Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bọ ánh kim hại hồi

Nấm gây bệnh cho côn trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trongviệc không chế côn trùng gây hại.Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do côntrùng gây hại của các chủng nấm vật ký sinh

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây hồi là tên gọi chung của giống Illicium thuộc họ Schisandraceae, giống hồi Illicium Hồi là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được xem là cây

nguyên sản của vùng Đông Bắc Việt Nam nói chung, tỉnh Lạng Sơn nói riêng.Cây hồi được trồng ở các huyện miền núi của tỉnh Lạng Sơn như huyện VănQuan, Bình Gia, Cao Lộc, Bắc Sơn, Lộc Bình với khoảng 37.000 ha, giá trịhoa hồi xuất khẩu đã và đang đem lại nguồn thu trên 600 tỷ đồng mỗi năm.Đây là nguồn nông sản xuất khẩu chính của tỉnh và cũng là nguồn thu nhậpchính của bà con nông dân dân tộc ít người và các xã đặc biệt khó khăn.Câyhồi không chỉ có vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế xã hội của tinhLạng Sơn mà nó còn là nét biểu trưng cho văn hóa, địa lý con người xứ Lạng

Trong quả hồi có chứa đường và rất nhiều các hợp chất hóa học như:anethol, tecpen, pinen, dipenten, limonen ở dạng tinh dầu Hồi là một vịthuốc được dùng trong cả đông y và tây y Tây y dùng hồi làm thuốc trungtiện, giúp tiêu hóa, lợi sữa, tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ Gần đây,tinh dầu hồi được sử dụng như nguồn dược liệu quý trong việc tạo kháng sinh

Tamiflu chống bệnh cúm A/H5N1, H3N2… trên gia cầm.Trong đông y hồi có

tác dụng đuổi hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa đau bụng, bụng đầy chướng,giải độc của thịt cá và trong chế biến thực phẩm khác

Cây hồi được coi là cây có ít sâu bệnh cho nên nó ít được quan tâmnghiên cứu trong thời gian dài Hầu hết các tư liệu về sâu bệnh hại cây hồiđều rất hiếm Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây tình hình sâu hại trên câyhồi ngày càng gia tăng nghiêm trọng nhấtlà bọ ánh kim (BAK) hại hồi đang làmối lo âu hàng đầu cho các rừng hồi.Bọ ánh kim hoa hại hồi là một loài sâuthuộc họ ánh kim Chrysomelidae đa và đang bùng phát với số lượng lớn, gâyhại nặng trên diện tích hơn 12.000 ha thuộc địa bàn 3 huyện Văn Quan, Cao

Lộc, Lộc Bình trên tổng số gần 37.000ha rừng hồi của cả tỉnh Cả trưởngthành và ấu trùng đều ăn lá cây, ấu trùng tuổi nhỏ ăn nhu mô lá làm cho lá câythủng lỗ chỗ, nhưng ấu trùng tuổi lớn lại có thể ăn trụi hết lá, từ lá non, lábánh tẻ cho đến lá già.

Khi mật độ sâu cao đã ăn trụi hết lá cây làm cho cây không thể phụchồi, cánh lá khô héo dần và dẫn đến chết toàn cây, ảnh hưởng lớn mật độ vànăng suất quả hồi Bọ ánh kim hoa hại hồi đã được các nhà khoa học thuộc

Bảo tàng Australia giám định tên khoa học là Oides sp.

Bọ ánh kimOides sp là loài sâu hại rất khó phòng trừ, có khả năng phát

tán nhanh Nếu không phòng trừ kịp thời sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sựtồn tại và phát triển của cây hồi Để phòng trừ bọ ánh kim hại hồi người dân

đã sử dụng nhiều loại thuốc hoá học, kể cả phương pháp xông khói,tuy nhiêntheo đánh giá của một số cán bộ tại chi cục bảo vệ thực vật (huyện Văn Quan,tỉnh Lạng Sơn) các phương pháp trên chi phí rất tốn kém hiệu quả phòng trừhạn chế do phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết Việc sử dụng thuốc hóahọc đã và đang làm ô nhiễm môi trường sinh thái, tiêu diệt thiên địch tựnhiên, ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi

Phòng trừ sinh học với các ưu điểm nổi bật như: an toàn, không gây ônhiễm môi trường, không gây độc hại đối với con người và sinh vật khác,hiệu quả bền vững hiện nay đang có xu hướng được sử dụng rộng rãi đểphòng trừ sâu bệnh hại theo hướng bền vững Cho nên chúng tôi tập trung vàonghiên cứu theo hướng phòng trừ bằng các biện pháp sinh học

Cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu nào về việc phòngtrừbọ ánh kimbằng biện pháp sinh học vì thế chúng tôi thực hiện đề

tài"Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bọ ánh kim hại hồi ( Oides sp.)" góp phần bảo vệ môi trường sinh thái, quản lý dịch hại

bền vững

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định phân lập loài nấm Metarhizium anisopliae(M.anisopliae) và Beauveria bassiana(B.bassiana)có hoạt lực cao trong việc phòng trừ bọ ánh

kim hại hồi

Đánh giá hiệu lực phòng trừ của các loài nấm đối với bọ ánh kim hại hồi

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu các đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm

M.anisopliae và B.bassianalà cơ sở khoa học quan trọng trong việc tạo chế

phẩm sinh học phòng trừ bọ ánh kim hại hồi

*Ý nghĩa thực tiễn

Phát triển và sử dụng chế phẩm M anisopliae và B bassianatrong

phòng bọ ánh kimhại hồi giảm sử dụng thuốc trừ sâu hoá học, góp phần bảo

vệ môi trường,sản xuất sản phẩm an toàn phục vụ xuất khẩu

Phần I TỔNG QUAN

2.1.Cơ sở khoa học

Trong sinh quần nông nghiệp có nhiều tác nhân sinh học là nhân tốđiều hòa tự nhiên, duy trì cần bằng sinh thái của quần thể sinh vật trên đồngruộng (Phạm Văn Lầm, 1995) [1].Trong số các tác nhân sinh học gây chết sâuhại cây trồng thì nấm ký sinh côn trùng chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng.Theo tác giả E A Steinhaus (1949) thì các nấm diệt sâu trong thiên nhiênchưa cần đến con người đã làm được nhiệm vụ điều hoà và tiêu diệt mộtlượng lớn các côn trùng gây hại (dẫn theo N N Tú và CS)[2]

Nấm gây bệnh cho côn trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trongviệc không chế côn trùng gây hại.Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do côntrùng gây hại của các chủng nấm vật ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiềucông trình của nhiều tác giả trên thế giới (V.P Paspelop 1940, Dusky S.R

1959, Hanada I 1959 -1964…) Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thốngquản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS, 1986).Việc nghiêncứu bệnh lý học côn trùngđã được tiến hành từ rất sớm

Do bọ ánh kim sinh trưởng và phát triển trong tiểu khí hậu ẩm thấp nênrất thuận lợi cho sự lây nhiễm của bệnh nấm Thành phần nấm ký sinh đadạng phong phú, chúng là yếu tố gây chết chủ yếu đối với bọ ánh kim Trongthành phần nấm ký sinh tự nhiên trên bọ ánh kim hại hồi thì loài nấm

M.anisopliae và B.bassianacó mức độ xuất hiện cao nên có nhiều tiềm năng

trong việc khống chế quần thểbọ ánh kim Đánh giá bước đầu cho thấy đây lànguồn nấm có nhiều triển vọng trong việc phát triển chế phẩm sinh học đểphòng bọ ánh kim.Thông tin nói trên là những luận cứ quan trọng, làm cơ sở

định hướng cho việc thực hiện đề tài“Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ bọ ánh kim hại hồi”

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu sâu bệnh hại cây hồi ở ngoài nước

* Sơ lược về sâu bệnh hại cây hồi

Hồi nói chung và giống hồi I verum nói triêng có sự phân bố rất hẹp,

chúng chỉ sống trên núi cao của một số nước trên thế giới cho nên nhữngnghiên cứu về sâu bệnh hại hồi trên thế giới khá hiếm hoi Còn tác giả Hook

lại nhận định rằng trên giống đại hồi I verum, các loài nấm gây hại là vấn đề

cần phải quan tâm bởi cây hồi sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm cao, rấtthuận lợi cho các loài nấm bệnh phát triển (Agroforesty database 4.0) Nhữngghi nhận về sâu bệnh hại trên cây hồi nơi là quê hương của cây hồi (TrungQuốc) cũng khá hiếm Trong một nghiên cứu của Yuelan (2004) về cây hồi đã

phát hiện ra loài sâu hại mới Pseudodoniella sp gây hại trên cây hồi ở tỉnh

Guangxi từ tháng 5 cho đến đầu mùa đông, trưởng thành qua đông trên thâncây và đẻ trứng vào tháng 3 cho đến tháng 4 năm sau Tác giả Zhao (2009) đãcông bố thành phần sâu bệnh hại cây hồi tại tỉnh Funing (Trung Quốc) gồm

có 20 loại sâu bệnh gây hại cho cây hồi Trong đó có 9 loài bệnh, 10 loài sâu

và 1 loài thực vật ký sinh Khi cây hồi ở tỉnh Lạng Sơn bị loài sâu hại thuộc

họ bọ ánh kim Chrysomelidae gây hại nặng Mẫu vật này đã được gửi đếnBảo tàng Australia và loài gây hại này mới chỉ được giám định đến giống với

tên khoa học là Oidessp[17].

Họ Chrysomelidae là một họ lớn trong bộ cánh cứng Coleoptera với hơn40.000 loài phân bố trên toàn thế giới hầu hết trong số chúng là loài ăn thựcvật, thành phần ký chủ của chúng tương đối phức tạp (Jolivet và cs, 1995).Thành phần loài của họ chrysomelidae ở Anh khá phong phú, chúng gồm 264loài thuộc 60 giống của 7 họ phụ, trong đó họ phụ Galerucinae có số lượnggiống loài lớn nhất (32 giống, 142 loài)[18] Chỉ tính riêng số loài thuộc bọánh kim Chrysomelidae ở bang Ohio (Mỹ) đã có tới hơn 400 loài chúng thuộc

99 giống của 12 họ phụ Trong đó họ phụ Halticinae có số giống loài nhiềunhất, chúng tương ứng là 27 giống, 124 loài (Hughes, 1944) Số loài thuộc họChrysomelidae ở Đài Loan ghi nhận được chưa nhiều, chỉ có 43 loài thuộc 36giống của 10 họ phụ được giám định với 5 loài được ghi nhận lần đầu tiên cho

hệ côn trùng Đài Loan Trong số đó, họ phụ Galerucinae có số lượng loài nhiềunhất (19 loài) (Kimoto, 1965) Khi nghiên cứu về thành phần các loài thuộc họ bọánh kim ở vùng Châu Á Thái Bình Dương tác giả Kimoto và Gressitt (1963) đãthống kê và giám định được 1.249 loài thuộc 5 họ phụ, bổ sung 178 loài mớithuộc côn trùng họ ánh kim cho khu hệ côn trùng Trung Quốc và Hàn Quốc

Trong cuốn sách này có loài Oides leucomelaena được ghi nhận gây hại trên cây

có dầu ở Trung Quốc trong một phạm vi rất hẹp, những thông tin về loài này cũngrất hạn chế Ở vùng Thái Lan và Đông Dương, tác giả đã ghi nhận được 188 loàithuộc 36 giống của 5 họ phụ, trong đó họ phụ Cryptocephalinae có số loài nhiềunhất với 81 loài, 16 loài mới đã được bổ sung cho danh sách các loài côn trùng họánh kim ở Thái Lan và Đông Dương (Kimoto và Gressitt (1981)

* Đặc điểm sinh học của một số loài sâu hại chính trên cây hồi

Những dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh học của các loài sâu hại trên

cây hồi khá khiêm tốn và sơ sài.Loài sâu hại Pseudodoniella sp được ghi

nhận có 3-4 lứa/năm các lứa gối lên nhau.Chúng qua đông ở giai đoạn trưởngthành trên những thân cây Trưởng thành kết đôi giao phối và đẻ trứng vàogiữa tháng 3 và tháng 4 năm sau, ấu trùng xuất hiện vào giữa hoặc cuối tháng

5 Cả trưởng thành và ấu trùng đều chích hút ở những phần non của cây nhưbúp non, ngọn non, nụ và hoa (Yuelan, 2004) Ngoài ra còn một loài sâu bộcánh vảy khác thuộc họ Geometridae chưa xác định được tên khoa học, gâyhại rất nặng trên cây hồi, chúng có 3-4 lứa/năm, qua đông ở giai đoạn nhộnghoặc ấu trùng Ban ngày trưởng thành thường nấp ở những nơi tối và bẩn,chúng có xu hướng ánh sáng yếu Trứng phát triển trong khoang bụng và có

tới 300 trứng, thời gian phát dục của trứng 6-13 ngày Ấu trùng tuổi nhỏ ăn ởmặt sau lá cây khi ấu trùng tuổi lớn chúng có thể ăn toàn bộ lá cây Nhộngđược làm trong lớp đất mặt tơi xốp ở độ sâu khoảng 6-10 cm [19] Cho đếnnay những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của loài sâu hại bộ cánh cứngcũng như sâu hại thuộc họ Chrysomelidae trên cây hồi chưa hề được nghiêncứu hay đề cập đến trong bất kỳ tài liệu nào đã được tham khảo.

* Biện pháp phòng trừ

Một số biện pháp phòng trừ sâu hại cây hồi được đề cập trong các tàiliệu tham khảo đều là những biện pháp thủ công cơ giới vật lý Các tác giảkhuyến cáo lợi dụng các đặc điểm sinh học của chúng như giai đoạn chúngqua đông, vị trí, thời điểm qua đông để có những biện pháp thu bắt làm giảmmật độ của chúng vào năm sau Rất ít biện pháp hóa học được khuyến cáo,hoạt chất beta-cypermethrin có được khuyến cáo nhưng với nồng độ khá cao800-1000 lần so với nồng độ khuyến cáo [20]

2.2.2 Tình hình nghiên cứu các chủng nấm gây hại côn trùng trên thế giới

Nấm gây bệnh cho côn trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trongviệc không chế côn trùng gây hại Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do côntrùng gây hại của các chủng nấm vật ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiềucông trình của nhiều tác giả trên thế giới (V.P Paspelop 1932- 1940, DuskyS.R 1959,Tanada I 1959 -1964, Hall I M 1964,… ).Đây là một nhân tố hữudụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và

CS, 1986)[15].Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để để phòngtrừ sinh học đối với các loài côn trùng đã được quan tâm nghiên cứu và ứngdụng từ rất sớm

Năm 1815, Agostino Bassi đã mô tả tỷ mỷ về nấm trắng Muscardin

(B.bassiana) trên tằm dâu và đưa ra biện pháp phòng trừ (dẫn theo T K.

Chỉnh, 1996) Sau đó một số công trình nghiên cứu về nấm có ích của tác giảnhư Oduen (1837), Luis Pasteur (1885-1890), Carte A và Levrat D(1909) v.v đã công bố những tài liệu trong đó miêu tả tỉ mỉ về hình thái cácchủng vi nấm ký côn trùng và sự phân bố của chúng trong tự nhiên Tronggiai đoạn này vấn đề sử dụng nấm có ích trong đấu tranh sinh học cũng đượcquan tâm nghiên cứu Người đi tiên phong trong lĩnh vực này chính là nhàkhoa học người Nga Ilya Ilich Mechnikov (1884) Ông cùng người học tròcủa mình là nhà côn trùng học Isac Krasirsik đã tiến hành sản xuất bào tử nấm

M anisopliae , trộn với đất bột để tung ra đồng ruộng diệt sâu non và trưởng thành bọ đầu dại hại củ cải đường (Bothinoderes punctiventris) và đã đạt được hiệu quả gây chết đến 55-80% sau 10-14 ngày[3].

Tiếp đó rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nấm cóích phòng trừ sâu hại cây trồng Các công trình tập trung nghiên cứu khả năngnhân nuôi nấm và đã xác định được môi trường thích hợp để nhân sinh khối

một số chủng nấm như Cordyceps norvegica (Sopp U J ,1911), Euprocties phacorhoca (Speare A G 1912) Entomophthorales sp (Wolff M., 1925)

[15] Ở thời kỳ đó thì thành tựu này là một tiến bộ rất to lớn Nó giúp vạch raphương hướng sử dụng vi sinh vật đấu tranh với côn trùng hại trên quy môlớn Sau giai đoạn này các thí nghiệm về nhân sinh khối và sử dụng nấm kýsinh để đấu tranh sinh học với các loại sâu hại đã được bổ xung và hoàn thiệnhơn bởi các nhà nghiên cứu khoa học người Nga như V.P Pospelov (1932).L.V Chesnova (1959),… Cũng trong khoảng thời gian này, tại Mỹ, EdwardSteinhaus (1944) là người đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm về bệnh lý họccôn trùng thuộc trường Đại học tổng hợp Califonia ở Berkeley

Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôicấy các nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng hại đã được phát triển rất mạnh

mẽ Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng các

loại nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng nông, lâmnghiệp của Muller – Cogler E (1961) Hall I.M (1963-1964), Camera J W.,Mac – Bain (1963-1967), Ferron P (1967), Madelin M.F (1965-1966),Ignoffo C.M (1977),, H D Burges và CS (1982), N K Maniania và CS.(1984) … Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất tỷ mỷ về phương pháp

để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phươngpháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phấm sinh học và sử dụng chúngtrên đồng ruộng(dẫn theo T K Chỉnh, 1996)[3]

Trong những năm gần đây, một loạt các công trình nghiên cứu sản xuất

và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh côn trùng Các chếphẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việcphòng chống sâu hại cây trồng đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe conngười (Noris et al., 2002; dẫn theo Sahayaraj K et al 2008) [15]

Tại Bắc và Trung Mỹ các công trình khoa học chủ yếu tập trung nghiêncứu sử dụng các loại nấm ký sinh đề phòng trừ sâu đục thân ngô, ruồi trắnghại khoai lang và các côn trùng sống trong đất như vòi voi hại rễ chanh, bọhung hại mía, côn trùng nhóm Scarab (Stimac J.L., 1994; L.L Allee, 1998;Hunter D M, 2000; Frank D.C, Borets, 2004) Ở Mỹ các nhà khoa học đã

chú trọng nghiên cứu và sử dụng nấmPaecilomyces,M anisopliae và B bassiana trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây,

bông, lúa mì đậu đỗ và ngô (Campell và CS, 1985; Hajek và CS., 1987;Anderson và CS., 1988; Quintela và CS., 1990; Bing, 1991) Ở Canada đã

nghiên cứu ứng dụng nấm B bassiana và Paecilomyces để phòng trừ châu

chấu hại lúa và loài rệp vừng (Heyden và CS, 1992) Còn tại các nước Mỹ tinh mà điển hình là tại Brazil đã có nhiều công trình nghiên cứu với xu

La-hướng sử dụng nấm M anisopliae và B Bassiana,Paecilomyces để phòng trừ

côn trùng trong đất hại cây trồng (Lobolima và CS., 1992; Quitella và

CS.,1998; Fernandes E K và CS., 2008) Hiện nay tại Bzazi các chế phẩmnấm ký sinh đã ứng dụng tới vài triệu hecta cây trồng

Ở các nước Châu Âu như Đức, Anh, Italy, Séc, Balan và Rumani đã

tập trung nghiên cứu và ứng dụng nấm M anisopliae để diệt côn trùng Tại

Đức ứng dụng nấm diệt mối đất, sâu vòi voi hại nho (Hanel; Andersch vàZimmerman) Tại Nga chế phẩm Boverin phòng trừ thành công bọ cánh cứngColorado Beetle (Ferron 1978) Một số nước Bắc Âu như Phần Lan, ThuỵĐiển cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng nấm có ích để phòng trừ sâu hạicây trồng (Wandresch và CS ,1990; Vainio và CS 1990; Keller và CS 1993)

Còn tại Châu Á, các tác giả ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, đã sử

dụng nấm Paecilomyces farinosus, B bassiana (Am, Wu.) và M anisopliae

để phòng trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatus (Fan và CS), sâu đục thân (Li), châu chấu hại lúa Locusta migratoria ( Lu và CS 1993) Tại Malaysia, nấm xanh Metarhizium anisopliae đã được nghiên cứu để phòng trừ mối đất

đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụngnấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày Năm 1986,

Rombach và cộng sự đã tiến hành phun nấm M anisopliae, M flavoviride, B bassiana và Hirsulella citriformis ở liều lượng 5 x 1012 bt/ha phòng trừ rầynâu hại lúa và nhận thấy hiệu quả của chế phẩm đạt cao nhất sau 2 tuần [16].Tại Nhật Bản, năm 1988 một số nhà khoa học đã sử dụng nấm xanh để phòngtrừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70%, sau 10 ngày

Những năm 1985-1995, thế kỷ XX nhiều nhà khoa học ở Liên xô cũ,Bungari đã nghiên cứu ứng dụng thuốc nấm Beauverin trừ sâu hại rau và sâróm hại thông đạt kết quả tốt, hiệu quả trừ sâu róm thông đạt trên 90%, năngsuất ổn định và chất lượng an toàn(Videnova E , K Velichcova )[8]

Tại Châu Á, năm 1990 ở Philippin, tác giả R Aguda và CS đã nghiên

cứu ứng dụng nấm B.bassiana trừ rầy nâu Nilaparvata lugens hại lúa , kết quả

phòng trừ đạt trên 70%[13]

Tại Úc, năm 1991 Miler đã nghiên cứu nấm M anisopliae để phòng trừ

bọ hung hại mía trên đồng ruộng đạt hiệu quả 68% Hiện nay trên thế giới đãsản xuất và thương mại hóa thành công nhiều loại chế phẩm sinh học từ nấmvới tên thương mại như Cobican, Bioplast Metarquino, Biogreen từ các

chủng nấm M Anisopliae; chế phẩm Boverin, Boverol, Boverosil, Ostrinil, Mycotrol WP, BotaniGard, Naturalis –L ( từ các chủng nấm B bassiana

(Buut và Cropping 2000, 2001) và các chế phẩm Prefera, Peak Bardan,

Futureco Nofly có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces fumosoroseus để phòng

trừ nhiều loại sâu hại cây trồng

Năm 1995 tác giả Milner R Đã lựa chọn được chủng M Anisopliae từ loài Antitrogus sp và Lepidiota sp với liều lượng LC50 là 1x106 – 5x106 bàotử/gam để phòng trừ bọ hung hại mía, tác giả ghi nhận thấy hiệu quả 87,6%sau 10 ngày thí nghiệm, năng suất mía cao, chất lượng an toàn

* Một số đặc điểm của nấm M.anisopliae và B.bassiana

Cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ XX các nhà bệnh lý côn trùng trên thế giớimới công bố nhiều công trình nghiên cứu về những chủng nấm có khả năngdiệt côn trùng hại cây trồng thông qua giám định và miêu tả Năm 1944, tạitrường đại học tổng hợp California, nhà khoa học Edward Steinhaus, ngườiđầu tiên thành lập ra phòng thí nghiệm chuyên nghiên cứu về bệnh lý học côntrùng bằng kính hiển vi điện tử, tác giả tập trung chủ yếu vào 2 chi nấm côntrùng có triển vọng:

a- : Chi Beauveria

Vì nấm có mầu trắng nên thường gọi tên là nấm bạch cương hoặc nấmtrắng Nhiều nước như Liên Xô cũ, Anh và Mỹ đã sản xuất thành công chế

phẩm nấm Beauveria với tên thương mại là Beauverin dựa vào động tố.

Trong chi này có 3 loài nấm chính có khả năng diệt côn trùng, đó là:

* Đặc điểm hình thái của nấm B bassiana

NấmB.bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào(1 tế bào), không

mầu, hình cầu hoặc hình trứng, đường kính từ 1-4m sợi nấm có đường kínhnằm ngang từ 3-5m phát triển mạnh trên môi trường nhân tạo hoặc trên cơthể côn trùng, chúng mang nhiều giá sinh bào tử, phồng to ở phía dưới vớikích thước 3-5 x 3-6 m Các giá bào tử trần thường tạo thành các nhánh ởphần ngọn hoặc trực tiếp tạo thành ra nhánh của giá, phần ngọn của bào tử códạng cuống hẹp hình dích zắc không đều

*Độc tố của nấm B Bassiana là Beauvericin

Năm 1696 R.L Hamill và cộng sự đã xác định được độc tố diệt côn

trùng của nấm bạch cương B bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin Năm 1971 Y.A Ovehinnokov và cộng sự đã tổng hợp lại độc tố

này, tác giả Jame và cs đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trìnhtrao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu vàng tenelin và basianin,những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra

từ testosteron (C19H28O2) sinh ra Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin có danhpháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy-izovaleryl).Đây là một loạidepxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94oC Từ một lít môi trường nuôi cấy

nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g Beauvericin.

*Cơ chế tác động của nấm B bassiana lên cơ thể con trùng:

Trong tự nhiên khi bào tử nấm B bassiana rơi vào cơ thể côn trùng,

thông qua tiếp xúc lây lan, gặp điều thời tiết thích hợp chỉ sau 12-24h thì bào

tử nấm nẩy mầm, chúng hình thành sợi đâm xuyên qua lớp vỏ kitin sau đóphát triển bên trong cơ thể côn trùng, côn trùng phải huy động các tế bào bạchhuyết để chống đỡ những nấm Beauveria tiết độc tố Beauvericin có chứaProteaza và một số chất khác phá huỷ ngay cả tế bào bạch huyết, làm cho sâuchết, sợi nấm mọc rất nhiều trong cơ thể sâu và sau đó chui ra ngoài, tạo ramột lớp bào tử phủ trên cơ thể sâu[4]

*Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh

Triệu chứng đặc trưng nhất là sự thay đổi các di động của côntrùng, sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh Khi bị bệnh các

mô dần dần bị phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau ngừnghẳn nằm im một chỗ cho đến khi chết.Khi bị bệnh nấm, vận động của côntrùng ngừng từ 2-3 ngày thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển đầy trongthân côn trùng Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn

thân mới thay đổi và xuất hiện những vết đen Khi sâu hại bị bệnh do nấm B bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm phát triển vào bên trong thân sâu tạo nên

một vệt đen không có hình thù nhất định Côn trùng chết do nấm thường cómàu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại Khi bị bệnh nấm thân côn

trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếuthức ăn Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thường tác động đến những mô

nhất định, côn trùng bị nấm B bassiana ký sinh thì tuyến mỡ và các mô khác

bị hòa tan là do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính nhờ đặcđiểm đó mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật

nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp (Coelomycidium, Entomophyhora ) gây

ra Hiện tượng chết hoặc gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng củabệnh nấm, quá trình này tiến triển qua hai giai đoạn:

- Hiện tượng chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ

bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô táisinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương

- Hiện tượng nhiễm trùng máu: của côn trùng khi bị bệnh nấm là do

lympho máu chứa đầy sợi nấm

b- :Chi Metarhizium:

Nấm Metarhizium nằm trong nhóm nấm bất toàn Deuterumycetes, loài

nấm này có sự phát triển mạnh trên môi trường thạch, có mầu xanh tối vớikích thước 5-8m lúc đầu mầu trắng – vàng, sau chuyển dần sang màu xanhlục, nên gọi là nấm lục cương hay nấm xanh Các nhà khoa học trên thế giới

nghiên cứu đã xác định chi nấm Metarhizium có 2 loài nấm chính ký sinh gây

bệnh trên côn trùng:

- Metarhizyum anisopliaaeký sinh chủ yếu trên bộ cánh bằng

Isoptera( mối)

bộ cánh thẳng Orthoptera(cào cào,châu chấu), bộ cánh đều, bộ cánh cứng

- Metarhizyum flavoviride ký sinh chủ yếu trên cá pha côn trùng bộ

cánh thẳng Orthoptera, bộ cánh cứng, 1 số sâu non bộ cánh vẩy

*Đặc điểm hình thái cơ bản:

Chi nấm Metarhizium có sợi nấm và bào tử lúc đầu có màu trắng rồi

chuyển sang màu xanh,cuống sinh bào tử ngắn:

Nấm Metarhizium favoviride: có bào tử trần hình oval hay hình trứng Nấm Metarhizium anisopliae: bào tử hình cổ chai hay hình trụ, hình hạt

đỗ Kích thước bào tử khoảng 3,5- 6,4 m, bào tử có màu lục xám đến màuxanh oliu, chúng thường đứng riêng rẽ hoặc có thể xếp thành chuỗi

*Độc tố của nấm Metarhizium:

Bao gồm 1 số ngoại độc tố Dextruxin A,B,C,D

Dextruxin A có công thức nguyên là C29H47O7N5 có điểm sôi là 1880C

Dextruxin B có công thức nguyên là C30H51O7N5 có điểm sôi là 2340C

*Cơ chế tác động của nấm M alisopliaelên cơ thể con trùng:

Cũng giống như nấm B bassiana, khi bào tử nấm M alisopliae rơi vào

cơ thể côn trùng, thông qua tiếp xúc lây lan trên côn trùng hại cây trồng [4]

2.3 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

2.3.1 Tình hình nghiên cứu sâu bệnh hại cây hồi ở trong nước

* Thành phần sâu bệnh hại cây hồi

Qua các cuộc điều tra sâu bệnh hại cây trồng nông nghiệp các năm1967-1968, 1977-1978, 1997-1998 và sâu bệnh hại rừng trồng 2000-2005(Viện Bảo vệ thực vật, 1976; 1999a; 1999b; Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2006)cây hồi và sâu bệnh hại cây hồi hầu như không được quan tâm nghiên cứu.Chỉ đến khi bọ ánh kim bùng phát mạnh ở Lạng Sơn mới có một số thông tin

về thành phần sâu bệnh hại trên cây hồi ở xã Yên Phúc huyện Văn Quan củatỉnh Lạng Sơn mới được đăng tải, những thông tin này được trích dẫn từ mộtbáo cáo của một đề tài tốt nghiệp đại học từ những năm 1994-1995 Tại thời

điểm đó tác giả đã ghi nhận được 19 loài sâu hại, 5 loài bệnh gây hại trên cây

hồi và nguy hiểm hơn cả là loài sâu hại bọ ánh kim Oides leucomeleana Pic.

(Cao Anh Đương, 2012)[12]

Thành phần sâu hại họ bọ ánh kim Chrysomelidae điều tra được ở miềnBắc nước ta năm 1967-1968 trên các cây trồng nông nghiệp và cây dại gồm

147 loài (Viện Bảo vệ thực vật, 1976) Kết quả điều tra ở miền Nam có số loàithuộc họ ánh kim ít hơn rất nhiều so với tập hợp côn trùng họ ánh kim ở miềnBắc, chúng chỉ có khoảng 20 loài và là những sâu hại thứ yếu (Viện Bảo vệthực vật, 1999a) Trên nhóm cây ăn quả số loài côn trùng họ ánh kim ghi nhậnđược cũng không nhiều, chúng chỉ có 14 loài gây hại trên cây mận, đào, cam,quýt, nhãn vải, táo hầu hết trong số chúng là sâu hại thứ yếu, chưa có tàiliệu nào ghi nhận về loài bọ ánh kim gây hại cây hồi ở Việt Nam (Viện Bảo

vệ thực vật, 1999b)

* Đặc điểm sinh học của một số loài sâu hại chính trên cây hồi

Những nghiên cứu về đặc điểm sinh học của côn trùng cánh cứng họánh kim ở Việt Nam rất ít Chỉ mới có một số loài như bọ ăn lá nâu vàng xanh

Phyllocharis undulata ăn lá cây mò hoa trắng và loài sâu gai hại ngô Dactylispa balyi (Gestro) đã được nghiên cứu đặc điểm sinh học (Bùi Hải

Sơn, 1990) Nhưng những nghiên cứu này khá sơ sài và mới dừng lại ở việcxác định được các tuổi, thời gian phát dục các pha và vòng đời của chúng màchưa khai thác được các đặc điểm sinh học khác như xác định được khoảngnhiệt độ thích hợp và không thích hợp cho loài phát triển hay tỷ lệ chết củaloài qua các tuổi khác nhau Trong một vài số báo Nông nghiệp gần đây tác

giả Cao Anh Đương có đề cập đến loài bọ ánh kim hoa Oides leucomelaena

hại cây hồi mà tác giả đã từng nghiên cứu trong những năm 1994-1995, tácgiả đã ghi nhận loài bọ ánh kim (BAK) gây hại trên cây hồi từ tháng 2 đếntháng 7-9 hàng năm, trứng được đẻ thành từng ổ trên những cành tăm và được

phủ một lớp sáp Khi trứng mới được đẻ có màu trắng sữa, sau chuyển dầnsang màu xám ghi và dần đồng màu với vỏ cây hồi, trứng thường được đẻ rộvào khoảng tháng 6-8 và ấu trùng xuất hiện vào tháng 2-3 năm sau và rất cóthể loài bọ ánh kim này qua đông ở giai đoạn trứng (Cao Anh Đương, 2012)

* Biện pháp phòng trừ bọ ánh kim

Thực tế đã cho thấy biện pháp hóa học được một số bà con nông dân sửdụng trong phòng chống BAK đều cho hiệu quả phòng chống không cao CaoAnh Đương đã nhận định biện pháp hóa học có hiệu quả rất kém trong phòngtrừ BAK hại cây hồi bởi khả năng bay của trưởng thành và địa lý đồi núi hiểmtrở cũng như phương tiện bơm phun không phù hợp Biện pháp canh tác có hiệuquả tốt trong giảm mật độ BAK hại hổi Việc vệ sinh đồng ruộng, dẫy cỏ và phánơi làm tổ của nhộng hay trong khi thu hái quả hồi tiến hành tiêu diệt ổ trứng củaBAK là một trong những giải pháp tốt giảm mật độ BAK cho vụ hồi sau (CaoAnh Đương, 2012)

Những nghiên cứu về sâu bệnh hại cây hồi cũng như loài BAK hại câyhồi ở Việt Nam còn khá hiếm và sơ sài Cho đến nay mới chỉ có duy nhấtthông tin về tổng số loài sâu bệnh đã xác định được và một số đặc điểm sinhhọc của loài BAK đã được nghiên cứu trong một báo cáo tốt nghiệp đại họcnăm 1994-1995

2.3.2 Tình hình nghiên cứu các chủng nấm gây hại côn trùng trong nước

Ở nước ta hướng ứng dụng nấm ký sinh công trùng để phòng trừ sâu hạicây trồng được đề cập đến trong những năm 70 của thế kỷ trước, nhưng trong

15 năm trở lại đây mới có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về lĩnhvực này Các công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại nước ta chủyếu tập trung vào công tác thu thập chủng, phân lập các chủng giống bản địa

và phát triển sinh khối tạo chế phẩm sinh học phòng trừ các loại sâu mà bịchính chủng nấm đó ký sinh

Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục

cươngMetarhizium mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium[5].

Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cs thuộc viện Bảo vệ thực vật đã phân

lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc 2 loàiMetarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride để phòng trừ cho các loài sâu bọ hại

cây nông, lâm nghiệp bằng phương pháp phun trực tiếp bào

tử Metarhizium trên đồng ruộng.

Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đã phân lập, nuôi cấy một số

chủngM.anisopliae và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu

bệnh hại cây nông nghiệp[3]

Phạm Thị Thùy và cộng sự (2002 - 2003), đã nghiên cứu sử dụng

nấmM.anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định bằng phương pháp phun trực tiếp.Kết quả cho thấy chế phẩm nấm M anisopliae đều có hiệu quả

cao với ấu trùng và trưởng thành của bọ dừa, đặc biệt là hiệu quả kéo dài đến

8 tuần sau phun.Điểm giá trị nhất của chế phẩm nấm là hiệu quả kéo dài,nấmkhông gây ô nhiễm môi trường và nguy hiểm đối với con người, không làmmất đi những loài kí sinh thiên địch có ích khác[6]

Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh và cs ở Trung tâmnghiên cứu phòng trừ mối đã nghiên cứu tuyển chọn các

chủng Metarhiziumcó hiệu lực cao để phòng trừ các loài gây hại điển hình ở nước ta, như loài mối nhà nguy hiểm nhất Coptotermes formosanus Shiraki.

Chế phẩm Metarhizium từ nghiên cứu của Lê Thùy Quyên để diệt trừ

các loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn lá và đặc biệt là khả năng tiêudiệt được một số loài côn trùng hại cây trồng trong đất như bọ hung, mối đất.Nấm có hiệu quả cao để phòng trừ bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông

trắng, bồ đề, hại cây điều, cây ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắt cải,sâu khoang hại cà chua…cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%.

Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu và sử dụng nấm Me.anisopliae và B.bassiana để phòng trừ một số sâu hại cây trồng (Phạm Thị Thuỳ, 1994) Bào tử nấm Metarhizium có khả năng gây chết trên 50% (LT50) cá thể các loại sâu bộ cánh vảy như sâu xanh da láng Spodoptera exigua, sâu xanh Heliothis armigera với lượng là 105bt/ml sau 48 giờ (Tạ Kim Chỉnh, Lý Kim

Bảng, 1995) Nấm xanh M.anisopliae được ứng dụng vào việc quản lý sâu rầy

hại lúa (Nguyễn Thị Lộc, 1997, 2001) Việt Nam cũng đã có sản phẩm với tên

thương mại là Mat được chế từ nấm xanh M.anisopliae trừ bọ cánh cứng hại

dừa và Boverit trừ sâu róm thông và các loại sâu hại cây trồng khác (ViệnBảo vệ thực vật, 2001)

Năm 2002 Trung tâm sinh học - Viện bảo vệ thực vật đã nghiên cứu

hoàn thiện quy trình nhân sinh khối nấm B.bassiana, trên cơ sở cải tiến môi

trường nhân sinh khối với việc bổ xung 10% trấu và một số phụ gia vào môi

trường cơ bản Với quy trình này đã sản xuất chế phẩm nấm B.bassiana đạt

lượng bào tử 2,5 x109 bt/g Còn đối với nấm M.anisopliae nhóm đề tài đã sử

dụng với nguyên liệu là tấm gạo, luộc rồi sấy khô, hỗn hợp với dịch CaCO30,5% để nhân lượng lớn sinh khối nấm với lượng bào tử đạt 3,2 x 109bt/g Đãhoàn thiện công nghệ sản xuất theo phương pháp lên men xốp bằng cácnguyên liệu rẻ tiền (Nguyễn Thị Chúc Quỳnh và CTV, 2009; Lê Văn Trịnh vàCTV 2010) [7] Hai chế phẩm nấm do Trung tâm sản xuất với tên thương mại

là Mat và Boverit đã được đưa vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật đượcphép sử dụng ở Việt Nam năm 2001

Từ năm 1996 đến nay, Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệthực vật đã thu thập, phân lập, tạo thuần và tuyển chọn được 28 chủng (10

chủng Beauveria và 18 chủng Metarhizium) trên các loại sâu hại khác nhau

tại các tỉnh phía Bắc và phía Nam Trong số đó đã chọn được 4 chủng có hoạtlực diệt côn trùng rất cao và hiện đang sử dụng để sản xuất chế phẩm là 2

chủng B.bassiana và M.anisopliae ở phía Bắc, 2 chủng B.bassiana và M.anisopliae ở phía Nam Hai chế phẩm nấm với tên thương mại là Mat và

Boverit đã được đưa vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng

ở Việt Nam vào năm 2001, để phòng trừ sâu tơ hại rau, rầy nâu hại lúa, bọcánh cứng hại dừa, sâu róm hại thông và một số loại sâu hại cây trồng nônglâm nghiệp khác Về công nghệ sản xuất, các cơ sở nghiên cứu ở trong nước

đã ứng dụng và phát triển các công nghệ đã có trên thế giới trong đó chủ yếu

là công nghệ lên men xốp Đồng thời đã cải tiến một số khâu trong quy trìnhsản xuất cho phù hợp với điều kiện của nước ta Đã hoàn thiện công nghệ sản

xuất B.bassiana theo phương pháp lên men xốp bằng các nguyên liệu rẻ tiền Đối với nấm M.anisopliae các tác giả đã sử dụng với nguyên liệu là tấm gạo,

luộc rồi sấy khô, hỗn hợp với dịch CaCO3 0,5% để nhân lượng lớn sinh khốivới lượng bào tử 3,2 x 109bt/g (L V Trịnh và CS, 2010)

Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ thực vật trong một vàinăm trở lại đây đãquan tâm nghiên cứu một số chủng có tiềm năng trongphòng trừ sinh học đối với một số loại sâu miệng chích hút Năm 2010, nhómnghiên cứu nấm ký sinh côn trùng thuộc Trung tâm, đã tiến hành thu thậpphân lập được một số nguồn nấmký sinh trên rầy nâu, rầy xám, rầy lưng trắnghại lúa Đánh giá bước đầu cho thấy, đây là những nguồn nấm có nhiều triểnvọng để phát triển chế phẩm sinh học phòng một số loài rầy hại lúa Đã sản

xuất được 2.355kg Beauveria và 3.275kg Metarhizium sử dụng trừ sâu keo da

láng, sâu khoang ăn lá đậu tương và sâu xanh đục quả đậu xanh Hiệu quả của

Beauveria với sâu xanh là 68,2% - 72,3%, còn của Metarhizium đạt từ

69,2-75,1%, hiệu quả của nấm Metarhizium trừ bọ hại dừa ở các tỉnh phía Nam

như Bến Tre, Bình Định, Bà Rịa Vũng Tàu đạt 63,63% - 81,42%

Trên cây ăn quả, kết quả của mô hình trình diễn trên cam, quýt, bưởi ở

tỉnh Tiền Giang cho thấy, chế phẩm nấm M anisopliae có hiệu quả cao với

rầy mềm hại cam quýt, đạt tới 83,3 % còn đối với rầy chổng cánh hại camquýt cũng đạt được 70,4% Hiệu quả kinh tế của mô hình sử dụng chế phẩmnấm đạt lợi nhuận cao hơn đối chứng 1.682.000 đồng/ha (N.T Lộc, 2006)

Phần II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm M.anisopliaevàB.bassianaký sinh bọ ánh kim hại hồi đã được

phân lập tại Viện bảo vệ thực vật

- Bọ ánh kim hại hồi( Oides sp )

- Cây hồi giống

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Nồi hấp vô trùng, tủ sấy vô trùng, buồng cấy vô trùng

- Tủ lạnh, tủ định ôn, kính hiển vi

- Đèn cực tím, đèn cồn

- Đĩa petri, bình tam giác

- Que cấy, pipet, bông, giấy thấm

- Một số dụng cụ cân đong khác

3.1.3 Nguyên vật liệu, hoá chất

Nguyên liệu: sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền như bột ngô mảnh, cámgạo, gạo, bột đậu tương, bã bia

- Đánh giá khả năng ký sinh của chủng nấm M.anisopliae và B.bassiana

trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, ngoài đồng ruộng

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm:Viện Bảo Vệ Thực Vật – phường Đức Thắng – Đông Ngạc – quậnbắc Từ Liêm – Hà Nội

-Thời gian thực hiện: từ ngày 1/3/2014 đến 7/6/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng ký sinhcủa chủng nấm M.anisopliaevàB.bassiana đối với

bọ ánh kim

- Phân lập lại và làm thuầnchủng nấm M.anisopliae vàB.bassiana

- Xác định môi trường thích hợp để nhân sinh khối

nấmM.anisopliaevàB.bassiana

- Đánh giá hiệu quả gây chết bọ ánh kim của chủng nấm

M.anisopliaevàB.bassiana trong phòng thí nghiệm và nhà lưới

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1.Đánh giá khả năng ký sinh bọ ánh kim hại hồi ( Oides sp ) của một

số nguồn nấm đã được phân lập tại Viện bảo vệ thực vật

Thí nghiệm đánh giá khả năng ký sinh gây chết bọ ánh kim của cácdòng nấm ký sinh trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí 4 công thức,mỗi công thức tương ứng với một dòng nấm đã phân lập được, các thí nghiệm

sử dụng nồng độ 1.108 bt/ml:

CT 1: Metarhizium anisopliae ( MaBAK)

CT 2: Beauveria bassiana (BbBAK)

CT 3: Paecilomyces javanicus (PaeR)

CT 4: Đối chứng phun nước lã

Mỗi công thức 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm trên 10 cáthể sâu tuổi 2-3 (đặt trong phòng thí nghiệm) Sâu khoẻ mạnh được chuyển từLạng Sơn về

Trước khi phun tiến hành phun thử vào bình định mức để xác định sốlần phun/hộp Sau đó tiến hành phun dung dịch nấm ướt đều lá các hộp đãthả sâu non BAK tuôi 2-3

Hiệu lực gây chết sâu được tính theo công thức Abbott

Ca - Ta M(%) = x 100

Catrong đó: M: tỉ lệ (%) chết

Ca: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm.Ta: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sai thí nghiệm

3.4.2 Phân lập lại và làm thuầnchủng nấmM.anisopliaevàB.bassiana

Các mẫu sâu nhiễm nấm tiến hành lấy nguồn nấm cấy trên môi trườngPDA (Peptone Dextroza Agar)+ kháng sinh streptomycin

Phân lập tạo tảng nấm điển hình Sau đó cấy chuyển để làm thuẩn Sau khoảng 24-48h cấy chuyển tiến hành cắt đỉnh sinh trưởng (WA) vàcấy sang môi trường mới

Định loại các chủng nấm có ích dựa trên kỹ thuật truyền thống và khóaphân loại của H L Barnett và Barry B Hunter

+Phân lập, tạo dòng thuần các nguồn nấm đã thu thập được

Phân lập, làm chủng thuần các nguồn nấm ký sinh BAK hại hồi theophương pháp nghiên cứu vi sinh thường áp dụng tại Việt nam[9,10,11]

Bước 1: Nấu môi trường PDA với thành phần 200g khoai tây, 20g Agar

và 5g đường Dextrose trong 1000ml nước (khoai tây thái lát đun sôi ở 1000Ctrong thời gian 20 phút và lọc lấy dịch chiết sau đó cho agar và đường vào)

Khử trùng môi trường PDA trong nhiệt độ 1210C (áp xuất 1 atm) trong thờigian 30 phút, sau đó để nguội khoảng 55oC và bổ xung kháng sinhstreptomycin 0,1% Đổ môi trường ra đĩa petri (đã được sấy khử trùng ở

250oC trong 2,5 giờ) và để nguội

Bước 2: Cấy phân lập mẫu nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu nấm kí sinh,dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấmnhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể rầy

và không bị nhiễm tạp sau đó cấy ria nhẹ lên bề mặt môi trường Để đĩa môitrường cấy phân lập trong phòng thí nghiệm 2-3 ngày, thấy khuẩn lạc đặctrưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khácnhau để làm thuần chủng

+ Phương pháp tách đơn bào tử tạo dòng thuần nấm M.anisopliae và B.bassiana

Tạo dòng nấm thuần bằng phương pháp tách đơn bào tử trên đĩa thạch

WA Bằng cách dùng que cấy thuỷ tinh chấm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc, rồicấy vào đĩa thạch môi trường WA Sau đó dùng trang thuỷ tinh trang đều ra

bề mặt đĩa thạch và để đĩa thạch đó trong điều kiện phòng thí nghiệm Saukhoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi đĩa nấm đó bằng kính lúp để bàn để sát bào

tử nấm nảy mầm Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy có đầu nhọn hìnhlưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử đó cấy sang đĩa môi trường khác,sau đó để đĩa có chứa đơn bào tử đó trong điều kiện phòng thí nghiệm

3.4.3.Xác định môi trường thích hợp để nhân sinh khối nấm

Với nấm M.anisopliae

Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức khác nhau:

1/ MT1:Cám gạo 50gam + bột ngô mảnh 30gam + bã bia20gam

2/ MT2: Gạo hấp chín 100 gam

3/ MT3: Bột ngô mảnh80 gam + bã đậu phụ 20g

9 ml nước cất

9 ml nước cất

9 ml nước cất

9 ml nước cất

để trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm

Sau 10 ngày nuôi cấy thì tiến hành kiểm tra số lượng bào tử bằngbuồng đếm hồng cầu theo phương pháp:

*Phương pháp pha loãng:

Cân 1gram chế phẩm, nghiền nhỏ trong cối sau đó cho thêm 9ml nước

cất vào và tiếp tục nghiền, được dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 cho vào ốngnghiệm và thêm 9ml nước cất lắc đều ta được dịch bào tử có độ pha loãng 10-2.Làm như vậy đến khi thu được dịch bào tử có độ pha loãng đếm được (10-n)

- Cách thức pha loãng bào tử được minh họa như sau:

1 gr 1 ml 1 ml 1 ml đem đếm

…

10-1 10-2 10-3 10-n

*Phương pháp đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu:

Sau khi có dịch bào tử ở độ pha loãng đếm được, dùng pipet hút dịch

bào tử và nhỏ 1 giọt xuống khoảng giữa lưới đếm của buồng đếm hồng cầu.Đậy lamen lên trên đưa buồng đếm đến kính hiển vi, lấy tiêu cự để đếm

Số lượng bào tử được tính theo công thức

a x 10n x 400

A = x 10000

b

Trong đó:

A: Số lượng bào tử đếm được trên 1ml

a: Số lượng bào tử đếm được trên buồng đếm hồng cầu

b: Số ô đếm được ( 16 ô lớn x 25 ô nhỏ = 400 ô nhỏ)

n: hệ số pha loãng

10000: hằng số

đếm 3 lần lấy giá trị trung bình

* So sánh và đánh giá kết quả số lượng bào tử tươi và khô giữa các môi

trường bổ xung thành phần khác nhau trong mỗi công thức thí nghiệm để rút

ra công thức có tỷ lệ tốt nhất

3.4.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ

Các nguồn nấm Me.anisopliae và B.bassianasau khi phân lập ở thí

nghiệm 1 thì tiến hành nuôi cấy trên môi trường PDA Sau 7 - 12 ngày lấynguồn sinh khối nấm đã nuôi cấy ở trên để đánh giá hoạt lực gây chết bọ ánhkim