gây bệnh theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III ấn hành

1997, 1998 của Viện BVTV; tiêu chuẩn Bảo vệ thực vật tập I, II của tuyển tập Tiêu chuẩn nông nghiệp Việt Nam [21] và Phân bón của tập III Tiêu chuẩn Phân bón, tuyển tập Phân bón tiêu chuẩn Nông nghiệp Việt Nam, 2001 [22]

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: theo phương pháp ngẫu nhiên, 3 lần nhắc đối với tất cả các thí nghiệm

- Các thí nghiệm ở nhà lưới mỗi công thức 10- 15 cây/lần nhắc

- Thí nghiệm ở ngoài đồng diện hẹp ≥ 500m2 , theo dõi 50 cây/lần nhắc

- Thí nghiệm ngoài đồng diện rộng (mô hình trình diễn 1 ha) theo dõi 250 cây/mô hình

+ Nguồn bệnh lây nhiễm

- Nguồn vi khuẩn R.solanacearum lây nhiễm ở mật độ 108CFU/ml, 5ml/cây theo phương pháp sát thương rễ [26], [40]

- Nguồn nấm F solani lây nhiễm mật độ 107 CFU/ml và với 3ml/cây Lây bệnh nhân tạo sau khi xử lý các chế phẩm 1 tuần theo phương pháp sát thương rễ và tưới bào

tử nấm vào đất [28], [56]

- Lây bệnh đối với nấm P capsici bởi tưới du động bào tử và sợi nấm vào đất với

liều lượng 1% từ dung dịch đặc từ hộp petri với liều lượng 0,5l/cây, tưới 3 lần trong thời gian 3 tuần theo phương pháp của Andre’ Drenth và David I.Guest, 2004 [27]

+ Mật độ các chế phẩm sử dụng: Chế phẩm EXTN-1 có mật độ 107 (0,1% của mật độ vi khuẩn gốc), tưới 2ml/cây ở nhà lưới và ngoài đồng là 5lit/ha Nên tưới chế phẩm vào xung quanh gốc cây

+ Cách xử lý các chế phẩm

- Ngâm hạt gieo: Sử dụng 1ml/1l của chế phẩm EXTN-1 ở mật độ 107, hoặc 30g/l của chế phẩm BE và BC ở mật độ là 108 CFU/1g ngâm hạt trong dung dịch chế phẩm trong vòng 50-60 phút, sau để ra bát cho hạt hơi se để vi khuẩn tạo màng bọc lấy hạt rồi đem gieo

- Đối với cành hồ tiêu: Ngâm cành trong dung dịch chế phẩm EXTN-1 ở mật độ

107 trong vòng 50-60 phút sau đem dâm và tưới với liều lượng 3ml/cây vào đất trồng cành dâm Đối với chế phẩm BE, BC sử dụng 30g/l của chế phẩm BE và BC ở mật độ

là 108 CFU/1g ngâm cành trong 50-60 phút đem dâm và bón vào đất trồng với lượng 5g chế phẩm/cây Phân HCVSVCN với lượng 8g/cây

- Xử lý các chế phẩm ở nhà lưới: 1ml/1l của chế phẩm EXTN-1 ở mật độ 107, tưới 5ml dung dịch đã pha/cây, xử lý các chế phẩm sau khi trồng 20-25 ngày

- Xử lý các chế phẩm đối với cà chua, khoai tây ở ngoài đồng: Đối với chế phẩm

EXTN-1 bón thúc vào gốc với mật độ 108 CFU/ml, tưới 5l/ha để hạn chế bệnh HXVK

và bệnh héo vàng trên cà chua và khoai tây Đối với nấm P.capsici xử lý tưới vào gốc

với liều lượng 5 l/ha, tưới 2 lần/năm

Ngoài đồng bón trực tiếp chế phẩm BC với mật độ 108 CFU/1g chế phẩm, nên bón cho khoai tây là 250-300 kg/ha và cà chua là 130- 150kg/ha tuỳ thuộc vào thâm canh Chế phẩm BE với mật độ 108 CFU/1g chế phẩm, nên bón cho khoai tây là 240-

280 kg/ha và cà chua là 130- 140kg Bón chế phẩm BC, BE vào xung quanh gốc trước khi trồng

+ Chỉ tiêu theo dõi:

- Tính tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 7, 14, 21, 28, 35, 42 ngày sau khi xử lý chế phẩm ở nhà lưới và 7, 14, 21, 28, 35, 42 ngày sau khi trồng ở ngoài đồng đối với cà chua và khoai tây nên theo dõi 7, 14, 21, 28, 35, 42 ngày sau khi trồng

- Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển qua các giai đoạn của cây, năng suất và chất lượng ăn nếm đối với khoai tây và năng suất đối với cà chua

- Độ ăn nếm (luộc ăn nếm) đối với khoai tây theo thang điểm (1-5) của Trung Tâm khoai tây Quốc tế (CIP) và W.G Burton, 1996 [69]

1- Khoai nhão, hơi ngái; 2- khoai nhão, ăn bình thường; 3- Khoai hơi bở, ăn đậm 4- Khoai bở, ăn hơi có mùi thơm; 5- Khoai bở, có mùi thơm ngon

Đối với cả 2 bệnh theo thang điểm 5 cấp bệnh

+ Chỉ số bệnh

- Chỉ số bệnh HXVK do vi khuẩn R.solanacearum theo thang đánh giá phân theo

5 cấp [37]

Cấp 0: Không có triệu chứng Cấp 1: Một vài lá bị héo

Cấp 2: Nửa số lá phía trên của cây bị héo Cấp 3: 3/4 số lá trên cây bị héo Cấp 4: Cây hoàn toàn héo và chết

- Chỉ số bệnh héo vàng do nấm F.solani trên cà chua, khoai tây theo 5 cấp [32]

Cấp 0: Cây không bị bênh Cấp 4: Cây chết

Cấp 1: Cây hơi còi cọc lá có một ít bị héo

Cấp 2: Lá mất sắc tố, rìa mép lá bị tổn thương

Cấp 3: Đầu rễ bị khô có màu nâu đến đen, lá khô

+ Cách tính Năng suất

- Đối với thí nghiệm diện hẹp: Cân toàn bộ khối lượng của tất cả số củ (hoặc

quả, hạt) của cây thí nghiệm trong 3 lần nhắc, đơn vị tính là kg, sau đó quy đổi thành đơn vị tấn/ha

- Đối với thí nghiệm diện rộng: Cân năng suất theo 5 điểm mỗi điểm 50 cây, đơn vị tính là kg, sau đó quy đổi thành đơn vị tấn/ha

HLCP: Hiệu lực của chế phẩm CTT: Công thức trước phun

ĐCT: Đối chứng trước phun CTS: Công thức sau phun

ĐCS: Đối chứng sau phun

2.4 Phương pháp nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học BE, BC

Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học BE, BC theo phương pháp của Tiến sĩ Kyung seok Park, 2003, viện NIAST, Hàn Quốc [51] , trường đại học Damstart, CHLB Đức, 2006 [56] và phương pháp trong Phân bón của tập 3 tiêu chuẩn phân bón, tuyển tập phân bón tiêu chuẩn nông nghiệp Việt Nam, 2001 [22]

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - TRIỂN KHAI

3.1 Điều tra, thu thập; phân lập VSV gây bệnh và VSV đối kháng năm 2006

3.1.1 Điều tra thu thập và phân lập mẫu VSV gây bệnh

3.1.1.1 Điều tra thu thập VSV gây bệnh trên cà chua, khoai tây và hồ tiêu

Đã thu thập được 150 mẫu VSV gây bệnh trong đó có 85 mẫu là vi khuẩn

R.solanacearum, 55 mẫu nấm F solani trên cà chua và khoai tây ở 3 tỉnh Hà Tây, Hà

Nội và Vĩnh Phúc, 10 mẫu Phytophthora trên hồ tiêu ở Đắk Nông năm 2006

Về triệu chứng của bệnh HXVK do vi khuẩn R.solanacearum, héo vàng do nấm

Fusarium trên cà chua, khoai tây và bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora trên hồ tiêu

Hình 1 Triệu chứng bệnh HXVK, héo vàng ở cà chua, khoai tây và

bệnh chết nhanh ở hồ tiêu (2006)

Trên hình 1 cho thấy triệu chứng bệnh HXVK khi bị bệnh mạch dẫn chứa đầy dịch vi khuẩn, chúng phát triển rất nhanh và tắc nghẽn mạch làm cây héo nhanh Ban đầu 1 cành bị héo sau héo toàn bộ cây nhưng cây vẫn giữ màu xanh một thời gian, sau

đó cây héo và chết Triệu chứng bệnh héo vàng do nấm F.solani cho thấy cây phát triển

còi cọc, cây bị bệnh lá chuyển màu vàng và có vết bệnh màu thâm đen ở mặt trên của

lá Rễ bị bệnh thường có màu nâu nhạt sau chuyển thành màu nâu đen, cây bị bệnh

nặng rễ thâm đen và chết Bệnh chết nhanh trên hồ tiêu do nấm Phytophthora bị nặng

vào mùa mưa và gây chết hàng loạt vườn tiêu rất nhanh vì vậy gọi là hiện tượng chết

nhanh hồ tiêu Bệnh chết nhanh chủ yếu do nấm Phytophthora kết hợp với nấm

Fusarium và cả tuyến trùng

3.1.1.2 Phân lập VSV gây bệnh

Phân lập từ 150 mẫu VSV gây bệnh và chọn lọc được nguồn bệnh có độc tính

cao làm vật liệu nghiên cứu Kết quả thu thập và phân lập vi khuẩn R.solanacearum, nấm F solani và P.capsici ở bảng 1

Bảng 1 Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV gây bệnh (2006)

Tên VSV

gây bệnh

Môi trường phân lập

Môi trường nhân

Số mẫu bệnh

Số isolates phân lập

so với nòi Fusarium morniforme trên cà chua nên chúng tôi sử dụng nòi F.solani cho

nghiên cứu trong đề tài Kết quả là đã phân lập được 100 isolates của VSV gây bệnh

trong đó có 60 isolates của vi khuẩn R.solanacearum, 36 isolates nấm F.solani và 4 ioslates nấm P.capsici có hoạt tính cao làm vật liệu cho nghiên cứu các thí nghiệm

invitro và lây bệnh nhân tạo cho các thí nghiệm ở nhà lưới

Vi khuẩn R.solanacearum

trên môi trường TZC

Vi khuẩn R.solanacearum

trên môi trường SPA

Nấm Phytophthora trên môi

trường PDA và PSM

Phân lập bào tử nấm P.capsici và F.solani Nấm F.solani trên môi trường PDA

Hình 2 Phân lập mẫu VSV gây bệnh trên môi trường (7/2006)

Kết quả ở hình 2 cho thấy khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn R.solanacearum trên

môi trường TZC có màu phớt hồng ở giữa, xung quanh màu trắng kem, nhầy Trên môi trường nhân nhanh SPA, khuẩn lạc có màu trắng, nhầy bóng

Nấm F solani trên môi trường PDA có màu tím nhạt, sợi nấm bông Bào tử trên

kính hiển vi điện tử có 3-4 vách ngăn, đầu hơi tròn hình oval, bầu dục hoặc dạng quả thận trên môi trường PDA

Nấm P.capsici trên môi trường CA (chứa Rose Bengal) sợi nấm có màu trắng

bông Bào tử nấm hình quả chuỳ, thon dài ở trên đầu bào tử có 1-2 vách ngăn Kích thước túi bào tử rất khác nhau (chiều dài: 32,8 đến 65,8 µm, chiều rộng từ 17,4 đến 38,7 µm) Cành bào tử được hình thành dưới ánh sáng thường phân nhánh

3.1.2 Thu thập mẫu, phân lập và chọn lọc VSV đối kháng tại Việt Nam

3.1.2.1 Thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng năm 2006

Thu thập theo nguyên tắc lấy mẫu rễ sâu cách mặt đất khoảng 2cm, chọn lấy cây

thật khoẻ ở ruộng bị bệnh HXVK hoặc bị bệnh héo vàng do nấm Fusarium Kết quả

thu thập được 9 isolates nhưng có 8 ioslates tạo vòng ức chế trên môi trường KB ở bảng 2

Bảng 2 Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng bệnh trên (2006)

Màu hơi vàng kem, rìa mép

có răng cưa, mọc dạng tia

11,0± 1,2 10,1± 1,1

Đ4 Song Phương, Hà

Tây ở Su hào

Màu hơi vàng kem, rìa mép

có răng cưa, mọc dạng tia

3.1.2.2 Tiếp tục thu thập mẫu và chẩn đoán VSV đối kháng mức phân tử

Năm 2007 thu thập thêm 60 mẫu ở Chí Linh, Hải Dương và Thanh Trì, Hà Nội,

phân lập được 48 isolates và 1 chủng Đ6-1* (để sản xuất chế phẩm BC năm 2007) ở mức phân tử Các ioslates VSV đối kháng được phân loại mức chủng bởi giải mã RNA

ở vùng 16s có hợp tác với viện NIAST, Hàn Quốc Các mẫu VSV đối kháng được thu thập chủ yếu trên rễ của cây cà chua, cây lạc khoẻ trên ruộng bị bệnh HXVK và héo vàng Kết quả phân lập được ở bảng 3

Bảng 3 Kết quả phân loại VSV đối kháng bằng phương pháp sequencce (RNA) 6/2007

Dòng vi khuẩn đối kháng Giải mã RNA Số ioslates

Pseudomonas plecoglossicida 16S ribosomal RNA(CCUG, ) 2

Pseudomonas sp 16S ribosomal RNA(CCUG, ) 3

Enterobacter sp 16S ribosomal RNA(CCBAU) 2

Pantoea agglomerans 16S ribosomal RNA(CCBAU,CCUG) 2

Bacillus subtilis 16S ribosomal RNA(GB03,PUL-A, LQ20, ) 22

Bacillus thuringiensis 16S ribosomal RNA(H27) 2

Bacillus sp 16S ribosomal RNA(F81612) 7

Tsukamurella pseudospumae 16S ribosomal RNA (PAO-48 , ) 1

Tsukamurella sp 16S ribosomal RNA (PAO-48 , 1

Bacillus amyloliquefiens 16S ribosomal RNA (GH3) 3

Bacillus velezensis 16S ribosomal RNA (C7-1) 1

Bacillus cereus 16S ribosomal RNA (C10-1) 2

Kết quả ở bảng 3 cho thấy đã phân loại được 48 chủng vi khuẩn có khả năng là

VSV đối kháng như Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Enterobacter

sp., Các chủng VSV đối kháng sẽ được giải mã bởi sequence cụ thể ở vùng 16S Đặc

biệt là tìm được 2 chủng VSV đối kháng mới ở Việt Nam trong 4 chủng VSV đối

kháng có giá trị trên thế giới như Tsukamurella pseudospumae, Pantoea agglomerans

+ Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng 2006-2007

Kết quả thu thập và phân lập VSV đối kháng năm 2006 và 2007 thể hiện ở bảng 4

Bảng 4 Kết quả thu thập mẫu và phân lập VSV đối kháng trên một số cây ký chủ

Tên cây ký sinh Môi trường

Kết quả ở bảng 4 cho thấy đã thu thập được 100 mẫu VSV đối kháng từ cà chua,

su hào, cà tím, lạc, khoai tây và hồ tiêu và đã phân lập được 48 ioslates có hoạt tính cao

để nghiên cứu và 1 chủng Đ6-1* đã chẩn đoán mức RNA để sản xuất chế phẩm BC

Tổng cộng là 49 isolates được phân lập mức phân tử

3.2 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học hạn chế 3 bệnh ở invitro và nhà lưới

3.2.1 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với 3 bệnh ở invitro

Thử nghiệm khả năng ức chế của các chế phẩm với các VSV gây bệnh ở invitro

Vi khuẩn R.solanacearum thử nghiệm ở mật độ 108 CFU/ml với lượng 250-300µl, vi

khuẩn đối kháng ở mật độ 108 CFU/ml được nhỏ vào lỗ đục sẵn lượng 200µl ở giữa

hộp petri Thử nghiệm với nấm F.solani và P.capsici ở mật độ 108 CFU/ml với lượng

TN

Số lượng tạo vòng ức chế (%)

Đường kính của vòng

ức chế (mm) Đối với

Kết quả ở bảng 5 cho thấy tất cả các chế phẩm sinh học tham gia thí nghiệm đều

tạo vòng ức chế đối với vi khuẩn R.solanacearum, trong đó EXTN-1 tạo đường kính

vòng ức chế lớn nhất (37,5mm), sau đến ESSC và thấp nhất là B17 (31,4mm)

Các chế phẩm cũng tạo vòng ức chế với nấm F solani, có EXTN-1 tạo đường

kính vòng ức chế lớn nhất (32,9cm), sau đến ESSC và thấp nhất là B17 (26,0cm)

Chế phẩm cũng đều tạo vòng ức chế với nấm P.capsici trong đó EXTN-1 tạo

đường kính vòng ức chế lớn nhất (28,3cm), sau đến B17 (23,4cm) và thấp nhất là phân

HCVSVCN (21,3cm)

Hình 3 Các chế phẩm sinh học đã ức chế với VSV gây bệnh

Kết quả thử nghiệm invitro của các chế phẩm sinh học tạo vòng ức chế với vi

khuẩn R.solanacaerum, nấm F solani và P.capsici được ghi nhận bởi hình 3 Kết quả

hình 3 tương tự như bảng 5 cho thấy chế phẩm EXTN-1 đều tạo vòng ức chế đối với cả

3 bệnh ở invitro với đường kính vòng ức chế lớn so với tiêu chuẩn ngành qui định

3.2.2 Thử nghiệm các chế phẩm EXTN-1 đối với VSV gây bệnh ở nhà lưới

3.2.2.1 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng

của hạt cà chua

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt cà chua trong vụ thu năm 2006 ở bảng 6

Bảng 6 Ảnh hưởng của chế phẩm EXTN-1 đến khả năng nảy mầm và

sinh trưởng của hạt giống cà chua Balan Công thức Số ngày mọc

(ngày)

Số lượng hạt

Tỷ lệ Mọc

Chiều cao cây (cm)

Đối chứng 12 200 82,5 17,62 EXTN-1 10 200 98,0 20,92

Kết quả ở bảng 6 cho thấy xử lý chế phẩm EXTN-1, ESSC, phân HCVSVCN số

ngày mọc ngắn hơn 2 ngày so với đối chứng Xử lý chế phẩm EXTN-1 có tỷ lệ mọc

cao hơn (98%) so với đối chứng (82,5%) và chiều cao cây con cũng cao hơn so với đối chứng từ 2-3 cm, cây cao nhất ở chế phẩm EXTN-1 (20,92cm), thấp nhất ở đối chứng

là 17,62cm Như vậy chế phẩm EXTN-1 đã kích thích hạt cà chua mọc tốt hơn

3.2.2.2 Thử nghiệm các chế phẩm sinh học đối với bệnh HXVK và héo vàng trên cà chua ở nhà lưới

+ Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học đối với bệnh HXVK ở cà chua

Các giống cà chua tham gia thí nghiệm là giống PT18 có khả năng chống chịu

bệnh HXVK, giống Balan mẫn cảm với bệnh Thử nghiệm với 5TN trong 2 vụ /năm (vụ xuân hè- 2 thí nghiệm và vụ thu đông - 3 thí nghiệm là vụ sớm, trung bình và vụ muộn) ở nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật năm 2006 Kết quả ghi nhận ở bảng 7

Bảng 7 Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học đến tỷ lệ bệnh HXVK (%) ở cà chua

Tỷ lệ bệnh HXVK (%) Thí nghiệm

Đối chứng EXTN-1 ESSC Phân HCVSVCNThí nghiệm1

13,33 20,00

13,33 20,00 Thí nghiệm 2

6,67 13,33

13,33 20,00 Thí nghiệm 3

13,33 20,00

13,33 20,00 Thí nghiệm 4

PT18

Balan

80,00 93,33

6,67 13,33

6,67 13,33

6,67 13,33 Thí nghiệm 5

13,33 20,00

13,33 20,00 Trung bình 5 TN

PT18

Balan

89,33 100,0

8,00 14,66

10,67 18,67

10,67 18,67

Kết quả ở bảng 7 với 5 thí nghiệm cho thấy với giống PT18 có tỷ lệ bệnh ở công thức đối chứng cao nhất khi tính trung bình 5 thí nghiệm là 89,33%, sau đến ESSC và