Nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây khoai mỡ (dioscorea alata l ) bằng kỹ thuật in vitro

Hóa chất và thiết bị...19 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ Dioscorea alata L... - Xác địn

Bảng 2.1 Phân bố các mẫu giống Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trong tập đoàn

theo vùng sinh thái Error: Reference source not found

quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error:

Reference source not found

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái

sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not

found

(Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference source not

found

Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference

source not found

Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA kết hợp với nồng độ

Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)

(sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference source not foundBảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây

Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference

source not found

Reference source not found

hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)

Error: Reference source not foundHình 4.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả

năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source

not found

Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh

chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) .Error: Reference source

not found

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found

ADN : Axit deoxyribonucleic

MỤC LỤC 4

PHẦN 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là Gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4 Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác [2], [13] Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem [15] 12

e) Các chất bổ sung 12

2.5 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước 15

3.3 Hóa chất và thiết bị 19

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 10 ngày nuôi cấy) 21

Hóa chất 21

Công thức thí nghiệm 21

Thời gian (phút) 21

HgCl2 0,1% 21

3 21

CT3 21

5 21

CT4 21

7 21

CT5 21

10 21

- Phương pháp nhân nhanh in vitro: 22

+ Các chồi sau khi được tái sinh, không bị nhiễm nấm, vi khuẩn được lựa chọn đưa vào nuôi cấy 22

+ Sử dụng dao cấy (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) nhẹ nhàng tách các chồi đã tái sinh ra khỏi đoạn thân, kích thước mỗi đoạn chồi có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank cấy gắp đặt trên bề mặt môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị trước 22

+ Mẫu được cấy với mật độ đồng đều, cấy xong đưa vào phòng nuôi cây Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường) 23

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau: 23

- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro: Lựa chọn chồi Khoai mỡ có từ 2-3 lá, chiều cao thân 8-10 cm chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường ra rễ dựa trên MT nền có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định, hình thành cây con hoàn chỉnh .24

Hệ số nhân chồi (lần) 25

Tổng số chồi nuôi cấy ban đầu (mẫu) 25

Số rễ trung bình/cây (rễ) 25

= 25

Tổng số chồi ra rễ (rễ) 25

Tổng số chồi nuôi cấy (mẫu) 25

4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 27

Ghi chú: *: Sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% 27

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 28

-Từ bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: 28

Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Với giá trị LSD.05 đạt 7,43 các công thức khác nhau đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất ở CT4 khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 7 phút đạt 73,33% Thấp nhất ở công thức Đ/C (đối chứng) với 0% Với thời gian khử trùng từ 0-7 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm tăng dần từ 0-73,33%; Còn từ 7-10 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bắt đầu giảm xuống chỉ còn 65% tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 5% 28

Tỷ lệ mẫu chết: Với giá trị LSD.05 đạt 2,35 các công thức khác nhau đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% CT5 tỷ mẫu chết cao nhất đạt 30%.Thấp nhất ở công thức Đ/C (đối chứng) với 0%, tiếp theo CT4 đạt 10% 28 Sử dụng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau thì cho hiệu quả khử trùng (khả năng diệt trừ nấm, vi khuẩn) khác nhau 28

- Kết quả trên được giải thích như sau: Gốc Hg2+ có hoạt tính, tính khử trùng mạnh, gây thoái hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của

đạt 30% và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 5% 29 Theo kết quả công bố của tác giả Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) [10] nghiên cứu phương pháp khử trùng đỉnh sinh trưởng và đoạn thân cây Sa Nhân tím

(Amomum longiligulare T.L.Wu) bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian khác nhau Kết quả cho thấy thời gian khử trùng trong 12 phút cho tỷ lệ sống không nhiễm cao nhất đạt 86,67% đối với đoạn thân 29 Theo kết quả công bố của tác giả Nguyễn Thanh Đào và cs (2013) [5] nghiên cứu phương pháp khử trùng đoạn thân có chứa chồi nách hoặc chồi ngọn cây Bắp cải cảnh (Brassica oleracea L var sabellica) bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian khác nhau Kết quả cho thấy thời gian khử trùng trong 8 phút cho tỷ lệ sống không nhiễm cao nhất đạt 90% So với kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên đối tượng cây Khoai mỡ thì kết quả của các tác giả cao hơn điều này có thể do: 29 Giống, thời điểm lấy mẫu và thời gian khử trùng khác nhau; 29 Cây Khoai mỡ dang thân leo không có khả năng tự đứng bò trên mặt đất Đặc điểm này làm cho đỉnh sinh và đoạn thân thường chứa nhiều nấm và vi khuẩn gây khó khăn trong quá trình khử trùng mẫu; 29 Cây Khoai mỡ là loài thân mọng nước rất rất dễ bị tổn thương bởi vết xây xước

từ dụng cụ thao tác, hay hóa chất khử trùng 29

- Kết luận: Đối với Khoai mỡ khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho hiệu quả tạo vật liệu vô trùng tốt nhất đạt 73,33% và tỷ lệ chết thấp nhất đạt 10% 294.2 Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 29 Hiện nay người ta đưa ra rất nhiều loại môi trường cho các cây khác nhau Nhìn chung chúng đều gồm thành phần khoáng, chất kích thích sinh trưởng, nguồn các bon, các vitamine Các môi trường khác nhau đều thay đổi thành phần nồng độ

- Môi trường giàu dinh dưỡng (MS); 30

- Môi trường trung bình (B5); 30

- Môi trường nghèo dinh dưỡng (WPM) .30 Tiến hành theo dõi kết quả sau 20 ngày nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được thể hiện bảng 4.2 và hình 4.2 30Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 10 ngày nuôi cấy) 47

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) thuộc họ Củ nâu (Dioscoreaceae), bộ Củ nâu (Discoreales), phân lớp Hành (Lilianae), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) và giới

thực vật bậc cao có mạch [4] Là 1 loài trong số 10 loài quan trọng nhất có giá trị kinh tế của chi Dioscorea, thuộc nhóm cây lấy củ được ghi nhận là một trong những cây lương thực lâu đời nhất Việt Nam Thành phần dinh dưỡng của củ Khoai mỡ gồm có đường, tinh bột, chất xơ và một số loại khoáng chất như P, Ca, Mg, K,

vitamin C, vitamin nhóm B [3] Đặc biệt củ Khoai mỡ chứa chất Diosgenin được chiết xuất sử dụng để tổng hợp cortisone, pregnenolone, progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen trong sản xuất dược liệu làm giảm

cholesterol trong máu [3] Và để điều trị khô âm đạo ở phụ nữ lớn tuổi hơn, hội

chứng tiền kinh nguyệt, kinh nguyệt đau, viêm khớp, tăng năng lượng và ổ định tình dục ở nam giới và phụ nữ, và làm nở ngực [7], [19]

Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều nhưng việc cung cấp giống cây Khoai mỡ để trồng chủ yếu do các hộ gia đình làm thủ công theo phương pháp truyền thống, sau khi thu hoạch Khoai mỡ những củ cái to được bán thương phẩm còn những củ nhỏ thì được lưu giữ để làm giống Mặt khác cây Khoai mỡ là có xu thế phân nhánh củ ít, hệ số nhân giống thấp, hơn nữa củ con để từ vụ trước sang vụ sau nếu không đảm bảo tốt thì rất dễ thối hỏng, giảm sức sống và sức nảy mầm của cây con Việc để giống theo cách truyền thống không thể kiểm soát được về mặt sâu bệnh của giống, nhiều loại virus, nấm, ký sinh trùng gây bệnh trên cây Khoai mỡ có thể được lưu giữ cùng giống từ vụ này sang vụ khác, giống không đảm bảo để trồng

Nếu sử dụng phương pháp nhân giống như vậy thì việc đáp ứng kịp nhu cầu thị trường là rất khó khăn Cùng sự phát triển của khoa học kỹ thuật, kỹ thuật nuôi

cấy in vitro ra đời đã mở ra một hướng khắc phục hiệu quả những khó khăn trên Nuôi cấy in vitro có thể từ một lượng nhỏ mẫu ban đầu nhân lên với số lượng lớn

cây con, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ và chúng ta có thể kiểm soát được các loại dịch bệnh Từ thực tiễn trên chúng tôi đã

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây Khoai mỡ

(Dioscorea alata L.) bằng kỹ thuật in vitro”.

1.2 Mục đích của đề tài

- Tìm ra quy trình nhân nhanh cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) bằng kỹ

thuật in vitro.

1.3 Yêu cầu đề tài

- Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ

- Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến

khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine đến khả năng nhân nhanh chồi Khoai mỡ

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Khoai mỡ

1.4 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra biện pháp tái sinh chồi Khoai mỡ bằng

phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích

số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học

Ý nghĩa thực tiễn

Hoàn thiện được quy trình nhân nhanh cây Khoai mỡ bằng kỹ thuật in vitro,

để đảm bảo sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất Mặt khác khắc phục được những khó khăn về diện tích canh tác, điều kiện tự nhiên, công chăm sóc so với phương pháp nhân giống truyền thống

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây Khoai mỡ

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây Khoai mỡ

2.1.1.1 Nguồn gốc cây Khoai mỡ

Khoai mỡ thuộc nhóm cây lấy củ được ghi nhận là một trong những cây lương thực lâu đời nhất ở Việt Nam Có rất nhiều quan điểm về nguồn gốc cây Khoai mỡ, tuy nhiên cho đến nay, đa số quan điểm đều cho rằng loài này có nguồn gốc ở trung tâm Đông Nam Á Người ta cũng đã xác định được số lượng rất lớn các giống Khoai mỡ bản địa đã tồn tại và được thuần hóa, trồng trọt từ rất sớm tại các vùng từ Ấn Độ đến các đảo thuộc Nam Thái Bình Dương [3]

2.1.1.2 Phân loại cây Khoai mỡ

Theo hệ thống thực vật [4] cây Khoai mỡ được phân loại như sau:

2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm phân bố cây Khoai mỡ

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái cây Khoai mỡ

Cây có thân leo, quấn sang phải, màu xanh, không có gai, thỉnh thoảng có những nốt sần con, có tiết diện vuông và có bốn cánh mỏng ở bốn góc Củ có nhiều hình dạng thay đổi: Hình trụ, hình chùy, hình trứng hay hình tù và phân nhánh ít hay nhiều; vỏ củ mỏng, dễ cạo, màu nâu xám, có nhiều mắt; Thịt củ có màu trắng, vàng ngà hay tím, tùy giống Lá đơn, phần lớn mọc đối, hình tim hay hình mác, đầu nhọn, dài từ 10-20 cm, có từ 5-7 gân hình cung, phiến lá mềm, nguyên Cụm hoa đực dạng bông, trục khúc khuỷu Cụm hoa cái thõng xuống Quả nang có 3 cánh; Hạt có cánh màu nâu đỏ [3] Cây đôi khi cũng có củ đeo [7]

- Rễ mọc ra từ thân củ quá ngắn và quá bé nên hấp thụ chất dinh dưỡng không đáng kể Một số giống Khoai mỡ, rễ còn có thể mọc ra từ một số đốt gần gốc của cây đang phát triển [3]

b) Đặc điểm của thân

Thân có cấu trúc hình dây; Bản thân nó không có khả năng tự đứng mà phải tựa vào cọc hoặc leo vào giàn Hầu hết các giống có thân phát triển dài vài mét trước khi phân nhánh Thân thường có màu xanh nhưng cánh thỉnh thoảng có màu

đỏ hay tím bởi sự có mặt của chất sắc tố, không có gai, thỉnh thoảng có những nốt sần con, có tiết diện vuông và có bốn cánh mỏng ở bốn góc với màng chạy dọc theo chiều dài của thân, khi leo nó thường quấn sang phải [3]

c) Đặc diểm của lá

Lá thuộc loại lá đơn, nhẵn, màu xanh, mọc đối, tuy nhiên một số giống có hiện tượng mọc cách, thường có hình trứng, hình tim và đỉnh lá thường nhọn Những gân lá chính thường xuất phát từ gốc lá, các gân phụ phân bố theo hình mắt lưới Màu sắc và kích thước lá biến động khá lớn, phụ thuộc vào giống và điều kiện

chăm sóc Các giống khác nhau về hình dạng lá, được xác định bởi độ rộng và sâu của gian thùy giữa hai thùy lá Cuống lá thường dài (6-12 cm) và cánh thường mở rộng tại gốc [3].

d) Đặc điểm của củ

Củ Khoai mỡ thuộc loại thân củ hình thành từ Hypocotil – vùng giữa thân củ

và rễ (Onwueme, 1986) Củ chia thành 3 phần: phần đầu củ, phần giữa củ và phần đuôi củ Củ của cây Khoai mỡ thuộc dạng thân củ ngầm, thường là củ đơn nhưng thỉnh thoảng có 2-5 củ mọc chụm Củ có thể phân nhánh hoặc không, thịt củ thường mịn nhưng đôi khi bị sần sùi, thô ráp Vỏ củ mỏng, dễ cạo, màu nâu xám hay nâu đen Củ của các giống thường khác nhau về hình dạng, kích thước và màu sắc thịt

củ Củ có hình dạng thay đổi: Hình trứng, hình ôvan, hình trụ dài, hình tù, hình con rắn, hình bàn tay, hình chân tượng…Tùy thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt Khi trong củ không có sắc tố, thịt củ có màu trắng hay kem, nếu có sắc tố biên độ màu thịt củ biến động từ vàng, hồng tới tím Ở một số giống chỉ có đường viền ngoài thịt củ có màu hồng, đỏ hay tím trong khi ở một số giống khác nhau chất sắc

tố phân bố đều khắp củ hoặc không đều từ đầu đến cuối củ [3]

đ) Đặc điểm của hoa, quả và hạt

- Hoa: Trong thực tế hầu hết các giống Khoai mỡ đều không ra hoa, nếu có thì hoc đực được hình thành từ trục bông, trong khi hoa cái sinh ra từ nhánh Cả trục bông và nhánh đều được mọc từ nách lá

Hoa đực nhỏ, khó nhìn thấy, mỗi hoa có 3 lá đài, 3 cánh và 6 nhị; Cánh và lá đài thường có màu xanh hay trắng, hạt phấn dính, nhìn dưới kính hiển vi thường có tật

Hoa cái to hơn hoa đực, có chiều dài 2 mm và 1 mm, thường có màu xanh hay màu tím Hoa cái cũng có 3 đài, 3 cánh hoa và 3 bộ nhụy mọc ngắn Bộ nhụy có

3 bầu nhụy, mỗi bầu nhụy chứa 2 noãn [3]

- Quả: Thuộc dạng quả nang, khô có nhiều ngăn với đường kính khoảng 1-2

cm Quả có 3 ngăn, vỏ dễ nứt, điểm nối của ngăn kéo dài ra thành cánh phẳng, mỗi ngăn quả có 2 hạt [3]

- Hạt: Thường nhỏ, dẹt và được bao quanh bởi màng cánh Những hạt lấy được

từ giống ra hoa, kết hạ, thường không nảy mầm hoặc tỷ lệ nảy mầm rất thấp [3]

2.1.2.2 Đặc điểm phân bố cây Khoai mỡ

Cây mọc hoang dại rải rác khắp vùng rừng núi với độ cao từ 100-600 m, cũng có khi lên đến 1000 m Cây ưa sáng, ưa ẩm và thuờng chỉ mọc ở đất còn tuơng đối màu mỡ Hằng năm, chồi thân từ củ mọc từ tháng 3-4, sau hai tháng có chiều dài tới vài mét, bao chùm lên các cây giá thể khác Cây ra hoa quả nhiều và đến cuối mùa thu, toàn bộ phần trên mặt đất bị tàn lụi [1]

Nguồn củ mọc tự nhiên ở Việt Nam tuơng đối phong phú Truớc kia, khi chưa có cây trồng thay thế, riêng ở các tỉnh phía bắc (từ Quảng Bình trở vào) mỗi năm đã khai thác thu mua được 30 - 60 tấn để làm thuốc [1]

2.1.2.3 Số lượng quần thể

Discorea L là chi duy nhất trong họ Discoreaceae, có tổng số khoảng 140

loài đều là loại dây leo, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc Đông và Đông Nam châu Á Ở Việt Nam, có khoảng 30 loài; Một số loài cây trồng lấy tinh bột từ củ và hầu hết đuợc dùng làm thuốc [1]

2.1.3 Giá trị của cây Khoai mỡ

Nguồn: Onwueme, I.C 1978

Củ Khoai mỡ chứa hàm lượng protein thô khá cao, từ 1,1 - 2,9% Khoảng 85

- 95% lượng đạm có thể được tạo thành 9 axit amin không thay thế, rất cần thiết cho con người như lizin, treonin, valin, izolơxin, metionin, xittin, phênylalamin, tyrozin

và lơxin lượng khoáng (Ca, Fe) và các vitamin như vitamin C, B1 và B2; tuy lượng thấp nhưng là những chất rất cần thiết cho con người Hiện nay một số công ty của Đài Loan, Nhật Bản đang đặt mua Khoai mỡ ruột trắng để chế biến, nhưng với số khiêm tốn, 1.000 tấn/năm Thị trường và giá Khoai mỡ tại đồng bằng sông Cửu Long tương ổn định, do đó, nông dân sản xuất khoai có thể bán ngay tại chỗ cho thương lái để thu lợi nhuận từ sản xuất [3].

2.1.4.2 Giá trị dinh dưỡng (dược liệu)

Giá trị dược liệu của Khoai mỡ là vấn đề đã được quan tâm nghiên cứu từ lâu Ở Trung Mỹ, những sản phẩm thuốc công nghiệp đều được chiết xuất từ

Diosgenin Hiện nay Diosgenin được yêu cầu như sản phẩm thương mại trên thế

giới [3] Củ Khoai mỡ chứa chất Diosgenin được chiết xuất sử dụng để tổng hợp

cortisone, pregnenolone, progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen trong sản xuất dược liệu làm giảm cholesterol trong máu [3] Và để điều trị

khô âm đạo ở phụ nữ lớn tuổi hơn, hội chứng tiền kinh nguyệt, kinh nguyệt đau, viêm khớp, tăng năng lượng và ổ định tình dục ở nam giới và phụ nữ, và làm nở ngực, …[7] [19]

Công dụng: Chữa kém ăn, gầy gò hay đái đục, đái tháo, di mộng tinh, nấu cháo củ mỡ ăn, thì sẽ biết đói, ngon cơm, vừa béo người, chắc bắp thịt, mà hết các chứng thận hư, mỏi lưng gối, tiết tinh, đái đục [7]

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô Tế bào Thực vật

2.2.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các

bộ phân tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…[2] Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học [9]

Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể [2]

2.2.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô Tế bào Thực vật

2.2.2.1 Tính toàn năng của Tế bào Thực vật

Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]

2.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [6]

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị như sau:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệtTuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào [6] Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ:

phân hóa tế bào

phản phân hóa tế bào

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của Tế bào Thực vật

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một

số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [6]

2.3 Môi trường nuôi cấy mô Tế bào Thực vật

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau

có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một

số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường như: MS, LS, WP Ví dụ, môi trường MS

là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm

Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô Tế bào Thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [2], [14], [16]:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng;

- Các vitamin và amino acid;

- Nguồn cacbon: Một số các loại đường;

- Các chất điều hòa sinh trưởng;

- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

a) Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ magie là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào,

nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào.

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy

Tế bào Thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym

Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hoá của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào [2], [14]

b) Các vitamin và acid amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở

các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm chí còn có hại (gây độc)

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải

bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [2], [14]

c) Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,

do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [2], [14]

d) Các chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở nên độc Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh Trái lại các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế

- Auxin:

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4-D (2,4 - Diclophenoxy acid) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [2], [16]

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [2]

- Cytokinin:

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế

nhiên trong chiết xuất acid nucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BA là Cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều Kinetin Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của Cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với ADN, tạo điều kiện cho

sự tổng hợp ADN [2], [16]

Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hormon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các hormon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của Auxin và Cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao thì thích hợp cho

sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch

(1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của Auxin và Cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, cảm ứng cho sự phân chia tế bào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của Cytokinin trong quá trình phân chia tế bào,

cụ thể là Cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển[2], [16]

- Gibberellin acid:

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là Gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi

xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4 Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác [2], [13] Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem [15]

e) Các chất bổ sung

Agar: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, người ta thường sử dụng agar để làm

đặc môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại tinh bột đặc chế

trường lỏng [2], [12] Agar tan ở nhiệt độ 1000C và đông đặc lại ở 450C Trong môi trường quá acid (pH<4,5) agar không có khả năng đông đặc [12]

pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác

nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6-6,0 Nếu pH của môi trường thấp hơn 5,0 thì agar sẽ không đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng [14] Nếu pH

>7,0 hoặc <4,5 đều ức chế cho quá trình sinh trưởng, phát triển của mô, tế bào Để điều chỉnh pH của môi trường người ta thường dùng NaOH 1M, HCl 1M

Than hoạt tính:

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó

vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường [11]

2.4 Các giai đoạn chính trong nhân giống in vitro

2.4.1 Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ

(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh đặc biệt là bệnh

vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm và tăng khả năng sống và sinh trưởng

của mẫu cấy in vitro [11].

2.4.2 Khử trùng mẫu và cấy khởi động

Giai đoạn này nhằm tạo mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mẫu bị nhiễm ít, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Bộ phận của cây được chọn làm mô nuôi cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loại cây và đúng giai đoạn phát triển Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng Ngoài ra chóp đỉnh

và chồi non nảy nầm từ hạt cũng được sử dụng nhiều Mẫu trước khi cấy vào môi trường cơ bản phải được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm vào trong dung dịch khử trùng với hàm lượng và thời gian thích hợp Tùy vào từng vật liệu mà chọn các hóa chất khử trùng khác nhau Trong đó quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu

2.4.3 Tạo chồi và nhân nhanh

Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nhân giống Trong giai đoạn này vai trò của chất điều hòa sinh trưởng có đóng góp rất lớn trong việc kích thích tạo chồi mà vẫn đảm bảo được sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy

2.4.4 Tạo cây mô hoàn chỉnh

Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn chỉnh Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ Môi trường tạo rễ thường giảm đi một nửa hàm lượng các chất môi trường cơ bản nhằm hạn chế quá trình sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi

và thay vào đó là một số auxin kích thích tạo rễ Tùy theo loại cây mà sử dụng các hàm lượng Auxin cho phù hợp Thông thường các chất NAA, IBA, IAA được sử dụng với hàm lượng 1-5 mg/l để kích thích chồi ra rễ đối với một số cây thân gỗ

và một số hợp chất như nước dừa… bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn luyện

2.4.5 Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm

Cây con đạt tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện môi trường bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới, sau đó chuyển

cây ra ngoài vườn ươm Cây in vitro do được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về

dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ mấy nước và mau héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao Cây con được cấy trong luống ươm có cơ chế dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm Trong những ngày đầu phải được phủ nilon để giảm thiểu quá trình thoát hơi nước của lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý thêm với các chế phẩm kích thích ra rễ bằng cách ngâm hoặc phun lên lá

để rút ngắn thời gian ra rễ

2.5 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trên thế giới

Theo Jean Martine và cs (1991) [24] khi nghiên cứu về tác động của một số

chất điều hòa sinh trưởng vào quá trình tạo củ của loài Dioscorea alata L 'Brazo fuerte' Cắt đoạn thân của Dioscorea alata L.‘Brazo fuerte’ và Dioscorea abyssinica

Hoch được nuôi trong ống nghiệm để đánh giá ảnh hưởng của NAA về sản xuất củ

bi Trên đối tượng D alata, nồng độ cao của NAA (27 và 54 mg/l) ủng hộ việc sản

xuất củ bi lớn, trong đó số lượng cao nhất của củ bi thu được với nồng độ NAA 2,7 mg/l; Trọng lượng của củ bi tăng khi nồng độ ABA tăng; BAP ở nồng độ thấp 0,22 mg/l ảnh hưởng xấu đến sự sống còn của mẫu cấy Tác động này, chỉ quan sát trên nuôi cấy dưới 8 giờ chiếu sáng, nhưng không phải trên nuôi cấy dưới 16 giờ Trên đối

tượng D abyssinica với nồng độ NAA cao hơn 0,27 mg/l thúc đẩy sự tăng

trưởng của mô sẹo trên bộ rễ Trong loài này, việc sản xuất các củ bi lớn nhất thu được 2,7 mg/l trong khi số lượng củ bi không bị ảnh hưởng bởi bất kỳ nồng độ kiểm tra

Theo Hodeba D Mignouna và cs (2003) [20] đã tìm thấy loài Dioscorea

alata được trồng đầu tiên ở Đông Nam Á tuy về diện tích không lớn như ở châu

Phi, nhưng giống D alata phân bố rất rộng trên thế giới tại châu Á, châu Đại

Dương, châu Phi và tây Ấn Và loài này được tuyển chọn vào danh sách giống từ vạc có giá trị kinh tế

Theo Mandal B B và cs (2007) [23] nghiên cứu ảnh hưởng của các chất

điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tái sinh chồi đỉnh của cây Dioscorea

floribunda được bảo quản lạnh: Ban đầu đỉnh chồi được bảo quản lạnh nuôi trên

tiếp theo nuôi trong 15 ngày trên môi trường với BAP 1 mg/l + NAA 0,5 mg/l +

0,15 mg/l kích thích sản xuất cây con phát triển đầy đủ Kết quả tất cả các cây tái sinh mà không hình thành mô sẹo

Theo I Q Ezeibekwe và cs (2009) [21] đã đưa ra kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa Auxin (NAA) và Cytokinin (BAP) đến khả năng nhân

nhanh in vitro ở cây Discorea rotundata L (White Yam) như sau: Người ta tiến

hành bổ sung vào môi trường MS lần lượt các nồng độ NAA (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0

mg/l) và BAP (0 - 0,4 mg/l)để cấy chuyền cây con Discorea rotundata L Chiều

cao cây, số lá, mắt, dây leo, rễ và trọng lượng tươi đã được đánh giá môi trường cơ bản Kết quả thu được với nồng độ BAP 0,2 mg/l + NAA 0,5 mg/l hầu hết cho các thông số đo cao nhất

Theo Heena J Shah S S Lele (2012) [19] khi nghiên cứu về nhân giống in

vitro của Dioscorea alata var purpurae đã chỉ ra rằng sự nẩy mầm chồi nách của

của chồi nách

2.5.2 Tình hình nghiên cứu cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) ở trong nước

Theo Lê Văn Tú và cs (2009) [13] đã đưa ra kết quả đánh giá đa dạng nguồn

gen cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Bao gồm:

- Kết quả đánh giá sự phân bố của Khoai mỡ, tập đoàn Khoai mỡ đang bảo quản tại Trung tâm được thu thập từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước Bảng 1 cho thấy 102 mẫu giống trong tập đoàn được thu thập từ 7 vùng sinh thái trong cả nước Vùng Đông Bắc là vùng thu được số lượng mẫu giống cao nhất (44 mẫu giống chiếm tỷ lệ 43,14 %) Khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên có số lượng mẫu giống thu thập ít nhất (01 mẫu giống chiếm tỷ lệ 0,98 %)

Bảng 2.1 Phân bố các mẫu giống Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trong tập đoàn

theo vùng sinh thái

- Kết quả đánh giá sự đa dạng một số tính trạng định tính của tập đoàn Khoai

mỡ tập đoàn Khoai mỡ được mô tả, đánh giá với 48 chỉ tiêu hình thái nông học Kết quả mô tả 102 mẫu giống có 6 hình dạng khác nhau trong đó hình tim dài có số lượng mẫu giống cao nhất 45 giống chiếm tỷ lệ 44,12% và lá có dạng hình mác chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,98% Màu cánh, có 3 màu trong đó cánh màu xanh với rìa mép tím chiếm tỷ lệ cao nhất 84,31% và cánh có màu xanh và tím có tỷ lệ bằng nhau chiếm 7,84% Về màu cuống lá có 3 màu chính, cuống có toàn cuống màu xanh và tím ở hai đầu có số lượng giống cao nhất (42 mẫu giống chiếm tỷ lệ 41,18%) và cuống có toàn cuống xanh chiếm tỷ lệ thấp nhất 28,43% Hình dạng củ

có 6 hình dạng khác nhau trong đó củ hình trụ chiếm tỷ lệ cao nhất 49,02% và củ có dạng hình khác chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,98% Thịt củ có 7 màu khác nhau, trong đó thịt củ màu vàng kem/trắng ngà có số lượng giống cao nhất 42 mẫu giống chiếm tỷ

lệ 41,18% và thịt củ màu vàng nhạt chiếm tỷ lệ thấp nhất chiếm 2,94% Kết quả mô

tả, đánh giá cho thấy tập đoàn Khoai mỡ rất đa dạng về đặc điểm hình dạng lá, màu sắc cánh, màu cuống lá, hình dạng củ, màu thịt củ Những đặc điểm hình thái quan trọng này có thể sử dụng làm khoá phân loại dưới loài cho tập đoàn Khoai mỡ

- Kết quả nghiên cứu các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của tập đoàn khoai mỡ Cho thấy số lượng củ/khóm có sự biến động rất lớn trong đó số lượng mẫu giống có từ 1 đến 5 củ/khóm chiếm đa số 86 giống chiếm tỷ lệ 84,31%; Các giống có số lượng trên 5 củ/khóm chiếm tỷ lệ thấp nhất 1,96% Trọng lượng củ trung bình cũng dao động khá lớn (từ 70-840 g/củ), các giống có trọng lượng củ dưới 400g chiếm tỷ lệ cao nhất 73,53% còn các giống có trọng lượng củ trên 800g chỉ chiếm 0,98% Nhưng trong thực tế sản xuất hiện nay thì củ có trọng lượng từ 400 đến

800 g/củ có ý nghĩa quan trọng nhất vì dạng củ này đang được thị trường chấp nhận

vì củcó trọng lượng vừa phải phù hợp với nhu cầu cho một bữa ăn của gia đình Năng suất lý thuyết trong tập đoàn Khoai mỡ dao động từ 2,22-51 tấn/ha; Với TB là 18,3 tấn/ha; Nhóm có năng suất 13,9-27,8 tấn/ha chiếm tỷ lệ cao nhất chiếm 47,06% và nhóm có tỷ lệ thấp nhất là nhóm có năng suất trên 27,8 tấn/ha (15,69%)

- Kết quả điều tra một số đặc điểm nông sinh học của một số giống Khoai

mỡ triển vọng: Giống Khoai mỡ có màu thịt củ có thể là trắng, tím, tím pha trắng, trắng pha tím Củ có dạng hình 5 trụ, hình oval hoặc hình elip; Vỏ củ nhẵn, rễ trên

bề mặt củ ít, trọng lượng củ 500-1000g là được thị trường chấp nhận và tiêu thụ

mạnh hơn cả Căn cứ vào kết quả điều tra và kết hợp với kết quả đánh giá tập đoàn Khoai mỡ chúng tôi nhận thấy một số giống Khoai mỡ triển vọng trong tập đoàn có khả năng đáp ứng được nhu cầu có năng suất khá, trọng lượng củ đạt yêu cầu của thị trường, chất lượng ăn luộc ngon có thể mở rộng ra sản xuất: Củ mỡ trắng (GBVN10471), củ phẩm (GBVN11485), củ mỡ tím (GBVN10507), củ canh (GBVN10507).

Theo Lê Thị Khánh và cs (2010) [8] đã chỉ ra rằng khối lượng lát cắt củ giống 30-40g có nhiều ưu điểm nhất: Khả năng nhân giống tốt nhất, hệ số nhân giống cao (5-6,7 lần), sinh trưởng, phát triển, năng suất và hiệu quả kinh tế khá, thích hợp với điều kiện sinh thái và khả năng đầu tư giống của địa phương Tiếp theo là khối lượng 60-80g cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao nhất, nhưng hệ số nhân giống thấp nhất (2,5-3,3 lần), khối lượng 10-20g cho năng suất và hiệu quả kinh tế thấp nhưng hệ số nhân giống cao nhất (10-20 lần)

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Giống khoai mỡ (Dioscorea alata L.) thu thập từ Hữu Lũng thuộc tỉnh

Lạng Sơn, Lạng Giang thuộc tỉnh Bắc Giang

- Thân Khoai mỡ, chồi tái sinh từ thân

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp tạo vật liệu vô trùng, khả năng tái sinh nhân

nhanh và ra rễ cây Khoai mỡ bằng kỹ thuật in vitro.

3.2 Địa điểm, thời gian và điều kiện nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014

- Điều kiện nghiên cứu: Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng thí nghiệm được duy trì trong điều kiện nhân tạo:

Cường độ chiếu sáng: 2000-2500 lux

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

Độ ẩm: 70 – 90%

3.3 Hóa chất và thiết bị

3.3.1 Hóa chất

- Môi trường cơ bản (MS, WPM, B5)

- Saccharose

- Agar

- Than hoạt tính, PVP (polyvinyl pyrolidone)

- Các chất điều chỉnh pH: HCl 1M, NaOH 1M

3.3.2 Thiết bị

- Máy đo pH

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2

0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5,

WPM) đến khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).

chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA; BA kết hợp với

Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra

rễ của cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1

- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:

+ Mẫu sử dụng nuôi cấy là các đoạn thân non bánh tẻ được rửa bằng dung dịch xà phòng loãng, sau đó rửa sạch dưới vòi nước, tiếp tục tráng lại bằng nước cất

vô trùng 3-4 lần

+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt thành các đoạn

trong 1 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần cho sạch cồn và bụi bẩn trong

7, 10, phút Kết thúc thời gian khử trùng dùng nước cất vô trùng rửa sạch mẫu 3-5 lần Tiếp đó, ngâm mẫu trong nước cất vô trùng 5 phút Sau đó mẫu được thấm khô bằng giấy thấm, sử dụng pank, dao vô trùng cắt mẫu thành các đoạn nhỏ (0,5-0,7 cm) có chứa mắt ngủ

+ Cấy mẫu đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị.

+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện: Nhiệt độ phòng:

Độ ẩm: 70 – 90% Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường)

0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)

(sau 10 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình một mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 10 ngày các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống

không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2

- Phương pháp tái sinh in vitro:

+ Chồi được cấy trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy

chiếu sáng: 2000-2500 lux; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày; Độ ẩm: 70 – 90% Tiến hành theo dõi số chồi, chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 20 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 3

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu Mỗi công thức bổ sung thêm than hoạt tính 1g/l Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức thí nghiệm Môi trường

Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi

Ghi chú: Môi trường thích hợp nhất xác định ở thí nghiệm này được sử dụng làm môi trường nền cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy

1 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.

Ghi chú: MT nền là thành phần của môi trường MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin + Inositol 0,1g /l + đường 30g /l + agar 6g /l, pH = 5,6 – 5,8) + than hoạt tính 1g/l

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4

- Phương pháp nhân nhanh in vitro:

+ Các chồi sau khi được tái sinh, không bị nhiễm nấm, vi khuẩn được lựa chọn đưa vào nuôi cấy

+ Sử dụng dao cấy (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) nhẹ nhàng tách các chồi

đã tái sinh ra khỏi đoạn thân, kích thước mỗi đoạn chồi có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank cấy gắp đặt trên bề mặt môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị trước

+ Mẫu được cấy với mật độ đồng đều, cấy xong đưa vào phòng nuôi cây Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến hệ số nhân nhanh

của chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy

1 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.

Ghi chú: MT nền = Thành phần của môi trường MS (khoáng đa lượng + vi lượng + vitamin + Inositol 0,1g /l + đường 30g /l + agar 6g /l, pH = 5,6 – 5,8) + than hoạt tính 1g/l

Nồng độ BA thích hợp cho nhân nhanh chồi Khoai mỡ xác định ở thí nghiệm

4 (ký hiệu A) được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến hệ

số nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy).

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy

1 mẫu Môi trường nuôi cấy sử dụng MT nền bổ sung nồng độ BA (A) mg/l kết hợp với các nồng độ Kinetin Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức thí nghiệm Nồng độ Kinetin (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.

Ghi chú: MT nền là thành phần của môi trường MS (khoáng đa lượng + vi lượng + vitamin + Inositol 0,1g /l + đường 30g /l + agar 6g /l, pH = 5,6 – 5,8) + than hoạt tính 1g/l

3.5.5 Phương pháp nghiên cứu nội dung 5

- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro: Lựa chọn chồi Khoai mỡ có từ

2-3 lá, chiều cao thân 8-10 cm chuyển sang môi trường ra rễ Môi trường ra rễ dựa trên MT nền có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định, hình thành cây con hoàn chỉnh

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ

của Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy).

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy

1 chồi Thí nghiệm được bố trí như sau:

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Số rễ/cây, chất lượng rễ

Ghi chú: MT nền là thành phần của môi trường MS (khoáng đa lượng + vi lượng + vitamin + Inositol 0,1g /l + đường 30g /l + agar 6g /l, pH = 5,6 – 5,8) + than hoạt tính 1g/l

3.5.6 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá

- Giai đoạn khử trùng mẫu:

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)