Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men

Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinhhọc để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đườngtiêu hoá và còn sử dụng trong điều trị kháng s

MỤC LỤC

PHẦN 1 . MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Mục tiêu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi khuẩn lactic 3

2.1.1 Phân loại vi khuẩn lactic 3

2.1.1.1 Theo Orla-Jensen 4

2.1.1.2 Phân loại theo hình dạng tế bào 4

2.1.1.3 Phân loại theo cách thức lên men 4

2.1.1.4 Phân loại dựa vào nhiệt độ 5

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 5

2.1.1.1 Đặc điểm sinh lý 5

2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic 6

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic7 2.1.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ đường 7

2.1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 7

2.1.3.3 Ảnh hưởng của pH 8

2.1.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic 8

2.1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm 8

2.1.4.2 Trong công nghiệp 8

2.1.4.3 Trong nông nghiệp và môi trường 9

2.1.4.4 Trong y học 9

2.1.4.5 Trong mỹ phẩm 9

2.1.4.6 Trong chăn nuôi thú y 9

2.2 Giới thiệu chung về bacteriocin 9

2.2.1 Khái niệm 10

2.2.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 10

2.2.3 Phân loại 11

2.2.3.1 Lớp I 12

2.2.3.2 Lớp II 13

2.2.3.3 Lớp III 15

2.2.3.4 Lớp IV 15

2.2.4 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 16

2.2.4.1 Phạm vi hoạt động 16

2.2.4.2 Cơ chế hoạt động 16

2.2.4.3 Tính kháng khuẩn của bacteriocin 17

2.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 18

2.2.6 Ứng dụng của bacteriocin 19

2.2.6.1 Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm 19

2.2.6.2 Ứng dụng bacteriocin trong y tế và chăm sóc sức khỏe 20

2.2.6.3 Ứng dụng bacteriocin trong nông nghiệp 20

2.3 Tình hình nghiên cứu 21

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 21

PHẦN 3 . ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 23

3.3.1 Hóa chất 23

3.3.2 Thiết bị sử dụng 24

3.3.3 Các chủng giống 24

3.3.4 Các môi trường sử dụng 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 25

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.5.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của vi khuẩn nghiên cứu 25

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn 26

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự tổng

hợp bacteriocin của vi khuẩn 26

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn 26

3.5.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn 26

3.5.6 Phương pháp khuếch tán thạch 27

3.5.7 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 28

3.6 Phương pháp sử lý số liệu 28

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị của các chủng lactic từ Boza 29

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 30

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 30

4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 31

4.2.3 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 32

4.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 33

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 34

5.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 28 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 29 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactic 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocincủa vi khuẩn BL1 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp bacteriocin của vikhuẩn BL1 31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 32 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vikhuẩn BL1 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của Nisin Z 17 Hình 2.2: Cấu trúc Sakacin P 19 Hình 3.1: Phương pháp cấy khảo sát khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị 31 Hình 4.1 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinhbacteriocin của vi khuẩn BL1 30 Hình 4.2 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợpbacteriocin của vi khuẩn BL1 31 Hình 4.3 Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩnBL1 33 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin củaBL1 34

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong cuộc sống hằng ngày chúng ta thì vi khuẩn lactic được sử dụngnhiều trong thực phẩm lên men hằng ngày như dưa muối, cà muối, lên menrượu, sữa chua, nem chua, pho mai, bia [3] Nó có vai trò quan trọng trongđời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các

vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn Và gần đây có nhiều nghiên cứu đãchứng minh rằng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ởriboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩnGram dương [20] Nó có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành cáckênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn cókhả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếuthành tế bào của vi khuẩn gây hại [29] Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứngdụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong yhọc và trong công nghệ thực phẩm [22]

Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinhhọc để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đườngtiêu hoá và còn sử dụng trong điều trị kháng sinh đồ[30] Trong ngành mỹphẩm, bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩmchăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm.Trong công nghệ thực phẩm,bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quảnmột số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩmthịt, rau quả đóng hộp [26]

Ở Việt Nam hiện nay có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin

từ nem chua, sữa chua, dưa chua Trong bài này tôi “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men”.

1.2 Mục đích của đề tài

Đánh giá được khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lacticphân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các điều kiệnlên men đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn

1.3 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát được khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) của các vi khuẩn lactic

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử,hình que hoặc hình cầu, có khả năng lên men đường thành acid lactic Khuẩnlạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàngkem hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to, tròn lồi trắng đục Đặc biệtkhuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid Nhóm vi khuẩn lactic được xếp

chung vào họ Lactobacteriacae thuộc bộ Eubacteriales [2] Chúng trao đổi

chất và phần lớn sản phẩm cuối của quá trình lên men cacbonhydrat là axitlactic [1]

Theo Nguyễn Thành Đạt (2007) tất cả những vi sinh vật lactic đều cócác đặc điểm sau:

Đó là những vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử,

có hoạt tính catalaza, oxydaza, nitratoreductaza âm tính

Tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống nhưng rất yếu, cho nênchúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiềubazơ nucleic, nhiều vitamin… Không có khả năng tổng hợp nhân hem của cácporphyrine, bình thường chúng không có cytochrome

Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, là loại có khảnăng lên men hiếu khí cũng như lên men kị khí Có khả năng chống chịu tốttrong môi trường acid

Vi khuẩn lactic phân bố tương đối rộng trong tự nhiên, đặc biệt trongcác sản phẩm lên men Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong đất, trong nước,trên bề mặt thực vật, trong các sản phẩm lên men (sữa chua, format,…), cácsản phẩm rau muối chua, trong đường tiêu hóa của người và động vật, trongcác sản phẩm thịt [2,8]

2.1.1 Phân loại vi khuẩn lactic

Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau Để phânloại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, căn cứ vào đặc điểm hình thái,phương thức lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năngchịu muối, chịu axit hay chịu kiềm.

Ngày nay người ta mới bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi

khuẩn Bifidobacterium (Kandler và Welss, 1986)

2.1.1.2 Phân loại theo hình dạng tế bào [2]

Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium.

Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus.

Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium.

Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu

(Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus).

Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào thànhphần môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy

2.1.1.3 Phân loại theo cách thức lên men [9]

Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng axit lactic tạo rachủ yếu 85 – 90% Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolazanhưng không có enzyme phosphoketolaza Nhóm vi khuẩn này gồm các

cầu khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cremoris, các trực

khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus

Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng axit lactic lên menchiếm tỉ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axitformic… và CO2 Nhóm vi khuẩn lactic này không có enzyme aldolaza nhưng

lại có enzyme phosphoketolaza Ví dụ: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus.

2.1.1.4 Phân loại dựa vào nhiệt độ

Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic

Phân loại dựa vào tỷ lệ phần trăm của các bazơ Guamin (G) + Cytosin

(C) (%GC) Các loài thuộc giống Streptococcus có tỷ lệ %GC 34-46%, Leuconostoc 36-43%, Pediococuss 34-43%… [2].

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc, không chứa enzymecatalaza, cytochrome, hô hấp tùy tiện

Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi trường dinh dưỡng, ngoàiđường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin

(thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) vàcác axit amin.

Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tùy từng loài,hình thái còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thời gian lên men, sự cómặt của oxi và các tác nhân khác

2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic

Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Cacbon là thành tố chính xây dựng nên cơ thể của mọi sinh vật Vìvậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho

tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tếbào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon khác nhau,chúng dễ dàng lên men các loại đường đơn (monosaccharide) như glucose,fructose, mantose, galactose Với các loại đường đôi (disaccharide) nhưsaccharose, mantose… thì được đồng hóa một cách chọn lọc hơn Đối với cácloại polysaccharide như dextrin, tinh bột… chỉ một số loài mới có khả năngđồng hóa

Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì đỏi hỏi nguồn cacbon khác nhau

Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tếbào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năngchống chịu khác nhau trước áp lực của các quá trình xử lý sau này Chẳng hạn

khả năng sống sót của L burgaticus sau khi sấy đông khô cao hơn khi sử dụng đường fructose và lactose so với mannose L.delbruceckii có thể sử dụng

đường glucose, galactose, mantose, saccharose nhưng không sử dụng đượclactose, rafinose [4,7]

Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ

Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của mọi sinh vật Nhữngvật chất cơ bản của tế bào protein, axit nucleic… đều chứa nitơ vì vậy nitơđóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Vikhuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng nitơ phức tạp Phần lớn vi khuẩn lactic

không thể tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ, do vậy chúngcần sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường chủ yếu là các nitơ hữu cơnhư protein, peptid, peptone, axit amine [1].

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như cao thịt, cao nấmmem, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone, dịch nấm men thủy phân, dịchchiết thịt Đây là nguồn nitơ được sử dụng thường xuyên trong môi trườngnuôi cấy [7]

Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chấtcủa tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào Tuy nhiên, đa

số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vìvậy cần bổ sung vào môi trường các loại [7]

Nhu cầu về các muối khoáng và các chất hữu cơ khác

Sự phát triển của vi khuẩn lactic không thể thiếu các yếu tố vi lượng và

đa lượng là các ion kim loại như đồng, mangan, sắt, kali, magie… Do đó một

số muối vô cơ như là NaH2PO4, MgSO4, MnSO4, KHPO4… được bổ sung vàomôi trường nuôi cấy để giúp cho vi khuẩn lactic phát triển tốt [1,7]

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

2.1.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Đường là nguồn hydrocacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổnghợp axit lactic Nồng độ đường càng cao thì lượng axit sinh ra càng nhiều.Tuy nhiên khi nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trườngtăng cao gây hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sinh trưởng và lên men của

tế bào Nguồn hydrocacbon quan trọng đối với vi khuẩn lactic bao gồm glucose,fructose và lactose Theo nhiều tác giả, trong lên men công nghiệp lượng đườngthường là từ 5% – 20% nhưng thông thường trong khoảng 12% [6]

2.1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vikhuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi

sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế cácenzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất [1].

Mỗi loại vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ thích hợp để phát triển.Loài ưa ấm, sẽ phát triển ở khoảng nhiệt độ 25oC - 35oC, loài ưa nhiệt sẽ pháttriển ở khoảng nhiệt độ 35oC - 45oC [11]

2.1.3.3 Ảnh hưởng của pH

Để vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt cần duy trì pH môi trường thích hợp,mặc dù sự ảnh hưởng của pH môi trường ít ảnh hưởng đến pH bên trong tếbào do màng tế bào tương đối ít thấm với các ion H+ và OH- [1] pH trong quátrình lên men lactic phải duy trì từ 4,5 trở lên, tốt nhất là từ 5,5 - 6,5 Giá trị

pH thấp mà mỗi giống vi khuẩn lactic chịu được là khác nhau Trong quátrình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế hoạt độngcủa các vi sinh vật khác Sau đó, khi lượng axit lactic tích lũy đủ lớn thì chính

vi khuẩn lactic cũng bị ức chế [7,11]

2.1.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là vi sinh vật thực phẩm an toàn được ứng dụng rộngrãi trong nhiều lĩnh khác nhau của xã hội như công nghiệp, nông nghiệp, ydược và trong thực phẩm…

2.1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm

Trong công nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic có ứng dụng quan trọngnhư sản xuất sữa chua, phomat, nem chua, muối chua rau quả Ngoài ra nócòn được dùng để bảo quản thực phẩm [3]

2.1.4.2 Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axit lactic Axit lactic có

vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loạinước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng được dùng để axit hóa rượuvang, và hoa quả nghèo axit, ngoài ra còn được dùng trong công nghiệp thuộc

da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo [3]

2.1.4.3 Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Khi nấm Fusarium phát triển sẽ làm cây

trồng phát triển yếu và làm cây bị bệnh Chế phẩm EM (Effective Microorganism)hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi khuẩn trong đó có sự gópmặt của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suấtcây trồng, và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [5]

2.1.4.4 Trong y học

Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột

Ứng dụng axit lactic trong phẫu thuật chỉnh hình

Ứng dụng để sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi

2.1.4.5 Trong mỹ phẩm

Các loại lactate kim loại (chẳng hạn như lactate natri) được sử dụngtrong thành phần của một số mỹ phẩn chăm sóc da như punosal của hãng mỹphẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bềmặt da, làm ẩm và làm sáng da [3]

2.1.4.6 Trong chăn nuôi thú y

Vi khuẩn lactic có tác dụng trong phục hồi cân bằng hệ vi sinh vậtđường ruột, và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ Nhờ vào sự giảm nồng độ

NH3 và hạn chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, vi khuẩn lactic cóhiệu quả kích thích tăng trưởng ở thú nuôi Vi khuẩn lactic còn được dùng để

ủ rơm, cỏ cho gia súc, trong quá trình lên men chúng sinh ra một số sản phẩm

có giá trị như vitamin, protein đơn bào… đồng thời kích thích vật nuôi ănnhiều hơn Các chủng vi khuẩn lactic thường được dùng ủ chua thức ăn cho vật

nuôi như Lb casei, Lb plantarum… làm tăng năng xuất vật nuôi [ 5].

2.2 Giới thiệu chung về bacteriocin

Trong quá trình sống vi sinh vật thường tiết ra những chất có khả năngkìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có cạnh tranh với chúng về

nơi sống và nguồn dinh dưỡng như các axit hữu cơ, axetoin, peroxide hidro,reuterin, các peptit kháng nấm trong đó phổ biến nhất là bacteriocin [16].

Bacteriocin là peptide hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tínhkháng khuẩn [29] Bacteriocin do Gratia phát hiện ra đầu tiên vào năm 1925

với tên gọi là principe V do một chủng Escherichia coli (colicin V) sinh ra.

Sau đó đổi tên thành “colicin” Năm 1953 Jacob và cộng sự đổi tên thànhbacteriocin [17]

Bacteriocin phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt có một sốloại có khả năng tiết hàng chục bacteriocin khác nhau [15] Cho đến nay cóhàng trăm bacteriocin được phát hiện và nghiên cứu Chúng rất đa dạng vềkính thước phân tử, tinh chất vật lý, hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơchế tác động [12]

Cho tới nay chỉ có Nisin là bacteriocin duy nhất được Tổ chức Y tế Thếgiới và Tổ chức Nông lương công nhận là chất bảo quản thực phẩm và được

sử dụng rổng rãi tại hơn 50 quốc gia trên Thế giới [17]

Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn nhưng hoàn toàn khác biệt vớicác chất kháng sinh dùng trong y học Đa phần bacteriocin có phổ khángkhuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác có mốiquan hệ gần gũi hoặc tương đồng, có sự canh tranh trức tiếp về nơi sống vànguồn dinh dưỡng [23]

2.2.1 Khái niệm

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay proteinđược tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương đểchống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng [23] Như vậy, loại vikhuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó.Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sứckhỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase [18]

2.2.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin

Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩnGram dương với những đặc điểm :

Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kíchthước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễndịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩnGram dương [25].

Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiềunhư ở vi khuẩn gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là:việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinhtổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩnGram âm [14]

Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi

khuẩn Gram âm, điển hình là E coli sinh tổng hợp colicin [28] Tuy nhiên

những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gramdương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thôngtin về vấn đề này Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc

sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là Bacillus sp Listeria sp và Staphylococcus

sp [18]

Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiêncứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thựcphẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phânhủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vậttrong ruột người [15] Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng,chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trênmàng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh

và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác ditruyền [15]

Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng cóhoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác Đặc tính này là do vi khuẩn lacticsinh acid hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm [26]

2.2.3 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiênviệc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang

là vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêuchí khác nhau Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượngphân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [20] Trong đó,phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocinđược chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp III và lớp IV Hai nhóm bacteriocinlớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hainhóm còn lại.

Hình 2.1 Cấu trúc của Nisin Z

Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm Nó có phổ kháng

khuẩn Gram dương rộng, E coli và các vi khuẩn Gram âm khác chỉ bị ảnh

hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng Nisin được cho là có

hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp và Clostridium spp

[18] Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sảnphẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật

chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả

chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram dương gây ra [16]

Phân lớp Ib

Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linhđộng, tích điện âm hoặc không tích điện Chúng thể hiện hoạt động bằng cáchgây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan [17], gây nhiễu với các phân tửenzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm Chúng thường hoạt động trong cácphản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn Nhóm này bao gồm các chấtkháng khuẩn như mersacidine , actagardin, cinnamycin, mutacin A [23]

2.2.3.2 Lớp II

Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọnglượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine Cácbacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc

Lớp IIa

Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại

diện đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1 Các sakacin A,sakacin P cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này Các bacteriocin nhóm nàyhoạt động bằng cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cânbằng và thất thoát ion phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn [23]

Sakacin A là bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 706,

được cấu tạo bởi 41 acid amin (tiền thân là 90 acid amin) Bacteriocin này làmột polypeptide ổn định nhiệt, mang đặc tính di truyền[16]

Sakacin P là một polypeptide nhỏ, ổn định nhiệt, được tổng hợp bởi ribosome,

mang đặc tính di truyền [16], được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 673.

Hình 2.2: Cấu trúc Sakacin P

Các bacteriocin này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng cộng nghiệp nhờ vào

hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin) Sakacin

được ứng dụng trong sản xuất xúc xích, xử lý ở các sản phẩm thịt để giữ đượclâu (như sản phẩm dăm bông [28] và thịt đông lạnh [14]), pho mát, các sảnphẩm lên men acid lactic khác Ngoài ra, còn được sử dụng để ức chế sự pháttriển của vi khuẩn không mong muốn, có thể là nguyên nhân gây nhớt và gâymùi ở các sản phẩm

Lớp IIb

Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, nhữngpeptide này ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhaugiữa các peptide bổ sung Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ,cũng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A, L50B) tạo lỗtrên màng tế bào, hoặc chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động khángkhuẩn (lactococcins Gα/GGβ, Lactococcins M/GN và plantaricins EF, JK) Cácbacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF vàplantaricin JK

Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổsung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ Lactococcin Gα gồm có 39 acidamin, còn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin Bactericoin này được sửdụng như một chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào vi khuẩn

Lactococcus lactis Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của cả

2 peptid, mặc dù 2 peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập

Lớp IIc

Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin khôngđồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau Nhóm IIcbao gồm tất cả các bacteriocin lớp II không rơi vào nhóm IIa, IIb Trong phânlớp này tìm thấy có 2 dạng [23]:

Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một vàcystibiotics có 2 gốc cystein)

Kháng khuẩn không có cystein (lactoccin A và acidocin B)

2.2.3.3 Lớp III

Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn

30 kDa, không bền nhiệt Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bàokháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin.Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của

giống Lactobacillus [18] Đại diện cho nhóm này là halveticin J [25] được sản xuất bởi vi khuẩn L halveticus 481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin

A, lactacin B được sản xuất bởi L acidophilus

2.2.3.4 Lớp IV

Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này Một cách tổng quátcác bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứalipid hoặc carbohydrate moities Bao gồm các glycoprotein (lactocin 27),hoặc lipoprotein (lacstrepcins) được quy định bởi non-protein [23]

2.2.4 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

2.2.4.1 Phạm vi hoạt động

Phạm vi hoạt động của bacteriocin được xem xét dựa trên phạm vikháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tínhchất hóa sinh và kiểu hoạt động của bacteriocin Hầu hết các bacteriocin đượctổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng.Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính

ức chế các loài vi khuẩn Gram dương đôi khi nó cũng ức chế một số loài vikhuẩn Gram âm

2.2.4.2 Cơ chế hoạt động

Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành cáckênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn cókhả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suyyếu thành tế bào

Các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram dương

như Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Các bacteriocin của

LAB có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram âm vì màng ngoài củachúng gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin Những màng này có khảnăng ngăn cản các chất tẩy rửa , kháng sinh và thuốc nhuộm xâm nhập vào tếbào chất (De Mertinis và ctv, 2001) Tuy nhiên cũng có một vài nghiên cứucông bố hoạt động của bacteriocin chống lại các vi khuẩn nhóm này

Các bacteriocin từ LAB có thể hoạt động thông qua các cơ chế khácnhau để phát huy tác dụng kháng khuẩn nhưng màng tế bào thường là đíchnhắm đến Các bacteriocin có thể có tính diệt khuẩn hoặc định khuẩn, tácđộng này chịu rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinhkhiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào chỉ thị và các điều kiện thínghiệm ( Cintas, 2001)

Có khả năng nhóm I và nhóm II có cơ chế hoạt động giống nhau Cácpeptide liên kết màng huyết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với cácphotpholipit tích điện âm Vì vậy, việc thâm nhập của bacteriocin qua màng tế

bào phụ thuộc vào điện thế màng, được điều khiển bởi pH và photpholipid.Các đơn phân tử của bacteriocin hình thành các khối proteic dẫn đến việchình thành lỗ kết quả là dẫn đến sự thất thoát của các ion ( K và Mg), tổn thấtlượng proton trong tế bào chất, thất thoát ATP và acid amin lượng protontrong tế bào chất có vai trò cơ bản trong việc tổng hợp ATP và trong sự dichuyển của vi khuẩn vì vậy việc tổng hợp các phân tử lớn cũng như sản xuấtnăng lượng bị ức chế, dẫn đến tế bào đích bị chết( Bruno và Montville, 1993).

Phương thức hoạt động của bacteriocin nhóm III chưa được biết đến do

đó cần nghiên cứu để làm sáng tỏ (Parada và ctv, 2007)

Một loại bacteriocin là Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trênnhững tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào Đó lànguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K+ và phosphate vô

cơ đi ra khỏi tế bào Trong sự nổ lực để tái tích lũy lại những ion này, cácATP sẽ bị thủy phân Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chứcnăng quan trọng trong tế bào, như gradient pH tại màng tế bào , thì đã không cònnữa, những chức năng sẽ bị phá vỡ và tế bào dần mất năng lượng và chết [32]

Có hai kiểu miễn dịch được thấy ở Lantibiotic Một kiểu miễn dịch dựavào protein miễn dịch đặc trưng, LanI Trong khi kiểu miễn dịch khác dựavào vật chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (Lan EFG) Bacteriocin sẽnhận biết được những vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của

những thụ thể đặc biệt và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinhvật đó [12].

2.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin

Sự khác nhau của điều kiện môi trường như nhiệt độ, thời gian, PH làmảnh hưởng đễn năng suất của bacteriocin Nhìn chung sự sản xuất bacteriocintốt ở điều kiện tối ưu của chủng sản xuất phát triển Nuôi ở nhiệt độ quá cao

có thể ngăn cản sự tổng hợp bacteriocin

Việc tạo ra các bacteriocin ở vi khuẩn gram dương thường chuyển từpha log đến pha ổn định Sản lượng bacteriocin tối đa trong môi trường có thểthấy ở nhiều pha khác nhau trong chu kì tăng trưởng Nghiên cứu củaSchlegel và Slade (2002) thấy sự sản xuất streptocin STH1 nhiều nhất trongpha log và giảm dần mức độ sản sinh bacteriocin trước khi vào pha ổn định.Trái lại sản xuất streptococcin A-FF22 bắt đầu ở cuối pha log và hoạt tínhgiảm dần khi nuôi cấy kéo dài

Trong khi đó một nghiên cứu khác của Suranjita Mitra et al, 2005 khảosát trên chủng Lc Lactics phân lập từ sữa lên men trên môi trường có pH banđầu là 6,5 ở nhiệt độ là 37oC kết quả cho thấy khả năng sinh tổng hợp caonhất là sau 7 giờ Hay nghiên cứu của L.G Stoyanova et al., 2005 thời giantổng hợp bacteriocin cao nhất là sau 12 giờ ở môi trường nuôi cấy ban đầu có

pH ban đầu là 7.0 ở 30oC

Hay nghiên cứu của E P Knoshaug et al., 2000 trên chủng Lactococcus lactis subsp lactis phân lập từ nguồn sữa lên men nhẹ cho kết quả thời gian nuôi

cấy tốt nhất là 16 giờ ở trên môi trường có pH ban đầu là 7.0

Và nghiên cứu của Svetoslav D.Todorov and Leon M.T.Dicks, 2004

trên chủng Lactococus lactis subsp lactis phân lập từ “bia barley” trong

nghiên cứu này tác giả nghiên cứu khảo sát các giá trị pH môi trường nuôi cấykhác nhau(4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5) hay Nghiên cứu của H.J.Choi et al(2000)khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu lên sự sinh trưởng và tổng

hợp bacteriocin của chủng Lactococus lactis subsp lactis phân lập từ kim chi

có pH ban đầu là 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 Cả 2 nghiên cứu đều kết luận rằng pHthích hợp nhất là 6,0 ở 30oC Sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là 20 giờ