Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro

Xuất phát từ tình hình thực tiễn nhằm bảo tồn loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp hữu hiệu cho hệ sốnhân chồi cao, ch

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (1,5mg/l) kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

(sau 35 ngày nuôi cấy) 25Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l)

và Kinetine (0,3mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 27Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l) và NAA (0,3mg/l) kết hợp với khoai tây đến khả

năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 29Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l) và NAA (0,3mg/l) kết hợp với chuối xanh đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

31Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l), NAA (0,3mg/l) kết hợp với nước dừa đến khả

năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 33

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân

nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 24Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l) kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau

35 ngày nuôi cấy) 25Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l) và

Kinetine (0,3mg/l) kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 27Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l) và NAA (0,3mg/l) kết hợp với khoai tây đến khả

năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 30Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l) và NAA (0,3mg/l) kết hợp với chuối xanh đến

khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

31Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5mg/l),

Kinetine (0,3mg/l), NAA (0,3mg/l) kết hợp với nước dừa đến khả

năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) 34

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) thuộc họ Lan

-Orchidaceae, được phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh của Việt Nam [4] Chi Lan

Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall) Là một loại thảo dược

có giá trị dược liệu, Lan Kim Tuyến có khả năng chữa trị các bệnh ung thư,chống tăng huyết áp, lưu thông khí huyết, kháng khuẩn, làm thuốc trị lao phổi,

ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm dạ dày mãn tính, viêmkhí quản, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, v.v [4] Ngoài tácdụng chữa bệnh Lan Kim Tuyến còn được dùng làm cảnh [1]

Hiện nay với nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng tăng Lan Kim Tuyến

đã bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt ngoài tự nhiên [1] Lan Kim Tuyến đượcxếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác sửdụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d

trong Sách đỏ Việt Nam (2007), phần thực vật [5], [4] Xuất phát từ tình hình

thực tiễn nhằm bảo tồn loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii việc

ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp hữu hiệu cho hệ sốnhân chồi cao, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và giữ được các đặc tính ditruyền của cây mẹ

Xuất phát từ tính cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro”.

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus

roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro.

1.3 Yêu cầu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin

và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

Xác định ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhânnhanh chồi Lan Kim Tuyến

1.4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra kĩ thuật nhân nhanh chồi lan Kim

Tuyến bằng phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Giúp sinh viên tiếp cận được với công tác nghiên cứu khoa học, qua đónâng cao trình độ chuyên môn và tạo cho sinh viên có tác phong làm việcnghiêm túc, sáng tạo

- Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nhân giống lanKim Tuyến nhằm cung cấp cây giống với số lượng lớn, có chất lượng đồng đềuđồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc

Bảo tồn được loại dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây lan Kim Tuyến

2.1.1 Phân loại thực vật

Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus roxburghii (Wall.) [4].

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây lan Kim Tuyến

Lan Kim Tuyến là cây thảo, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nướcmang 2-6 lá mọc xoè sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và cómũi ngắn, cỡ 3,5-4,5 x 2,5-3,5 cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên Hệ gân lá mạnglưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặttrên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu

đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá

ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0.6-1.2 cm, thường nhẵn và có màu trắngxanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Hoa tự chùm mọc ở đầungọn thân, trục hoa dài từ 5-20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10hoa Mùa hoa nở tháng 9-12 Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau Hoa có cánhmôi màu trắng Hai bên rìa mang từ 6-8 râu mỗi bên [10]

- Về mặt cấu tạo, Lan Kim Tuyến có các đặc điểm sau:

+ Thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài.

Chiều dài thân rễ từ 5-12cm, trung bình là 7,87cm Đường kính thân rễ từ 4mm, trung bình là 3,17mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03lóng Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 1,99cm Thân rễ thường có màuxanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [10]

3-+ Rễ: Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình

thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấuchỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ Số

lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường

từ 3-10 rễ, trung bình là 5,4 rễ Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8cm, rễ dài nhấttrung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm, chiều dài trung bình củacác rễ trên một cây là 3,82cm [10]

+ Thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi

mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4-6cm, trung bình 5,4cm Đường kínhthân khí sinh từ 2,5-3,5cm, trung bình là 2,98cm Thân khí sinh mang nhiềulóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4lóng, trung bình là 3,6 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4cm, trung bình 1,52cm Thânkhí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng,đôi khi có màu hồng nhạt [10]

+ Lá: Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần

tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3-4cm, trung bình là4,03cm và rộng từ 2-3cm, trung bình là 3,12cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên vàphủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc.Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa cómàu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Cácgân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6-1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ

và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thường có 4 lá Kích thước

của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt[10]

+ Hoa: Cụm hoa dài 10-15cm, mang 4-10 hoa mọc thưa Lá bắc hình

trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5-3cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm,môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu,hốc chứa mật dài 7mm, bầu dài 1,3cm màu lục có nhiều lông mềm [4], [10]

2.1.3 Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến

- Phân bố theo kiểu rừng: Lan Kim Tuyến hầu hết phân bố ở rừng kín lá rộng, rừng thường có cấu trúc 2 tầng cây gỗ [10]

- Phân bố theo trạng thái rừng: Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khuvực Lan Kim Tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ khoảng 15-30%, độ caocủa lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực Lan KimTuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi, thảm tươi dày đặc Chúng có thểnằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ [10]

- Phân bố theo sinh cảnh: Lan Kim Tuyến chủ yếu phân bố trên đất,chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm, độ xốp cao, thoángkhí, thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ Đôi khi chúngmọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây trên cácđoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây Có thể bắt gặp Lan Kim Tuyến ở trongrừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừngtrúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng [10]

- Phân bố theo địa lý, địa hình: Phân bố ở hầu hết các dạng địa hình, như

chân núi, sườn núi, đỉnh núi [10]

- Phân bố theo đai cao: Lan Kim Tuyến thường phân bố ở đai cao trên735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m [10]

Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm các tỉnh:Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quảng Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây(Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kom Tum (Đắc Tô: Đăc Uy),Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng), Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Thuận, Hà Tĩnh,Quảng Trị, Đắk Lăk [4]

Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan,Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [4]

2.1.4 Giá trị của lan Kim Tuyến

- Giá trị kinh tế

Hiện nay Lan Kim Tuyến ngoài tự nhiên đã bị thu hái đến mức cạn kiệt[16] do có rất nhiều tác dụng dược liệu và làm cây cảnh Giá bán trên thị trườngthế giới của Lan Kim Tuyến khô là 3.200USD/kg [29], cây tươi có giá từ 300-320USD/kg, nếu được thu hái trong tự nhiên, đặc biệt có nấm cộng sinh ở rễ thìgiá này sẽ cao gấp 3 hoặc nhiều hơn nữa [17], [29] Cây giống Lan Kim Tuyến

có thể tạo từ nhân in vitro các mắt đốt thân, hạt giống và các bộ phận sinh dưỡng của cây Tuy nhiên sự sinh trưởng các của cây Lan Kim Tuyến in vitro chậm,

kéo dài thời gian nhân giống Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây Lan Kim

Tuyến từ nuôi cấy hạt in vitro Trung Quốc, Đài Loan, Nhật bản đã trồng và xuất

khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nguồn thu lớn

- Giá trị dược liệu

Lan Kim Tuyến có rất nhiều tác dụng dược liệu do có chứa axit hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit,kinsenoside nên được sử dụng trong điều trị bệnh [29]

4-Theo y học cổ truyền Đài Loan, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô nấu nước

uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận [21], [26],sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách, tim, phổi [16], [17], [26], [27].Cây tươi sử dụng để chữa các vết thương do rắn cắn [16], [29] Dịch chiết LanKim tuyến có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng đểchữa các bệnh về gan [25], [26], [19] chống khối u, ung thư và tính chống virus[18], điều trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống mệt mỏi [27]

Gần đây, một hợp chất 3(R)-3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên

thương mại là kinsenoside được chiết xuất từ Lan Kim Tuyến có tác dụng chống

tăng huyết áp hiệu quả và hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đếnchức năng tim mạch [25] Lan Kim Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co,

Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa, chuỗipolysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người [19]

Cây Lan Kim Tuyến sau khi thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sảnphẩm gồm thân, rễ và lá phơi khô để chế biến trà dược, thực phẩm chức năng,thạch Lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide

từ Lan Kim Tuyến để sản xuất biệt dược kinsenoside [29].

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả cácloại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [6] Nhân giống vô tính in vitro

được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn

rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng củaống nghiệm [3]

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống

vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những

ưu điểm như tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm; Chủ động sảnxuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng công nghiệphóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ,ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống với sốlượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới [3]

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hànhnuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng[13]

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khảnăng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tếbào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bàonguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộthông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuậnlợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh[13]

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thựcnghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vôtính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [13]

Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô

tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thểhoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]

- Sự phân hóa và phản phân hóa

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của

mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Ví dụ: Mô dậulàm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dựtrữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng [6]

Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt

Hình 2.1: Sơ đồ phân hóa tế bào

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cầnthiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phânchia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phânhóa tế bào [13]

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa tế bào

Hình 2.2: Sơ đồ phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, cómột số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới,còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chươngtrình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử acid deoxyribonucleic của mỗi

tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn đượchài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ứcchế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thướccủa khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [6]

2.2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôicấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại củanuôi cấy mô [12]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chấthóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn [12]

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó, có ý nghĩa quyết định đến thànhcông trong nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử

lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất

Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng cấy và tủ cấy vô trùng, phòng nuôi cây [12]

- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quátrình sinh trưởng của mô nuôi cấy

+ Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếusáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sángthích hợp với đa số các loài cây là 12-18h/ngày Cường độ ánh sáng tác độngđến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [12]

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởngcủa mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìnchung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000lux (Morein,1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái

của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so

với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn caonhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay, trong cácphòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ35-40cm [12]

+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnhhưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vàoxuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt

2.2.3.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiếtcho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thànhcông hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khácnhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiêncứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứumột loại môi trường cơ bản phù hợp [12]

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấythực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụngcho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ

rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợpcho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trường B5 dùng thử nghiệm trênđậu tương [12]

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đềugồm một số thành phần cơ bản sau [3] [13]:

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Nguồn cacbon

Các vitamin và aminoacid

Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

Các chất điều hòa sinh trưởng

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quantrọng Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào,nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein Ngoài ra, cácnguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cầnthiết cho hoạt động sống của tế bào [13]

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôicấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme [13]

Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môitrường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quantrọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào [13]

- Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang

hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của

tế bào [13]

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đườngsaccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế chosaccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thựcvật [13]

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màuvàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào

- Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro

ở các loài khác nhau là khác nhau [13]

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhấtphải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axít.Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự pháttriển của thực vật Vitamin B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trườngnuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [13]

- Các chất bổ sung

+ Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về VanOverbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) [24] Sau đó, tác dụng tích cựccủa nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tácgiả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chấtkhoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [18]

Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ởnhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc saubảo quản Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau

đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh [18]

Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởngcủa mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quảnlạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn [18]

Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kíchthích phân hóa và nhân nhanh chồi

+ Khoai tây

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin như

trưởng và phát triển của mô, tế bào Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môitrường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác [30] Nồng độkhoai tây thường sử dụng là 20mg/l [25]

+ Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào.Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tếbào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặcbột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (chuối xanh) nhằm tăngcường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

+ Agar

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắnhoá môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại tinh bột đặcchế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì

+ pH môi trường

Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pHcủa môi trường thường từ 5,6-6,0 [2] Nếu pH của môi trường thấp hơn 5,0 thìagar sẽ khó đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng

- Các chất điều tiết sinh trưởng:

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin,ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinhtrưởng phát triển và phân hóa cơ quan

+ Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA IAA có tácdụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ NgoàiIAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4 - diclophenoxy axit (2,4 D).Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trongquá trình hình thành rễ [1], [2], [6]

NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện Chất này có tác dụng tăng

hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đếntrao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môitrường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA [13]

NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ Kết quảnghiên cứu của Butenco (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong

tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzyme vàkích hoạt enzyme hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin kíchthích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và cácenzyme phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thayđổi tính thấm của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAAkết dính vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm

trưởng Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [3]

Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang pháttriển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phầnphía dưới của cây

+ Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia

tế bào Các cytokinin thường gặp là Kinetin, BAP Kinetin được Skoog pháthiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axit nucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuấtcủa bazơ nitơ adenine BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tínhmạnh hơn Kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bàokéo dài thời gian động của tế bào phân sinh và làm hạt chế sự hoá già của tế bào.Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợpADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym Cơ chếtác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương

hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon vớiADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [3], [13], [14]

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải cácchất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởngnội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác độngtương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp củaAaxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hìnhthái của tế bào và mô Những nghiên cứu của tác giả Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì thích hợp cho quátrình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển

mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụngđồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA,dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giaiđoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theothì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đãkhẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể làcytokinin điều kiển quá trình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạtđang phát triển [3], [13], [14]

+ Gibberellin

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhậtKurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroigây ra Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G Fujikuroi và đượcgọi là gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vìvậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bìnhthường Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có cácchất giống như gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt têntheo thứ tự là A1, A2, A3 và A4 Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham

gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chấtđiều hoà sinh trưởng khác [13]

Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đóđược vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem

2.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Lan Kim Tuyến trên thế giới

và trong nước

2.3.1.Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến trên thế giới

Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tiến hành phương pháp nhân giống

hàng loạt Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách thụ phấn chéo và nuôi

cấy hạt nảy mầm Sau khi thụ phấn số quả đậu đạt 86,7% Những hạt 7 tuần tuổiđược nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8%chuối trong 4 tháng Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA2mg/l trong bình nón 125ml trong 2 tháng Trước khi tiến hành thụ phấn trongống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy trên môitrường ½ MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2mg/l và NAA 0,5mg/l[29]

Năm 2004, Kiet Van Nguyen đã nghiên cứu thành công quy trình nhân

giống in vitro loài Lan Kim Tuyến - Anoectochilus formosanus Môi trường tạo

vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l +peptone 2g/l) Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ)+ than hoạt tính 1% [21]

Năm 2011, Lazarus Agus Sukamto và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A.

setaceus tốt nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A formosanus với TDZ là 0,5 mg/l Số lá

cao nhất của A.setaceus với TDZ 0,001 mg/l, còn A formosanus với hàm lượng TDZ là 0,005mg/l Số chồi được tạo ra trên môi trường TDZ đối với loài A.

setaceus là 0,01mg/l còn với A formosanus là 0,05mg/l Số rễ cao nhất của A setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A formosanus là 0,005mg/l [22].

Năm 2012, N Ahamed Sherif và cs đã nghiên cứu thành công quy trình

tái sinh tạo cây hoàn chỉnh loài Anoectochilus elatus Lindley từ nguyên liệu ban

đầu là mắt đốt thân và chồi đỉnh Chồi phát triển tốt nhất ở nồng độ TDZ 3,0mg/l

và chiều dài chồi đạt cao nhất ở nồng độ KIN 3,5mg/l với mắt đốt thân, ở

0,01mg/l đối với chồi đỉnh Anoectochilus elatus Lindley ra rễ 100% ở môi trường

có bổ sung than hoạt tính 0,3g/l [23]

Năm 2008, Yang Bai-yun đã nghiên cứu về loài Anoectochilus

roxburghii đã kết luận môi trường tốt nhất cho nhân nhanh protocom là MS +

BA 2,0mg/l + NAA 0,2 mg/l cho hệ số nhân của 9.4 lần Môi trường ra rễ phùhợp nhất là 1/2 MS + NAA 0,2 mg/l + than hoạt tính 0,05% + agar 0,7 sốrễ/cây đạt 4.4 rễ [28].

2.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến ở Việt Nam

Năm 2009, Phùng Văn Phê và cs đã đưa ra kết quả nghiên cứu về đặc

điểm hình thái và phân bố của loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus

Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10]

Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nhân

nhanh chồi in vitro loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.

Kết quả cho thấy: Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

in vitro là Knud Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ

2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sungBAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa 100ml/l + dịch chiết

khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l [9]

Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã tiến hành nghiên cứu kĩ thuật

nhân giống loài Lan Kim Tuyến in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý Kết quả

cho thấy: Cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân đượckhử trùng và đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson) Sau

đó, các chồi và mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung

BA, Kinetin, αNAA trong 4 tuần NAA trong 4 tuần Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thểchồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + αNAA trong 4 tuần NAA0,3mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là

6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3-4cm được sử dụng để ra rễ in vitro.

Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có

bổ sung αNAA trong 4 tuần -NAA 1mg/l [11]

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nuôi cấy là giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghi)

được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoahọc Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus

roxburghii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sựsống, Đại học Nông LâmThái Nguyên

3.2.2 Thời gian tiến hành

Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Dụng cụ

- Micropipette 200µl

- Đầu côn vô trùng

- Pank, dao, kéo, đĩa cấy

- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, Kinetine, NAA

- Chất hữu cơ tự nhiên: Khoai tây, nước dừa, chuối xanh

3.3.3 Thiết bị

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh

trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên

(khoai tây, nước dừa, chuối xanh) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một

số chất kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).

- Cách tiến hành

Chồi tái sinh từ mẫu cấy khoảng 4-6 tuần sinh trưởng và phát triển bìnhthường có đầy đủ thân, lá được sử dụng làm mẫu cấy chuyển sang môi trườngnhân nhanh

Sử dụng dao đã khử trùng cắt lấy đoạn chồi có chiều dài từ 1,5-2 cm, dùng

pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi cấy vàomôi trường nhân nhanh

Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều Sau khi cấy xongcác bình này được đưa vào phòng nuôi Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chấtlượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi Thí nghiệm được bố trí như sau:

Nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ở thínghiệm 1 (kí hiệu A) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP tốt nhất kết

hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngàynuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi Kinetine và A (nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh chồiLan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 1) được bổ sung vào môi trường nền vớicác nồng độ sau:

Nồng độ BAP và kinetine thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

ở thí nghiệm 2 (kí hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine tốt

nhất kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi NAA được bổ sung vào môi trường nền và B ( nồng độ BAP vàkinetine thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến được xác định ở thínghiệm 2)

- Cách tiến hành: như nội dung 1

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine và

NAA tốt nhất kết hợp với khoai tây đến khả năng nhân nhanh chồi Lan KimTuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi Khoai tây được bổ sung vào môi trường nền và C (nồng độBAP, Kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến đượcxác định ở thí nghiệm 3)

Công thức Nồng độ khoai tây (g/l)

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine và

NAA tốt nhất kết hợp với chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan KimTuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi Chuối xanh được bổ sung vào môi trường nền và C (nồng độBAP, Kinetine và NAA thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến đượcxác định ở thí nghiệm 3)

Công thức Nồng độ chuối xanh (g/l)

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP, Kinetine,

NAA tốt nhất kết hợp với nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan KimTuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy trong 3 bình, mỗibình cấy 5 chồi Nước dừa được bổ sung vào môi trường nền và D (nồng độ

BAP, Kinetinen, NAA và khoai tây thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan KimTuyến được xác định ở thí nghiệm 4).

Công thức Nồng độ nước dừa (ml/l)

3.4.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi

- Thường xuyên theo dõi hàng ngày, đánh giá tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn…

- Sau 35 ngày theo dõi tiến hành xác định các chỉ tiêu:

Hệ số nhân chồi

Tổng số chồi (chồi)Tổng số mẫu nuôi cấy(mẫu)

- Chất lượng chồi đánh giá ở 3 mức:

+ Chồi tốt (+++): Chồi khỏe, mập, cao, hình thái bình thường (không didạng)

+ Chồi trung bình (++): Chồi gầy, sinh trưởng bình thường

+ Chồi xấu (+): Chồi bị dị dạng

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excell 2007

- Quá trình xử lý thực hiện trên máy tính theo chương trình IRRISTAT 5.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến

Nhân nhanh là giai đoạn kích thích sự phân hóa các mầm chồi từ mộthay vài chồi ban đầu Đây là giai đoạn không thể thiếu với một quy trình sản

xuất giống có tính chất công nghiệp bằng phương pháp nhân giống in vitro.

Trong giai đoạn này sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy phụ thuộcvào điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng), môi trường nuôi cấy (thành phầndinh dưỡng, chất điều tiết sinh trưởng và tỷ lệ giữa chúng) Tùy theo từng loạicây mà người ta có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều tiếtsinh trưởng với nồng độ và tỷ lệ khác nhau để thu được hệ số nhân chồi vàchất lượng chồi cao nhất

Với mục đích nhân nhanh chồi cây Lan Kim Tuyến sau tái sinh, chúngtôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng(BAP, Kinetine, NAA) và chất hữu cơ tự nhiên (khoai tây nước dừa chuối

xanh) đến sự nhân nhanh của chồi cây Lan Kim Tuyến Anoectochilus

roxburghii sau tái sinh Kết quả thu được như sau:

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau 35 ngày nuôi cấy)

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy)

Công thức Nồng độ

BAP (mg/l)

Tổng số mẫu cấy (mẫu/CT)

Hệ số nhân chồi (lần)

Chất lượng chồi