Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (lates calcarifer) và thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm

MỞ ĐẦU Protease là một nhóm enzyme có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, từ nội tạng động vật hay từ vi sinh vật, là một nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiề

LÂM TUYẾT HẬN

NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI

TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT

BỘT CÁ THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KĨ THUẬT

Nha Trang - 2009

LÂM TUYẾT HẬN

NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI

TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT

BỘT CÁ THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 60.54.10

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐỖ VĂN NINH:

Nha Trang - 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và

kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công

trình nào

Tác giả luận văn

Lâm Tuyết Hận

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cám ơn: TS Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS TS Trần Thị Luyến, TS Nguyễn Thị Nga, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học, TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường -Trường Đại học Nha Trang cùng các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành

có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhận tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, quý thầy cô giáo Khoa Chế biến và bạn bè đã chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 4

1.1.1 Phân loại enzyme protease:[03], [06], [45], [48] .4

1.1.2 Protease trong cá và động vật thuỷ sản [04], [34] 8

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [06], [34], [44], [45] 9

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE NỘI TẠNG CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN [06], [11], [12], [34], [39], [42], [43] 12

1.2.1 Một số nghiên cứu về protease nội tạng của động vật thủy sản 12

1.2.2 Ứng dụng protease trong chế biến thủy sản 14

1.3 NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN Ở NƯỚC TA [34] 16

1.3.1 Những vấn đề tồn tại trong nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến 16

1.3.2 Hướng phát triển nghiên cứu và ứng dụng protease, CPE nội tạng cá trong chế biến thủy sản ở nước ta.[34] 17

1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHẼM VÀ PHẾ LIỆU CÁ CHẼM TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN[04], [16] 20

1.4.1 Giới thiệu về cá Chẽm 20

1.4.2 Giới thiệu về phế liệu của ngành chế biến thuỷ sản Việt Nam [57] 23

1.5 GIỚI THIỆU VỀ BỘT CÁ VÀ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PROTEASE ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CÁ THỦY PHÂN TỪ CÁ NỤC [06], [29], [33] 24

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 26

2.1.2 Nguyên liệu cá sử dụng để thủy phân thu bột đạm 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Sơ bố trí thí nghiệm tổng quát 27

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu về enzyme nội tạng cá Chẽm 28

2.2.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của DC và CPE 32

2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt cá Nục bằng chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm 34

2.3 Các phương pháp nghiên cứu: 37

2.3.1 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [06] 37

2.3.2 Phương pháp phân tích 37

2.3.3 Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng 38

2.3.4 Pháp xử lý số liệu 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 THÀNH PHẦN KHỐI LƯỢNG CỦA CÁ CHẼM .39

3.2 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA PROTEASE NỘI TẠNG CÁ CHẼM .39

3.2.1 Xác định điều kiện ủ thích hợp 39

3.2.2 Xác định dung môi chiết rút enzyme từ nội tạng cá Chẽm 42

3.2.3 Xác định tỷ lệ nước cất và nội tạng cá 43

3.2.4 Xác định quá trình kết tủa enzyme 44

3.2.5 Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của DC và CPE 47

3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 51

3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THỊT CÁ NỤC BẰNG CPE NỘI TẠNG CÁ CHẼM 54

3.3.1 Thành phần hoá học của cá Nục 54

3.3.2 Nghiên cứu chế độ thủy phân thịt cá Nục bằng CPE nội tạng cá Chẽm 55

3.4 QUI TRÌNH ĐỀ XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT CÁ NỤC 77

3.4.1 Đề xuất qui trình 77

3.4.2.Thuyết minh qui trình 78

3.4.3 Sơ bộ tính toán chi phí nguyên liệu sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Nục 78

3.4.4 Sản xuất thử bột cá Nục theo quy trình đề xuất 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHẦN PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CPE: chế phẩm enzyme là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease nội tạng cá Chẽm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần khối lượng của cá Chẽm (% so với toàn bộ cơ thể) 39

Bảng 3.2 Kết quả thu nhận protease từ nội tạng cá Chẽm 53

Bảng 3.3 Sơ bộ tính toán giá thành cho 100g protease CPE (1,24 UI/g) 53

Bảng 3.4 Thành phần khối lượng của thịt cá Nục (%) 54

Bảng 3.5 Thành phần hoá học chủ yếu của cá Nục 54

Bảng 3.6 Thành phần amino acid tự do của thịt cá Nục tươi 55

Bảng 3.7 Trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE nội tạng cá Chẽm 56

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ muối bổ sung tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 60

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 64

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 67

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 70

Bảng 3.12 Sự biến đổi trạng thái cảm quan của hỗn hợp theo thời gian

thủy phân 75

Bảng 3.13 Sơ bộ tính toán giá thành cho bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục (trong 100kg thịt cá) 79

Bảng 3.14 Trạng thái cảm quan của bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục 79

Bảng 3.15 Thành phần hóa học của bột đạm 80

Bảng 3.16 kết quả kiểm nghiệm vi sinh trong bột đạm thủy phân cá Nục 80

Bảng 3.17 Thành phần axit amin trong bột đạm thủy phân từ cá Nục 81

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1.Cá Chẽm (Lates calcarifer) 26

Hình 2.2 Cá Nục thuôn (Decapterus macrosoma) 26

Hình 2.3 Sơ đồ tách chiết protease từ nội tạng cá Chẽm 27

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ tới hoạt tính protease nội tạng cá Chẽm 40

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hoạt tính protease của nội tạng cá Chẽm 41

Hình 3.3 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 42

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 43

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tác nhân kết tủa tới hoạt tính protease CPE 44

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ aceton (%) đến hoạt tính enzyme 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hoạt tính protease của CPE 46

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme trong DC và CPE 47

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 49

Hình 3.10 Độ bền nhiệt của enzyme nội tạng cá Chẽm .50

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn tới hoạt tính enzyme protease nội tạng cá Chẽm 48

Hình 3.12 Quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 52

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 58

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng NH3 của các mẫu thủy phân 58

Hình 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 59

Hình 3.16 Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 61

Hình 3.17 Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 62

Hình 3.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng NH3 của các mẫu thủy

phân 62

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước tới hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 65

Hình 3.20 Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến hàm lượng NH3 của các mẫu thủy phân 65

Hình 3.21 Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 66

Hình 3.22 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 68

Hình 3.23 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng NH3 của các mẫu thủy phân 67

Hình 3.24 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 69

Hình 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 72

Hình 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 73

Hình 3.27 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng NH3 của các mẫu thủy phân 73

Hình 3.28 Ảnh hưởng hàm lượng protein, NH3, Naa của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 76

Hình 3.29 Qui trình sản xuất bột đạm từ thịt cá Nục 77

MỞ ĐẦU

Protease là một nhóm enzyme có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như

từ thực vật, từ nội tạng động vật hay từ vi sinh vật, là một nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống như: công nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm…Trong thời gian gần đây, một số nhà khoa học ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu thu nhận protease từ nội tạng cá và động vật thuỷ sản khác để sử dụng trong chế biến thủy sản Tuy nhiên,

ở nước ta, các công trình nghiên cứu về protease nội tạng cá cũng như sử enzyme này còn rất hạn chế và vì vậy, đây là lĩnh vực mới thuộc Công nghệ sinh học đang trên đà phát triển, rất cần được quan tâm nghiên cứu

Hiện nay cá cũng một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của ngành Thủy sản tỉnh Cà Mau, Theo thống kê của Sở Nông Nghiệp Cà Mau Tổng các sản phẩm thủy sản xuất khẩu năm 2008 là 76.772 tấn Trong đó, cá chiếm khoảng 20% đến 30% với các loại sản phẩm fillet, cắt khúc, nguyên con bỏ nội tạng, surimi…Theo số liệu thống kê từ các nhà sản xuất thì phế liệu của sản phẩm cá fillet khoảng 48-50% tuỳ thuộc vào giống loài và mùa vụ Nhưng riêng đối với loài cá Chẽm fillet, phế liệu chiếm khoảng 50 ÷ 55% Theo báo cáo năm 2008 của Sở Nông Nghiệp Cà Mau từ năm 2008 đến năm 2010 sản lượng cá Chẽm khai thác tự nhiên và nuôi trồng tăng rất lớn, vì hiện nay có rất nhiều đơn đặt hàng tại các nhà máy chế biến thủy sản tại Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc trăng, Cần Thơ Từ thực tế trên UBND Cà Mau đã có kế hoạch mở rộng, đầu tư nuôi cá Chẽm cho những vùng nuôi tôm không hiệu quả nhằm khai thác một cách hiệu quả diện tích ao nuôi và cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy trong và ngoài tỉnh Như vậy, trong thời gian tới nguyên liệu cá Chẽm tại Cà Mau sẽ có sản lượng lớn được chế biến thành mặt hàng fillet đông lạnh và các sản phẩm khác

và do đó, lượng phế liệu từ cá Chẽm thải ra hàng ngày tại các nhà máy chế biến rất nhiều Hiện tại, riêng xí nghiệp Chế Biến Xuất Nhập Khẩu & Dịch vụ thủy

Cà Mau hàng ngày trung bình thải ra từ 1,3 tấn đến 2,0 tấn phế liệu chưa xử lý hoăc chỉ xử lý sơ bộ rồi thải ra ngoài làm ảnh hưởng đến môi trường và đời sống người dân nơi đây Phế liệu cá Chẽm gồm nội tạng, da, đầu, xương, vây

vẩy Không có giá trị kinh tế cao nhưng lại nhanh ươn thối, gây ô nhiễm môi trường, khó khăn cho các nhà quản lý cũng như các nhà sản xuất, ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm và môi trường của các nhà máy chế biến thủy sản Để giải quyết khó khăn trên hiện nay,Việt Nam và trên thế giới đang có xu hướng tận dụng phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm giá trị gia tăng [25], [27], [34] như chế biến nội tạng thành chế phẩm enzyme, peptit có hoạt tính sinh học, sản phẩm y học, bột cá …Việc chế biến phế liệu cá có thể mang lại những hiệu quả kinh tế cao cho địa phương cũng như cả nước

Mặt khác, lượng cá tạp, cá nhỏ chiếm tỷ lệ rất đáng kể, trên 30% tổng sản lượng của cá Theo truyền thống, cá tạp chỉ sử dụng chế biến nước mắm, thức ăn chăn nuôi, ướp muối…Hiệu quả kinh tế thấp

Từ thực tế trên, yêu cầu cấp bách đặt ra cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản sử dụng hợp lý, hiệu quả lượng phế liệu cá cũng như lượng cá nhỏ,

cá tạp do các nhà máy chế biến thủy thải ra hàng ngày Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là thu nhận chế phẩm protease từ nội tạng cá và sử dụng chế phẩm này để chế biến cá tạp thành phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, vừa giảm thiểu chất thải, vừa nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành thủy sản

Với mong muốn góp phần giải quyết vấn đề trên của tỉnh Cà Mau, tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nội tạng cá Chẽm (Lates

calcarifer) và thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm” nhằm tăng giá trị

sử dụng và sử dụng triệt để hơn nguồn phế liệu cá Chẽm và nguyên liệu cá tạp, giảm ô nhiễm môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho ngành kinh tế thủy sản địa phương phát triển

Mục đích của đề tài

Xác định các điều kiện thích hợp để tách chiết, thu nhận chế phẩm protease

từ nội tạng cá Chẽm (Lates calcarifer) ở vùng Cà Mau, xác định hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của chế phẩm thu được Sau đó thử nghiệm

ứng dụng chế phẩm protease thu được vào trong sản xuất bột cá thủy phân từ thịt cá

Nục (Decapterus macrosoma)

Nội dung nghiên cứu của đề tài

1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nội tạng cá Chẽm để chiết rút, thu nhận dịch chiết nội tạng và xử lý dịch chiết thu chế phẩm enzyme nội tạng cá Chẽm, từ đó xây dựng qui trình thu nhận chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm

2 Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm: Độ bền nhiệt, khả năng chịu muối, nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp

3 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Chẽm để thủy phẩm thịt cá Nục, bột đạm thủy phẩm từ thịt cá Nục

Ý nghĩa thực tiễn và khoa học

Thành công của đề tài luận văn sẽ được áp dụng để sản xuất bột cá, bột dinh

dưỡng

Nâng cao được giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của phế liệu cá cũng như nguồn nguyên liệu cá tạp, cá Chẽm và giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập, giải quyết được đời sống khó khăn cho người dân tỉnh Cà Mau

Tăng giá trị của nguyên liệu cá Chẽm, từ đó khuyến khích được người nuôi Lần đầu tiên nghiên cứu về các đặc tính của protease từ nội tạng cá Chẽm và nghiên cứu ứng dụng enzyme này trong chế biến thủy sản, kết quả của luận văn góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về protease từ nội tạng cá Chẽm nói riêng và protease từ động vật thủy sản nói chung

Kết quả của luận văn sẽ góp phần vào chương trình “Chế biến các sản phẩm

có giá trị gia tăng” của nước ta cũng như ngành thực phẩm

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

1.1.1 Một số khái niệm cơ bản về enzyme

Hầu hết các phản ứng hóa sinh học xảy ra trong hệ thống sống đều do enzyme xúc tác Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống cũng như xảy ra ở ngoài tế bào Mặt khác enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm, hàng nghìn lần so với các chất vô cơ thông thường Chẳng hạn trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng enzyme saccharase làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng nhanh gấp 2.1012 lần so với khi dùng axit làm chất xúc tác Quan trọng hơn nữa là enzyme có khả năng xúc tác cho những phản ứng hóa học xảy ra trong những điều kiện nhiệt độ bình thường của cơ thể, ở pH môi trường gần pH sinh lý Trong khi các chất vô cơ không có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học thì enzyme có khả năng xúc tác đặc hiệu

cao đối với kiểu phản ứng cũng như đối với cơ chất mà nó tác dụng [6]

Ví dụ: axit clohydric có khả năng xúc tác thủy phân liên kết peptit có trong protein cũng như liên kết glycosit trong tinh bột Còn protease là enzyme chỉ thủy phân liên kết peptit trong protein mà không thủy phân liên kết glycosit trong tinh bột, còn amylase lại chỉ có khả năng thủy phân liên kết glycosit của tinh bột mà

không thuỷ phân được liên kết peptit của protein

Do những ưu điểm trên mà ngày nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme càng có ý nghĩa về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn

Bản chất cấu trúc của enzyme

Enzyme là các protein có hoạt tính sinh học, do vậy chúng có đầy đủ tính chất của một protein

Về khối lượng phân tử: enzyme là những protein có khối lượng phân tử lớn, đa

số enzyme có khối lượng phân tử từ 6.000 ÷1.000.000 Dalton do vậy enzyme không thể đi qua được màng bán thấm

Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng và khi tan trong nước thì tạo thành dung dịch keo giống như dung dịch của protein, enzyme không tan trong dung môi phân cực

Enzyme bị kết tủa bởi các yếu tố gây kết tủa protein Các yếu tố vật lý và hóa học làm kết tủa protein thì cũng làm kết tủa enzyme Enzyme cũng bị mất hoạt tính khi bị tác động bởi các yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng…

Enzyme được cấu tạo bởi các L- axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme cũng bị thủy phân dưới tác dụng của các peptit-hydrolase, axit hoặc kiềm Khi enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L- axit amin, trong một số trường hợp ngoại lệ ngoài axit amin còn nhận được các chất khác

Enzyme có hai loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Enzyme một thành phần thì trong thành phần của nó chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân Enzyme hai thành phần gồm có: phần protein và phần phi protein Phần protein gọi là apoenzyme, phần phi protein gọi là coenzyme Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa protein nhưng chuỗi polypeptit trong phân tử enzyme có thể thay đổi tùy từng

enzyme [13]

Đến nay người ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều có

cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau bằng liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị hoặc một số liên kết khác, tùy mức

độ liên kết mà hình thành nên các đồng phân của enzyme gọi là isoenzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme

có nhiệm vụ liên kết với cơ chất và chuyển hóa cơ chất

Có những enzyme có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt động

Ví dụ: alcol-dehydrogenase của gan động vật có hai trung hoạt động, còn alcol-dehyrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động Các trung tâm hoạt động có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng

Đối với enzyme một thành phần trung tâm hoạt động của nó là sự phối hợp giữa các nhóm chức nằm ở mạch bên của axit amin có trong thành phần của nó Các nhóm chức thường gặp là: nhóm sulfihydryl (-SH-) của Cys; nhóm hydroxyl (-OH-) của Ser, Thr, Tyr; nhóm cacboxyl (-COOH) của Asp, Glu; nhóm amin (-NH2-) của Lys; vòng imidazol của His; nhóm guanilic của Arg Đối với enzyme hai thành phần trung tâm hoạt động của nó ngoài các nhóm chức của axit amin người ta còn gặp các nhóm chức của các thành phần phi protein chẳng hạn như các nhóm chức của phần coenzyme ( thường chứa các vitamin hoặc các ion kim loại) [13]

Cơ chế tác động của enzyme

Enzyme thường tác động vào cơ chất theo phương trình phản ứng sau:

E + S ES P +E

Trong đó E: là enzyme; S: là cơ chất; ES: là phức hợp enzyme-cơ chất; P: là sản phẩm

Enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua ba giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: enzyme tác dụng với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết Vandecvan Mỗi liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

+ Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

+ Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng enzyme Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu

1.1.2 Cách gọi tên và phân loại enzyme protease: [03, 06, 45, 53]

Cách gọi tên và phân loại nhóm enzyme thủy phân protein – protease cũng thay đổi qua các thời kỳ [48] Theo Grassmann và Dyckerhoff (1928) thì protease

được phân chia thành proteinase và peptidase Theo Bergmann và Ross (1936) thì

peptidase lại được chia thành 2 nhóm là endopeptidase và exopeptidase

Năm 1960, Hartley [48] phân chia proteinase thành 4 nhóm theo cơ chế xúc tác Nhưng do các hiểu biết mới về mặt hóa học trong trung tâm hoạt động của enzyme nên Barrett đã phân chia lại và được ủy ban danh pháp hóa sinh quốc tế công nhận (1984) Theo Barrett proteinase được chia làm 4 nhóm nhỏ, tên các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme

+ Proteinase serine (EC.3.4.21.): là những proteinase có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Các proteinase serine này thường hoạt động ở vùng pH kiềm

và có tính đặc hiệu tương đối rộng Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc axit amin chứa nhóm (-CO - ) của liên kết peptit bị thủy phân Nhóm (-OH) này có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các enzyme thuộc nhóm này như: trypsin có thể thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axit amin kiềm (Lys, Arg), chymotrypsin xúc tác thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axit amin có vòng thơm, … Chúng bị ức chế mạnh dưới tác dụng của DFP và một số protein đặc hiệu khác như các antitrypsin có ở hạt đậu tương

+ Proteinase cystein (EC.3.4.22.): là các proteinase có nhóm thiol (-SH) của axit amin cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như axit hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa,… Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt khác nhau như tạo thành phức trung gian enzyme – cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor… Các proteinase cystein thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng, chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây Do đó các chất như cystein, axit ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng ức chế proteinase cystein, còn các chất oxy hóa như: iôt, H2O2, EDTA,… có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của nhóm enzyme này

+ Proteinase aspartic (EC.3.4.23.): là những proteinase chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc Glu hay cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptit Các proteinase aspartic thường hoạt động mạnh ở vùng pH axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng thơm hoặc axit amin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân

+ Proteinase kim loại (EC.3.4.24): là những proteinase trong trung tâm hoạt động chúng có các ion kim loại Các proteinase kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc axit amin chứa nhóm (-NH -) của liên kết peptit, chúng có thể tác dụng lên liên kết peptit chứa nhóm (- NH -) của các axit amin kỵ nước có kích thước lớn hoặc liên kết peptit được tạo thành từ các axit amin có phân tử lượng thấp Các proteinase kim loại thường giảm hoạt động mạnh dưới tác động của EDTA

1.1.3 Protease trong cá và động vật thuỷ sản [04, 34]

Protease của cá là protease nội bào, có ở mọi nơi tế bào nhưng tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, kế đó là cơ quan nội tạng khác và cơ thịt

1.1.3.1 Protease của cơ quan tiêu hóa

Hệ enzyme tiêu hóa có nhiều bộ phận khác nhau, mỗi bộ phận có chức năng

và đặc điểm riêng trong qúa trình chuyển hóa và hấp thụ

Theo như các nhà sinh hóa động vật, trong hệ enzyme tiêu hóa của cá sự phân bố và vai trò protease có thể như :

- Khoang miệng: Enzyme không có vai trò gì ở đây

- Họng (hầu): Chưa có enzyme tham, vì ở cá không có tuyến nước bọt

- Thực quản cá: Theo như tài liệu tham khảo thì các nhà nghiên cứu cho rằng, thấy enzyme gần giống tripsin và một số enzyme khác nhưng hoạt tính yếu

- Dạ dày: Là cơ quan dự trữ thức ăn, theo nhà nghiên cứu ở dạ dầy có enzyme pepsin A, B, C, D

- Đường ruột: Có enzyme tripsin, chymotripsin, cacbonxylpeptidase A, B Enzyme này tiết ra ngoài tế bào cùng dịch vị, có chức năng tiết dịch ruột, trong đó

có hệ enzyme thủy phân, hấp thụ, nội tiết, miễn dịch, bài tiết

- Tuyến tụy có thể sản xuất ra dịch tiêu hóa có thành phần phức tạp, trong đó enzyme thủy phân protein và enzyme thủy phân các thành phần khác trong thức ăn Đặc biệt của tuyến tụy là tổng hợp được các enzyme thủy phân protein

Như vậy, các cơ quan của hệ tiêu hóa từ dạ dày, ruột, tuyến tụy là cơ quan chủ yếu chứa hệ enzyme protease, tuy nhiên từng cơ quan có chức năng riêng

- Enzyme dạ dày: Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có chưa enzyme pepsin xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong môi trường axit mạnh Theo như tài liệu của các nhà nghiên cứu đã xác định, trong dạ dày của cá chứa 2 loại enzyme là pepsin và parapepsin

1.1.3.2 Protease của cơ thịt cá

Ở cơ thịt cá tồn tại enzyme protease thuộc loại cathepsin, giống cathepsin của động vật máu nóng nhưng không đồng nhất Theo các nhà nghiên cứu cho biết

có hai ý kiến về enzyme cathepsin trong cơ thịt cá như sau:

-Trong cơ thịt cá chỉ có enzyme cathepsin D thuộc nhóm endopeptidase, pH thích hợp là 3,5 – 4.0, thủy phân hemolobin ở pH thích hợp 4,0 enzyne này ngừng hoạt động ở nhiệt 50C nhưng khi nung nóng 680C trong 15 phút vẫn còn 85% hoạt

độ, enzyme này bị ức chế bởi xistein và khả năng chịu muối kém, muối 5% hoạt độ còn rất kém

-Trong cơ thịt, ngoài cathepsin D ra còn có các cathepsin khác như E, A, B,

C và các exopeptidase

1.1 4 Phương pháp tách chiết thu nhận CPE [06]

Để tách chiết protease từ nội bào, cần phá vở cấu ỷtúc tế bào bằng phương pháp cơ học (nghiền với thuỷ tinh hoặc xay, nghiền, đồng hoá bằng sóng siêu âm…) sau đó dùng các dung môi thích hợp như nước, dung dịch muối trung tính, các dung dịch đệm để chiết rút enzyme Dịch chiết thu được, ngoài enzyme còn có các protein tạp, các chất tan hữu cơ và vô cơ nên phải xử lý, tinh sạch enzyme

Phương pháp xử lý và tinh sạch enzyme rất đa dạng, phức tạp, tuỳ mức độ, yêu cầu tinh sạch Các biện pháp thường áp dụng là: thẩm tích, lọc gel Sephadphex, CM-xenluloza, siêu lọc, kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc muối hữu cơ, phương pháp sắc ký, điện di, hấp phụ chọn lọc…và thường áp dụng kết hợp nhiều phương pháp mới có thể thu CPE có độ tinh sạch cao

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [06, 13, 17, 21]

Trong quá trình thủy phân thịt cá bằng protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân như:

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh

hưởng đến hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt

độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷50oC và ở nhiệt độ lớn hơn 700C đa số enzyme bị mất hoạt tính Như vậy nhiệt độ 700C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme nếu nhiệt

độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng 1,5 ÷2 lần Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH cơ chất

Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH

Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích

pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động trong vùng axit hay kiềm Thịt cá thường có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong cơ thịt như cathepsin và các protease bổ sung thêm từ bên ngoài vào Vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò xúc tác chính cho quá trình thủy phân để tạo pH thích hợp cho nó và hạn chế ảnh hưởng đến các enzyme khác

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng

tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt Khi nồng độ enzyme càng bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa thì vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với cơ

chất là thịt cá, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất, phức này sẽ kéo căng liên kết peptit, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

Ảnh hưởng của nồng độ muối: Trong quá trình thủy phân chúng ta thường bổ sung muối ăn bởi vì muối ăn có tác dụng ức chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa và các loại vi sinh vật không chịu muối nhưng nếu bổ sung muối ăn với tỷ lệ cao vào hỗn hợp thủy phân sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme protease vì bản chất hóa học của enzyme là protein nên cũng bị kết tủa bởi muối trung tính Mặt khác khi nồng độ muối quá cao làm sản phẩm bột đạm có vị mặn Để chọn được nồng độ muối thích hợp bổ sung vào quá trình thủy phân cần phải tiến hành trên các mẫu bổ sung muối ăn với các tỷ lệ

khác nhau để từ đó chọn được tỷ lệ muối ăn bổ sung cho phù hợp

Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và thịt cá cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân

Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt ngưới ta thường xay nhỏ, đập dập, cắt khúc cá Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein

càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân kéo dài hoặc rút ngắn đều ảnh

hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân do enzyme tác động và chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất, nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm thứ cấp như: NH3, H2S, indol, … đồng thời khi thời gian kéo dài hiệu quả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây loãng phí nguyên liệu và gây khó khăn ở công đoạn lọc, tách xương để thu dịch thủy phân

Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân: Nước là môi

trường thuận lợi cho hoạt động enzyme và vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện để các loại enzyme và vi sinh vật hoạt động được là môi trường phải

có nước và lượng nước ở trạng thái tự do tối thiểu phải là 15% Do vậy trong quá

trình thủy phân thịt cá nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp thì hạn chế hoạt động của

vi sinh vật nhưng đồng thời cũng ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao thì chính nước là môi trường thuận lợi để cho vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các

sản phẩm thứ cấp như: indol, NH3, H2S… làm ảnh hưởng đến chất lượng bột đạm

Vì vậy để xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân ta tiến hành thí nghiệm trên nhiều mẫu bổ sung nước với tỷ lệ khác nhau và từ đó chọn tỷ

lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

Chất lượng bột cá thành phẩm còn bị ảnh hưởng bởi chất lượng nguyên

liệu cá dùng cho quá trình thủy phân như: loài cá, độ tươi của cá…

Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu: Mỗi loài cá khác nhau sẽ có hàm

lượng protein khác nhaụ, cá có giá trị dinh dưỡng cao sẽ có đầy đủ các axit amin không thay thế với tỷ lệ cân đối

Nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến chất lượng bột cá thành phẩm, cá ươn thì

sự phân hủy protein thịt cá thành sản phẩm cấp thấp như: indol, scaptol, H2S,

NH3,…các chất này dễ gây ngộ độc cho người sử dụng

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE NỘI TẠNG CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN [06, 11, 12, 34, 39, 42, 43]

1.2.1 Một số nghiên cứu về protease nội tạng của động vật thủy sản

Ở Việt Nam có nhiều công trình công bố về nghiên cứu sử dụng protease, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một một số đặc tính của enzyme… một số công trình nghiên cứu về protease nội

tạng tại Việt Nam như:

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex G -75 thu được hai protease có nhiệt

độ thích hợp ở 600C, 500C và pH tương ứng là 7,5; 8,5 Tác giả còn cho thấy có thể

sử dụng protease đầu tôm bộp trong thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá

Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Văn Ngoạn, Phạm Thị Hà, Vũ Thanh Hoa và Nguyễn Văn Lệ (1993) công bố nghiên cứu về protease đầu tôm biển cho thấy hoạt

độ proteolitic của DC cực đại ở pH 7,5 nhiệt độ 650C; đối với CPE, pH0pt là 8,5 và

t0pt = 550C Cystein, iôt và các ion kim loại hoá trị 2 (Ba, Cu, Pb, Ca, Fe, Mg, Cd,

Zn, Mn, Hg) ở nồng độ 10-3M làm giảm hoạt độ proteolitic của DC và CPE, tách

CPE qua cột sắc kí lọc gel sephadex G-75 thu được hai loại protease có hoạt lực chủ yếu là protease P-I và protease P-II

Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), công bố công trình nghiên cứu protease của

đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus brevicornis) Kết quả cho thấy có thể dùng đệm

Britton để chiết enzyme protease có hoạt tính cao và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng cách dùng aceton để gây kết tủa protease thu được có nhiệt độ thích hợp

là 500C, pH thích hợp từ 8,5÷9,5 khi tách protease này bằng sắc kí lọc gel sephadex G-75 cho thấy P-II là một protease serine Dùng chế phẩm enzyme kỹ thuật của đầu tôm này để thủy phân cá mối cho bột đạm chất lượng cao [45]

Nguyễn Văn Truyền (2006), nghiên cứu chiết enzyme protease từ đầu tôm càng xanh, tác giả nghiên cứu xây dựng quy trình chiết enzyme, thử các yếu tố ảnh hưởng như: Dùng đệm briton để chiết, kết tủa enzyme protease bằng aceton 70%, nhiệt độ tối thích 55oC, pH tối thích 8, nhiệt độ 600C bị phá hủy, NaCl 1 làm tăng hoạt tính, Các chất làm giảm hoạt độ protease DC và CPE là: DFP, Cd2+, Cu2+, Hg2+,

Pb2+, , Mg2+, Zn2+, Fe2+, CN-, H2O2, L- cystein, EDTA trong đó DEP làm giảm gần như hoàn toàn hoạt tính của proteaes DC và làm mất hoàn toàn hoạt tính của protease CPE còn Ca2+, Ba2+, As thì làm tăng nhẹ hoạt độ protease DC và CPE [44]

Các nghiên cứu về protease cá không nhiều, chủ yếu có một số công trình sau:

Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng

cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50  550C và hoàn toàn có thể

sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [34]

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), nghiên cứu thu nhận chế phẩm

enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti) Nhóm nghiên cứu cho biết,

dịch chiết protease kiềm thu được có tổng hoạt tính 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút Dung môi isopropanol là tác nhân thích hợp nhất để kết tủa proteasẹ Tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và thể tích isopropanol là 15/85, mức tinh sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần và hiệu suất thu hồi enzym đạt được là 90,42%.[18]

Một số công trình nghiên cứu về protease nội tạng thủy sản nước ngoài như: Năm 1987 Doke S.N và cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Độ

(P.inducus) là một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0, bền với nhiệt, hoạt

động phụ thuộc vào ion kim loại, có khối lượng phân tử 25kDa và được xem như một protease serine Theo các tác giả này, trong thịt tôm còn tìm thấy hoạt động của exopeptidase mang tính chất của một aminopeptidase, hoạt động cực đại ở pH trung tính (pH 6,8) [49]

Năm 1996, các tác giả H.R Kim, H.H Baek, S.P Meyes, K.R Cadwallader

và J.S Godber thuộc trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Louisiana đã nghiên cứu

sử dụng “chất chiết từ gan – tụy” của tôm nước ngọt và nhận thấy khi sử dụng

“chất chiết từ gan – tụy” tôm để xử lý phế liệu cua có thể làm tăng khả năng chiết tách các chất tạo mùi từ phế liệu cua

Các công trình nghiên cứu trên đã góp phần thúc đẩy lĩnh vực nghiên cứu

về protease nội tạng cá ở nước ta phát triển Các nghiên cứu ứng dụng protease ở nước ta vẫn còn một số hạn chế như các chế phẩm enzyme được sản xuất với giá thành còn cao … Vì vậy cần nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra một phương pháp ứng dụng phù hợp với điều kiện sản xuất thực tế tại Việt Nam, đặc biệt là cần nghiên cứu về protease từ động vật thủy sản là một lĩnh vực còn ít các công trình nghiên cứu nhưng có nhiều triển vọng ở nước ta

1.2.2 Ứng dụng protease trong chế biến thủy sản

Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu và cho biết enzyme protease trong hệ tiêu hóa ứng dụng trong sản xuất nước mắm rất phổ biến Nhiều nhà khoa học đã ứng dụng protease để sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng cách bổ sung thêm enzyme protease từ tụy tạng, ruột non Thời gian gần đây, nhờ CPE thương mại có tác dụng thủy phân thịt cá mạnh, rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá chỉ còn 10-30 ngày Ngoài ra protease còn ứng dụng trong lột da, mang bao rất hiệu quả Để lột

da một số loài thủy sản vốn rất khó bóc vỏ, tách da ở Iceland đã thực hiện việc ngâm cá ngừ, cá đuối trong dung dịch hỗn hợp proteaza và cacbohydrase ở 600C, sau đó phun nước có áp lực trên bền mặt cá, da sẽ được tách ra một cách nhẹ nhàng

hoặc da cá trích, người ta dùng pepsin ở pH thấp hay mức Ống, người ta dùng papain trong nước muối nhạt, Tương tự, có thế sử dụng proteaza để xử lý, làm yếu liên kết giữa vỏ và thịt tôm trước khi bóc vỏ tôm Protease cũng được sử dụng dưới dạng dung dịch để ngâm cá ở nhiệt độ 00C, làm mền da, giúp đánh vẩy dể dàng cá

mú, cá tuyết sọc đen…

Ủ Xilo: Sử dụng protease trong quá trình thuỷ phân phế liệu thuỷ sản hoặc cá tạp, cá nhỏ trong môi trường axit Kết thúc quá trình thuỷ phân, li tâm tách bỏ xương, lipit, phần dịch protein thuỷ phân thu được dùng để thay thế sữa khi khẩu phần ăn của vật nuôi

Sử dụng protease sản xuất chất tạo mùi, vị thuỷ sản rất quan trọng, có nhu cầu rất lớn trong sản xuất các sản phẩm mô phỏng có gía trị tăng từ surimi, bột ngũ cốc Có thể sử dụng protease để giúp tách chiết chất mùi, vị và màu thuỷ sản từ nguyên liệu, phế liệu tôm, cua, ghẹ Một số chủng vi khuẩn sinh protease được cho vào phế liệu tôm, cua để thuỷ phân nhanh protein, cô đặc dịch thuỷ phân và sấy phun, thu được bột có các thành phần tạo vị và mùi, có hàm lượng axit amin tự do

và nucleotit cao chất mùi, vị tôm, cua dùng làm phụ gia thực phẩm trên nền surimi, tinh bột Protease cũng được dùng để thu nhận chất tạo mùi, vị

Trong sản xuất bột cá nếu sử dụng protease sẽ dễ dàng tách da thịt ra khỏi xương, bột cá mịn hơn, dễ hòa tan hơn, hàm lượng axit amin cao hơn, hiệu quả kinh

tế cao hơn

Từ góc độ phân tích ở trên cho thấy chưa có một công trình nghiên cứu nào công bố về protease từ nội tạng cá Chẽm Nên việc nghiên cứu tách chiết và tìm hiểu về tính chất của protease từ nội tạng cá Chẽm để nghiên cứu khả năng thủy phân thịt cá Nục ( một loại cá kém giá trị kinh tế) để sản xuất bột đạm thủy phân là một lĩnh vực cần thiết đối với ngành Chế biến Thủy sản, góp phần cho ngành thủy sản phát triển mạnh hơn

Nhìn chung việc nghiên cứu và ứng dụng protease rất phổ biến từ lâu nhưng

về ứng dụng và nghiên cứu protease của cá thì rất hạn chế, đồng thời còn mới mẽ Chủ yếu nghiên cứu và ứng dụng chưa rộng, trong phòng thí nghiệm, chưa đủ khả năng chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp Chưa có nhiều qui trình sản

xuất CPE từ nhiều nội tạng cá mặc dù nhu cầu cho chế biến hiện nay rất lớn nhưng chúng ta chủ yếu nhập khẩu từ các nước khác, vừa tốn kém vừa không chủ động Trong khi đó nguồn nội tạng cá do các xí nghiệp chế biến thủy sản thải ra hàng năm rất lớn đang bị thải bỏ, trở thành nguồn ô nhiễm môi trường, đó là vấn đề cần giải quyết hiện nay

1.3 NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN THỦY SẢN Ở NƯỚC TA [34]

1.3.1 Những vấn đề tồn tại trong nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến

Protease của động vật thuỷ sản nói chung và của cá nói riêng ít được sử dụng

ở quy mô công nghiệp Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:

+ Nghiên cứu về enzyme protease thuỷ sản được công bố từ những năm đầu thập niên 80 của thế kỷ trước: Trước đó, chỉ có vài nghiên cứu về pepsin của cá hồi, cathepxin của cá tuyết, cá trích và cá bơn (Schmitt và Sibert – 1967) Thông tin và

sự hiểu biết và protease của thuỷ sản còn rất hạn chế và việc ứng dụng chúng ở quy

mô công nghiệp mới chỉ ở những bước khởi đầu

+ Trong cơ thể động vật thuỷ sản, cơ quan tập trung enzyme nhiều và có hoạt lực cao là nội tạng nên thường sử dụng nội tạng của chúng làm nguồn thu enzyme Tuy nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh, hôi, có nhiều vi sinh vật, dễ hư hỏng nên rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên

Protease của động vật thuỷ sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác nhau Để tách ra và làm tinh sạch từng enzyme cần qua rất nhiều bước khác nhau phức tạp Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị trường chưa có CPE thương mại từ động vật thuỷ sản Để phát triển sản xuất CPE từ thuỷ sản phải nghiên cứu hoàn thiện công nghệ và giảm giá thành sản phẩm

Tồn tại cần giải quyết trong sản xuất dịch protein thuỷ phân từ cá là:

Vị đắng: dịch thuỷ phân dễ có vị đắng Trước đây, người ta cho rằng vị đắng

là do xử lý cá chưa sạch, chưa rửa hết dịch mật trong thịt cá nguyên liệu Nhưng vị đắng của dịch đạm thuỷ phân không phải là vấn đề của riêng cá mà là của mọi sản

phẩm thuỷ phân protein Người ta đã xác định được vị đắng của dịch protein thuỷ phân do các “peptit đắng” gây ra, peptit đắng là có thành phần axit amin kị nước như leuxin, prolin…ở đầu mạch và có độ dài của mạch peptit xác định Nếu protein được thuỷ phân triệt để, thu sản phẩm thuỷ phân chủ yếu là axit amin và peptit ngắn mạch, dịch thuỷ phân sẽ không bị đắng Như vậy, vị đắng là sản phẩm tất yếu của quá trình protein dưới tác dụng của protease và có thể tách được nhờ điều chỉnh mức độ thuỷ phân Cũng có một số ý kiến cho rằng: vị đắng là do hoạt động của hỗn hợp pepsin và lipase khi thuỷ phân thịt cá, các peptit liên kết với các sản phẩm của quá trình oxi hoá lipit

Trên cơ sở hiểu biết cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành vị đắng, ngưới ta đã đưa ra các giải pháp công nghệ để nhận được sản phẩm thuỷ phân

từ thịt cá bằng protease không có vị đắng Các giải pháp điều nhằm điều khiển quá trình, mức độ thuỷ phân của protease Hiện tại đã xây dựng được các chương trình điều khiển các nồi thuỷ phân protein bằng enzyme và việc điều khiển quá trình này thực hiện tự động nhờ máy vi tính

+ Vị và mùi tanh cá: dịch thuỷ phân từ protein cá thường có mùi và vị tanh đặc trưng của cá là do bảo tồn các cấu tử gây mùi tanh tự nhiên của nguyên liệu cá tươi có bản chất nitơ phi protein như: TMAO, URE, NH3 …Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách khử mùi tanh như: Rửa thịt cá tươi hoặc xử lý khử mùi tanh bằng dung dịch axit axetic 0,5% (Trần Thị Luyến và cộng sự - 1998) hoặc đơn giản

là “ che đậy” mùi tanh bằng các hương liệu, gia vị thích hợp

1.3.2 Hướng phát triển nghiên cứu và ứng dụng protease, CPE nội tạng cá trong chế biến thủy sản ở nước ta.[34]

- Các nhà quản lý, các nhà công nghệ và nhà khoa học cần quan tâm đầu tư vào lĩnh vực nghiên cứu enzyme, đặc biệt là protease của cá và các động vật thuỷ sản khác, xây dựng hệ thống dữ liệu về chúng để phục vụ ứng dụng chúng vào ngành chế biến thủy sản

- Sớm hoàn thiện công nghệ chiết rút protease từ nội tạng cá để sản xuất CPE nội tạng cá cung cấp cho ngành chế biến thuỷ sản

- CPE có thể sử dụng dưới hai dạng:

+ Dạng enzyme hoà tan: CPE được phối trộn theo một tỷ lệ xác định với nguyên liệu có độ ẩm lớn để enzyme có thể hoà tan, phân tán, tiếp xúc với protein

và xúc tác cho quá trình thuỷ phân nguyên liệu Như vậy, enzyme hoà tan chỉ sử dụng được một lần, dẫn đến giá thành sản phẩm cao Tuy nhiên, sử dụng enzyme hoà tan hiệu quả hơn nhiều so với quá trình thuỷ phân bằng enzyme của chính bản thân nguyên liệu vì CPE có thể bảo quản, sử dụng rộng rãi, linh hoạt theo yêu cầu công nghệ và có thể dễ dàng điều chỉnh các yếu tố môi trường để điều khiển quá trình thuỷ phân theo yêu cầu, nếu giảm giá thành CPE bằng cách sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, có hàm lượng protease lớn như nội tạng động vật, nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh protease thì vẫn có thể tăng được hiểu quả kinh tế của các quá trình thuỷ phân bằng protease Vì vậy, vài chục năm lại đây, việc sản xuất và sử dụng CPE hoà tan tăng lên nhanh hơn

+ Dạng enzyme cố định: enzyme cố định là các enzyme được gắn cố định trên các chất mang không tan Có thể tạo enzyme cố định theo các phương pháp như sau:

- Gắn bằng liên kết đồng hoá trị: gắn protease với chất mang không hào tan, hoặc gắn các phân tử enzyme lại với nhau, tạo thành các đại phân tử (polyme) enzyme không tan Các chất mang thường dùng là polyme tự nhiên hoặc nhân tạo như : xenlulose (hoặc dẫn xuất của xenlulose như: DEAE – xenlulose, CM-xenlulose…), dextran (hoặc dẫn xuất của nó như: DEAE – sephadex, CM-sephadex), polyacrylamit, polystyrol, polystyerene…

- Nhốt enzyme trong khuôn gel bằng cách trùng hợp các chất mang để tạo khuôn gel khi có mặt đồng thời enzyme Khi hạt gel hình thành thì enzyme bị nhốt trong các mắt lưới của hạt gel Do màng lưới của hạt gel có kích thước nhỏ hơn kích thước của phân tử enzyme nhưng lớn hơn kích thước của phân tử cơ chất và sản phẩm nên cơ chất và sản phẩm có thể khuếch tán qua một cách dễ dàng Vật liệu dùng làm khuôn gel gồm: polyacrylamit, hydroxyetyl – 2 - metacrylat, polyvinyl, polyure etan, alginat, caragenan…

- Cố định enzyme bằng cách hấp thụ trên các chất mang, có hoặc không có điện tích Người ta sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt như than hoạt tính,

xenluose, tinh bột, dextran, colagen, chitin, agaroza, polyacrylamit, polystyrol, một

số loại nhựa trao đổi ion, silicagel….Các proteinaza axit ( pepsin) rất dể dàng cố định trên DEAE – xenlulose, các proteinaza kiềm ( tripsin, chymotripsin) dễ liên kết với CM – xenlulose, các nhựa trao đổi ion có nền xenlulose có khả năng hấp dẫn phụ 20- 50% proteinase

Sử dụng enzyme cố định có những ưu điểm như : có thể tái sử dụng lại nhiều lần, enzyme không lẫn vào sản phẩm nên có thể dễ dàng tách khỏi sản phẩm và có thể ngừng phản ứng bằng cách tách enzyme cố định ra khỏi hỗn hợp phản ứng Enzyme cố định bền hơn các yếu tố gây biến tính enzyme so với enzyme ở trạng thái tự do

- Tăng cường đầu tư cho công nghệ hiện đại để có thể nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen, cắt ghép AND, cho phép từ CPE ban đầu có thể tạo ra các chế phẩm enzyme mới, có hoạt tính cao và tính chất đặc hiệụ

- Các công trình nghiên cứu về protease của cá và các hướng, các lĩnh vực ứng dụng chúng đã và đang tăng lên nhanh chóng ở nhiều nước có nghề cá phát triển, tiềm năng pháp triển sản xuất CPE từ thuỷ sản và ứng dụng để chế biến ra nhiều sản phảm mới là rất to lơn Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn trương và thuận lợi, các nhà khoa học – công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển nhanh chóng công nghệ chế biến thuỷ sản của đất nước

- Các phòng nghiên cứu công nghệ chế biến cá cần hoàn thiện nhanh công nghệ

xử lý nội tang cá, thu CPE công nghiệp, vừa tăng hiệu quả kinh tế, vừa bảo đảm an toàn, vệ sinh, bảo vệ môi trường, góp phần phát triển bền vững ngành thuỷ sản

Từ những lợi thế của enzyme thuỷ sản so với enzyme từ các nguồn khác, có thế nói, mặc dù còn nhiều vấn đề về kỹ thuật, công nghệ thu nhận, phạm vi sử dụng…còn phải tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện, nhưng có thể nói: kỷ nguyên sản xuất và ứng dụng enzyme protease thuỷ sản đã tới

1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHẼM VÀ PHẾ LIỆU CÁ CHẼM TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN [04,16]

1.4.1 Giới thiệu về cá Chẽm

1.4.1.1 Đặc điểm hình thái cá Chẽm [16]

Cá Chẽm còn gọi là cá vược thân dài, dẹp bên, phần lưng hơi vồng cao, bắp đuôi ngắn Đầu dài, nửa trước nhọn, từ gáy đến mút mõm cong xuống, chiều dài lớn hơn chiều cao Chiều dài thân bằng 3,2 lần chiều cao thân và bằng 2,9 lần chiều dài đầu Mép sau xương nắp mang trước hình răng cưa, góc dưới có một gai cứng, dài Xương nắp mang chính có một gai dẹt Mắt lớn, khoảng cách hai mắt hẹp Miệng rộng hơi so le, hàm dưới nhô dài hơn hàm trên Răng nhọn, khỏe Xương khẩu cái

và xương lá mía có nhiều răng mọc thành đai Vây lưng thứ nhất có 7 gai cứng Tia vây ngực ngắn và tròn, có các dãy răng cưa cứng và ngắn phía trên gốc, vây lưng và vây hậu môn có vảy bao phủ Vây hậu môn tròn 3 gai, 7-8 tia mềm, vây đuôi tròn, không chia thuỳ, có quanh năm

Nguồn nguyên liệu này gồm có tự nhiên, nuôi ao hoặc quảng canh Vùng phân bố: Vịnh Bắc, vùng biển miền Trung và Nam Bộ

Các dạng sản phẩm: ăn tươi, chế biến fillet và các sản phẩm phối chế khác…

1.4.1.2 Thành phần hóa học của một số loài cá [04]

Cá Chẽm là loài cá dữ, ăn mồi sống và có khả năng ăn thịt đồng loại trong

suốt cuộc đời của nó Cá Chẽm ăn mồi sống chủ yếu là cá như cá đối (Mugil sp), cá

sơn, giáp xác như tôm, cua, ruốc, nhuyễn thể; thực vật mềm bám trên đá Khi cá Chẽm còn nhỏ (cỡ 1 – 10 cm), thức ăn chủ yếu của chúng là cá, tôm nhỏ (80%), phần còn lại là sinh vật phù du (20%), chủ yếu là tảo Silic Tuy nhiên, khi cá Chẽm lớn > 20 cm chỉ thấy trong dạ dày của chúng 100% xác động vật, trong đó 70% là giáp xác (tôm, cua) và 30% là cá nhỏ (Kungvankij 1981) Từ thức ăn như thế nên cá Chẽm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cũng như các thành phần khác của nó

và thành phần của động vật của cá khác và giáp xác Đặc biệt là trong nội tạng mà hiện nay chưa có công trình nào nghiên cứu

Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm có: nước, protein, lipit, gluxit, khoáng chất, vitamin, enzyme Thành phần hóa học của cá thường khác nhau theo giống loài nhưng trong cùng một loài mà ở môi trường sống khác nhau thì thành phần hóa học cũng khác nhau Thành phần hóa học của cá còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, mùa vụ, thức ăn, thời tiết Sự khác nhau về thành phần dinh dưỡng làm ảnh hưởng rất lớn đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Thành phần hóa học của cá Chẽm được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1.Thành phần hóa học của cá Chẽm (vược)

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được

Năng

lượng Nước Protein Lipid Tro Calci Phospho Sắt Natri Kali A B1 B2 PP C

111 75,5 20,5 3,2 1,2 26 202 0,4 56 329 15 0,10 0,16 2,1 0 Trong thịt cá chứa khá đầy đủ các loại vitamin, trong đó hàm lượng protein khá nhiều Ngoài ra cá cũng là thực phẩm giàu vitamin và chất khoáng như: K, P, Ca, Mg, Na…

1.4.1.3 Tình hình nuôi cá Chẽm trong nước và thế giới [16]

1.4.1.3.1 Tình hình nuôi cá Chẽm trên thế giới

Trong số những loài cá biển nuôi chính của Úc có cá Chẽm (Lates

calcarifer), chúng được nuôi trong lồng hình chữ nhật hoặc lồng hình tròn có chiều

dài hoặc đường kính lớn hơn 20m Cá Chẽm ăn thức ăn chứa 45-50% Protein thô, chất béo 13-18% với giá dao động 1,1-2,2 USD/kg; còn cá hồi Đại Tây Dương chứa 40-42% Protein thô, chất béo 28-30% có giá trong khoảng 1,30-1,45 USD/kg Nghề nuôi cá Chẽm cũng như các loài cá biển khác đều khởi đầu là việc nuôi

cá trong mùa mưa theo phương pháp quảng canh, với giống cá thu được từ tự nhiên Sau đó, nghề nuôi cá Chẽm bắt đầu phát triển với mức độ thâm canh như nuôi ghép

cá Chẽm với cá Rô Phi Đến những năm 1970, nhờ sự phát triển của kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo, hình thức nuôi dần dần chuyển sang nuôi quản canh, trong hệ

thống mương, trong lồng bè… ở nhiều quốc gia như Malaysia, Hồng Kông, Đài Loan, Na Uy, Úc… Theo thống kê của FAO (2006), tính riêng tổng sản lượng cá Chẽm nuôi của thế giới năm 2004 đạt 22.989 tấn, tăng 37,4% so với năm 1990 và tổng giá trị đạt 77.733 USD

Thái Lan là nước đầu tiên có báo cáo về những thành công trong nghiên cứu sản xuất giống đại trà từ giữa thập kỷ 1970 do Wongsomnuk và Manevonk (1973)

Kể từ đó sản xuất giống ngày càng được phát triển rộng rãi ở Úc và ở các nước Đông Nam Á Theo thống kê năm 1987, các loài cá biển sản xuất chủ yếu của Nhật

Bản gồm Pagrus major với sản lượng 58.266.000 con, Seriola quenqueradia với

sản lượng 1.192.000 con ở Thái Lan, hàng năm sản xuất được khoảng 100 triệu giống Cá Chẽm, trong đó xuất khẩu hơn 70% (Kungvankij 1986)

Năm 1990, Đài Loan sản xuất 152 triệu ấu trùng cá biển, trong đó có 130

triệu cá măng, 5 triệu cá Acanthopagus chlegeli, 2 triệu cá Ancanthpagus latus, 3 triệu cá Lateolabrax japonicas, 3 triệu cá tráp Sparus sarba, 2 triệu cá mú

Epinephelus malabaricus, 1 triệu cá Chẽm Lates calcarifer và các ấu trùng các loài

cá khác Tính đến năm 2000, Trung Quốc đã sản xuất thành công con giống nhân tạo của 54 loài thuộc 24 họ cá biển Khoảng 10.000 triệu cá bột được sản xuất tập

trung vào một số loài có giá trị kinh tế như red drum (Scianeops ocellatus), Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus), red seabream (Pagrosomus major), cá măng (Chanos chanos), Japanese flounder (Paralichthys olivaceus), black porgy (Sparus macrocephalus), Cá Chẽm(Lates calcarifer)…(FAO 2006, Hong W 2003)

Trong đó, ở các nước châu Âu, cá Chẽm Dicentrachus labrax là loài được ưa

chuộng trong nghề nuôi và sản xuất giống ở Pháp, ý, Hy Lạp, số lượng cá Chẽm giống sản xuất vào năm 1987 lần lượt là 2,6 triệu, 5 triệu, 3 triệu con Ngoài ra, nước Anh, Pháp, Tây Ban Nha và Na Uy vào năm này cũng sản xuất loài

Scophthamus maximus với sản lượng tương ứng là 230.000 con, 75.000 con,

265.000 con, 110.000 con (Kỹ thuật sản xuất giống nước lơ 2004)

1.4.1.3.2 Tình hình nuôi cá Chẽm trong nước

Việt Nam có điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển nuôi cá biển Với diện tích mặt nước lớn, nhiều loài cá biển đã được đưa vào nuôi và trở thành những loài mang lại nguồn thu nhập cao cho người dân

Hiện nay cá Chẽm được nuôi trong các ao đầm nước lợ, nuôi lồng hoặc nuôi quảng cang Năm 2001, tổng số lồng nuôi trên biển là 23.989 chiếc, nhiều hơn năm

2000 là 5.244 chiếc, trong đó số lồng nuôi cá biển là 4.077 chiếc Sản lượng nuôi lồng bè nước mặn năm 2001 đạt 2.635 tấn, cao hơn năm 2000 là 853 tấn, trong đó sản lượng cá biển là 1.898 tấn Năng suất cá nuôi từ 8-10 kg/m3 (Bộ Thủy sản 2002) Năm 2004, diện tích nuôi cá biển trong ao là 1.750 ha và số lồng nuôi cá Chẽm trên 8.850 chiếc đạt sản lượng 7.675 tấn Ngoài ra tại các đầm nước lợ ven biển cá đã được thả nuôi ghép với các đối tượng khác Sản lượng cá nuôi nước lợ mặn đạt 13.865 tấn Kết quả này còn hạn chế, một trong những nguyên nhân chủ yếu là do chưa chủ động được nguồn cá giống

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất giống cá biển từ những năm 1993 –

1994 Đến năm 2005, chúng ta cơ bản chủ động sản xuất giống một số loài cá biển trong đó có Cá Chẽm Trong năm 2003 – 2004, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II và trường Đại học Nha Trang đã sản xuất 400.000 con giống cá Chẽm

1.4.2 Giới thiệu về phế liệu của ngành chế biến thuỷ sản Việt Nam

Trong những năm gần đây, ngành chế biến thủy sản phát triển rất mạnh Sản lượng xuất khẩu tăng lên rất rõ rệt, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế, tạo công

ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo cho nhân dân Ngành thủy sản thực sự là ngành kinh tế mũi nhọn trong cả nước, nhưng bên cạnh sự phát triển đó thì hiện nay, ước tính chung có khoảng 30 – 40 % phế liệu so với tổng sản lượng chế biến, trong đó nội tạng chiếm trên 12% so với trọng lượng toàn thân Phế liệu thuỷ sản xuất hiện liên quan đến vấn đề xử lý chất thải, ô nhiễm môi trường, sản xuất sạch hơn Mặc

dù đã có xu hướng tận dụng để chế biến sản phẩm giá trị gia tăng như: Dầu cá, bột

cá, enzyme Tuy nhiên trong còn rất nhiều hoạt chất sinh học trong phế liệu mà ta chưa khai thác hết

Năm 2008 Cà Mau, tổng sản lượng nuôi và khai thác biển là 3.481,8 ngàn tấn Trong đó riêng cá biển khoảng 2.657,6 ngàn tấn, cá Chẽm chiếm khoảng 3.000 tấn, như vậy phế liệu cá Chẽm khoảng trên 1.700 tấn, trong đó nội tạng chiếm khoảng 148 tấn Theo dự báo năm 2009 lượng cá Chẽm tại Cà Mau còn tăng lên rất nhiều Nên việc nghiên cứu protease phế liệu cá Chẽm là điều thiết yếu

1.5 GIỚI THIỆU VỀ BỘT CÁ VÀ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PROTEASE

ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CÁ THỦY PHÂN TỪ CÁ NỤC [06, 29, 31]

Cá biển là nguyên liệu giàu protein nên thích hợp cho việc sản xuất bột đạm Ngoài ra, trong cá biển còn có nhiều phospho, iôt…là những chất chỉ có nguồn gốc

từ biển Do vậy các sản phẩm chế biến từ cá biển nhất là bột đạm được coi là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, khoáng chất và vitamin Bột đạm, cá thường có hàm lượng protein khoảng 70%, lipit khoảng 0,55%, độ ẩm < 10% và có

tỷ lệ nitơ dễ hấp thụ cao

Cá càng nhiều mỡ (cá béo) thì bột đạm thành phẩm càng khó bảo quản do lipit cá dễ bị oxy hóa Vì thế việc lựa chọn loài cá thích hợp rất quan trọng trong việc sản xuất bột đạm Thường người ta chọn những loài cá có giá trị kinh tế thấp, cấu trúc cơ thịt không săn chắc như các loài cá tạp, nhưng có hàm lượng protein cao làm nguyên liệu để sản xuất bột đạm thủy phân Vì vậy bột đạm sản xuất từ các loài

cá này có giá thành rẽ hơn so với các loại nguyên liệu khác

Nước ta thuộc vùng biển nhiệt đới nên nguồn nguyên liệu cá biển rất phong phú và

đa dạng Tuy vậy trong quá trình khai thác đánh bắt thủy sản, lượng cá tạp kém giá trị

kinh tế thường chiếm tỷ trọng lớn Vì vậy trong chương trình“ Chế biến các sản phẩm có

giá trị gia tăng” của Bộ Thủy sản có phần nghiên cứu sử dụng hợp lý các nguồn cá tạp

Một trong các hướng chế biến đó là sản xuất bột đạm thuỷ phân

Thực chất quá trình sản xuất bột đạm bằng phương pháp sử dụng protease là quá trình thủy phân protein để tạo ra các peptit và các axit amin dưới tác động của

hệ protease nội tại và protease bổ sung từ bên ngoài như sau:

Protein polypeptit peptit axit amin protease protease protease

Khâu thủy phân là khâu quan trọng quyết định trong sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá Tùy theo yêu cầu sản phẩm mà ta điều chỉnh các điều kiện của quá trình thủy phân để thu được peptit hay axit amin Nếu quá trình thủy phân không tốt thì vi sinh vật hoạt động sẽ tạo như: sản phẩm thứ cấp, đạm thối tăng nhiều Trong quá trình thủy phân thịt cá bằng protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân như: tỷ lệ enzyme và thịt cá, nhiệt độ,

pH, tỷ lệ nước bổ sung, thời gian…Nên yêu cầu đặt ra là phải tìm ra chế độ thủy phân thích hợp để sản xuất bột đạm thủy phân đạt yêu cầu

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme protease

Đối tượng dùng để nghiên cứu tách chiết protease là nội tạng cá Chẽm (Hình 2.1)

Tên khoa học: Lates calcarifer

Tên tiếng Anh: Seabass

Nguồn thu enzyme la nội tạng cá Chẽm được thu gom tại nhà máy Chế Biến Xuất Nhập Khẩu Và Dịch Vụ Thủy Sản Cà Mau ngay sau khi fillet và được bảo quản lạnh, thời gian bảo quản lạnh không quá 5 giờ Nội tạng thu được loại bỏ sạch

mỡ, gan, bong bóng, trứng, còn lại dạ dày, ruột, tụy tạng đưa đi bảo quản ngay Nếu thời gian dài hơn, nội tạng cá Chẽm được cấp đông và bảo quản lạnh Nội tạng thu được phải từ cá Chẽm còn tươi tốt, cá Chẽm nuôi quảng canh hoặc tự nhiên

Hình 2.1.Cá Chẽm (Lates calcarifer)

2.1.2 Nguyên liệu cá sử dụng để thủy phân thu bột cá

Cá Nục nguyên liệu: Cá Nục thuôn (Hình 2.2)

Tên khoa học: Decapterus macrosoma

Tên tiếng Anh: Layang scad

Cá thuôn có sản lượng khá cao

Vùng phân bố: vịnh Bắc Bộ, vùng biển Trung Bộ và Tây Nam Bộ

Mùa vụ khai thác : Quanh năm

Cá Nục dùng làm thí nghiệm được mua tại tàu đánh bắt của các ngư dân huyện Trần Văn Thời tỉnh Cà Mau Cá Nục phải tươi đảm bảo yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn TCVN 3250-88

Hình 2.2 Cá Nục thuôn (Decapterus macrosoma)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.3 Sơ đồ tách chiết protease từ nội tạng cá Chẽm

Từ sơ đồ tổng thể trên ta bố trí thí nghiệm để xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết enzyme như sau:

NC K/N Thủy phân sản xuất bột cá Nục

Dung môi chiết

Tỷ lệ dm/nội tạng

Bảo quản

ủ

Ly tâm lạnh Chiết rút

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu về enzyme nội tạng cá Chẽm

2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình ủ

Do các enzyme khi còn nằm trong tế bào thường ở dạng chưa hoạt động (zimogen) nên cần phải hoạt hóa enzyme Năng lượng hoạt hóa cần cho cho quá trình hoạt hóa enzyme là nhiệt lượng cung cấp từ môi trường bằng cách ủ Mỗi enzyme cần

có một chế độ ủ thích hợp cho quá trình hoạt hóa

Để xác định nhiệt độ ủ và thời gian ủ thích hợp cho hoạt hóa enzyme, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:

Chọn nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp

Ủ ở topt với các thời gian (phút)

Chiết rút bằng dung môi

Ly tâm lạnh

Xác định hoạt tính protease

Nghiền nhuyễn Nội tạng cá Chẽm

2.2.2.2 Nghiên cứu chọn dung môi chiết

Xác định dung môi chiết thích hợp

Tiến hành chiết rút enzyme bằng các dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphat 0,03M (pH=7), tỷ lệ 1/1, sau đó ly tâm lạnh, thu dịch chiết Xác định hoạt tính protease từng dịch chiết, so sanh, chọn dung môi thích hợp Bố trí thí nghiệm như sau:

Chiết bằng các dung môi

Nước cất Nước muối sinh lý Đệm phosphate (pH 7)

Xác định hoạt tính protease của DC

Chọn chọn dung môi thích hợp

Nghiền nhuyễn và ử với nhiệt độ,

thơì gian thích hợp Nội tạng cá Chẽm