nghiên cứu phân lập và chuyển gen nac2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc

Có rất nhiều hợp chất liên quan đến tính chịu hạn của thực vật, một số chất được quan tâm nghiên cứu trong việc đáp ứng với hạn của cây trồng như các phytohormon, amino acid, đường, poly

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán Tại Việt Nam trong 7,3 – 7,4 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước

Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính trạng đa gen Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở thực vật (ví dụ P5CS, RD22…) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích Tuy nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen riêng rẽ được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu hiện nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải Một trong số những yếu tố kích hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF)

Họ nhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ

TF đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật [106] Nhân tố phiên mã NAC có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99] Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường trong đó có hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc

lá, [54], [55], [60], [77], [87], [103], [127], [133] Trên đối tượng cây lạc, các gen

AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành

công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc chịu hạn và

chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72]

Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới Ở nước

ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và

năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn kém [13] Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15] Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều Từ những lí do trên, chúng tôi đã

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu

hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)” nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ

thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục

vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này

2 Mục tiêu nghiên cứu

(1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt (2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá

(3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non

(2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên

quan đến tính chịu hạn của cây lạc

(3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2, tạo

vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình (4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả

năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng proline Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen

(5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô

sẹo và phôi soma

(6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào cây lạc, phân tích các dòng lạc chuyển gen

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Về mặt phân loại, cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea (L.) với 2n=40

NST Theo Krapo Vikas và một số tác giả khác, cây lạc thuộc họ cánh bướm

Fabaceae, thuộc chi Arachis Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ:

Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia và Bersuta kohter Loài phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia và Vulgaris harz loại hình Spanish

Về hình thái, cây lạc gồm các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả lạc

Rễ lạc có rễ cọc và rễ con Trên rễ lạc có nhiều nốt sần được tạo thành do vi

khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng cố định nitơ phân tử

trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất trồng Những nốt sần này tăng nhanh về số lượng và kích thước từ khi cây lạc có 6 - 7 lá đến lúc nở hoa Thân chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm Lá lạc là loại lá kép hình lông chim có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có 2 lá kèm hình dải nhọn bao quanh thân Trên thân chính thường có khoảng 20 lá Khi cây lạc có 5 - 6

lá trên thân chính thì lạc bắt đầu phân hoá các mầm hoa Hoa lạc mọc ra từ các mắt của cành Mỗi vị trí có thể có từ 3 - 5 hoa, khi cây lạc đã có 8 - 9 lá thì hoa nở Lạc

là loại cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi thấy hoa nở là cây đã thụ phấn xong Hoa lạc sau khi thụ phấn thì đâm tia xuống đất hình thành quả (thường gọi là củ) Quả

lạc có hình trụ thuôn thắt lại ở giữa các hạt vỏ quả cứng có gân mạng Mỗi quả có 1

- 3 hạt Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen hoặc trắng [13]

Theo thời gian sinh trưởng của cây lạc người ta chia làm giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) và giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày) Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển của cây lạc từ

240C - 330C Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 120C, từ 150C hạt lạc đã bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 170C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%,

độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở

độ ẩm đất 40% - 50% Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu

cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13]

Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp

Diện tích trồng lạc tập trung nhiều nhất ở vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh rồi tới đồng bằng trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình) Trên thực tế, diện tích trồng lạc ở nước ta còn nhỏ và phân tán, trừ một vài vùng lạc tập trung như Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá) Gần đây cây lạc được khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt ở những nơi đất bạc màu, thoái hoá như vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ, những dải đất ven biển từ Thanh Hoá chạy dài tới giáp Đông Nam Bộ,… đều có thể trồng được lạc Nhiều vùng đất nhất

là ở miền Nam có thể trồng được 2 vụ lạc trong năm [13]

1.1.1.2 Tác động của hạn đến thực vật

Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm đến nhiều nhất hiện nay Hiện tượng khô hạn xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của thực vật, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và mất mùa [7], [23], [27], [36] Các yếu tố bất lợi của môi trường có thể là: nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết và khí hậu Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng

mất nước của cây Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn [7].

Xu thế thay đổi của khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy ra ở nhiều nơi, đây là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng [94] Theo FAO, ước tính

có 70% tiềm năng về năng suất bị mất đi do điều kiện bất lợi của môi trường và sâu bệnh hại, ngay cả ở những quốc gia có nền nông nghiệp phát triển Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45] Tại Việt Nam, trong 7,3-7,5 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5-1,8 triệu ha thiếu nước

Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thuỷ hoá của keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể Hạn ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của bộ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [28], [36], [45]

Để chống khô hạn, cây có thể giữ không bị mất nước, giảm diện tích lá, rút ngắn chu kì sống Bất kỳ sự mất nước nào cũng dẫn đến hiện tượng thiếu hụt nước trong tế bào Nước vừa là nguyên liệu, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra Vì vậy, sự vi phạm chế độ nước ảnh hưởng rất lớn đến mọi quá trình sinh trưởng và phát triển của cây

Về tác động của hạn đến thực vật, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu theo 2 hướng: khảo sát tính chịu hạn của các đối tượng thực vật trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm

Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng Một trong những phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này

[5] Khi gặp hạn, cây lạc cũng chịu ảnh hưởng nặng nề đến quá trình sinh trưởng và phát triển Khi tiến hành nghiên cứu ngoài tự nhiên bằng phương pháp gây hạn nhân

tạo, nhận thấy sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm hàm lượng lipit trong hạt lạc [8] Những quan sát cho thấy, trong điều kiện thí nghiệm gây thiếu nước ở thời kì ra hoa đã làm giảm nghiêm trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở [13]

Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động của hạn ở một số giai đoạn phát triển của các đối tượng thực vật khác nhau như mô sẹo, hạt nảy mầm, cây non 3 lá…Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu

nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in

vitro như ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],…

Nhiều nghiên cứu đã sử dụng PEG, sorbitol, manitol… như những tác nhân gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động của hạn lên thực vật PEG là một hợp chất có ái lực rất lớn với nước, khi đưa vào môi trường nuôi cấy nó không chỉ ngăn cản rễ hút nước mà còn chiếm nước từ rễ cây, khiến cây nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67]

Như vậy có thể thấy, mức độ ảnh hướng của các yếu tố cức đoan trong đó có hạn đến khả năng phản ứng của cây trồng là rất rõ rệt Hiện tượng mất nước cục bộ chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng Các loài thực vật khác nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào bản chất di truyền từ bao thế hệ của chúng Vì vậy, có cây có thể chống chịu được

và tồn tại, có cây sẽ bị chết Ngay trong cùng một loài, các cá thể khác nhau cũng phản ứng ở các mức độ không hoàn toàn như nhau [7]

1.1.1.3 Tác động của hạn đến cây lạc

Cây lạc được trồng trên 35,5 triệu ha ở 82 quốc gia trên thế giới Hơn một nửa số khu vực sản xuất, chiếm 70% diện tích trồng lạc thuộc vùng khô hạn và bán khô hạn, ở những nơi này cây lạc thường xuyên chịu áp lực hạn hán với thời gian và cường độ khác nhau [50], [79], [92], [104] Dự kiến giá trị tổn thất hàng năm trong sản xuất lạc tương đương với hơn 520 triệu USD gây ra bởi hạn [39], [40] Tại Hoa

Kỳ, cây lạc đóng góp hơn 4 tỷ USD cho nền kinh tế của đất nước mỗi năm Tại đây, phần lớn cây lạc được trồng dưới điều kiện nước trời và chỉ có một diện tích hạn chế được tưới tiêu [39] Ở châu Á và châu Phi, cây lạc được trồng trong điều kiện nước trời trong mùa mưa và bị hạn hán liên tục do lượng mưa ít có thể xảy ra tại bất

kỳ thời điểm nào trong chu kỳ sống của cây trồng [40] Ở Việt Nam, sản xuất lạc được phân bố ở tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích các cây công nghiệp ngắn ngày [13]

Ảnh hưởng của hạn với cây lạc được thể hiện theo nhiều cách, ảnh hưởng đến cả số lượng và chất lượng của cây trồng Thâm hụt nước, tùy thuộc vào thời gian xảy ra, có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng giảm đáng kể năng suất lạc bằng cách tác động lên các quá trình sinh lý như cố định đạm, quang hợp, và sự hấp thu canxi cho phát triển vỏ quả [50], [79] Khi cây lạc gặp hạn sẽ làm mất độ ẩm từ quả dẫn đến làm giảm hoạt động sinh lý của hạt, bên cạnh đó ảnh hưởng của hạn hán còn làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng của protein trong hạt lạc [39] Hạn làm ảnh hưởng đến lipid màng tế bào, các phản ứng quang hợp [92], quá trình trao đổi chất, tăng trưởng và năng suất của cây lạc [39] Thiếu hụt về độ ẩm làm cản trở quá trình hình thành nốt sần ở các cây họ đậu Có nhiều bằng chứng cho thấy, quá trình hấp thụ N, P và K của cây lạc bị giảm do hạn hán [39]

Hạn đã ảnh hưởng xấu đến các mối quan hệ về nước, quang hợp, dinh dưỡng khoáng, sự trao đổi chất và tăng trưởng ở lạc Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm giảm hàm lượng chất diệp lục a, b và diệp lục tổng số Sự sụt giảm chất diệp lục là

do sự ức chế tổng hợp chất diệp lục Tích lũy hàm lượng chất khô bị giảm khi tình trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92] Căng thẳng về nước thường xuyên dẫn đến thay đổi về giải phẫu học như giảm kích thước của các tế bào và các khoảng gian bào, vách tế bào dày hơn và phát triển hơn của mô biểu bì, giảm kích thước lá và thay đổi trong hệ rễ [40], [92]

Sự thoát ra của các chất hòa tan là kết quả của hiện tượng tổn thương màng

tế bào Đây là một phản ứng thông thường của mô cây lạc dưới ảnh hưởng của một

số điều kiện bất lợi từ môi trường như nhiệt độ thấp hoặc cao, độ ẩm của đất thấp hoặc độ mặn của đất cao Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng canxi là yếu tố cần thiết

để duy trì tính toàn vẹn của màng Quá trình bổ sung canxi có ảnh hưởng thuận lợi đến mối quan hệ về nước của cây trồng và khả năng chịu khô hạn trong cây lạc

[39], [92] Thiếu nước trong đất ở giai đoạn hình thành vỏ quả có thể làm giảm sự hấp thu canxi cho phát triển vỏ và gây ra hiện tượng vỏ không dày, hàm lượng canxi thấp trong vỏ và hạt Dấu hiệu điển hình của sự thiếu hụt canxi trong hạt bao gồm tim rỗng, hư hỏng phôi hoặc phát triển chồi mầm

Hầu như tất cả các quá trình trao đổi chất đều bị ảnh hưởng bởi sự thiếu nước Hoạt động của các enzyme bị suy giảm do hiện tượng thiếu hụt nước nghiêm trọng gây ra Phức hệ carbohydrate và protein bị phá hủy bởi các enzyme thành các loại đường đơn giản và các amino acid tương ứng Proline, một amino acid, được tích lũy mỗi khi thực vật gặp điều kiện bất lợi về độ ẩm Hàm lượng proline được tích lũy nhiều hơn sau khi cây trồng gặp hạn, do đó hàm lượng này được coi là một chỉ số tốt khi nghiên cứu về cây trồng chịu hạn [39], [40]

Tốc độ tăng trưởng của rễ lạc bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của đất Thiếu hụt về nước kích thích sự tăng trưởng của rễ vào trong đất sâu hơn Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, rễ lạc chiết xuất nước trong đất có hiệu quả ở độ sâu ít nhất là 180 cm trong đất cát mịn Tất cả những đặc điểm này góp phần làm tăng khả năng tránh bị khô hạn của cây lạc [92]

Tác động của hạn đến các giai đoạn phát triển của cây lạc

a) Thời kì trước ra hoa

Trong mỗi thời kì sinh trưởng cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một mức độ nhất định [31] Biểu hiện bề ngoài khi cây lạc bị hạn ở tất cả các thời kì sinh trưởng rõ rệt nhất là ở bộ lá Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và dày hơn, màu lá từ xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá huỷ Ở thời kì trước ra hoa, nhu cầu về nước không cao lắm Cây lạc chịu được hạn nhất vào thời kì trước ra hoa, bị hạn trong thời gian ngắn ở thời kì này chỉ làm chậm sự phát triển và tốc độ sinh trưởng dễ được khôi phục trở lại nếu được tưới đủ ẩm [13], [62], [79]

b) Trong quá trình ra hoa

Những quan sát cho thấy, thời gian bắt đầu ra hoa của cây lạc không bị trì hoãn bởi khô hạn [39] Tuy nhiên thiếu nước trong thời kì ra hoa làm giảm nghiêm

trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở Vì vậy, hạn ở thời kì ra hoa có thể kéo dài thời gian ra hoa – chín của lạc , gây ảnh hưởng đáng kể tới năng suất của lạc [13], [39] Sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm hàm lượng lipit trong hạt lạc [8].

c) Quá trình hình thành quả

Cây lạc có thể gặp điều kiện bất lợi về nước trong suốt quá trình đâm tia và phát triển quả [79] Điều này sẽ dẫn đến làm giảm rõ rệt về năng suất, mức độ giảm phụ thuộc vào từng giống lạc Không chỉ năng suất lạc mà chất lượng của hạt cũng

bị giảm dưới điều kiện hạn hán Tia không có khả năng thâm nhập hiệu quả vào trong đất khô Quá trình đâm tia và vùng rễ trong khu vực đất thiếu nước làm giảm tốc độ tăng trưởng của quả và hạt giống xấp xỉ 30% và giảm trọng lượng cho mỗi hạt từ 563 đến 428 mg [39] Hạn trong giai đoạn hình thành quả và hạt làm giảm năng suất 56-85% [84], [104] Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khô tích luỹ cũng cao nên cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác trong thời kì sinh trưởng Độ ẩm đất có thể giảm đi trong thời kì quả chín (65% - 70%) Độ ẩm quá cao trong thời kì này (trên 90%) thường dẫn đến lốp

đổ và dễ làm quả bị thối, nảy mầm [7], [79]

1.1.2 Cơ chế chịu hạn của thực vật

Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào đặc tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật Tính chống chịu là khả năng của thực vật có thể ngăn ngừa được thương tổn khi bị tác động bất lợi từ ngoại cảnh Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính, làm tăng nhiệt độ cơ thể của cây

và gây mất nước trong cây Tính chịu hạn là khả năng của cây chịu đựng sự đốt nóng và khô [7]

Cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, không chỉ liên quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh trong tế bào, sự điều chỉnh hoạt động của gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật Những thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước làm cho chúng bị mất cân

bằng về thẩm thấu và các cơ chế bảo vệ của thực vật được khởi động để phản ứng với tình trạng thiếu nước cực đoan [45].

1.1.2.1 Cơ chế biến đổi hình thái của đặc tính chịu hạn

Khả năng chịu hạn của thực vật liên quan đến việc thay đổi toàn bộ cơ thể, mức độ mô, mức độ sinh lý và phân tử Biểu hiện của một hoặc sự kết hợp của những thay đổi này xác định khả năng cơ thể thực vật duy trì được sự sống dưới điều kiện độ ẩm giới hạn Những cơ chế bảo vệ của thực vật đã được nhiều nhà nghiên cứu tìm hiểu và phân tích, trong đó cơ chế biến đổi về mặt hình thái trong điều kiện hạn đã được đề cập đến và giải thích [45]

Thực vật có thể phát triển nhanh về mặt hình thái và thúc đẩy quá trình hình thành hạt (cơ chế thoát hạn) Cơ chế này được thể hiện ở việc trưởng thành và ra hoa sớm, thay đổi thời gian sinh trưởng cho phù hợp với giai đoạn thiếu nước Phát triển những giống có thời gian sinh trưởng ngắn là một chiến lược có hiệu quả cho việc giảm thiểu tổn thất về năng suất cây trồng dưới tác động của hạn, giúp cây trồng tránh được những điều kiện bất lợi của môi trường [45], [75]

Các cơ chế làm giảm sự mất nước từ thực vật như kiểm soát sự thoát hơi nước của khí khổng, hoặc duy trì sự hấp thu nước thông qua một hệ thống rễ tốt (cơ chế tránh hạn) [75], [104] Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các đặc điểm chính giúp cho việc tránh hạn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng dưới tác động thiếu nước của môi trường [45], [75], [121, [104]

Có hai cơ chế của cây trồng để làm giảm lượng nước mất đi đó là sự thay đổi

độ mở của khí khổng và làm giảm lượng bức xạ hấp thụ Khi cây gặp hạn khí khổng đóng lại, ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài Khi mất nước nhiều, khí khổng không còn khả năng đóng, nước ồ ạt thoát ra ngoài dẫn đến cây héo và chết Để duy trì cân bằng nước nội bộ có hiệu quả, khí khổng phải đóng chặt và sự mất nước qua tầng biểu bì phải nhỏ [45], [75] Cơ chế làm giảm lượng nước mất đi bằng cách giảm lượng bức xạ hấp thụ đạt được nhờ hoạt động của lá hoặc sự thay đổi đặc điểm phản xạ của lá Sự cuộn lá là chuyển động thụ động cũng có tác động làm giảm sự bức xạ Giảm diện tích bề mặt thoát hơi nước để làm giảm lượng nước mất đi Các cây trồng chịu hạn thường có số nhánh và số lá ít, diện tích lá giảm Sự giảm sinh

trưởng của lá khi thiếu nước làm giảm nhu cầu nước Giảm diện tích lá được coi là một yếu tố quan trọng trong khả năng chịu hạn của cây trồng [45].

Trên phương diện hình thái thì chồi và rễ bị tác động nhiều nhất bởi tình trạng thiếu nước Đây đều là những bộ phận quan trọng của thực vật trong sự thích nghi với hạn hán Trạng thái lá có lông là một đặc điểm chịu khô hạn giúp bảo vệ lá khi nhiệt độ quá cao Lông lá làm giảm nhiệt độ và thoát hơi nước Hình thành lớp cutin và sáp trên bề mặt cũng là một trong những phương pháp hiệu quả về mặt kiểu hình nhằm chống mất nước [45]

Như vậy, thực vật có thể thoát khỏi hạn hán bằng cách rút ngắn thời gian sinh trưởng, và tránh hạn với việc duy trì tiềm năng nước trong mô bằng cách giảm

sự mất nước, tăng cường sự hấp thu nước, hoặc cả hai Một số thực vật có thể làm giảm diện tích bề mặt của họ bằng cách rụng lá hoặc tạo lá nhỏ

1.1.2.2 Cơ chế sinh lý, hóa sinh của đặc tính chịu hạn

Điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT), bảo vệ thẩm thấu, các chất chống oxy hóa có vai trò vô cùng quan trọng hình thành nên một hệ thống bảo vệ có ảnh hưởng đến khả năng chịu hạn của thực vật [45], [73]

Cơ chế hóa sinh có tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện mất nước là: khử độc các sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử, xúc tiến sự phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại Sau khi hạn ngừng tác động, quá trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ gen được bảo tồn khỏi hư hại trong thời gian khô hạn Điều đó có được là do các protein trong nhân với sự tham gia của các protein đáp ứng với stress đặc hiệu, nhờ vậy mà DNA chỉ bị biến đổi khi hạn nặng kéo dài Khi gặp hạn, trong tế bào xuất hiện nhiều H2O2 gây độc cho tế bào và cho cây, vì vậy trong cây có hiện tượng tăng hoạt tính các enzyme oxydoreductase để giải độc Đây cũng là một cơ chế để bảo vệ ti thể khỏi bị tổn thương

Có rất nhiều hợp chất liên quan đến tính chịu hạn của thực vật, một số chất được quan tâm nghiên cứu trong việc đáp ứng với hạn của cây trồng như các phytohormon, amino acid, đường, polyamine, sắc tố và carotenoid… [45]

a) Bảo vệ nước trong tế bào và mô

Cải thiện tình trạng nước trong mô có thể đạt được thông qua sự điều chỉnh

thẩm thấu hoặc thay đổi tính linh hoạt của tế bào Điều này là cần thiết để duy trì hoạt động sinh lý trong thời gian hạn hán kéo dài Thay đổi tính linh hoạt của tế bào

có thể thông qua biến đổi thành tế bào Như vậy, có thể ngăn cản nước đi từ trong tế bào ra ngoài nhờ biến đổi cấu trúc thành tế bào, thu hẹp kênh trao đổi nước [45]

Các cơ chế khác nhau như điều chỉnh ASTT, hình thành abscisic acid… có thể chống chịu đối với tác động của hạn bằng cách duy trì tiềm năng nước trong mô cao Với sự tích tụ các chất hòa tan, khả năng thẩm thấu của tế bào được tăng lên, thu hút nước vào trong tế bào và giúp bảo vệ sức trương Điều chỉnh ASTT giúp duy trì sự cân bằng về nước trong tế bào cùng với sự tích lũy các chất hòa tan trong

tế bào chất, do đó giảm thiểu những tác hại của hạn hán [45], [75], [109]

b) Các chất chống oxy hóa

Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa trong tế bào thực vật bao gồm cả các thành phần thuộc enzyme và phi enzyme Các thành phần có bản chất enzyme bao gồm superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase và glutathione reductase Các yếu tố phi enzyme có cystein, glutathione khử và ascorbic acid [45]

Trong điều kiện môi trường bất lợi, như hạn, hoạt động của các enzyme chống oxy hóa diễn ra mạnh và hàm lượng của các yếu tố phi enzyme rất quan trọng

Enzyme chống oxy hóa là một trong những cơ chế hiệu quả chống lại stress oxy hóa Sự phiên mã của một số gen mã hóa cho enzyme chống oxy hóa như glutathione reductase hoặc ascorbate peroxidase diễn ra mạnh trong suốt quá trình phục hồi từ thời điểm thiếu nước, điều này đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các bộ phận của tế bào khỏi bị hư hại bởi các phản ứng oxy hóa Thiệt hại do oxy hóa trong các mô thực vật được giảm bớt bởi sự phối hợp hoạt động của một hệ thống các chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme Chúng bao gồm β-carotene, acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione khử [45] Sự hình thành carotenes như một phần quan trọng của hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ở thực vật [119] β-carotene trong lục lạp của tất cả các cây xanh liên quan chặt chẽ với hệ thống trung tâm quang hệ I và quang hệ II Ở đây, β-carotene, ngoài chức năng như một sắc tố còn hoạt động như một chất chống oxy hóa hiệu quả và đóng một vai trò duy nhất trong việc bảo vệ chu trình quang hóa [45]

d) Điều hòa sự phát triển của thực vật

Điều hòa sự phát triển của thực vật liên quan đến các phytohormon được sản xuất trong tế bào Những chất có ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý trong cơ thể thực vật như auxin, gibberellins, cytokinin, ethylene và abscisic acid Dưới điều kiện khô hạn, các auxin nội sinh, gibberellins và cytokinin thường giảm, trong khi

đó abscisic acid và ethylene lại tăng [109]

ABA là một chất ức chế sự tăng trưởng và được sản xuất dưới tác động của nhiều nhân tố bất lợi từ môi trường, trong đó có hạn Hàm lượng ABA tăng kéo theo sự đóng lỗ khí làm giảm cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình tổng hợp protein và amino acid có tác dụng tăng khả năng giữ nước của tế bào trong điều kiện khô hạn Tất cả thực vật đáp ứng với hạn và nhiều nhân tố bất lợi khác bằng cách tích lũy ABA ABA thường gặp trong tất cả thực vật có hoa và được công nhận là một loại hoocmon điều chỉnh biểu hiện gen và hoạt động như một tín hiệu cho sự khởi đầu của các qúa trình liên quan đến thích ứng với hạn và và các yếu tố bất lợi khác từ môi trường [45] Tăng nồng độ ABA dẫn đến nhiều thay đổi trong quá trình phát triển, sinh lý và tăng trưởng ABA làm thay đổi tốc độ tăng trưởng tương đối của các bộ phận khác nhau trong thực vật như ức chế phát triển

diện tích lá, phát sinh rễ nhiều và sâu ABA gây ra sự xuất hiện của một loạt các sự kiện phức tạp dẫn đến việc đóng cửa khí khổng, vốn là một yếu tố phản ứng bảo tồn nước Do hiệu quả trong việc khí khổng đóng, ABA có thể kiểm soát tốc độ thoát hơi nước, đến mức độ nào đó, có thể tham gia vào cơ chế chịu hạn ở thực vật [130]

Ethylene từ lâu đã được coi là một hormone ức chế sự tăng trưởng [109]

Ethylene có thể đáp ứng điều hòa hiệu suất lá trong suốt vòng đời của nó cũng như xác định sự khởi đầu của quá trình lão hóa tự nhiên và sự lão hóa gây ra qua trung gian hạn hán Nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng, cơ thể thực vật có thể tối ưu hóa quá trình tăng trưởng và chống chịu stress phi sinh học như hạn hán Phản ứng này

có liên quan đến quá trình tổng hợp ethylene [86]

Polyamine là cation có thể kết hợp với các thành phần anion của màng tế bào, chẳng hạn như phospholipid, do đó bảo vệ màng kép lipid khỏi bị hư hỏng dưới tác động của các yếu tố bất lợi Sự quan tâm trong các nghiên cứu ngày càng tăng về sự tham gia của polyamine trong phản ứng bảo vệ cơ thể thực vật chống lại các yếu tố bất lợi từ môi trường [45] Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất polyamine được tách dòng từ một số loài, và biểu hiện của chúng dưới một số điều kiện bất lợi đã được phân tích [129]

e) Các chất hoà tan và điều chỉnh thẩm thấu

Một trong những khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phổ biến nhất trong thực vật là sản xuất lượng lớn các loại chất hữu cơ hoà tan khác nhau Chúng bảo vệ

cơ thể thực vật khi gặp các yếu tố bất lợi thông qua các biện pháp như điều chỉnh thẩm thấu, khử độc bởi các phản ứng oxy hóa, ổn định màng tế bào và cấu trúc tự nhiên của enzyme, protein Điều chỉnh thẩm thấu là một cơ chế để duy trì mối quan

hệ về nước dưới sự bất lợi về thẩm thấu Nó liên quan đến sự tích tụ của một loạt các phân tử/ion, bao gồm đường tan, proline, glycinebetaine, axit hữu cơ, canxi, kali, ion clo…[7]

Quá trình điều chỉnh thẩm thấu được thực hiện với sự tích lũy các chất hòa tan Trong số này, proline là một trong những chất quan trọng nhất và sự tích lũy proline tự do là một đáp ứng phổ biến của thực vật bậc cao, tảo, động vật và vi khuẩn khi tiềm năng nước thấp [119] Vai trò sinh lý của proline tự do bao gồm bảo

vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về ASTT, bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme khác nhau, chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và bất hoạt các gốc oxy tự do [108]

Glycinebetaine (N, N, N-trimethyl glycine) là một trong những hợp chất hoà tan được nghiên cứu nhiều trong thực vật, động vật và vi khuẩn [119] Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, glycinebetaine đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng cường khả năng chống chịu của thực vật dưới tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học trong đó có hạn hán [90]

Trehalose được biết đến là một disaccharide không có tính khử của glucose, đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và nâng cao sức đề kháng của cơ thể chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường Trong tự nhiên, trehalose được sinh tổng hợp như một cơ chế đáp ứng với các yếu tố bất lợi của nhiều cơ thể sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm, tảo, côn trùng, động vật không xương sống và thực vật bậc thấp [121]

Khả năng sản xuất trehalose, trước đây được cho là không có ở thực vật bậc cao, hiện nay đã có nghiên cứu cho thấy chúng được tích lũy với số lượng lớn ở một số cây dương xỉ chịu hạn và thực vật hạt kín chịu khô hạn Myrothamnus flabellifolia

[45] Sự có mặt với hàm lượng thấp của trehalose đã được chứng minh cả trong thuốc lá và nhiều thực vật bậc cao [66] Vai trò sinh lý của trehalose bao gồm ổn định hiệu suất của các enzyme khử nước, protein và màng lipid, cũng như bảo vệ các cấu trúc sinh học dưới tác động của khô hạn [121]

f) Protein liên quan đến khả năng chịu hạn

Một số hormon hoặc chất kích thích (ví dụ như ABA) sẽ giúp cho cây hoạt hóa một loạt các quá trình sinh tổng hợp các protein và các chất khác ngăn ngừa tác động bất lợi và cây có thể thích ứng với điều kiện này Dựa vào khả năng chống chịu, tính chất và mức độ phản ứng khác nhau của từng loài, người ta có thể chia các protein được sinh ra trong quá trình đó làm 2 loại, các protein có chức năng chống chịu và các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng stress [7]

Tùy trong từng điều kiện môi trường bất lợi khác nhau, thực vật sản sinh ra

những loại protein có chức năng chống chịu khác nhau Ví dụ đối với khô hạn, có thể biểu hiện những loại protein như: môi giới phân tử (MGPT)- molecular chaperone, LEA protein, protein kênh chuyển nước qua màng - aquaporin, proline, transporters, các enzyme loại độc tố (detoxification enzymes), protein chống đông lạnh (antifreeze proteins), protein gắn với mRNA (mRNA binding protein), enzyme chủ chốt trong sinh tổng hợp các chất điều hoà áp suất thẩm thấu và các loại protease khác nhau (hình 1.1) [101].

Hình 1.1 Chức năng của các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn [101]

Để biểu hiện bất kỳ gen nào cũng đều cần có sự hoạt hóa promoter của chúng

Hệ thống tín hiệu nhận biết từng loại stress khác nhau, bao gồm nhiều chất cảm ứng

có nguồn gốc protein hoặc là các chất khác Đó là các yếu tố điều hòa phiên mã như MYB, MYC, NAC, DREB, protein kinase như MAP kinase Các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng hạn như protein kinase, TF và các enzyme trong chuyển hoá phospholipid

Protein chức năng như aquaporins có khả năng tạo điều kiện thuận lợi và điều chỉnh trao đổi nước thụ động qua màng Chúng là thành viên thuộc một họ

protein bảo thủ cao trong màng tế bào Ở thực vật, aquaporins có mặt nhiều trong màng sinh chất và trong màng không bào Phân tích cấu trúc của aquaporins đã cho thấy cơ chế chung của protein vận chuyển nước qua màng Aquaporins có thể điều chỉnh tính thấm của màng tế bào theo cả hai hướng phụ thuộc vào ASTT [7]

Aquaporins giữ một vai trò đặc biệt trong việc kiểm soát vận chuyển nước qua màng

Protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) có chức năng môi giới phân tử được gọi là chaperone Chúng có một vai trò quan trọng việc tái tạo lại cấu trúc không gian đúng của protein mới tổng hợp, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự hủy hoại của protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu cho sự phân giải protein bị biến tính Protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử thấp thường được sản xuất để đáp ứng với các yếu tố bất lợi của môi trường [7], [119] HSP chiếm trên 1% protein tổng số trong lá, rất đa dạng và có ở hầu hết các loài thực vật Chúng không những xuất hiện khi gặp nóng đột ngột mà còn luôn có mặt trong quá trình sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hóa của mô, thời kỳ sinh sản, cũng như được tổng hợp ở điều kiện cực đoan khác của môi trường trong đó có hạn [7]

Protein ổn định màng tế bào và protein biểu hiện trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi (LEA) là những nhóm protein khác chịu trách nhiệm quan trọng trong việc đáp ứng với khả năng chịu hạn Thuộc về nhóm protein này có thể

kể đến dehydrins Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cô lập ion được tập trung trong quá trình mất nước của tế bào Những protein này giúp bảo vệ protein khỏi sự suy giảm và proteinases, có chức năng loại bỏ protein hư hỏng và biến tính Dehydrins thuộc nhóm protein LEA, được tích lũy để đáp ứng với sự mất nước và nhiệt độ thấp Trong cấu trúc của các protein này có vùng bảo thủ cao giàu Lysine được dự đoán tham gia vào tương tác kỵ nước, dẫn đến làm ổn định cấu trúc của các đại phân tử [107]

Nhiều protein biểu hiện nhằm đáp ứng với khô hạn trong đó có protein thuộc nhóm LEA đã được Ramesh và đtg (2007) nghiên cứu Các tác giả đã chứng minh được sự liên quan về chức năng của các protein này với việc phát triển các giống lạc có khả năng chịu hạn Trong nghiên cứu, một số protein liên quan đến sự

bất lợi về nước trong kiểu gen cây lạc đã được xác định, đánh giá vai trò của các protein này trong cây lạc để thích nghi với khí hậu và thích ứng với hạn hán [91]

1.1.2.3 Cơ chế phân tử của đặc tính chịu hạn

Thực vật phản ứng và thích ứng, sống sót dưới tác động của sự khô hạn bằng cách đáp ứng khác nhau về mặt hình thái, sinh lý, hóa sinh và phân tử Khả năng chịu hạn được xem như thực vật có khả năng phát triển, ra hoa và cho năng suất kinh tế dưới điều kiện không được cung cấp nước tối ưu [45] Hạn hán làm ảnh hưởng đến các mối quan hệ về nước của thực vật ở mức độ tế bào, mô và cơ quan, gây ra những phản ứng đặc hiệu cũng như không đặc hiệu, phản ứng thích ứng hoặc gây thiệt hại [23], [28]

Biểu hiện gen có thể được kích hoạt trực tiếp dưới tác động của các yếu tố bất lợi hoặc là kết quả của các đáp ứng thứ cấp khi bị thương tổn Tuy nhiên khả năng chống chịu hạn là một hiện tượng phức tạp liên quan đến hoạt động của nhiều gen

[7] Khi gặp hạn, một loạt các cơ chế bảo vệ được khởi động thông qua việc tiếp nhận các tín hiệu được cơ thể thực vật nhận biết Khi đó, những thay đổi trong biểu hiện gen (điều chỉnh lên và xuống) sẽ diễn ra Những gen khác nhau được cảm ứng

để đối phó với hạn hán ở mức độ phiên mã, các sản phẩm của gen được cho là có chức năng trong chống chịu hạn [101]

Có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng đối với điều kiện sinh thái phi sinh học bất lợi Xu hướng thứ nhất là tìm những gen liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu hạn, lạnh, ngập úng hay phèn

mặn…(Ví dụ RD29A), xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo

hướng các yếu tố điều khiển như các nhân tố phiên mã [1]

Các yếu tố cực đoan của môi trường trong đó có hạn tác động lên các nhân tố phiên mã (ví dụ CBF1 – hình 1.2), tiếp theo, nhân tố phiên mã hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với DNA nhờ các yếu tố cis phản ứng với sự mất nước (DRE –

drought responsive element) trên promoter của gen đích (ví dụ RD29A – hình 1.2)

tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trường đến việc hoạt hóa các nhân tố phiên mã và tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen đích ở giai đoạn phiên mã Trong quá trình này, có thể đồng

thời tham gia nhiều gen, tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên

mã cũng như protein liên quan đến tính chống chịu

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn [76]

Việc tìm kiếm gen liên quan đến khả năng chịu hạn theo xu hướng thứ nhất được nhiều phòng thí nghiệm chú ý trên nhiều đối tượng khác nhau Ví dụ như ở Cỏ

Ba lá, lúa mỳ, lúa mạch, ngô, Arabidopsis, lúa nước, đậu tương, lạc…Hai nhóm gen

được mô tả nhiều và chi tiết là nhóm LEA của cây lúa mạch và nhóm RAB của cây lúa nước Nhóm thứ nhất mã hóa những protein xuất hiện vào thời kỳ muộn của quá trình hình thành phôi sau khi thụ phấn và đó là những protein góp phần bảo vệ phôi trong quá trình ngủ và chịu hạn của phôi trong hạt khô Nhóm thứ hai liên quan đến tác động ức chế sinh trưởng tế bào của ABA khi thực vật gặp điều kiện bất lợi Các gen RAB phản ứng với ABA ngoại sinh và nội sinh tạo ra những protein có chức năng ức chế và bảo vệ Đây là hai nhóm gen được chú ý nhiều để sử dụng trong công nghệ gen [1]

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò làm tăng tính chống chịu khô hạn của các gen mã hóa cho protein LEA như gen mã hóa cho protein Em của lúa

mỳ, đậu xanh, đậu tương, lúa gạo [7] Chức năng của chúng được dự đoán dựa trên khả năng giữ nước tốt của tế bào Gen mã hóa cho protein D7 từ cây bông, protein

HVA1 từ đại mạch có chức năng cô lập ion trong quá trình mất nước Gen mã hóa cho LE25 từ cà chua và D113 từ cây bông, protein của các gen này có thể thay thế

vị trí nước trong màng tế bào để giữ ổn định cấu trúc này [7] Gen OsLEA3-1 ở lúa

đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển

của promoter CaMV35S [124] Đặc điểm chung của các protein LEA là chúng có các chuỗi peptide ưa nước cao nên một số LEA protein thích hợp với vai trò mang nước, những protein này có thể giúp duy trì nhu cầu nước trong tế bào Chúng có thể xem như các chất tan thích hợp đóng vai trò duy trì cấu trúc của không bào khi thiếu nước [7]

Phần lớn dehydrin đều được tổng hợp khi cảm ứng với điều kiện mất nước Gen mã hóa cho protein RAB 18 ngăn ngừa sự mất nước trong tế bào khí khổng ở

lá, còn gen mã hóa cho protein LTI29 và ERD 14 tăng cường giữ nước trong rễ Khi gặp hạn hoặc bị mất nước, chúng đều được tổng hợp với lượng đáng kể ở

Arabidopsis Gen mã hóa cho protein DHN13 của đại mạch có trong hầu hết các mô

tế bào ở điều kiện bình thường cũng như khi gặp hạn, lạnh và xử lý ABA, còn protein DHN4 chỉ có trong hạt, khi xử lý ABA và mất nước Các gen dehydrin khác

của đại mạch như Dhn1, Dhn 3, Dhn 4, Dhn 6, Dhn 9 đều có sản phẩm phiên mã rõ

rệt khi mất nước và xử lý ABA [7], [94]

Nhiều gen mã hóa cho enzyme tham gia vào các phản ứng với hạn đã được nghiên cứu về mặt chức năng Các độc tố xuất hiện dưới ảnh hưởng của các yếu tố bất lợi thường do nguyên nhân có sự tích lũy các phân tử phản ứng lại với các yếu

tố bất lợi như aldehyde Các phân tử này có thể là nguyên nhân phân giải lipid, làm biến đổi các protein và acid nucleic Dưới tác động của aldehyde dehydrogenase (ALDH), aldehyde có thể bị biến đổi thành carboxylic acid không độc Gen mã hóa cho ALDH xuất hiện trong tất cả các cơ thể sinh vật cho thấy sự quan trọng của nó trong các chức năng sinh học nói chung Sự cân bằng aldehyde là rất cần thiết trong quá trình bảo vệ thẩm thấu khỏi các yếu tố bất lợi Gen BADH (betaine aldehyde dehydrogenase) cũng đóng vai trò quan trọng trong sự chống chịu của thực vật với hạn và muối Gen JcBD1 thuộc nhóm này đã được biểu hiện, sau khi đánh giá cho thấy khả năng chịu hạn cao hơn so với đối chứng [131] Trong các chất tan, proline

được xem là chất đóng vai trò chính trong điều chỉnh thẩm thấu ở các cây chịu khô hạn hoặc đất nhiễm mặn Vai trò của các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp proline liên quan tới khả năng chịu hạn của thực vật nói chung

và cây trồng nói riêng đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến [42] Hầu hết các amino acid tăng lên khi cảm ứng với điều kiện bất lợi của môi trường nhưng proline tăng lên rõ rệt hơn cả Khi tế bào bị mất nước nghiêm trọng hàm lượng proline tăng lên 48 lần so với đối chứng Khi xử lý với muối, cây tích lũy proline một cách từ từ

và tăng gấp 7 lần so với đối chứng sau 72 giờ xử lý [112]

Rất nhiều gen được phân lập và biểu hiện có mối quan hệ với tính kháng hạn

đã được chứng minh như trehalose6-phosphate-synthase (gen TPS) phân lập từ cây bông [66], gen CaAMP1 từ cây tiêu [69], gen TaAIDFFa từ lúa mỳ [126], gen codA

từ cây khoai tây [20], gen mã hóa chaperonin từ cây đậu tương [10] … Đã có nhiều công bố nghiên cứu về gen mã hóa cho cystatin và thảo luận về mối liên quan của cystatin với khả năng chống chịu của thực vật như khả năng chịu hạn, lạnh, mặn Gen mã hóa cystatin đã được phân lập từ cây lạc [16], đậu đũa [41], Arabidopsis

[132],…

Theo xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo hướng các yếu tố điều khiển, ví dụ như các nhân tố phiên mã (bZIP, MYB, MYC, EREBP/AP2, NAC, DREB và zinc fingers) Hiện nay nhóm gen mã hóa cho các yếu tố điều khiển quá trình phiên mã của những gen liên quan đến khả năng kháng

hạn ở thực vật đang rất được quan tâm nghiên cứu Gen NAC (mã hóa cho nhân tố

phiên mã NAC) khi được chuyển vào cây không chỉ biểu hiện tính chống chịu lại cùng lúc với nhiều điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh mà còn ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển và năng suất cây trồng [57] Gen TERF1 điều khiển tổng hợp

ethylene responsive factor (ERF) protein đã được chuyển vào lúa cho thấy biểu hiện khả năng chịu hạn của cây và sống sót trong môi trường có nồng độ muối cao [48],

ngoài ra gen TERF1 cũng đã được phân lập và chuyển gen, giúp cây thuốc lá tăng

cường khả năng chống chịu trong điều kiện hạn [130] Gen điều khiển tính chịu hạn

DREB (Dehydration responsive element/C repeat) được phân lập từ các cây trồng

nhau như đậu tương, súp lơ, cà chua, lúa, lúa mỳ Biểu hiện của gen DREB1/CBF1,

DREB1/CBF2, DREB1/CBF3 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn,

mặn và lạnh [56] Biểu hiện của gen mã hóa DREB2A hoạt hóa sự biểu hiện của

nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [95]

1.2 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN

1.2.1 Nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

Sự phản ứng của cơ thể thực vật ở các mức độ khác nhau trước tác động của các yếu tố cực đoan đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu hiện nay Sự phản ứng đầu tiên của tế bào khi mất nước là xuất hiện ABA Trong trường hợp này các gen đặc hiệu được biểu hiện, một loạt các chất được tổng hợp mới trong tế bào Những yếu tố cực đoan khác nhau (hạn, mặn, lạnh) tạo ra những tín hiệu như nhau

và sự phản ứng của cơ thể sống đối với các yếu tố cực đoan của ngoại cảnh phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi

và giai đoạn của sự phát triển, dạng các cơ quan hoặc tế bào [7], [101]

Hình 1.3 Hệ thống điều hòa phiên mã của các tín hiệu stress phi sinh học

và sự biểu hiện gen [101]

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo hướng các yếu tố điều khiển, ví dụ như các nhân tố phiên mã nhằm tiếp cận cách điều hòa tổng thể hơn của thực vật khi gặp điều kiện bất lợi trong đó có hạn hán [1] Nhân tố phiên mã là các protein tham gia điều khiển mức độ biểu hiện gen thông qua việc gắn vào các trình tự DNA ngắn đặc hiệu trong vùng promoter của các gen đích và làm tăng hoặc giảm mức độ biểu hiện của chúng Gen mã hoá cho TF có chứa motif gắn DNA (bZIP, MYB, MYC, EREBP/AP2, NAC, DREB và zinc fingers) được mô tả hoạt hoá bởi tác động của các yếu tố bất lợi Tiếp theo đó, chúng có vai trò điều hoà các gen chức năng (hình 1.3) [101].

Vai trò của các yếu tố phiên mã trong phản ứng với các điều kiện bất lợi đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến [19], [33], [99], [116] Hệ gen thực vật có khoảng 7% trình tự mã hóa cho họ nhân tố phiên mã [116] Trong hệ gen của cây

Arabidopsis có khoảng 1500 nhân tố phiên mã tham gia vào đáp ứng biểu hiện gen

khi gặp các nhân tố tác động bất lợi Nghiên cứu trên cây Arabidopsis và rất nhiều

các cây trồng khác đã cho thấy, có một số con đường đáp ứng một cách độc lập với các áp lực từ môi trường (bao gồm cả con đường phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA) Như vậy, đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi được điều khiển ở mức độ phiên mã bởi một hệ thống điều hòa gen vô cùng phức tạp [101]

ABA được xem là chất có vai trò điều hòa chính khi cây trồng gặp các yếu tố bất lợi, đặc biệt là trong khả năng chống chịu với hạn hán của thực vật, cùng phối hợp với một hệ thống điều hòa biểu hiện gen phức tạp cho phép thực vật đối phó với việc thiếu nước [37], [65] Phụ thuộc vào phản ứng với ABA những đường dẫn truyền tín hiệu chia thành 2 loại

Nhân tố phiên mã và con đường dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc ABA

MYB - DNA binding domain là một nhóm nhân tố phiên mã rất đa dạng ở các loài Eukaryote Vùng MYB là trình tự DNA trên promoter của các gen chịu hạn,

trên promoter có trình tự để các protein MYB, MYC nhận biết Ở Arabidopsis, ATMYB2 nhận biết trình tự TGGTTAG trên promoter để hoạt hóa gen rd22 (dehydration –responsive gene rd22) trong điều kiện mất nước [18] Đây là gen cảm

ứng với ABA Còn gen AtMYB60 biểu hiện trong tế bào khí khổng, giúp cho tế bào

thực vật vượt qua được tình trạng mất nước [7] Vùng gắn DNA – MYB (MYB – DNA binding domain) được biết đến lần đầu tiên ở dạng v-myb oncogene (gen gây

ung thư) của virus gây bệnh ung thư tủy xương (Myeloblastosis) ở loài chim [7]

Protein MYB đặc trưng bởi sự có mặt của 2 hoặc 3 Myb motif, mà mỗi motif này chứa cấu trúc xoắn chuyển xoắn (helix-turn-helix) với 3 vị trí gốc Trp Protein MYB của động vật có chứa 3 Myb motif được ký hiệu là R1, R2, R3, trong khi đó ở

thực vật chỉ chứa 2 Myb motif R2, R3 [18]

Protein MYC là nhân tố phiên mã được biểu hiện cảm ứng do ABA và nhận biết trình tự đặc trưng MYC trên promoter các gen chịu hạn Protein MYC được đặc trưng bởi cấu trúc domain cơ bản basic helix-loop-helix (bHLH) bHLH có thể nhận biết được trình tự dạng CANNTG trên promoter (N – nucleotide bất kỳ) Tuy vậy,

hai nucleotide NN đặc trưng cho từng vùng Kết quả nghiên cứu promoter rd22 của

Arabidopsis trên cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, protein rd22BP1 chỉ nhận biết

trình tự CACATG đầu tiên phản ứng với hiện tượng mất nước, còn trình tự CACATG thứ hai trong vùng này lại có chức năng ức chế [7]

Nhóm nhân tố phiên mã AREB/ABF (bZIP) nhận biết yếu tố ABRE (ABA – responsive element) - PyACGTGGC trong vùng promoter Hoạt hoá gen phản ứng

với sự mất nước RD29B, RD20A ABRE lần đầu tiên được phân lập từ gen Em của lúa mỳ và từ rab của lúa gạo Protein gắn với Em (EmBP) mã hoá cho bZIP

(leucine zipper motif) protein Trình tự ACGT là điểm gắn đặc hiệu của bZIP protein [47], [73], [101]

Nhân tố phiên mã và con đường dẫn truyền tín hiệu không phụ thuộc ABA

Nhận biết yếu tố DRE- yếu tố điều hòa phản ứng với sự mất nước là tên của

trình tự dài 9 bp: TACCGACAT trên promoter Trong đó, vùng quan trọng nhất của DRE motif là vùng lặp lại giàu C (CRT – C repeat) - CCGAC Các yếu tố protein gắn với trình tự DRE (DRE binding proteins - DREBs) ở vùng promoter đã được nghiên cứu và phân lập Những protein này chứa các vùng bảo thủ như các protein EREBP (tham gia biểu hiện ethylene-responsive gene) và AP2 (Apetala2) - tham gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực vật có hoa Chúng phản ứng rất nhanh với các yếu tố cực đoan trước khi xuất hiện ABA Ví dụ như promoter của

gen phản ứng với sự mất nước rd29A ở Arabidopsis [73], [95], [101]

NAC (NAM, ATAF và CUC2) và HD-ZIP transcription factors liên quan đến

sự biểu hiện của gen ERD1 (Early responsive to dehydration stress 1) trong điều

kiện hạn [33], [76], [77] Nhân tố phiên mã NAC nhận biết các trình tự đặc trưng

phản ứng với sự mất nước trong promoter của gen ERD1 [113]

Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã xác định được sự tồn tại của cả con đường phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA trong đáp ứng với các yếu tố bất lợi ở các

họ nhân tố phiên mã chức năng như AP2/EREBP, NAC/ZF-HD, DREB/CBF Ngoài những nhân tố phiên mã đã biết này, một số lượng lớn nhân tố phiên mã khác

có liên quan đến khả năng đáp ứng với điều kiện bất lợi cũng đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tăng cường khả năng chống chịu ở thực vật [33]

Một số gen mã hóa cho TF được phân lập và chuyển vào thực vật nhằm mục đích kích hoạt một lúc nhiều gen có phản ứng với điều kiện cực đoan, làm tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng và tạo ra cây chuyển gen chống chịu tốt

1.2.2 NAC và gen mã hóa NAC liên quan đến tính chịu hạn

1.2.2.1 Nhân tố phiên mã NAC liên quan đến tính chịu hạn

Họ NAC là một trong những họ nhân tố phiên mã đặc trưng lớn nhất trong

hệ gen thực vật với 106 và 149 thành viên trong cây Arabidopsis và lúa, 101 thành

viên trong hệ gen đậu tương [68], [106] Chúng có một vùng bảo thủ cao nằm trong khu vực vùng đầu N (NAC domain – được chia ra thành 5 phân vùng bảo thủ từ A đến E) và một vùng điều hòa phiên mã hay biến đổi ở đầu C (có thể kích hoạt hay

ức chế sự phiên mã của nhiều gen đích) [54], [106],[71] Tên NAC được bắt nguồn

từ ba chữ cái đầu tiên của tên mô tả nhân tố phiên mã chứa miền NAC, cụ thể là

NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và

CUC (cup-shaped cotyledon) Các yếu tố cis của nhân tố phiên mã NAC [NAC

recognized sequence (NACRS)] cũng đã được xác định trong Arabidopsis [33], [113]

Nhân tố phiên mã NAC liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật như sự phát triển mô phân sinh ngọn, sự phát triển hình dạng hoa, hình thành lá và già hóa, phát triển phôi, phát triển hạt, sinh tổng hợp

flavonoid, phát triển rễ bên [52], [99] Một số nhân tố phiên mã NAC tham gia trong tín hiệu hormone qua trung gian của auxin [125], abscisic acid [46], [48],

gibberellic acid [65], salicylic acid [38], methyl jasmonate [32] cũng như trong các đáp ứng đối với stress sinh học và phi sinh học, chẳng hạn như nhiễm nấm, hạn hán, lạnh, độ mặn cao [76], [99], [123] Nhân tố phiên mã NAC cảm ứng bởi stress đã được chứng minh là liên kết với các nhân tố điều hòa cis, NACRSs (NAC recognition sequences - trình tự nhận biết NAC), làm tăng các gen phản ứng với stress khác và kích hoạt biểu hiện của chúng [113]

Nghiên cứu toàn diện đầu tiên về nhân tố phiên mã NAC đã được Olsen đề cập đến vào năm 2005 [81] Với sự hỗ trợ của tin sinh học trong phân tích genome, các nhà nghiên cứu dự đoán 20 - 25% gen NAC có chức năng đáp ứng trong ít nhất một hoặc một vài yếu tố bất lợi [106]

1.2.2.2 Đặc điểm cấu trúc và một số vùng chức năng của NAC

Protein NAC chứa một vùng bảo thủ NAC (NAC domain) ở đầu N (khoảng

150 amino aicd) và một vùng điều hòa phiên mã (transcription regulatory domain- TR) ở đầu C (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ protein NAC [83]

a) NAC domain

Khả năng gắn DNA (DNA-binding (DB)) của nhân tố phiên mã NAC nằm trong phạm vi miền NAC domain, vùng này có thể được chia thành năm phân vùng (A-E; Hình 1.4) Phân vùng bảo thủ C, D có khả năng liên kết với DNA, trong khi phân vùng A có thể tham gia vào sự hình thành của một dimer chức năng, phân vùng B và E có thể chịu trách nhiệm cho sự đa dạng về chức năng của các gen NAC

[59], [82] Val119 - Ser183 (β 4-6, phân vùng D-E), Lys123 và Lys126 (β 4-5, phân vùng D), cùng với Lys79, Arg85 và Arg88 (β 1-2, phân vùng C) đã được xác định

có vai trò rất quan trọng cho DB, Lys115 có vai trò quan trọng trong gắn DB và

định vị trong nhân [34], [43], [82] Một phần tín hiệu định vị trong nhân ở phân vùng D và đóng vai trò quan trọng đối với vận chuyển vào nhân [82], [115] Phân vùng D ở một số miền NAC chứa một vùng điều hòa không ưa nước (Hydrophobic negative regulatory domain - NRD) đóng vai trò ngăn cản hoạt động phiên mã [51]

Tính không ưa nước liên quan một phần với cấu trúc 'LVFY' trong vùng này có thể giải thích cho sự ức chế phiên mã

b) Vùng điều hòa phiên mã (Transcription regulatory regions - TRRs)

Vùng TRR, thường nằm ở đầu C của nhân tố phiên mã NAC, có thể hoạt hóa hoặc ức chế quá trình phiên mã [106], [113] TRR có một số nhóm motif đặc biệt rất giàu các đoạn lặp của threonine-serine, proline-glutamine, hoặc có tính axit, ví

dụ như TRR trong protein NAC của lúa có chứa 10 motif ở đầu C [44] Một số nghiên cứu thấy rằng các motif này bảo thủ ở các phân nhóm trong cùng một phân

họ NAC nhưng thay đổi ở các phân họ khác nhau Như vậy, vùng này đem lại sự thay đổi về chức năng cho mỗi protein NAC Tính linh hoạt của TRR cho phép chúng tương tác với các protein đích khác nhau Một số protein NAC có khả năng gắn protein trong TRR của chúng [106] Một motif xuyên qua màng (transmembrane - TM) dạng xoắn α có mặt trong một số protein NAC chịu trách nhiệm bám vào màng sinh chất hoặc màng của mạng lưới nội chất [98]

c) Protein NAC

Cấu trúc vùng NAC (ANAC019) đã được xác định bằng phân tích tia X (Hình

1.5) Vùng NAC không có bất kỳ motif DB nào được biết đến nhưng một mặt của vùng này rất giàu điện tích dương và được cho rằng đã tham gia vào DB [43], [81]

Nếp gấp trong miền NAC được nhị phân hóa (dimerization) qua Leu14 - Thr23 và một phần của Glu26 - Tyr31, hình thành một phiến β đối song song tại các bề mặt dimer chung và được làm ổn định bằng cầu liên kết được hình thành bởi Arg19 và Glu26 trong môi trường chứa các ion muối [34], [43]

Hình 1.5 Cấu trúc vùng bảo thủ NAC [81]

Vùng trung tâm – Bề mặt dimer: Vùng bảo thủ NAC bao gồm một phiến β đối song

song xếp chặt với một xoắn α ở đầu N trên một mặt và một xoắn ngắn bên mặt còn lại Một monomer trong dimer có màu sắc chứa: hai xoắn chính màu đỏ, phiến β đối song song chính màu xanh, xoắn ngắn phụ, tiếp theo là dải màu vàng và màu lục lam tương ứng Monomer còn lại (màu xám) minh họa các vị trí của các amino acid tương ứng với các đột biến có khả năng gây biến đổi trong nam (vị trí hình

tròn màu xanh), trong allele cuc1-1 (màu tím) và trong allele cuc1-4 (màu hồng)

Protein NAC đã được chứng minh có cấu trúc homo - và heterodimerize, khả năng hình thành dimer đã được xác định vị trí ở vùng NAC Vùng NAC của ANAC019 tạo thành một dimer khi ở trong dung dịch và điều này phù hợp với các dimer thấy ở trạng thái tinh thể Vị trí tiếp xúc của dimer liên quan đến vùng bảo thủ ở đầu N của miền NAC và bao gồm các tương tác kỵ nước, một phiến β ngắn đối song song Cầu liên kết được hình thành bởi 2 amino acid bảo thủ arginine-19

và glutamate-26 Khi hai yếu tố này được thay đổi thành alanine, vùng NAC của ANAC019 được tìm thấy trong cấu trúc mono [43], [83]

1.2.2.3 Vai trò điều hòa của nhân tố phiên mã NAC

a) Điều hòa phiên mã

Phiên mã là bước đầu tiên mà tại đó hoạt động của một gen có thể được điều khiển bởi quá trình gắn của các TF đặc trưng với vùng điều hòa trong promoter của chúng Biểu hiện của các gen NAC trong đáp ứng với các yếu tố bất lợi có thể được kiểm soát chặt chẽ bởi một số yếu tố tác động cis trong vùng promoter (Hình 1.6)

Hình 1.6 Sơ đồ quá trình điều hòa của NAC protein [107]

Mặc dù các trình tự nhận biết của đa số TF đã có trong NAC promoter nhưng

cơ chế điều hòa chính xác của chúng còn chưa được biết đến một cách rõ ràng Bao gồm các vị trí gắn ABRE, DREs, MYB và MYC, W-Box, JA và SA [78], [81]

Trình tự ABRE trong promoter của OsNAC5 và OsNAC6 cần thiết cho đáp ứng bởi ABA Sự biểu hiện của OsNAC3 và SNAC1 khi gặp các điều kiện bất lợi có thể được gây ra bởi DREB (DRE - binding) [110], trong khi đó sự biểu hiện của ONAC045 là do sự có mặt của vùng gắn MYB và MYC trong promoter [133]

Một số loại nhân tố phiên mã DREB và AREB đã được dự đoán có chứa vị trí bám của các NAC protein trong vùng promoter của chúng khi gặp điều kiện bất lợi Protein DREB và AREB có thể kiểm soát quá trình phiên mã của gen NAC

Vai trò của NAC TF trong đáp ứng với stress phi sinh học đã được tìm hiểu qua nhiều nghiên cứu Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng các gen NAC có thể được điều hòa bởi con đường phụ thuộc vào ABA hoặc không phụ thuộc vào ABA do sự

khác biệt của các yếu tố trong promoter của chúng ANAC019 và ANAC055 được

điều hòa bởi cả ABA và JA [32] Hoạt động của ATAF1 được cảm ứng bởi tín hiệu

JA / Et (Ethylene) [106] Biểu hiện của ATAF2 được gây ra bởi tình trạng mất nước,

JA và SA, nhưng không phụ thuộc vào ABA [38] Sự tham gia của SiNAC không phụ thuộc ABA đã được xác định nhằm đáp ứng với stress phi sinh học [88]

b) Yếu tố tác động cis và các gen đích của nhân tố phiên mã NAC

NAC TF kiểm soát quá trình phiên mã của gen bằng cách liên kết với một trình tự nhất trí trong promoter của gen đích (Hình 1.7)

Hình 1.7 Sơ đồ nhân tố phiên mã NAC trong điều hòa phiên mã gen

với stress phi sinh học [106]

Những nghiên cứu đầu tiên đã chỉ ra rằng một số protein NAC liên kết với đoạn 21bp trong promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV), hai trình tự trung tâm CGTA và CGTC trong đoạn đã được xác định [43] Sau đó, vùng trình tự nhận biết của NAC TF (NAC recognition site - NACRS) CGT(G/A) và CACG được xem như các motif trung tâm của DB đã được xác định trong promoter của gen cảm ứng

bởi hạn ERD1 (Early response to dehydration1) ở Arabidopsis [113], những trình

tự này được gọi chung là NACBS (NAC binding sites)

Nhân tố phiên mã NAC kích hoạt hoạt động của các gen chức năng mã hóa cho protein tham gia vào quá trình điều chỉnh thẩm thấu, loại bỏ các phản ứng oxy hóa và giải độc, bảo vệ các đại phân tử và ubiquitin Nhóm thứ hai của các gen đích bao gồm protein điều hòa thực hiện chức năng trong việc truyền tín hiệu và điều khiển biểu hiện gen Sự có mặt của NACRS trong promoter của một số gen làm cho

chúng có khả năng điều khiển trực tiếp các gen đích của NAC TF (ví dụ gen ERD1

và R2R3-MYB) Tầm quan trọng của NAC TF trong đáp ứng sinh lý ở thực vật dưới

điều kiện bất lợi ngày càng được nhiều nghiên cứu chú ý và đánh giá cao [106]

1.2.2.4 Gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC ở một số cây trồng

Như đã biết, họ NAC là một trong những họ TF đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật [106] Nhiều nghiên cứu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen

liên quan đến hạn hán trong họ NAC TF như: ANAC019, ANAC055, và ANAC072

từ Arabidopsis [113] Kết quả tách chiết ANAC019 từ mRNA của Arabidopsis thu được đoạn mã hóa dài 1232bp (Mã số: XM_002894363) Gen ANAC055 được phân lập từ mRNA dài 1274bp (Mã số: NM_112418) ANAC072 còn được biết đến với

tên gọi RD26 (responsive to desiccation 26) được phân lập từ mRNA dài 1718bp (Mã số: NM_118875) Các gen này đã được kiểm tra và chứng minh có liên quan

đến khả năng chịu hạn của Arabidopsis [113] Trong điều kiện hạn, sản phẩm biểu

hiện của các gen ANAC019, ANAC055, và ANAC072 đều có thể gắn vào vùng promoter của gen ERD1 (early responsive to dehydration stress 1) và kết quả là

tăng cường khả năng chịu hạn [114]

Nhiều thành viên trong họ gen NAC liên quan đến hạn hán đã được mô tả ở

lúa SNAC1 được cảm ứng bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, ABA

trong lá và rễ [133] SNAC1 tham gia vào khả năng chống chịu hạn và bảo vệ tế bào

ở lúa, kết quả của sự biểu hiện này là làm tăng khả năng chống chịu hạn ở thời kì ra hoa trong tình trạng thiếu nước [54] Quá trình biểu hiện của SNAC2/OsNAC6,

OsNAC045, OsNAC063 đều làm tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất

lợi trong đó có hạn hán ở lúa [55], [77], [133] SNAC2 được kích hoạt chủ yếu trong

quá trình bảo vệ tế bào khỏi sự mất nước [55], được phân lập từ DNA hệ gen dài

1529bp mã hóa cho phân tử protein dài 303 amino acid (Mã số: HI422616)

Kết quả nghiên cứu ở cải bắp cho thấy, có 11 gen NAC đã được phân lập thành công Chúng đều được biểu hiện dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ môi trường Gen ngắn nhất có chiều dài khoảng 733bp và dài nhất khoảng 1229bp [53]

Nhân tố phiên mã NAC ở lúa mì, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 đã được tìm

thấy trong phản ứng với hạn, lạnh, muối, bị thương tổn và ABA [123] TaNAC2, TaNAC4 được phân lập từ DNA hệ gen có chiều dài 1566bp và 1515bp, trong đó có

3 exon và 2 intron, 3 exon mã hóa cho phân tử protein dài 405 và 396 amino acid

(Mã số: HQ630372 và HQ630374) TaNAC8 được phân lập từ mRNA có chiều dài

1275bp (Mã số HM027573)

Ở đậu tương, nhiều protein NAC được xác định đã tham gia vào phản ứng với

các stress phi sinh học trong đó có hạn hán như GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4

[87] GmNAC3 và GmNAC4 được cảm ứng biểu hiện bởi ABA, JA, mặn và hạn

Chúng đều được phân lập từ mRNA và có chiều dài khoảng hơn 1100bp

Trên cây lạc, 3 gen thuộc họ NAC đã được phân lập thành công là AhNAC1,

AhNAC2, AhNAC3 trong đó sự biểu hiện của AhNAC2, AhNAC3 cho thấy, các gen

được cảm ứng bởi tình trạng thiếu nước, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp [71]

AhNAC2, AhNAC3 đều được tách chiết từ mRNA và có chiều dài 1565 và 1276bp

(Mã số: EU755023 và EU755022) Gen AhNAC2 được chuyển thành công vào

Arabidopsis Tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở

cây Arabidopsis chuyển gen qua phân tích Northern blot và RT-PCR [72]

Sau khi phân lập, những gen thuộc họ NAC được thiết kế với các promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) và chuyển thành công vào một số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen Một số nghiên cứu công bố đã

thu được cây trồng chuyển gen mã hóa NAC tăng cường khả năng chống chịu khi

gặp tình trạng thiếu nước của môi trường như Arabidopsis, thuốc lá, lúa, lúa

mỳ… [72], [77], [113], [127]

1.3 NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

1.3.1 Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân thành hai nhóm phương thức chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là virus hoặc vi khuẩn Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần nhờ các sinh vật trung gian [1] Tuy nhiên, tất cả các phương pháp chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, chính xác và rất tốn kém mà khả năng tái sinh sau chuyển gen lại thấp, vì thế, phương pháp chuyển gen gián tiếp sẽ mang lại hiệu quả cao hơn và kinh tế hơn Trong các kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thì chuyển gen gián tiếp thông qua vi

khuẩn A tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp này dễ sử

dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả cao (lượng bản sao gen biến nạp ít – tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [6]

Chủng A tumefaciens và A rhisogenes được sử dụng phổ biến trong nghiên

cứu chuyển gen ở thực vật Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm và một số ít các loài thực vật một lá mầm, kết quả là gây ra những khối u hay hình thành lông tơ ở rễ Về

sau, người ta xác định được rằng trong tế bào của các dạng hoang dại A tumefaciens

và A rhisogenes có chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid

(Tumor-inducing plasmid) chứa một đoạn DNA (T-DNA (Transferred-DNA)) có thể chuyển

sang tế bào chủ theo cơ chế tự nhiên Do đó, Agrobacterium là một hệ thống chuyển

gen tự nhiên [1], [4]

Bằng cách cải biến cắt bỏ những gen gây khối u và lông tơ ở rễ, cài xen vào vùng T-DNA (Transferred-DNA) những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và

gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan

trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A

tumefaciens [134]

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật

1.3.2.1 Hệ thống tái sinh cây và quy trình chuyển gen

a) Tái sinh cây ở thực vật

Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cây cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định đến thành công của một thí nghiệm chuyển gen Nếu quá trình biến nạp xảy ra

mà tế bào không tái sinh được thành cây hoặc sự tái sinh diễn ra mà không có sự biến nạp thì thí nghiệm chuyển gen chưa thành công [4]

Các yêu cầu cơ bản đối với hệ thống tái sinh cây

Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng tái

sinh in vitro nhanh Các mô, tế bào này có khả năng tiếp nhận gen mới Quy trình

tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen Cây tái sinh có tỷ lệ sống cao (khi đưa ra ngoài đất trồng), tần số biến dị thấp và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu nhằm tiếp tục tiến hành các thí nghiệm ở các thế hệ tiếp theo

Như vậy, có thể thấy hoàn thiện hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết để thực hiện thành công quá trình biến nạp gen ở thực vật Các loại mô được sử dụng trong hệ thống tái sinh như phôi non, phôi trưởng thành; Mô sẹo có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau ở cơ thể thực vật; Mô lá, thân mầm

Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn

chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi

khi chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết Các chồi bất định hay phôi được hình thành từ các

tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm)

Có thể thấy, tái sinh ở thực vật thông qua hai con đường: Phát sinh cơ quan

(organogenesis) có thể xảy ra do sự phát triển chồi trực tiếp từ mẫu mô nuôi cấy

[49] hoặc qua giai đoạn tạo mô sẹo còn gọi là sự phát sinh chồi từ mô sẹo và con

đường thứ hai là hình thành phôi soma (embryogenesis), thường có một tế bào hoặc

một cụm nhỏ các tế bào diễn ra phản biệt hóa để tạo phôi soma (phôi vô tính) phát triển thành cây hoàn chỉnh tương tự như phôi hữu tính (phôi zygotic) [35]

Hình thành phôi soma là một giai đoạn quan trọng đối với quá trình tái sinh ở

thực vật trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro [85] Phôi soma là kết quả của một quá trình phát triển từ các tế bào soma thành những cấu trúc tương tự như phôi hữu tính thông qua các giai đoạn phát triển đặc trưng là hình cầu, hình tim, hình ngư lôi, mọc lá mầm và trưởng thành [61] Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi soma được

sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và sự xuất hiện của cây khảm có thể được giảm đáng kể [35]

Phương thức tái sinh cây thông qua giai đoạn mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn [61] Ngoài ra khả năng tái sinh cây cũng chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng con đường nuôi cấy mô tế bào

Từ một tế bào biến nạp có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt

b) Hệ thống tái sinh cây phục vụ chuyển gen ở cây lạc

Trên cây lạc, nhiều nghiên cứu đã được công bố nhằm xây dựng một hệ thống tái sinh cây hoàn thiện từ nhiều nguồn mẫu ban đầu khác nhau [29], [49], [105], [117], [118] Tối ưu hệ thống tái sinh là một trong những giai đoạn quyết định ảnh hưởng đến kết quả quá trình chuyển gen Vì vậy, đây là vấn đề rất được quan tâm khi tiến hành nghiên cứu chuyển gen ở thực vật cũng như trên cây lạc

Nguồn mẫu vật ban đầu được sử dụng cho các nghiên cứu tái sinh cây ở lạc rất đa dạng như từ phôi hữu tính, lá non, lá mầm, phần trụ của lá mầm, đoạn thân Các mẫu vật này được sử dụng trong hệ thống tái sinh thông qua hai con đường như

ở các đối tượng thực vật khác: tái sinh trực tiếp hoặc qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh thông qua hình thành phôi soma trên các môi trường thích hợp

Tái sinh chồi trực tiếp theo con đường thứ nhất từ mẫu vật là lá mầm, mảnh

lá, nách (nốt) lá mầm (cotyledon node) là một trong những phương pháp có hiệu quả được sử dụng gần đây trong tái sinh và chuyển gen ở một số loài thực vật thuộc cây họ đậu như đậu tương [80] và lạc [49], [105], [117], [118] Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi trực tiếp từ nách lá mầm Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài thực vật thường sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin như IAA, IBA, BAP Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau [21], [105] Akasaka

và đtg (2000) đã tái sinh chồi thành công từ mảnh lá giống lạc Chico trên môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, kinetin [21] Sharma và đtg (2000), đã tái sinh chồi thành công trực tiếp từ nuôi cấy lá mầm trưởng thành của các giống lạc khác nhau với tỷ lệ tái sinh hơn 90% [100] Swathi và đtg (2006)

đã thành công trong việc tái sinh đa chồi trực tiếp từ các mắt lá mầm

của giống lạc JL-24 với tỷ lệ tái sinh là 82% [105]

Quá trình tái sinh theo con đường thứ nhất sử dụng nguồn mẫu ban đầu trải qua quá trình mô sẹo hóa đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu trên đối tượng cây lạc [11], [12], [14], [35] Các mẫu vật được sử dụng có thể có nguồn gốc từ các phần mô khác nhau trên cơ thể thực vật như phôi trục, lá non, đoạn thân Sau khi mẫu cấy được xử lý và đưa lên môi trường tạo mô sẹo thích hợp, thường là chứa chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4D) với thời gian nuôi cấy nhất định sẽ tạo khối mô sẹo Phôi trục là mẫu vật được sử dụng tạo mô sẹo phổ biến hơn

cả Tuy nhiên, quá trình tái sinh cây trực tiếp từ khối mô sẹo có nguồn gốc từ phôi hữu tính cho tỷ lệ đa chồi rất thấp Thường từ khối mô sẹo chỉ phát sinh được một chồi, chỉ một số ít tạo hai chồi Điều này là không có ý nghĩa cho quá trình chuyển gen do cần phải có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhằm tăng hiệu quả hình thành cây mang gen chuyển như mong muốn Vì vậy, con đường thứ hai giải quyết vấn đề này là từ khối mô sẹo có thể chuyển lên môi trường tạo phôi soma Khối phôi soma hình thành trên môi trường thích hợp sẽ được tái sinh tạo cây hoàn chỉnh Con đường tái sinh này đã làm tăng hiệu quả tạo đa chồi từ một phôi trục hạt lạc [12], [35]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, trong quá trình phát sinh phôi soma, môi trường có chất kích thích sinh trưởng 2,4D với nồng độ cao cho kết quả tạo phôi soma tốt nhất trên cây lạc [12], [35], [61] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã nhận thấy, việc tối ưu nồng độ và thời gian tiếp xúc với auxin (2,4D) là rất quan trọng cho sự hình thành và phát triển của phôi soma [102] Hệ thống tái sinh cây qua phôi soma hình thành nên hai dạng phôi: phôi soma phát triển bình thường cho cây lạc tái sinh hoàn chỉnh với tần số không lớn và phôi soma phát triển bất thường dẫn đến kết quả không tái sinh được thành cây với tần số cao [12], [61]

Khắc phục hiện tượng phát triển bất thường của phôi soma nhằm tăng tỷ lệ tái sính cây hoàn chỉnh đã được nhiều tác giả đề cập đến trong các nghiên cứu từ khá lâu [12], [35], [61] Việc kết hợp các chất KTST như BAP và kinetin, BAP và NAA với nồng độ khác nhau đã đem lại kết quả tái sinh tốt từ phôi soma có hình dạng bất thường Nghiên cứu của Bùi Văn Thắng và đtg (2005), trên môi trường phục hồi phát triển phôi thích hợp, tỷ lệ tái sinh cây thu được rất cao (82%) [12]

Đã có nhiều công trình chuyển gen trên cây lạc được công bố trên thê giới Nguồn mẫu vật ban đầu được sử dụng phổ biến thường là lá mầm [30], [64], [100],

nách lá mầm [29], [105], phôi trục, mô sẹo phôi [24] Ngoài ra lá chét non [93], [97], [111], hoặc trục của lá mầm [89] cũng được sử dụng làm nguồn mẫu vật để chuyển gen Từ các mẫu vật này, có thể sử dụng phương pháp chuyển gen trực tiếp

như bắn gen hoặc chuyển gián tiếp qua Agrobacterium nhằm tạo ra cây lạc chuyển

gen mang các tính trạng mong muốn

1.3.2.2 Một số nghiên cứu chuyển gen mã hóa NAC TF nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng

Những ứng dụng của công nghệ chuyển gen thực vật trong việc nâng cao tính chịu hạn đã đạt được những kết quả bước đầu ở một số loài cây khác nhau như lúa,

ngô, đậu tương, lúa mỳ, thuốc lá, cải, Arabidopsis thaliana , tuy nhiên trên đối

tượng cây lạc còn rất ít nghiên cứu chuyển gen được công bố

Hiện nay có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng Hướng thứ nhất là tìm những gen liên quan trực tiếp đến khả năng chịu hạn, chịu lạnh, ngập úng hay phèn mặn Hướng thứ hai nghiên cứu về gen chống

chịu theo hướng các yếu tố điều khiển ví dụ như transcription factor (TF) nhằm tiếp cận cách điều hòa tổng thể hơn của thực vật khi gặp điều kiện bất lợi [1].

Nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen liên

quan đến hạn hán trong họ NAC TF như: ANAC019, ANAC055, và ANAC072 từ

Arabidopsis [113], BnNAC từ cải bắp [53], AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 từ cây lạc

[71], [72], SNAC2 được kích hoạt chủ yếu trong quá trình bảo vệ tế bào khỏi sự mất

nước [55] GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4 trong đậu tương chứa miền bảo thủ

NAC được xác định đã tham gia vào phản ứng với các stress phi sinh học trong đó

có hạn [87] Ở lúa, ONAC045, SNAC1 được cảm ứng bởi hạn hán, nồng độ muối

cao, nhiệt độ thấp, ABA trong lá và rễ [133], OsNAC6 tăng cưởng khả năng chống

chịu hạn hán và muối trong lúa NAC TF ở lúa mì, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 đã

được tìm thấy trong phản ứng với hạn, lạnh, muối, bị thương tổn và ABA [123]…

Sau khi phân lập, những gen này được thiết kế với các promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) và chuyển thành công vào một số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen Một số nghiên cứu công bố đã thu được cây trồng chuyển gen thành công có khả năng tăng cường chống chịu các điều kiện thiếu

nước của môi trường như: A.thaliana, thuốc lá , lúa …

Phân tích promoter của gen ERD1 cho thấy, các TF thuộc họ NAC đóng vai trò quan trọng đối với sự hoạt hóa của gen ERD1 Quá trình biểu hiện của ba gen

ANAC019, ANAC055, và ANAC072 dưới sự điều khiển của promoter ERD1 trong Arabidopsis cho thấy khả năng chống chịu dưới điều kiện hạn hán đã được tăng

cường [113] Cây Arabidopsis chuyển gen mã hóa một số NAC TF trong các điều

kiện bất lợi khác như nhiệt độ thấp, nhiệt độ cao, khô hạn cũng thu được kết quả tương tự Nghĩa là, cây chuyển gen mã hóa NAC TF có khả năng chống chịu được các điều kiện bất lợi từ môi trường: mặn, lạnh, hạn và nhiệt độ cao [46], [72]

Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa NAC TF thành công vào một số loài cây trồng như ở lúa, ngô, đậu tương, thuốc lá, Các kết quả thu được đều chứng minh việc tăng khả năng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi từ môi trường như nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, nhiệt độ cao, khô hạn, từ đó cải thiện được sự sinh

trưởng và phát triển của cây trồng Kết quả chuyển gen SNAC1, OsNAC6/SNAC2,

vào lúa cho thấy, khả năng đáp ứng với hạn, lạnh và muối tăng lên [77] Gen mã

hóa GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4 tách từ đậu tương sau khi chuyển vào thuốc

lá đã thu được cây chuyển gen tăng khả năng chống chịu với hạn và muối [87]

TaNAC2, được tách dòng thành công ở lúa mì đáp ứng với sự thiếu nước, nồng độ

muối cao, nhiệt độ thấp Thí nghiệm chuyển gen đã chỉ ra rằng, TaNAC2 làm tăng khả năng chống chịu với hạn, muối và lạnh ở cây Arabidopsis [74]

Ở cây lạc, gen AhNAC2, AhNAC3 được tách dòng thành công và biểu hiện của

chúng cho thấy được cảm ứng bởi tình trạng thiếu nước, nồng độ muối cao và nhiệt

độ thấp [71] Gen AhNAC2 đã được chuyển thành công vào Arabidopsis Tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở cây Arabidopsis chuyển gen qua phân tích Northern blot và RT-PCR [72]

Bảng 1.1 Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC

có khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất lợi

Gen

Thực vật chuyển gen Chống chịu stress Nguồn tham khảo

AtNAC019 Arabidopsis Hạn Tran et al., 2004 [113]

AtNAC055 Arabidopsis Hạn Tran et al., 2004 [113]

ATAF1 Arabidopsis Hạn Wu et al., 2009 [1122]

RD26 Arabidopsis Hạn Fujita et al., 2004 [46]

AhNAC2 Arabidopsis Hạn, muối Liu Xu et al., 2011 [72]

TaNAC2 Arabidopsis Hạn, muối, lạnh Mao et al., 2012 [74]

SNAC2 Lúa Hạn, lạnh, muối Hu et al., 2008 [55]

OsNAC5 Lúa Hạn, lạnh, muối Song et al., 2011 [103]

ONAC045 Lúa Hạn, muối Zheng et al., 2009 [133]

ONAC10 Lúa Hạn, lạnh, muối Jeong et al., 2010 [60]

GmNAC2 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]

GmNAC3 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]

GmNAC4 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]

Nhận xét chung

Cây lạc đã được biết đến là cây trồng thuộc nhóm chịu hạn kém Trong quá trình sinh trưởng phát triển có những giai đoạn rất mẫn cảm với tình trạng thiếu nước như thời kỳ trước ra hoa, thời kỳ ra hoa, thời kỳ đâm tia và tạo quả Dù gặp hạn ở giai đoạn nào cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng bình thường của cây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt lạc

Một số biện pháp tăng cường khả năng chịu hạn ở lạc đã được nghiên cứu Trong đó kỹ thuật chọn tạo các giống lạc có khả năng chịu hạn như lai chọn giống hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng Tuy nhiên, việc sử dụng

kỹ thuật chuyển gen ở cây lạc nhằm tạo ra giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều Trên thế giới đã có một số nghiên cứu công bố chuyển gen thành công vào cây lạc Phương pháp chuyển gen có hiệu quả vào cây lạc qua

Agrobacterium đã được Sharma và đtg đề cập đến trong nghiên cứu của mình từ

năm 2000 Bhatnagar và đtg (2007) đã chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố

phiên mã liên quan đến tính chịu hạn AtDREB1A tách từ Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter rd29A vào giống lạc JL 24 Kết quả đánh giá cây chuyển gen

cho thấy, hiệu quả sử dụng nước cao hơn hẳn so với cây đối chứng trong điều kiện chịu thiếu hụt về nước…

Ở Việt Nam, việc phát triển hệ thống tái sinh cây lạc phục vụ cho mục đích chuyển gen cũng đã được đề cập trong nghiên cứu của Bùi Văn Thắng và cs (2005), tuy nhiên nghiên cứu chuyển gen ở cây lạc thì chưa có công trình nào được công bố