Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp protease tham gia quá trình phân hủy xác động vật

Trong những năm gần đây, nông nghiệp là một trong những ngành đóng góp quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam, trong đó chăn nuôi chiếm một vị trí không nhỏ. Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật, các trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm ngày càng được mở ra với quy mô lớn, kèm theo nhiều vấn đề bất cập cần được giải quyết. Các dịch bệnh nguy hiểm như lở mồm long móng, cúm gia cầm H5N1, tai xanh v.v… liên tiếp xảy ra đã và đang gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi và tiềm tàng mối nguy gây ô nhiễm môi trường sống. Chăn nuôi với quy mô lớn phát sinh một lượng lớn chất thải ra môi trường. Việc đào thải xác động vật và các chất thải ra môi trường bên ngoài, đặc biệt là môi trường nước không những gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường sống do sự phân hủy các thành phần hữu cơ trong xác chết mà còn vô tình tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh cư trú, phát triển và có thể bùng phát thành dịch bệnh khi có điều kiện thuận lợi. Để ngăn ngừa nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và bùng phát dịch bệnh, các biện pháp như chôn lấp, thiêu hủy đã được sử dụng để xử lý lượng lớn xác động vật. Tuy nhiên các phương pháp này đều chưa thật sự an toàn đối với môi trường và con người. Ủ phân (composting) được coi là phương pháp xử lý “sạch” đối với môi trường, với nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn kém, và tạo ra được nguồn nguyên liệu hữu cơ để làm phân bón cho cây trồng. Tuy nhiên, thời gian xử lý kéo dài, chiếm nhiều diện tích, và gây mùi khó chịu lại là nhược điểm lớn khiến nhiều trang trại e ngại khi lựa chọn phương pháp này để xử lý nguồn chất thải chăn nuôi và xác động vật chết sau mỗi đợt dịch. Sử dụng vi sinh vật trong các quá trình sinh học đang trở thành một giải pháp an toàn, hiệu quả, và thực sự thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học. Nhiều kết quả nghiên cứu trong lĩnh vực này đã được ứng dụng thành công, như sử dụng vi sinh vật trong sản xuất bia, rượu, xử lý ô nhiễm dầu trên biển, hay phân hủy chất thải hữu cơ. Từ những đánh giá tổng quan trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp protease tham gia quá trình phân hủy xác động vật”

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nông nghiệp là một trong những ngành đónggóp quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam, trong đó chăn nuôi chiếm một vị tríkhông nhỏ Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật, các trang trại chăn nuôigia súc, gia cầm ngày càng được mở ra với quy mô lớn, kèm theo nhiều vấn đềbất cập cần được giải quyết

Các dịch bệnh nguy hiểm như lở mồm long móng, cúm gia cầm H5N1,tai xanh v.v… liên tiếp xảy ra đã và đang gây thiệt hại kinh tế cho người chănnuôi và tiềm tàng mối nguy gây ô nhiễm môi trường sống Chăn nuôi với quy

mô lớn phát sinh một lượng lớn chất thải ra môi trường

Việc đào thải xác động vật và các chất thải ra môi trường bên ngoài, đặcbiệt là môi trường nước không những gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường sống

do sự phân hủy các thành phần hữu cơ trong xác chết mà còn vô tình tạo điềukiện thuận lợi cho mầm bệnh cư trú, phát triển và có thể bùng phát thành dịchbệnh khi có điều kiện thuận lợi

Để ngăn ngừa nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và bùng phát dịch bệnh,các biện pháp như chôn lấp, thiêu hủy đã được sử dụng để xử lý lượng lớn xácđộng vật Tuy nhiên các phương pháp này đều chưa thật sự an toàn đối với môitrường và con người Ủ phân (composting) được coi là phương pháp xử lý

“sạch” đối với môi trường, với nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn kém, và tạo rađược nguồn nguyên liệu hữu cơ để làm phân bón cho cây trồng Tuy nhiên, thờigian xử lý kéo dài, chiếm nhiều diện tích, và gây mùi khó chịu lại là nhược điểmlớn khiến nhiều trang trại e ngại khi lựa chọn phương pháp này để xử lý nguồnchất thải chăn nuôi và xác động vật chết sau mỗi đợt dịch

Sử dụng vi sinh vật trong các quá trình sinh học đang trở thành một giảipháp an toàn, hiệu quả, và thực sự thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhàkhoa học Nhiều kết quả nghiên cứu trong lĩnh vực này đã được ứng dụng thànhcông, như sử dụng vi sinh vật trong sản xuất bia, rượu, xử lý ô nhiễm dầu trênbiển, hay phân hủy chất thải hữu cơ Từ những đánh giá tổng quan trên, chúng

tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp protease tham gia quá trình phân hủy xác động vật”

Mục tiêu đề tài

Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh đểsản xuất chế phẩm vi sinh thúc đẩy quá trình phân hủy xác động vật, góp phầngiảm thiểu ô nhiễm môi trường, lây lan mầm bệnh

Ý nghĩa khoa học

Đóng góp những dữ liệu khoa học mới về khả năng ứng dụng các vi sinhvật nhỏ bé trong xử lý lượng chất thải khổng lồ các xác chết động vật sau nhữngdịch bệnh lớn đang xảy ra với tần suất ngày càng liên tiếp

Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất giải pháp xử lý nhanh, hiệu quả và an toàn với môi trường sốnglượng xác động vật nuôi chết do dịch bệnh và nguồn chất thải khổng lồ củangành chăn nuôi, góp phần xây dựng sự phát triển bền vững của ngành chănnuôi nói riêng, và nền kinh tế nói chung

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Tình hình một số dịch bệnh nguy hiểm ở động vật nuôi hiện nay

2.1.1 Tình hình dịch bệnh động vật trên thế giới

Trong nhiều năm gần đây, việc xảy ra liên tiếp nhiều dịch bệnh nguy hiểm

ở động vật nuôi như bò điên, lở mồm long móng, cúm gia cầm H5N1 v.v… đãkhiến số lượng động vật nuôi bị chết và tiêu hủy trở nên quá tải đối với mọi biệnpháp xử lý [14] Theo thống kê tính đến tháng 12 năm 2005, đại dịch cúm H5N1

đã khiến hơn 150 triệu chim nuôi và hàng chục nghìn chim di cư bị chết hoặctiêu hủy [16] Dịch bệnh LMLM điển hình nhất là đại dịch diễn ra ở Anh năm

2001 đã khiến 7 triệu bò và cừu bị giết chết [13], năm 1967 đã tiêu hủy 44.200động vật nuôi, ước tính giá trị thiệt hại lên tới 370 triệu bảng, và ở Đài Loannăm 1997 đại dịch này cũng đã khiến 3,8 triệu lợn bị tiêu hủy, gây thiệt hại 6,9 tỉ

đô la cho ngành chăn nuôi của quốc gia này Dịch bệnh bò điên, mặc dù phạm viphát tán bệnh không rộng song cũng gây hậu quả nặng nề, điển hình là ở Anhnăm 1984 đã khiến 179 bò bị nhiễm bệnh và 4,4 triệu bò bị tiêu hủy [14]

y thông báo tình hình dịch bệnh LMLM tại các tỉnh diễn biến rất phức tạp,LMLM do virus type A trên trâu bò đã xảy ra tại 10 tỉnh, bệnh LMLM type

A trên heo tại 4 tỉnh, Trong khi đó 80-85 % heo hơi và 98 % trâu bò hơi từ cáctỉnh, thành của cả nước đưa về thành phố Hồ Chí Minh giết mổ hay đã giết mổsẵn từ các tỉnh lân cận đưa về tiêu thụ Tình hình bệnh tai xanh ở lợn thể độclực cao xảy ra tại 26 tỉnh thành Tại khu vực phía nam dịch đã xảy ra tại LâmĐồng, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tây Ninh, Vĩnh Long, Bến Tre, Bình Phước, BạcLiêu gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức khoẻ ngườidân Đây thực sự là những lượng phế thải khổng lồ mà ngành chăn nuôi của mỗinước phải hứng chịu và phải đau đầu để tìm ra giải pháp xử lý hiệu quả, đồngthời đảm bảo an toàn môi trường, tránh gây lây lan dịch bệnh Ở Việt Nam, vấn

đề này càng phải được quan tâm và xử lý chặt chẽ bởi do ý thức bảo vệ môitrường của người dân không cao, mặc khác người ta nằm trong vùng khí hậunhiệt đới ẩm gió mùa là điều kiện thuận lợi để gây phát tán mầm bệnh nếu nhưlượng chất thải trên không được thu gom và xử lý kịp thời

Bên cạnh đó, các loại phế phẩm từ ngành công nghiệp chăn nuôi nhưphân, nước thải, thức ăn thừa v.v… và đang thu hút sự quan tâm nhiều nhất hiệnnay đó là phụ phẩm của ngành giết mổ đang trở thành các nguồn có nguy cơ caogây ô nhiễm môi trường Theo thống kê của Cục Chăn nuôi, lượng chất thải rắn

do vật nuôi thải ra bao gồm phân, các chất độn chuồng, thức ăn thừa, xác giasúc, gia cầm chết, chất thải lò mổ v.v… trong năm 2008 là 80,49 triệu tấn Song,ước tính hiện nay, chỉ có khoảng 40% lượng chất thải này được xử lý Số còn lạithường được thải thẳng ra ao, hồ, kênh, rạch v.v… gây ô nhiễm nặng nề cho môitrường sống

2.2 Các phương pháp xử lý xác động vật

Xử lý động vật chết có thể được thực hiện bởi nhiều phương pháp khácnhau Một số phương pháp xử lý xác động vật và phụ phẩm của ngành chănnuôi thường gặp là thiêu hủy (incineration), chôn lấp (burial) và ủ làm phân trộn(composting) [16]

2.2.1 Phương pháp chôn lấp

Phương pháp chôn lấp là đặt đối tượng như xác chết động vật, phụ phẩmđộng vật vào trong lòng đất thông qua hố, hào, được phủ lên trên bằng một lớpđất Chôn lấp là một trong những phương pháp được sử dụng sớm nhất

Động vật chết sẽ được chôn lấp trong hố hoặc hào, hoặc được đắp thành

ụ Chôn cất phải được thực hiện theo các hướng dẫn sau đây (hình 2.1):

- Chôn lấp phải được thực hiện ở khu vực xa nhất có thể Khu chôn lấpđược bố trí cách xa giếng, suối và các nguồn nước khác tối thiểu là 9,1 kmhoặc cách xa vùng đất thường xuyên bị ngập lụt.

- Phần đáy của hố chôn phải cách mực nước ngầm, hoặc các vết gãy địachất ít nhất 60cm Đất ở khu vực chôn lấp cần phải được kiểm tra để đảm bảotính phân hủy tốt xác động vật

- Hố chôn phải có độ sâu khoảng 160 – 180cm, và có độ dốc ổn định

- Động vật chết được đặt gọn trong hố chôn, cách miệng hố 60cm Lớpphủ mặt phía trên và xung quanh xác động vật bị chôn được tối thiểu là 90cm.Lớp phủ trên cùng phải thoát nước được, tránh để nước bị ứ đọng lại

- Tất cả các dòng chảy bề mặt phải được chuyển vào một rãnh thoát nướcdẫn ra khỏi hố

- Khu chôn lấp phải được kiểm tra thường xuyên và được bồi đầy đất ởnhững chỗ bị lún Ở những vùng điều kiện đất không đáp ứng cho việc chôn xácđộng vật thì được xử lý bằng cách lấp Xác được đặt trên mặt đất và phủ đất lêntrên một lớp dày 90 cm Ụ đất chôn phải có thành để ngăn nước từ các ao, hồxung quanh tràn vào [12]

Hình 2.1 Hố chôn xác động vật lớn (Karl VanDevender., 2006)

Hình 2.2 Điển hình cho hố có chiều sâu và chiều rộng lớn với chiều

dài thay đổi (USAD, 2005).

Hình 2.3 Điển hình cho hố có chiều sâu và chiều rộng nhỏ với chiều dài

thay đổi (USAD, 2005).

Hình 2.4 Điển hình cho hố đào có chiều sâu khoảng 1,2 – 1,8m, chiều rộng

khoảng 1m, chiều dài có thể thay đổi (USAD, 2005).

Hình 2.5 Điển hình cho hố đào sâu cho xác động vật lớn (USAD, 2005).

Một số phương pháp chôn lấp khác được trình bày ở các hình 2.2, 2.3, 2.4, 2.5.Phương pháp chôn lấp là phương pháp dễ thực hiện, không yêu cầu côngnghệ cao và chi phí thấp nên rất được sử dụng rất phổ biến Bên cạnh đó, chônlấp là giải pháp ưu tiên để xử lý xác động vật khi xảy ra dịch, hoặc thảm họa lũlụt vì có hiệu suất xử lý lớn

Song thời gian chôn lấp kéo dài, xảy ra quá trình lên men kỵ khí tạo cácloại khí có mùi và nguy hại như H2S, NH3, CH4, CO2, NOx, SOx,… Đồng thời,phát sinh một lượng lớn nước rò rỉ từ các hố chôn, có khả năng gây ảnh hưởngxấu cho môi trường, và dễ dẫn đến nguy cơ bùng phát dịch bệnh nguy hiểmtrong cộng đồng dân cư Đối với bãi chôn lấp cũ (không hợp vệ sinh): không cólớp lót đáy, không có hệ thống thu gom và xử lý khí thải và nước thải Vì thế,mặc dù chi phí chôn lấp thấp nhưng tốn nhiều diện tích nên chi phí đất cao, chi

phí xử lý môi trường sau khi chôn lấp cũng rất cao, những tác động đến môitrường và sức khoẻ cộng đồng là nghiêm trọng và lâu dài.

Công nghệ chôn lấp hợp vệ sinh, có thu gom và xử lý nước rác và khí bãirác, kể cả có và không thu hồi năng lượng, thì chi phí đầu tư cũng rất lớn (chogiá trị đất sử dụng, hệ thống xử lý gas và động cơ gas phát điện), chi phí vậnhành cao nên giá thành sản xuất điện cao, thị trường tiêu thụ khó chấp nhận

2.2.2 Phương pháp thiêu hủy

Phương pháp thiêu hủy sử dụng các nguồn nguyên liệu phụ trợ nhưpropan, diesel hoặc khí gas tự nhiên được coi là đảm bảo về mặt an toàn sinhhọc Phương pháp thiêu hủy cũng là một trong các phương pháp lâu đời để xử lýxác chết và phụ phẩm động vật Phương pháp này được nhiều nước phát triển sửdụng vì nó có một số ưu điểm như không đòi hỏi nhiều diện tích đất, do đó giảmđược thể tích chôn lấp, loại bỏ được các mầm bệnh song không hoàn toàn dohiệu suất xử lý không cao và gây ô nhiễm không khí nghiêm trọng do sản sinh ranhiều chất độc hại như dioxin, NOx, SOx [15], lại tốn kém hơn do chi phí đầu tư

và bảo trì rất cao so với các phương pháp khác Tại các lò thiêu hủy cũng đòi hỏicác nhân viên vận hành phải có trình độ cao Ngoài tác động thứ cấp do mộtlượng các chất khí độc hại, sau khi đốt tạo ra một lượng tro không phân hủyđược từ các bộ phận như sừng, móng hoặc xương động vật, nếu không xử lý tốtthì sẽ tạo ra một lượng bụi không khí, và gây tác động xấu đến môi trường vàsức khỏe con người

2.2.3.Phương pháp ủ phân

Ủ phân được hiểu là quá trình phân hủy sinh học hiếu khí các chất hữu cơđến trạng thái ổn định dưới tác dụng của oxy và sự hoạt động của vi sinh vật, tạothành sản phẩm giống như mùn gọi là compost Đây là phương pháp xử lý xácđộng vật được áp dụng để tận dụng giá trị dinh dưỡng còn lại từ sản phẩm ủ làmphân bón phục vụ cho ngành nông nghiệp

Phương pháp ủ phân đang được coi là giải pháp có nhiều triển vọng vớinhiều ưu điểm như giá thành thấp, dễ tiến hành với các nguồn nguyên liệu thô

và trang thiết bị máy móc sẵn có ở nông trại, nguy cơ gây ô nhiễm không khíthấp Ngoài ra trong quá trình xử lý, các đống ủ thường được duy trì ở nhiệt độcao trong một thời gian dài (1300F – 1500F) nên tạo điều kiện giết chết các mầmbệnh, cỏ dại và ấu trùng bay [12]

Quá trình ủ thường gồm 3 giai đoạn:

- Tiền xử lý rác (cắt nhỏ, bổ sung chất dinh dưỡng, trộn chế phẩm, )

- Ủ (phân hủy ổn định sinh học chất hữu cơ)

- Xử lý sau ủ (nghiền, sàng, đóng gói,…)

Giai đoạn ủ đòi hỏi kiểm soát tốt các điều kiện: độ ẩm (50-60%), nhiệt độ(40-550C), pH (7-7.5), oxy (thông khí ), kích cỡ hạt,

Sau khi quá trình phân hủy hoàn thành, sản phẩm cuối cùng được tận dụnglàm phân bón giàu dinh dưỡng cho cây trồng nông nghiệp [13] Tuy nhiênnhược điểm lớn nhất của phương pháp này đó là quá trình phân hủy chủ yếu dựavào hoạt động của tập đoàn các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên nên đòi hỏi mộtthời gian xử lý dài, tốn nhiều diện tích và thường gây mùi khó chịu [15]

Phương pháp ủ phân được coi là phương pháp thích hợp, an toàn với môitrường để xử lý lượng xác thải động vật ngày càng tăng do dịch bệnh Tuynhiên, thời gian phân hủy kéo dài (thường từ 30-60 ngày đối với phương pháp ủhiếu khí) là nhược điểm lớn nhất của phương pháp này Ngoài ra, việc sinh racác khí có mùi khó chịu như NH3, H2S v.v., đặc biệt đối với phương pháp ủ kỵkhí cũng là một trong những yếu tố chính cản trở người chăn nuôi lựa chọnphương pháp này để xử lý xác chết động vật

2.3 Enzym protease

2.3.1 Giới thiệu chung về enzym protease

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, cácchế phẩm enzym được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trongcác lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng nămlượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giátrị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]

Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngànhsản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổsung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩmtrong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cungcấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ranhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạnchế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quátrình nuôi cấy sản xuất enzym chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vìprotein chỉ chiếm 20-30% [4]

Nhóm enzym protease (peptid – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phânliên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sảnphẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năngthuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.

Hình 2.6 Mô hình enzym protease thủy phân phân tử protein.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ

vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật(gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật cónhững đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rấtphức tạp bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hìnhdạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên protease vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng Phân loại Protease:

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 2.7 Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phânchia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, một dipeptide hoặc mộttripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một axit amin hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thànhbốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serintrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt độngxúc tác của enzym Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin vàsubtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym động vật như chymotrypsin,

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn như subtilisinCarlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùngkiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinasethường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động

và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy

ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metalloproteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tácdụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

ES Enzym – S  Enzym – S + P1  Enzym + P2

Trongđó: E: Enzym, S: cơchất, Enzym-S: phức chất enzym-cơchất,

P1,P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 của phản ứng

2.3.2.Protease từ vi sinh vật

Enzym protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm

nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces

và một số và một số loại nấm men

2.3.2.1 Protease vi khuẩn

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loạiendopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loạitrên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khảnăng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6] Lượng

protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượngenzym được sử dụng [6].

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất [1].

Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng

pH trung tính và kiềm yếu Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ởkhoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tínhtạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật vàtăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với

các axit amin ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [1].

Vì vậy, trong công nghiệp thực phẩm người ta thường lựa chọn các chế phẩmprotease trung tính có nguồn gốc vi khuẩn Protease kiềm và ưa kiềm của vikhuẩn có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng, chịu nhiệt tốt với nhiệt độ tối

ưu là khoảng 600 nên những protease này thường được ứng dụng trong ngànhcông nghiệp sản xuất chất tẩy rửa

2.3.2.2 Protease nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc

này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấmmốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở

pH 2,5-3 [1]

Protease nấm mốc có ưu điểm là phổ pH hoạt động rộng (pH = 4-11),bền trong môi trường có pH thấp (pH = 2,5-6), và thường hoạt động tối ưutrong môi trường axit (pH = 4-4,5) Việc tách chiết protease từ nấm cũng đơngiản, và khá dễ dàng do chúng sinh trưởng thích hợp với quá trình lên menrắn Tuy nhiên, hoạt tính enzym không cao và khả năng chịu nhiệt kém hơn sovới enzym vi khuẩn

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti…

cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sảnxuất pho mát

2.3.2.3 Protease xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vikhuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả

năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus [1].

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật)

được tách chiết từ S grieus, enzym này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng

thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành axit amin Ở Liên Xô

(cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin.

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở

Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [1]

Protease từ S fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng

trong công nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể

sử dụng các enzym này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kếtpeptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, cácnhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sảnphẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuấtenzym ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống, với nhiều ưu điểm như:chu kỳ sinh trưởng ngắn nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm, có thể điềukhiển được sinh tổng hợp enzym theo hướng có lợi, giá thành thấp, chủ động vềnguồn nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật Tuy nhiên trong mọitrường hợp, cần lưu ý khả năng sinh độc tố của chủng sử dụng để có biện phápphòng ngừa, xử lý thích hợp

2.3.3.Ứng dụng protease

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như côngnghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sựthủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thíchhợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vịthịt Ngoài papain còn có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủyphân một phần các protein có trong thành phần thịt, do đó chất lượng của các loạithịt được nâng cao

Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được

chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm

từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit aminchứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L-sang D- làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thuỷ phân sâu sắc và triệt

để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng cácprotease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùngphối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệtổng cộng 1 - 2% khối lượng protein cần thuỷ phân Ưu điểm của việc thuỷ phânprotease bởi enzym là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra cácsản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm)thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lạiphụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nênhiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó

sử dụng chế phẩm enzym thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rútngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn cònmột số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ

hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát.

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời giantrộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc

làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được

dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủyphân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da

bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻonhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, để làmmềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật

Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus )

vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị tríquan trọng.

Trong công nghiêp dệt: Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơtằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin)

để sợi được được bóng, dể nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp proteinserisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm,

do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vịtrong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗnhợp enzym dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trongchăn nuôi gia súc và gia cầm

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vắc xin,kháng sinh…

- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩnprotein, sản xuất mỹ phẩm,…

2.4 Đại cương về vi khuẩn Bacillus

2.4.1 Đặc điểm chung của Bacillus

Theo khoá phân loại của Bergey, chi Bacillus thuộc họ Bacillaceae, lớp

Bailli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn

Các vi khuẩn chi Bacillus là những vi khuẩn to, hình que, Gram dương, dinhdưỡng hữu cơ hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dươngtính, hình thành nha bào, đề kháng cao với nhiệt

Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu, Bacillus anthracis không gây dung huyết, trong khi đó Bacillus cereus tạo ra vòng dung huyết trên

thạch máu [9]

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về sinh thái Các loài Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có tiềm năng

lớn về các enzym ngoại bào Nhiều trong số các enzym ngoại bào này là nhữngenzym thủy phân các phân tử hữu cơ lớn Chính vì thế vi khuẩn này có nhiềuứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa,

công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghiệp dược phẩm, côngnghiệp thuộc da, công nghiệp dệt và trong xử lý chất thải

Bacillus có khả năng sinh bào tử Thông thường bào tử được tạo ra khi tế

bào đã trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng.Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử Khi bào tử trưởng thành tế bào dinhdưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Bào tử có khảnăng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồntại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm Bào tử của vi khuẩn không phải là mộthình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn

vượt qua những điều kiện sống bất lợi Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù họp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt

độ cao (450C – 750C), hay ưa lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus

sống ở nhiệt độ 340C – 370C

Hình 2.8 Hình dạng khuẩn lạc (A) và hình thái khi nhuộm Gram của

vi khuẩn Bacillus (B) 2.4.2 Protease từ Bacillus

Hệ thống enzym của Bacillus đặc biệt là Bacillus subtilis rất phong phú và

đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, cellulase… Protease của

Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ

20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12

Một nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả Ngô Tự Thành và cộng sự đã

phân lập được 236 chủng Bacillus từ các mẫu đất và nước thải khác nhau cho

thấy enzym protease của các chủng T20, TR6 và TH5 có tác dụng tốt trong xử lýnước thải [7]

Một số ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản đã được nghiên

cứu như đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzym tiêu hóa cho các đối tượng nuôitrồng thủy sản Ngoài ra các nghiên cứu ứng dụng còn cho thấy khả năng tăng

cường miễn dịch không đặc hiệu như chủng Bacillus sp HY1 được phân lập từ nước nuôi tôm có khả năng ức chế tốt các vi khuẩn Vibrio Chủng Bacillus sp HY1 có khả năng kháng Staphylococcus aureus, Sarcina lutea…, nhưng không

có khả năng kháng E coli [5] Nhờ có ưu điểm kháng tốt vi khuẩn nên chủng vi

khuẩn này đang được thử nghiêm trong các chế phẩm sinh học

Bacillus tiết ra enzym phân hủy các chất như carbonhydrate, các chất béo

và protein thành những đơn vị nhỏ hơn Chúng cũng có khả năng phân hủy các

chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm Bacillus có tác dụng làm giảm

COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi Bacillus được ứng dụng trong

trường hợp làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất

dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy như NH3, H2S…Một số nghiên cứu còn cho thấy khả năng ức chế các tác nhân gây bệnhbằng cách tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn gây ảnhhưởng đến quần thể vi sinh khác [5], [7] Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinhdưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường Nghiên cứu của Stein (2005) cho

thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B subtilis đã được ghi nhận hơn 50

năm qua Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn B subtilis cókhả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau [17]

Như vậy, có thể thấy các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn Bacillus có

thể góp phần làm giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiệnsức khỏe của tôm cá, cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong

ao nuôi

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các các chủng vi sinh vật tham gia vàoquá trình phân hủy xác động vật thu nhận từ các hầm chôn xác động vật củaPhân viên Thú y miền Trung

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện : từ 1/2012 đến 5/2012

- Địa điểm nghiên cứu : Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phân viện Thú y miềnTrung

- Mẫu để phân lập vi khuẩn được lấy từ hầm chôn xác động vật của Phânviện Thú Y miền Trung

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật từ các hầm chôn xác động vật cókhả năng sinh tổng hợp protease tham gia vào quá trình phân hủy xác động vật

- Xác định các đặc tính vi sinh vật học của chủng vi sinh vật phân lập được

- Xác định các điều kiện tối ưu ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợpprotease của chủng vi sinh vật phân lập được

- Xác định các đặc tính lý hóa của enzym protease của chủng vi sinh vậtphân lập được

- Đánh giá khả năng phân hủy protein của chủng vi sinh vật phân lậpđược trong trên cơ chất thịt trong quy mô phòng thí nghiệm

3.4 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

Môi trường nuôi cấy

Môi trường I (môi trường phân lập): 1% (w/v) peptone; 0,3% (w/v) caothịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar, pH = 7 hấpkhử trùng 1100C trong 30 phút

Môi trường II (kiểm tra hoạt tính protease): 1% (w/v) peptone; 0,3% (w/v)cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar, 1%(w/v) casein, pH = 7, hấp khử trùng 1210C trong 30 phút

Môi trường III (kiểm tra hoạt tính cellulase): 1%(w/v) peptone; 0,3% (w/v)cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; bổ sung 2%(w/v) agar, 0,5% (w/v) Glucose, 1%(w/v) CMC, pH = 7, hấp khử trùng 1100C trong 30 phút

Môi trường IV (kiểm tra hoạt tính amylase): 1% (w/v) peptone; 0,3%(w/v) cao thịt; 0,5% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) Glucose; bổ sung 2% (w/v) agar,1% (w/v) tinh bột tan, pH = 7, hấp khử trùng 1100C trong 30 phút

Hoá chất:

Các hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phântích, chủ yếu là hóa chất của các hãng như Merck, Sigma, Favorgen được trìnhbày qua bảng 3.1:

Bảng 3.1 Thành phần các loại dung dịch và đệm NHÓM HOÁ CHẤT HOÁ CHẤT

Môi trường nuôi cấy Pepton, cao thịt, NaCl, agar

Định tính enzym protease

Peptone, cao thịt, NaCl, agar, casein, dung dịch nhuộm Comassie Briliant Blue (30% v/v methanol, 10% v/v axetic axit, 0,1% w/v CBB), dung dịch tẩy (30% v/v methanol, 10% v/v axetic axit)

Định tính cellulase, amylase Peptone, cao thịt, NaCl, agar, tinh bột,

CMC, thuốc thử LugolNhuộm gram Crystal violet, lugol, ethanol, fuchsinTách chiết DNA vi khuẩn Lysozyme, protease K, lysis buffer

type 4, wash buffer type 6, elution buffer type 5, RNAse A

Phản ứng khuếch đại gen (PCR) DNA, primer, taq, H2O, dNTP buffer,

MgCl2

Thiết bị

Nghiên cứu được thực hiện với các trang thiết bị, máy móc hiện đại, có độchính xác cao của Bộ môn Công nghệ Sinh học và Phòng Thí nghiệm chung,Phân viện Thú Y miền Trung Bao gồm có : tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh -40C, -200C,-800C, nồi hấp khử trùng, máy PCR, bể điều nhiệt cách thủy, máy li tâm lạnh,máy đo quang phổ kế, máy lắc, cân phân tích, máy chuẩn pH, hệ thống điện dingang, pipet, máy ảnh, kính hiển vi

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu tổng quát được trình bày ở các hình 3.1 và 3.2

Lấy mẫu đất Phân lập các chủng vi sinh vật

Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính

protease mạnh nhất

(Phương pháp khuếch tán thạch)

Đặc điểm hình thái (Quan sát dưới kính hiển vi)

Đặc điểm sinh hóa (Test catalase, amylase, cellulase)

Nhận diện vi sinh vật (Phương pháp PCR)

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease (Anson cải tiến)

Xác định các đặc tính lý hóa của enzym protease (Anson cải tiến)

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả phân hủy

3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở cả bốn hầm chôn xác động vật của Phânviện Mẫu đất được lấy vào các bình tam giác nút bông đã được khử trùng trước

đó (15g mẫu đất/bình), rồi đem về phòng thí nghiệm và tiến hành phân tích visinh trong vòng 24 giờ

3.4.2.2 Phân lập vi khuẩn

Mẫu đất lấy về (115 mẫu) được lắc trong 30ml dung dịch nước muối sinh

lý 0,9% trong 30 phút, sau đó tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý từ 10

-1 đến 10-7 lần Hút 100µl dịch ở các nồng độ pha loãng khác nhau trang trên đĩathạch chứa môi trường I đã chuẩn bị sẵn Các đĩa thạch được đem ủ trong tủ ấm

ở 300C, sau 24-48 giờ trên đĩa thạch sẽ xuất hiện nhiều dạng khuẩn lạc Cáckhuẩn lạc được cấy chuyển sang các đĩa môi trường I mới bằng phương pháp ria

ba pha để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ Có thể tiếp tục cấy chuyển 2 hoặc 3lần như vậy cho đến khi thu được các khuẩn lạc thuần

3.4.2.3 Định tính protease bằng phương pháp khuếch tán thạch

Tất cả các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được tiến hành kiểm tra khảnăng sinh enzym protease Các chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở 300Ctrong 24 giờ Dịch nuôi cấy được đem ly tâm ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phúttrong 5 phút để loại bỏ cặn tế bào 50µl các dịch nổi được đem nhỏ vào cácgiếng 10mm đã được đục sẵn trên các đĩa môi trường II-agar Các đĩa này được

để ở 40C trong 24 giờ để cho phép toàn bộ dịch nổi khuếch tán vào trong thạch,sau đó chuyển qua tủ ấm 300C để enzym phân giải cơ chất casein Sau 24 giờ,các đĩa thạch được nhuộm với dung dịch nhuộm Comassie Briliant Blue (30%

Lựa chọn chủng để lên men sản xuất

Lên men chủng được chọn theo phương pháp lên men trên môi trường rắn

Thu sinh khối Phối trộn trên cơ chất Chế phẩm chứa vi khuẩn Đánh giá khả năng phân hủy

ở quy mô phòng thí nghiệm

v/v methanol, 10% v/v axetic axit, 0,1% w/v CBB) (bảng 2.1) trong 30 phút, vàrửa lại bằng dung dịch tẩy (bảng 2.1) Vòng phân giải protein sẽ xuất hiện màusáng hơn so với môi trường xung quanh Tiến hành đo đường kính vòng phângiải để bước đầu đánh giá hoạt độ enzym protease của các chủng vi sinh vật.

3.4.2.4 Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến

Hoạt tính protease được xác đinh theo phương pháp Anson cải tiến.Protease tác dụng với cơ chất casein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA.Thuốc thử Folin-Ciocalteau có chứa phosphomolipdic axit và phosphowolframicaxit, các gốc này phản ứng với gốc tyrosine (Tyr) và tryptophan (Trp) trongphân tử protein tạo thành phức chất màu xanh da trời hấp thụ cực đại ở bướcsóng 750nm Do đó ta có thể xác định hoạt tính protease thông qua hàm lượngtyrosine và tryptophan

Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzym trong điều kiện tiêuchuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCAcho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương ứng với 1µmoltyrosine

Tiến hành

Phản ứng enzym

Ống thí nghiệm: hút 0,5ml dịch enzym vào ống nghiệm giữ ở 400C, thêm0,5ml dịch casein (đã đạt 300C) lắc đều giữ ở 300C trong 10 phút Sau đó cho3ml TCA vào, hỗn hợp được lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng để dừngphản ứng hoàn toàn rồi ly tâm 10 phút với 10.000 vòng/phút để thu dịch trongsuốt có chứa sản phẩm hoà tan của phản ứng enzym Hàm lượng của sản phẩmtrong dung dịch lọc được xác định bằng phản ứng màu

Ống kiểm tra: hút 0,5ml dịch enzym và 3ml TCA vào ống nghiệm, lắc

đều để bất hoạt enzym, thêm 0,5ml casein vào lắc đều và làm tiếp tục như ốngthí nghiệm Mỗi ống thí nghiệm của một dịch vi sinh vật có một ống kiểm trariêng

Ống đối chứng: thay 0,5ml dịch nuôi vi sinh vật bằng 0,5ml nước cất Các

bước tiếp theo tiến hành tương tự như ống thí nghiệm

Phản ứng màu

Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào các ống nghiệm, thêm 2ml

Na2CO3 6% lắc đều Bổ sung 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều Sau

30 phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu ở máy quang phổ bước sóng 750nm

Hiệu số hấp thụ đọc trên máy so màu giữa ống thí nghiệm và ống kiểmtra được đối chiếu trên đồ thị chuẩn tyrosine Hoạt tính của 1ml dịch enzymđược tính theo công thức

X = .4. 2

t

b a

Trong đó: X là số đơn vị hoạt tính trong 1ml dịch enzym, 4 là thể tíchhỗn hợp phản ứng enzym, a là số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số đọc trênmáy giữa ống thí nghiệm và ống kiểm tra, b là độ pha loãng dung dịch enzym, t

là thời gian phản ứng (10 phút)

Dựng đường chuẩn: chuẩn bị dung dịch Tyr 1µmol/ml trong 0,2N HCl.

Sau đó, tiến hành pha loãng bằng 0,2N HCl để được các nồng độ từ 0,1-1µmol/ml Lấy 0,5ml các dung dịch này và làm phản ứng màu như trên

Đường chuẩn có phương trình y = 1,576x + 0,071

Trong đó: y là độ hấp phụ ở bước sóng 750nm, x là nồng độ tyrosinetrong dải 0,1-1µmol/ml

Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 3.4.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi sinh vật

Quan sát dưới kính hiển vi: lấy 1 giọt dịch vi sinh vật nuôi cấy trên môi

trường lỏng đặt lên lam kính Bổ sung muối sinh lý 0,9% và quan sát dưới kínhhiển vi vật kính dầu với độ phóng đại 1000X

Nhuộm Gram: nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam kính, sau đó dùng que

cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn hoà vào giọt nước, dàn mỏng giọthuyền phù, hong khô và cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm tiêu bảnbằng dung dịch crystal violet trong 1 phút rồi rửa bằng nước cất, vẩy khô Sau

đó nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol, để trong 1 phút Đổ dung dịch lugol, rửa

qua bằng cồn ethanol, nhỏ cồn ethanol cho chảy qua tiêu bản đến khi dịch rửakhông còn màu thì thôi, rửa nước, thấm nhẹ xung quanh vết bôi Nhuộm tiếpbằng dung dịch fuchsin để 1 phút, rửa lại bằng nước và để khô Quan sát sự bắtmàu thuốc nhuộm của vi khuẩn dưới vật kính dầu Gram dương sẽ bắt màu xanhtím, Gram âm bắt màu hồng

3.4.2.6 Định tính amylase

Các chủng được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở 300C trong 24 giờ Dịchnuôi cấy được ly tâm ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏcặn tế bào 50µl các dịch nổi được đem nhỏ vào các giếng 10mm đã được đụcsẵn trên các đĩa môi trường IV Các đĩa này được để ở 40C trong 24giờ để chophép toàn bộ dịch nổi khuếch tán vào trong thạch, sau đó chuyển qua tủ ấm 300C

để enzym phân giải cơ chất tinh bột Sau 24 giờ, các đĩa thạch được đem nhuộmvới dung dịch lugol và quan sát vòng sáng xuất hiện trên nền xanh đen của đĩathạch do tinh bột phản ứng với iốt

3.4.2.7.Định tính cellulase

Các bước tiến hành tương tự phương pháp định tính amylase Dịch nổi visinh vật được đem nhỏ vào các giếng đục sẵn trên đĩa thạch chứa cơ chất củacellulase là CMC (môi trường III) Quan sát vòng sáng xuất hiện trên nền màuhồng nhạt của đĩa thạch do CMC phản ứng với thuốc thử

3.4.2.8 Định tính catalase

Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường I cho phát triển với mật

độ dày đặc Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật, và quan sátxem sự sủi bọt khí có xảy ra hay không

3.4.2.9 Nhận diện vi sinh vật bằng phản ứng PCR

Tách chiết DNA vi khuẩn

DNA vi khuẩn được tách chiết bằng bộ kit tách chiết Favorgen theo hướngdẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1)

Mồi xuôi 9F: 5’ GAG TTT GAT CCT GGC TAC G 3’

Mồi ngược 1525r: 5’ AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC 3’

Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích trong một phản ứng (µl)

Tổng thể tích phản ứng 25 (µl)

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm có các bước: biến tính các mẫuDNA ở 940C trong 2 phút Sau đó thực hiện 35 chu kỳ gồm: 940C trong 1 phút ,

550C trong 1 phút, 720C trong 3 phút và cuối cùng 720C trong 10 phút

Sản phẩm được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sau đó được điện di trêngel agarose 1% có bổ sung ethidium bromide (EtBr) So sánh độ dài băng DNA

vi khuẩn phân lập với các băng DNA chuẩn (Marker) dưới ánh sáng tử ngoại

3.4.2.10 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease

Động thái sinh trưởng

Chủng Bacillus sp phân lập được được nuôi lắc ở 300C, 200 vòng/phúttrong môi trường I trong 32 giờ Dịch nuôi vi khuẩn được thu tại các thời điểmkhác nhau để xác định hoạt độ protease và mật độ tế bào

Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

Để khảo sát nhiệt độ tối ưu, chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc 200vòng/phút trong môi trường I, tại các nhiệt độ khác nhau 280C, 300C, 400C,

500C, 600C, 700C Sau 24 giờ, dịch nuôi vi sinh vật được đem xác định mật độ

vi sinh vật trên máy quang phổ tại bước sóng 620nm, và hoạt độ enzym proteasetrong dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến Kết quảthu được sẽ cho phép chúng tôi xác định được nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để chủng

vi khuẩn Bacillus phân lập được sinh enzym protease

Xác định pH tối ưu

Để khảo sát pH tối ưu của môi trường cho chủng vi khuẩn Bacillus đã

phân lập sinh enzym protease, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn, lắc 200vòng/phút ở nhiệt độ tối ưu đã xác định được trước đó, trong môi trường I với

các pH khác nhau 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Mật độ vi sinh vật và hoạt độ enzymprotease trong dịch nuôi vi sinh vật cũng được xác định tương tự như thí nghiệmxác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu Kết quả thu được sẽ cho phép chúng tôi xác

định được pH môi trường tối ưu để chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được sinh

enzym protease

3.4.2.11 Xác định điều kiện tối ưu cho enzym protease

Nhiệt độ tối ưu

Để xác định protease của chủng Bacillus đã phân lập hoạt động tốt nhất ở

nhiệt độ nào, dịch enzym được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30 -700C trong

5-10 phút để ổn định Sau đó ủ với cơ chất casein ở nhiệt độ tương ứng trong 5-10phút Xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến

pH tối ưu

Mỗi một enzym hoạt động tối ưu ở một phổ pH nhất định Để khảo sát pHmôi trường phản ứng tối ưu, hỗn hợp enzym-cơ chất được thực hiện ở các pHkhác nhau từ 5,5–9 Các bước tiếp theo tiến hành theo phương pháp Anson cải

tiến để xác định hoạt độ enzym của chủng Bacillus phân lập được ở các độ pH

khác nhau

Độ bền nhiệt

Để nghiên cứu tính bền nhiệt protease của chủng Bacillus phân lập được

chúng tôi tiến hành ủ dịch enzym ở các nhiệt độ khác nhau từ 30 – 700C trong 1giờ Sau đó xác định hoạt tính enzym còn lại theo phương pháp Anson cải tiến

Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm

Số liệu thực nghiệm được xử lý trên phần mềm tin học Microsoft Exel 2003

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật tổng hợp protease

4.1.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ hầm phân hủy xác động vật

Để phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp proteasetham gia vào quá trình phân hủy xác động vật chúng tôi đã lấy 115 mẫu đất ởhầm chôn xác động vật tại Phân viện Thú y miền Trung, tiến hành pha loãngbằng nước muối sinh lý từ 10-1 đến 10-7, và nuôi cấy trên môi trường cơ bản Đã