Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố epsilon của vi khuẩn clostridium perfringenstype d trên động vật thí nghiệm

perfringens type D tiết ra, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringens type D trên động vật thí nghi

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Lê Lập - Trưởng

Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Bác sĩ Lê Đình Hải và KS Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu

Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn: ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong

Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Nha Trang, tháng 6, năm 2011 Sinh viên

Ngọ Thị Ngọc Tú

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC BẢNG vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3

1.1.1 Nước ngoài 3

1.1.2 Trong nước 5

1.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C perfringens 5

1.2.1 Phân loại 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu 6

1.2.3 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 7

1.2.4 Đặc tính di truyền 9

1.2.5 Sức đề kháng của C perfringens 9

1.2.6 Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gây bệnh 10

1.2.6.1 Type A 11

1.2.6.2 Type B 12

1.2.6.3 Type C 12

1.2.6.4 Type D 13

1.2.6.5 Type E 14

1.3 MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C perfringens [18] 14

1.3.1 Alpha toxin (CPA) 14

1.3.2 Beta toxin (CPB) 15

1.3.3 Epsilon toxin (ETX) 15

1.3.4 Iota toxin (CPI) 16

1.3.5 Enterotoxin (CPE) 16

1.3.6 Delta toxin 16

1.3.7 Theta toxin 17

1.4 HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C perfringens 17

1.4.1 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX 17

1.4.2 Gen mã hóa ETX 17

1.4.3 Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định 18

1.4.4 Cơ chế gây bệnh của độc tố epsilon (ETX) 19

1.5 MỘT SỐ LOẠI BỆNH DO VI KHUẨN C perfringens GÂY RA TRÊN DÊ, CỪU 20

1.5.1 Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết trên dê, cừu 20

1.5.2 Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu do C perfringens gây ra 21

1.6 ENZYME TRYPSIN 22

1.7 PHƯƠNG PHÁP PCR 23

1.7.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR 23

1.7.2 Thực nghiệm 24

1.7.3 Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng PCR 25

1.7.4 Phương pháp phân tích kết quả PCR 27

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 29

2.3 VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 29

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.4.1 Giám định một số đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn C perfringens theo phương pháp của Quinn P.J và cộng sự (1994) [34] 29

2.4.2 Xác định gen mã hóa độc tố epsilon bằng phản ứng PCR 31

2.4.3 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon trên động

vật thí nghiệm 34

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI KHUẨN C Perfringens 36

3.1.1 Kết quả kiểm tra hình thái của vi khuẩn C perfringens 36

3.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi 36

3.1.3 Đặc tính nuôi cấy 37

3.1.4 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfringens 38

3.2 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ETX BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 41

3.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA EPSILON TOXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM 42

3.3.1 Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 42

3.3.2 Kết quả kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon toxin trên dê 44

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

4.1 KẾT LUẬN 46

4.2 ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SPS Agar Perfringens Selective Agar

Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin Etx Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin

Ia Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin

NĐRH Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết

MDCK Tế bào thận chó Madin Darby

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C perfringens 6

Hình 1.2 Hiện tượng dung huyết beta 8

Hình 1.3 Cấu trúc của plasmid mang gene Etx 18

Hình 1.4 Thiết kế primer phân biệt etx gene C perfringens type D và B 18

Hình 1.5 Phản ứng PCR 25

Hình 2.1 Tiêm độc tố vào tĩnh mạch chuột 34

Hình 2.2 Theo dõi chuột chết 34

Hình 2.3 Tiêm độc tố vào tĩnh mạch cổ trên dê 35

Hình 2.4 Mổ khám kiểm tra bệnh tích 35

Hình 3.1 Hình thái của vi khuẩn C perfringens soi trên kính hiển vi 36

Hình 3.2 Hình thái vi khuẩn C perfringens khi soi tươi 37

Hình 3.3 Vi khuẩn C perfringens trên môi trường Fluid thioglycolate 37

Hình 3.4 Khuẩn lạc trên môi trường SPS 38

Hình 3.5 khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 38

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra lên men đường 39

Hình 3.7 Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk 39

Hình 3.8 Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường Egg yolk 40

Hình 3.9 Kết quả CAMP – test 40

Hình 3.10 Kết quả giám định gene mã hóa độc tố ETX bằng phản ứng PCR 42

Hình 3.11 Phổi, gan bị sưng, tụ huyết 45

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C perfringens 9

Bảng 1.2 Đặc tính phát triển của C perfringens 10

Bảng 1.3 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens 10

Bảng 1.4 Các bệnh gây ra bởi các type vi khuẩn C perfringens 11

Bảng 1.5 Các enzyme thường sử dụng trong phản ứng PCR 26

Bảng 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 2.2 Thành phần tham gia phản ứng PCR 33

Bảng 2.3 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR 33

Bảng 3.1 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfringens 41

Bảng 3.2 Kết quả biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 43

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên dê 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Clostridium perfringenes là một vi khuẩn yếm khí, gram dương, có khả

năng sinh bào tử thường được tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và đường tiêu hóa của nhiều loài động vật) Nó được coi là một trong những vi khuẩn chủ yếu gây ra nhiều bệnh cho người và nhiều loài gia súc, gia cầm khác nhau

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C perfringens sản sinh hơn 17 loại độc

tố khác nhau như: Độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2, Enterotoxin, Theta, vv…Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta,

epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C perfringens thành 5 type độc tố

(toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E) Các type khác nhau thường gây ra các thể

bệnh khác nhau cho người và động vật Trong số các loại độc tố do C perfringenes sản sinh, độc tố epsilon toxin (ETX) được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type B

và type D có độc lực mạnh nhất Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy C perfringens type D đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm ruột hoại tử dê, cừu ở

Việt Nam [3,4] Độc tính của độc tố epsilon, chỉ xếp sau độc tố botulinum và tetanus, được trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ liệt vào nhóm chất khủng bố sinh học

Độc tố epsilon được mã hóa bởi gene Etx, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn C perfringens, tiết ra trong đường ruột dưới dạng tiền độc tố (prototoxin),

trọng lượng phân tử khoảng 34,25 kDa, sau đó được hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho ETX hoạt động Độc tố epsilon tác dụng lên nhóm lipid: Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận của con bệnh Độc tố epsilon được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong Tại đây độc tố làm tăng áp lực thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số

cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan và thận [18] Khi tác động vào con vật, độc

tố sẽ gây tổn thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật

sẽ bị mù, la hét, mất phương hướng và không có khả năng ăn uống…Thận cũng sẽ

bị phân giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác như: tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt có mùi thối khắm, co giật toàn thân, nghiến răng…và cuối cùng là dẫn đến chết nếu không được chữa trị kịp thời

Để tìm hiểu về độc tính và tác động gây bệnh của độc tố epsilon do C

perfringens type D tiết ra, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khả năng biểu

hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringens type

D trên động vật thí nghiệm ”

Nội dung của đề tài:

1 Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của 10 chủng C perfringens type D phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử

2 Giám định gene Etx mã hóa độc tố epsilon bằng kỹ thuật PCR

3 Nghiên cứu khả năng biểu hiện gene Etx mã hóa độc tố epsilon trên động vật thí nghiệm

Mục tiêu của đề tài:

Góp phần cung cấp những thông tin về độc tố epsilon của chủng C perfringens đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột hoại tử ở dê trong những năm gần

đây Giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả, để giảm thiểu tối đa những thiệt hại do độc tố epsilon vi khuẩn C perfringens gây ra

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1.1 Nước ngoài

Vào năm 1892 tại phòng thí nghiệm trường đại học Johns Hopkins ở

Baltimore, lần đầu tiên vi khuẩn C perfringens được phát hiện và đặt tên là Bacillus aerogenes capsulatus bởi William Welch và George Nuttall, sau đó được đổi thành Bacillus welchii, và đến nay được gọi là C perfringens [18]

C perfringens là trực khuẩn yếm khí, gram dương, có khả năng sinh bào

tử, thường tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và ống tiêu hóa của nhiều loài động vật) Nó được coi là một trong những vi khuẩn độc nhất được biết đến,

nó là tác nhân gây ra nhiều thể bệnh khác nhau không chỉ nguy hiểm cho nhiều loài gia súc, gia cầm mà còn nguy hiểm đến con người Hiện nay đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu về vi khuẩn C perfringens ở nhiều lĩnh vực khác nhau

Theo Field và cộng sự (1955) thuộc trường Đại học Cambridge, từ những

năm 50 vi khuẩn C perfringens (lúc đó có tên gọi Clostridium wellchii) đã gây

bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết – enterotoxaemia (NĐRH) đối với động vật nuôi như bê sơ sinh (Griner & Bracken, 1953), cừu non (Griner & Jonhson, 1954) và có thể gây chết heo con (Field & Gibson, 1955) Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết phát triển làm xuất hiện trong ruột những đốm nhỏ viêm xuất huyết [16]

Niilo L và Chalmers G A (1982) đã phát hiện bệnh NĐRH ở ngựa con 4 ngày tuổi tại Alberta, Canada Bệnh này làm ngựa con chết, mổ khám phát hiện ruột có nhiều điểm nhỏ xuất huyết và viêm hoại tử Cũng tại miền Nam Alberta

vào năm 1973, lần đầu tiên phát hiện C perfringens type D trên bê [29, 30]

Niilo L (1986) cho biết đã phân lập được C perfringens type C, type D từ

tá tràng của cừu trưởng thành 8-9 tháng tuổi, cừu thường chết vì bị xuất huyết ruột với những điểm hoại tử [31]

Năm 1998, Miserez và cộng sự tiến hành định type vi khuẩn C perfringens

trên dê, cừu với 52 mẫu bệnh phẩm biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm ruột hoại tử và 13 mẫu dê, cừu khỏe mạnh Kết quả cho thấy tất cả 52 mẫu bệnh phẩm

trên dê, cừu bị bệnh đều phát hiện được gene mã hóa độc tố alpha và epsilon, còn trên dê, cừu khỏe mạnh thì 11/13 thuộc chủng type A và 2/13 thuộc chủng type

D Từ kết quả này cho thấy vi khuẩn C perfringens type D có ở dê, cừu khỏe

mạnh và bị bệnh, chúng là nguyên nhân chính gây bệnh hoại tử trên dê, cừu [26]

Manteca C và cộng sự (2001) đã phân lập được C perfringens type A từ

dạ múi khế bị xuất huyết của bê con 2 ngày tuổi và 1 tháng tuổi ở Bỉ, bê không biểu hiện bệnh và chết đột ngột [24]

Năm 2003, Sipos và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex định type độc tố

vi khuẩn C perfringens trên các loài gia súc khác nhau Thu được kết quả trên

cừu: 8/10 chủng thuộc type A, và 2/10 chủng thuộc type D (hầu hết là ở cừu non) Còn trên dê: 18/26 chủng thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A, 2/26 mẫu thuộc type E Kết quả này cho biết hầu hết type D đều gây bệnh trên dê, và cừu non [36]

Theo Malone F (2004) ở Bắc Ireland, cừu ở các lứa tuổi, đặc biệt từ 1-3 tháng tuổi thường bị bệnh viêm ruột nhiễm độc máu, còn gọi là bệnh mềm thận

(pulpy kidney) do C perfringens type D Sau khi mổ khám phát hiện ruột bị

xung huyết và thận bị mềm [22]

Năm 2004, Wen và cộng sự đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện các gene mã hóa độc tố cho alpha - toxin, epsilon – toxin, iota

– toxin Tác giả đã phân lập được 52 chủng C perfringens từ 104 mẫu cừu mắc

bệnh viêm ruột hoại tử và 61 chủng từ 194 mẫu cừu khỏe mạnh Kết quả thu được trong 52 chủng phân lập từ cừu mắc bệnh có 33 chủng (64%) thuộc type A,

và 11 chủng (21%) thuộc type D, 8 chủng (15%) thuộc type C Trong 61 mẫu cừu khỏe mạnh có 58 chủng (95%) thuộc type A, 3 chủng thuộc type D (5%) Kết quả cho biết độc tố epsilon đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử ở cừu [40]

Miyashiro và cộng sự (2007) đã tiến hành mổ khám và nghiên cứu dê 18 tháng tuổi đã chết và có biểu hiện xuất huyết ở thận phù gan và ruột Tác giả đã

phân lập được các chủng vi khuẩn C perfringens type D từ thận, type A từ ruột

Xét ở mức vi thể thấy xuất hiện một vùng rộng động mạch thận bị tổn thương nghiêm trọng (bệnh mềm thận) Gan xuất hiện xuất huyết và tổn thương các tiểu

thùy gan Tổn thương nhung mao thành ruột, phù phổi, xuất huyết tiểu não và đại não [27]

1.1.2 Trong nước

Lê Văn Tạo và cộng sự (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn yếm

khí C perfringens từ trâu, bò chết đột ngột tại các tỉnh phía Bắc, vi khuẩn có độc

lực cao trên động vật thí nghiệm [11]

Nguyễn Văn Sửu và cộng sự (2003) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một gam phân bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình

thường Tác giả khẳng định vi khuẩn C perfringens có vai trò quan trọng trong

hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng [10]

Lê Lập và cộng sự (2007) nghiên cứu sự lưu hành các type độc tố của các vi

khuẩn C.perfringens phân lập từ bò, bê, dê và cừu mắc bệnh tiêu chảy nuôi tại

một số tỉnh duyên hải miền Trung bằng kỹ thuật Multiplex PCR Kết quả cho

thấy những chủng vi khuẩn C perfringens phân lập từ phủ tạng của dê, cừu tiêu chảy đều thuộc type D mang gen Etx mã hóa độc tố epsilon và gen Cpa mã hóa

độc tố alpha [4]

Để xác định vai trò của vi khuẩn yếm khí C perfringens gây hội chứng tiêu

chảy, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) đã tiến hành phân lập và giám định các đặc tính sinh học của vi khuẩn trong phân bò, lợn mắc hội chứng tiêu chảy nuôi tại Hà Nội và vùng lân cận Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, có độc tố gây chết chuột Kết quả

định type bằng kỹ thuật Multiplex PCR cho thấy: Các chủng C perfringens phân

lập từ bò thuộc type A (48,1%) và type D (51,9%), các chủng phân lập từ lợn thuộc type A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta2 (18,9%) [5]

1.2 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C perfringens

1.2.1 Phân loại

Feser (1865) lần đầu tiên phát hiện C perfringens, sau đó các tác giả khác

lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra Loài

C.perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892)

và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii

Hiện nay C perfringens được phân loại như sau [44]:

Giới (regnum) : Bacteria

Ngành (phylum) : Firmicutes

Lớp (class) : Clostridia

Bộ (ordor) : Clostridiales

Họ (familia) : Clostridiaceae

Chi (genus) : Clostridium

Loài (species) : C Perfringens

1.2.2 Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu

Vi khuẩn C perfringens là trực khuẩn ngắn, yếm khí, bắt màu gram

dương Vi khuẩn có thể đứng riêng rẽ, kết thành chuỗi hoặc đứng song song Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4 × 1,3 – 19 µm )

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C.perfringens

Vi khuẩn không có khả năng di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan hơi lệch

tâm Khuẩn lạc của C perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha) Người ta thường gọi hiện tượng này là dung huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật [9, 18]

1.2.3 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa

C perfringens là vi khuẩn dinh dưỡng hữu cơ, yếm khí không tuyệt đối

nên có thể sống sót trong môi trường có oxygen Vi khuẩn có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 120C - 500C, phát triển nhanh ở 43 - 47°C ở nhiệt độ tối thích

450C, sau 8 giờ vi khuẩn mọc, thời gian mỗi thế hệ vào khoảng 8- 10 phút và

trong quá trình phát triển có sinh khí C perfringens có thể sống sót trong những

điều kiện khắc nghiệt nhờ sự biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và sản sinh nha bào Nha bào thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như nóng, khô, acid, chất tẩy rửa [1, 18]

Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan và hơi lệch tâm nhưng không tìm thấy nha bào trong những môi trường thông thường Việc hình thành nha bào đòi hỏi sự có mặt của đường và protein và trong những điều kiện đặc biệt [9]

C perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí

không đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn yếm khí khác [18, 34]:

- Điều kiện nuôi cấy: Phát triển tốt ở môi trường yếm khí thông thường 10% CO2

2 Môi trường: Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường có bổ sung đường hoặc máu động vật, có khả năng phát triển trên môi trường lỏng như thioglycolate

- Trên môi trường Fluid thioglycolate: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường

- Trên môi trường thạch máu (5-10% máu cừu hoặc máu thỏ): Sau 24 – 28

giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của C perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao

bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha) Hiện tượng này là dung huyết beta (hình 1.2) trên môi trường nuôi cấy thạch máu

Hình 1.2 Hiện tượng dung huyết beta

- Trên môi trường SPS (Perfringens Slection Agar) hoặc TSC agar (Tryptose -Sulfit-Cycloserin Agar): Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen

- Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm đục môi trường và môi trường chuyển sang màu vàng rơm

- Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose Không lên men Mannitol, không sinh Indol

- Trên môi trường Egg yolk (lòng đỏ trứng gà): Vi khuẩn C perfringens

phát triển sản sinh men Lecithinase, phân giải Lecithine tạo thành vòng trắng sữa

xung quanh khuẩn lạc

- Trên môi trường Litmus milk: Vi khuẩn lên men đường Lactose, làm đông vón Casein Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị

pH Litmus, khi cục axit vỡ sẽ tạo thành khí gas

- Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C perfringens và Streptococus agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc của Streptococus agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng

khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố

alpha của C perfringens

- Phản ứng O- F test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C perfringens trên môi

trường O- F, vi khuẩn phát triển, lên men đường trong môi trường tạo ra các sản phẩm trung gian có tính axit Làm môi trường chuyển từ tím sang vàng với chỉ thị Bromocresol purple

1.2.4 Đặc tính di truyền

C perfringens là loài điển hình để nghiên cứu genome vì chúng có khả năng phát triển nhanh chóng và việc thao tác trên bộ gene của C perfringens

cũng dễ dàng hơn các chủng khác

Năm 2002, cấu trúc bộ gene của C perfringens đã được công bố Bộ nhiễm

sắc thể bao gồm 3.031.430 cặp bp; có 2.660 vùng mã hóa cho các protein; 10 loại RNA vận chuyển và hàm lượng C+G vào khoảng 28,6%

Khi so sánh hệ gene của C perfringens với hệ gene của những loài vi khuẩn không có khả năng gây bệnh như C acetabutylicum thì ta thấy rằng sự

khác biệt chính giữa hai bộ gene của hai loài này chủ yếu là do những gene có

khả năng sinh độc tố của C perfringens

Việc xác định trình tự bộ gene của vi khuẩn C perfringens cho thấy các

gene gây độc không có tác động cộng gộp với nhau mà có sự tác động riêng rẽ Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng độc tố alpha là loại độc tố được tất cả các

type vi khuẩn C perfringens sản sinh ra Gene mã hóa các loại độc tố ở vi khuẩn

này không chỉ nằm trên nhiễm sắc thể mà còn có trên plasmid [18]

[

Bảng 1.1 Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C perfringens

C perfringens có khả năng sinh nha bào, tùy theo từng chủng, nha bào có

thể chịu được nhiệt hoặc không (1-30 phút ở 100°C) Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độ, tuy nhiên một số chủng gây bệnh lại chịu được ở nhiệt độ cao Đặc biệt một vài loài còn có khả năng sống sót rất lâu trong môi trường đông lạnh Các kết quả nghiên cứu ở thịt gà đông lạnh chỉ có khoảng 4% tế bào sống sót khi thịt trữ ở - 17,7°C sau 180 ngày, trong khi tỉ lệ này ở bào tử khô là 40%,

sau 90 ngày và 11% sau 180 ngày Về pH, nhiều chủng thích hợp trong khoảng

pH (5,5 – 8,5) nhưng thường không dưới 5,5 và không trên 8,5 Nồng độ NaCl, gần như bị ức chế ở nồng độ NaCl 5%, một số chủng ức chế ở NaCl 2,5% [1]

Bảng 1.2 Đặc tính phát triển của C perfringens

Giới hạn dưới Tối thích Giới hạn trên Tác giả

Nhiệt độ (C)

10 -12 43 - 47 50 - 55

Labbé,2000;Li và McClane,2006

1.2.6 Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gây bệnh

C perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau Dựa vào 4 loại độc

tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) do vi khuẩn sản sinh người ta chia ra thành 5 type khác nhau (A, B, C, D và E) [18]

Bảng 1.3.Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens

Ngoài 4 loại độc tố chính trên, vi khuẩn C perfringens còn sản sinh một

số loại độc tố khác như: Gama, delta, eta, theta, kappa, mu, lambda, nu, enterotoxin… Các type khác nhau thường gây ra các thể bệnh khác nhau cho động vật khác nhau

Bảng 1.4.Các bệnh gây ra bởi các type vi khuẩn C perfringens

Type Độc

- Hoại thư sinh hơi (hoại tử)

- Viêm ruột hoại tử

- Viêm ruột nhiễm độc máu

- Ngựa con, cừu và dê

C α,β - Viêm ruột hoại tử

- Viêm ruột nhiễm độc máu

- Người

- Cừu, bê con, cừu con, heo con

D α, ε - Viêm ruột nhiễm độc máu

- Viêm ruột hoại tử

- Cừu con, cừu (mềm thận), dê và trâu bò

Các chủng C perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột,

môi trường sống của những động vật máu nóng và trong đất Độc tố type A gây nên sự viêm nhiễm ở các vết thương, gây hoại thư sinh hơi và còn là yếu tố chính gây nên các bệnh về đường ruột ở động vật Bệnh hoại thư sinh hơi và xuất huyết

ở dạ múi khế của bê con nuôi thịt, triệu chứng thường gặp như: Sưng phù và tiêu chảy, đôi khi chết đột ngột mà không có triệu chứng báo trước Khi mổ khám phát hiện dạ múi khế bị giãn nở, xuất huyết và loét, bị khí thủng trên thành và nếp gấp Dê thịt trên 4 tháng tuổi ít bị nhiễm bệnh này Các chủng type A cũng thường được phân lập từ vùng tai giữa, dạ múi khế ở bê mắc bệnh

C perfringens type A cũng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Triệu chứng

đầu tiên khi gà bị mắc bệnh là giảm cân, sau đó là suy nhược, biếng ăn, tiêu chảy Những triệu chứng trên thường diễn ra trong một thời gian rất ngắn, khó quan sát được hiện tượng và khi phát hiện thì gà đã chết Vi khuẩn type A thường tồn tại

trong đường tiêu hóa của gà, đất, bụi và những phần thức ăn bị ôi thiu Chế độ ăn

uống không hợp lý cũng có thể làm gia tăng số lượng vi khuẩn C perfringens

trong ruột gà lên dẫn tới bệnh hoại tử đường ruột ở gà Số lượng gà chết do vi

khuẩn C perfringens sẽ là rất ít nếu chúng được tiêm chủng với 2 loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoặc Enterococcus faecalis Việc phát triển một trong

hai loại vi khuẩn này trong đường ruột gà sẽ ngăn chặn khả năng sản sinh độc tố

alpha của vi khuẩn C perfringens

Bệnh đường ruột do type A gây nên cũng được phát hiện ở lợn sữa, với những triệu chứng thường thấy như rụng lông hay hoại tử đường ruột dạng nhẹ Hiện tượng trên thường phát triển ở những vùng ruột nhỏ của lợn như ruột chay

và ruột hồi Khi nuôi cấy vi khuẩn từ những vùng tổn thương này thì số lượng vi

khuẩn C perfringens thấy được là rất lớn [18, 25]

1.2.6.2 Type B

C perfringens type B là tác nhân chính gây nên bệnh lị ở cừu non và cả cừu

trưởng thành Cừu non có thể mắc bệnh lị ngay từ những ngày đầu tiên khi mới sinh ra Nguyên nhân là do sự lây nhiễm vi khuẩn này từ cừu mẹ và môi trường sang cừu con Lúc này, vi khuẩn trong đường ruột sẽ tăng lên một cách nhanh chóng, đặc biệt là khi cừu con bú sữa mẹ Kết quả là ruột cừu sẽ bị loét và xuất huyết, rồi chết một cách nhanh chóng Triệu chứng cấp tính có thể nhận thấy là cừu không ăn uống, đau bụng, cộng với hiện tượng tiêu chảy ra máu, nằm nghiêng, hôn mê và chết chỉ trong vòng 24 giờ Tỷ lệ mắc bệnh này ở cừu khoảng 30%, trong một vài trường hợp tỷ lệ này có thể lên đến 100% Bệnh mãn tính ở những cừu trưởng thành cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng

sẽ không bị tiêu chảy Ngoài ra, type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất huyết đường ruột ở dê, bê, lừa và ngựa

Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây độc của vi khuẩn type B này đối với động vật Khả năng gây độc của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại độc tố khác thì vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi [18, 25]

1.2.6.3 Type C

Vi khuẩn C perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà, chó

và cả người Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất

Vi khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật

chủ Sự thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một

yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm của vi khuẩn C perfringens type C vào cơ thể

vật chủ Tỷ lệ lây nhiễm thường khác nhau ở những bầy đàn, chuồng trại khác nhau, thông thường khoảng 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn kịp thời trong vòng 24 tiếng thì tỷ lệ đó có thể lên đến từ 50 – 100% [18]

Lợn con là loài dễ bị lây nhiễm hơn cả, bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ

từ 1 đến 2 ngày tuổi Triệu chứng đi kèm là suy nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ, xuất hiện máu và những tế bào ruột bị hoại tử ở trong phân Đối với lợn được 1 đến 2 tuần tuổi, khi mắc bệnh thời gian điều trị sẽ phải kéo dài, vì lúc này các triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn nhiều, như mất nước, tiêu chảy cấp, niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại tử

Hoại tử không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả màng cơ nhẵn trong một số lớp màng nhầy khác Triệu chứng bệnh cũng được thấy tương tự ở dê, bò và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất phương hướng…

1.2.6.4 Type D

Độc tố type này được biết đến là một trong những nguyên nhân chính gây nên các bệnh đường ruột, hay đột tử ở cừu và một số động vật khác Ngoài độc tố alpha, vi khuẩn type D còn có khả năng sản sinh một loại độc tố khác, độc tố epsilon, một loại độc tố rất độc Đích của độc tố này là nhóm lipid, vì vậy độc tố này thường tập trung ở não và thận Khi tác động vào con vật độc tố sẽ gây tổn thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật sẽ bị mù,

la hét, mất phương hướng và không còn khả năng ăn uống Thận cũng sẽ bị phân giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác và cuối

cùng là dẫn đến chết nếu không được điều trị kịp thời

Cừu khoảng từ 3 đến 10 tuần tuổi hay những con cừu cái đang cho con bú sẽ rất dễ bị mắc bệnh do độc tố type D gây ra Cừu non sau khi cai sữa sẽ không sử dụng sữa mẹ như là thức ăn chính nữa mà thay vào đó là những loại cây cỏ hay thức

ăn có hàm lượng tinh bột cao Chính sự thay đổi thành phần, hàm lượng các chất có trong thức ăn làm rối loạn hoạt động của đường ruột trong một thời gian ngắn Vì vậy, đây là lúc mà con vật dễ bị tiêm nhiễm độc tố type D nhất [25]

Độc tố này cũng gây nên các bệnh tương tự ở dê, bê, bò, ngựa Tuy nhiên, riêng đối với dê, còn xuất hiện một số triệu chứng khác như viêm chảy, tơ huyết, xuất huyết đường ruột, nhưng lại không bị mềm thận như ở cừu…[25]

tố Iota ở C perfringens cũng tương tự như độc tố ở vi khuẩn C spiroforme, một

loại vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều [25] Ngoài khả năng gây nhiễm độc

tố đường ruột ở bò bê, chuột lang và thỏ, thì độc tố này còn có thể gây nên bệnh

lỵ ở cừu

1.3 MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C perfringens [18]

1.3.1 Alpha toxin (CPA)

Tất cả các type của vi khuẩn C perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố này Gene mã hóa cho độc tố alpha là cpa, độc tố Cpa nằm trên nhiễm sắc thể của

vi khuẩn Trọng lượng phân tử của gen khoảng 43 kDa, gồm 1197 nucleotid mã hóa cho 399 axit amin Hàm lượng G + C thấp, chỉ khoảng 34% tổng Nu trong

bộ gen cpa, điểm đẳng điện pI 5,4

CPA là một phospholipase C, có khả năng thủy phân phosphotidylcholine

và sphingomyeline Phản ứng chỉ xảy ra khi có mặt enzyme phosphotidase, enzym này chỉ hoạt động được khi có ion Ca2+ trong tế bào [18] Phản ứng đặc trưng để nhận biết sự có mặt của độc tố CPA là phản ứng phân giải lecithin trên môi trường Egg yolk, tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc Khả năng tạo vòng dung huyết trên môi trường thạch máu Để chứng minh cho khả năng tạo ra 2 phản ứng trên của CPA, Titball và cộng sự (1989) đã tiến hành chèn

đoạn gene mã hóa độc tố CPA vào plasmid của vi khuẩn E coli và nhận thấy rằng vi khuẩn E coli mang plasmid tái tổ hợp này có khả năng tạo ra phản ứng

phân giải lecithin trên môi trường Egg yolk và tạo vòng dung huyết trên môi

trường thạch máu

Khi xâm nhập vào cơ thể, CPA sẽ làm tăng tính thấm thành mạch, tăng tính bám của tiểu cầu, gây xung huyết và hoại tử cơ Độc tố này gây bệnh hoại thư sinh hơi, hoại tử ruột và gây nhiễm độc máu ở một số động vật như bò, dê, ngựa…

1.3.2 Beta toxin (CPB)

Là độc tố được sản sinh bởi vi khuẩn C perfringens type B và type C là

một protein mẫn cảm cao với trypsin, gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào

màng trong ruột Gene mã hóa cho độc tố beta là cpb, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn Cpb có trọng lượng phân tử khoảng 40 kDa, tương đương với 1113

nucleotid mã hóa cho 371 axit amin, điểm đẳng điện pI = 5,6 Cả 2 đặc tính trên

đều gần giống cpa, vì vậy rất khó để phân tách được 2 độc tố CPA và CPB nếu chỉ dựa vào 2 đặc điểm trên Hàm lượng G + C trên cpb tương đối thấp, chỉ

chiếm khoảng 28,5% Nu tổng số

Theo Lawrence và Cook năm 1980, CPB ở vi khuẩn C perfringens type C

bị ức chế bởi sự hoạt động của enzyme protease Khi con vật còn nhỏ chúng rất mẫn cảm với bệnh gây ra bởi CPB so với con trưởng thành, bởi vì trong đường ruột của con vật còn non có ít enzym có khả năng bất hoạt độc tố này Mặc khác, trong sữa đầu của mẹ có yếu tố làm ức chế hoạt động của enzym protease, điều này càng làm tăng tính dễ bị tổn thương của con non đối với độc tố beta CPB còn có khả năng giải phóng catecholamines vào máu, làm huyết áp tăng nhanh, nhịp tim giảm mạnh ở động vật mắc bệnh CPB là nguyên nhân gây nên bệnh viêm ruột hoại tử ở heo, dê, cừu và cả ở người, chúng gây tổn thương tế bào biểu

mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ Ngoài ra, CPB còn tác động đến

mô thần kinh làm ảnh hưởng đến quá trình trao đổi Canxi màng gây rối loạn các chức năng thần kinh bình thường [18]

1.3.3 Epsilon toxin (ETX)

Độc tố epsilon được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type B và type D ETX được mã hóa bởi gene etx, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn, trọng

lượng phân tử khoảng 34,25 kDal ETX được tiết ra dưới dạng tiền độc tố và được hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin [25] Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho ETX hoạt động [18]

ETX được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong Tại đây độc tố làm tăng áp lực trong thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan và thận ETX tác dụng lên nhóm lipid: Cholesterol và sphingolipid có mặt

trên màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận 1.3.4 Iota toxin (CPI)

Độc tố Iota được tiết ra bởi vi khuẩn C perfringens type E Gen mã hóa độc

tố này nằm trên plasmid CPI là độc tố gồm 2 phần là 2 polypeptid độc lập với

nhau Vị trí hoạt hóa enzyme gọi là Iota a (gene mã hóa Ia) và vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích Iota b (gene mã hóa Ib) Chuỗi nặng Ib có trọng lượng

phân tử khoảng 71,5 kDal; pI = 4,2 sẽ gắn độc tố với tế bào biểu mô đích và giúp cho chuỗi nhẹ Ia có trọng lượng phân tử 47,5 kDa, pI = 5,2 thấm qua màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào CPI gây nên các triệu chứng về bệnh nhiễm độc tố, bệnh đường ruột ở cả bò, bê, chuột lang và thỏ Ngoài ra, khi vào cơ thể CPI sẽ là tăng tính thấm thành mạch của tế bào vật chủ

1.3.5 Enterotoxin (CPE)

Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy, viêm ruột và hoại thư sinh hơi ở động vật Độc tố gây tiêu chảy làm mất nước và chất điện giải trong cơ thể Enterotoxin được sản sinh trong quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn, và độc tố sẽ tăng khi tế bào sinh dưỡng bị phá hủy Gene mã

hóa cho CPE là cpe nằm trên cả nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C perfringens CPE là một đoạn polypeptide mạch đơn nặng 35 kDal, điểm đẳng

điện pI = 4,3 tồn tại ở pH = 5-12 [20] Khi bị nhiễm độc enterotoxin các triệu chứng xuất hiện bao gồm: Tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày, thời gian ủ bệnh từ 6 – 24giờ 24 giờ, thường từ 10 – 12 giờ

1.3.6 Delta toxin

Được sản sinh bởi vi khuẩn C perfringens type B và type C Gene mã hóa

độc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 42 kDal và pI = 7,1 Độc tố Delta là chất gây nên hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê, và heo Tuy nhiên, độc tố này lại bị

ức chế bởi các hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các loại động vật có vú khác

1.4 HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C perfringens

ETX là độc tố được sinh ra bởi cả hai chủng C perfringens type D và type

B Nó thường gây ra các bệnh cho các loài động vật như dê, cừu và bê, nhanh chóng gây tử vong và làm thiệt hại cho nền kinh tế nông nghiệp

1.4.1 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX

Độc tố epsilon được tổng hợp từ DNA plasmid có chiều dài 311 acid

amin, ở dạng tiền độc tố bất hoạt “protoxin” trọng lượng phân tử khoảng 34,25 kDal đến 35,2 kDal, điểm đẳng điện pI = 8,2 Sau đó được hoạt hóa bằng enzyme ngoại bào thủy phân protein như trypsin, chymotripsin hoặc độc tố Kappa,

Lampda do chính vi khuẩn C perfringens sinh ra Độc tố sau khi hoạt hóa có

trọng lượng phân tử là 31,2 kDal; điểm đẳng điện là pI = 5,36 [20]

Thực chất của sự hoạt hóa là làm cho protein độc tố hoạt động nhanh hơn sau khi gắn kết vào tế bào vật chủ Hơn nữa, sự hoạt hóa giảm điểm đẳng điện của độc tố (từ 8,2 ở tiền độc tố xuống 5,36 ở độc tố hoạt hóa hoàn toàn, hoặc 5,74 ở độc tố hoạt hóa từng phần) [32] Sự hoạt hóa làm thay đổi về cấu trúc của tiền độc tố [20], có hoàn thiện tương tác của độc tố với thụ thể

1.4.2 Gen mã hóa ETX

Phản ứng PCR đã được sử dụng để xác định sự có mặt của gen mã hóa

độc tố epsilon của các chủng C perfringens type B và D nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm Gen etx mã hóa độc tố epsilon nằm trên plasmid lớn có khả năng chuyển

ngang giữa các vi khuẩn (conjugative plasmid) Toàn bộ plasmid có độ dài trên 64

Kb (hình 1.3), và đoạn mã hóa cho độc tố epsilon trên 1Kb trong đó có 933 nucleotid mã hóa cho 311 axit amin của tiền protein toxin epsilon

Hình 1.3 Cấu trúc của plasmid mang gene Etx

Promoter của gen etx nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã So sánh

trình tự nucleotid các yếu tố chính để khởi động quá trình phiên mã bao gồm hộp TTGTAT khoảng 35 bp trước điểm phiên mã, hộp TATA 10 bp trước điểm phiên

mã Chúng lần lượt được gọi là vùng -35 và vùng -10 (hộp Pribnow) [6] So sánh

trình tự nucleotid của các promoter của hai gen EtxB (từ C perfringens type B)

và EtxD (từ C perfringens type D) cho thấy không có sự tương đồng, chúng khác

nhau về trình tự ở vùng -35 và vùng -10 (Hình 1.4) Từ sự khác nhau này chúng

ta có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen mã hóa độc tố epsilon từ

C perfringens type B hay từ type D [32]

Hình 1.4 Thiết kế primer phân biệt Etx gene C perfringens type D và B

Khung đọc mở (open reading frame, ORF) là một trình tự mã hóa chuỗi polypeptide được bắt đầu với mã khởi đầu (start codon - ATG) và kết thúc bằng một mã dừng (stop codon - TAA) [6]

So sánh trình tự gen của EtxB và EtxD trong khung đọc mở cho thấy chỉ

sai khác 2 nucleotide, kết quả của quá trình dịch mã chỉ có 1 axit amin được thay thế [18]

1.4.3 Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định

Có nhiều phương pháp để phát hiện độc tố epsilon và giám định các bệnh

do độc tố gây ra ở động vật Các kỹ thuật miễn dịch học đã được áp dụng để phát hiện sự có mặt của độc tố như kỹ thuật khuyếch tán phóng xạ đơn, phản ứng vi kết

hợp bổ thể, phản ứng ELISA, ngưng kết trên đĩa nhựa (LAT) Phản ứng ELISA và LAT còn được dùng để phát hiện độc tố epsilon từ các dung dịch mô bào, các chất chứa trong đường ruột và canh trùng

- Xác định độc lực trên chuột: Thông thường, để giám định độc tính của độc tố epsilon tinh chế người ta sử dụng phương pháp thử khả năng gây chết

chuột [40], liều LD50 trên chuột được xác định được là 78 ng/Kg chuột khi tiêm bằng đường tĩnh mạch [23]

- Xác định độc lực trên tế bào (cytotoxicity): Nghiên cứu về độc tính của

độc tố epsilon trên tế bào nuôi cấy cho thấy rằng tế bào dòng MDCK (tế bào thận

chó Madin Darby) rất nhạy cảm với chất tiết trong canh trùng C perfringens type D,

vì thế có thể dùng phương pháp gây nhiễm trên tế bào nuôi cấy để thay thế cho các

phương pháp thử độc lực trên chuột Hiện nay, phương pháp xác định độc lực in vivo của độc tố epsilon do C perfringens type D sản sinh đã được sử dụng rộng rãi,

gọi là phản ứng gây độc tế bào (cytotoxicity) Chỉ cần 15ng/ml độc tố epsilon tinh chế có thể phá hủy 50% tế bào MDCK [33]

1.4.4 Cơ chế gây bệnh của độc tố epsilon (ETX)

Độc tố epsilon do C perfringens type B và D tiết ra chỉ gây bệnh giới hạn cho

một số vật chủ như cừu, dê và bò, ít gây bệnh cho người [37] Độc tố gây bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết (enterotoxemia) với các triệu chứng bệnh rất nặng và chết

nhanh Độc tố epsilon do C perfringens type B tiết ra gây bệnh lỵ ở cừu con, còn epsilon do C perfringens type D tiết ra gây bệnh NĐRH, với tổn thương thực thể ở

thận cừu non (còn gọi là bệnh nhũn thận), ở cả cừu trưởng thành, tỷ lệ chết ở 2 thể bệnh này có thể đến 100% và gây thiệt hại kinh tế rất lớn đối với chăn nuôi tập trung [14]

Bệnh do C perfringens gây ra là bệnh truyền nhiễm tính chất truyền lây Căn

bệnh thường trực ở gia súc và môi trường xung quanh, gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi Do vậy, bệnh thường xảy ra lẻ tẻ, thường khi hệ vi sinh vật đường ruột bị mất cân bằng (như sau điều trị bằng kháng sinh) Sự thay đổi chế độ thức ăn từ ít chất dinh dưỡng sang nhiều dưỡng chất làm cho cơ thể không tiêu hóa kịp, nhiều chất tinh bột bị chuyển từ dạ cỏ vào ruột non thường dẫn đến sự phát bệnh nhiễm độc máu từ ruột Với môi trường yếm khí và nhiều chất dinh dưỡng ở ruột non đã làm cho vi khuẩn tăng sinh nhanh về số lượng, có thể hơn 1 tỷ vi khuẩn / gam chất chứa ở ruột

hồi, trong đó các C perfringens type B và D sản sinh một lượng lớn độc tố epsilon

Cơ chế tác động của độc tố epsilon vẫn còn chưa rõ, tuy nhiên nhiều quan sát cho thấy độc tố tác động đến hệ thần kinh trung ương Sau khi thâm nhập vào cơ thể

vật chủ, vi khuẩn C perfringens sản sinh độc tố Độc tố được hoạt hóa tại ruột, làm

gia tăng tính thẩm thấu của thành ruột dẫn đến làm tăng hấp thu độc tố vào tuần hoàn máu [17,28] Tại tế bào đích, độc tố đục những cái “lỗ”trên màng tế bào; làm mất cân bằng ion và tạo các lỗ rò; làm gia tăng tính thẩm thấu Tất cả các hoạt động đều làm cho tế bào bị chết

Sau khi xâm nhập vào tuần hoàn máu, độc tố epsilon tác động làm cho hàm lượng hormon adrenalin và noradrenalin trong máu tăng cao Khi hormone này ở mức cao thì nó hoạt hóa adenyl cyclase, từ đó kéo theo mức cAMP (Cyclic Adenosine Monophosphate) và đường glucose ở trong huyết thanh tăng cao gây ra bệnh tích phù ở não Ở chuột không thấy có sự thay đổi về mức adrenalin và noradrenalin ở trong não sau khi tiêm độc tố epsilon vào tĩnh mạch và quan sát trong vòng 30 phút, tuy nhiên mức dopamine lại giảm xuống rất thấp Dopamine là chất dẫn truyền thần kinh ở não, có tác dụng bảo vệ não chống lại tác động của độc tố epsilon [28]

1.5 MỘT SỐ LOẠI BỆNH DO VI KHUẨN C perfringens GÂY RA TRÊN

DÊ, CỪU

Vi khuẩn C perfringens có ở khắp nơi trong tự nhiên và là một phần của

hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật Thường có hai dạng cơ bản hình thành nên bệnh: Một là vi khuẩn có sẵn trong ruột, hai là thức

ăn bị nhiễm C perfringens cùng với một số thay đổi về môi trường, thay đổi

khẩu phần thức ăn đột ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein

và năng lượng Những thay đổi này tạo điều kiện thuận lợi C perfringens phát

triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố trong ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh viêm ruột hoại tử, bệnh nhiễm độc máu ở dê, cừu non và dê, cừu trưởng thành

1.5.1 Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết trên dê, cừu

Type D gây bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết (mềm thận) ở cừu và dê trên

khắp thế giới Bệnh thường xảy ra với cừu 4-10 tuần tuổi và cừu trên 6 tháng tuổi Cừu trưởng thành ít bị nhiễm bệnh nhưng khi đã nhiễm bệnh thì rất nặng

Nguyên nhân và cách lây nhiễm

Bệnh thường xảy ra khi có sự thay đổi về thức ăn Bệnh xảy ra ở các mùa, nhưng đặc biệt dễ xảy ra trong suốt thời gian cai sữa Bệnh thường xảy ra ở cừu khi được chăn thả trên đồng cỏ vào mùa hè, lúc này cừu ăn nhiều lúa mì và hạt ngũ cốc, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn nhân lên và sinh độc tố epsilon Quá trình này cần sự hoạt hóa của trypsin Khi độc tố epsilon có nồng độ cao thì sẽ di chuyển từ từ vào ruột, tăng tính thấm vào thành ruột và chuyển hướng độc tố vào máu Trong máu, độc tố gây nhiễm độc máu và bắt đầu biểu hiện triệu chứng bệnh [42]

Bệnh mềm thận thường gặp ở cừu nhiều hơn dê, phụ thuộc đặc thù dinh dưỡng Ở cừu khi thấy có những dấu hiệu về thần kinh thì cừu sẽ chết đột ngột

Dê thường bị viêm ruột kết xuất huyết Bệnh mềm thận kinh niên thường xảy ra

ở dê và những động vật có biểu hiện tiêu chảy trước khi chết [39]

1.5.2 Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu do C perfringens gây ra

Nguyên nhân và cách lây nhiễm

Loại vi khuẩn này thường xuyên cư trú trong đường ruột của gia súc khoẻ

mà không gây bệnh vì số lượng vi khuẩn thấp và độc tố được tiết ra sẽ nhanh chóng theo chiều nhu động của ruột thải ra ngoài Khi gặp sự tiêu hóa bất bình thường như cho ăn nhiều thức ăn dễ lên men, giàu tinh bột hoặc thức ăn khó tiêu

qua dạ cỏ tới dạ tổ ong và ruột, ở nơi đó tạo điều kiện cho vi khuẩn Clostridium perfringens phát triển nhanh Sự tăng trưởng vi khuẩn này cùng với giảm nhu

động ruột sẽ tăng cường độ và độc lực gây bệnh của độc tố được sản xuất ra bởi

vi khuẩn, rồi dẫn đến viêm ruột và tiêu chảy Đặc biệt, khi niêm mạc đường tiêu hóa bị tổn thương thì vi khuẩn phát triển rất nhanh chóng và gây bệnh

độ cơ thể tăng cao 40 - 41°C, xuất hiện tiêu chảy phân lỏng dính lẫn bọt, máu, có chất nhầy, sau đó thân nhiệt giảm xuống còn 36,2°C và dê chết trong vòng 24 giờ [38]

- Thể cấp tính

Bệnh thường xảy ra ở dê trưởng thành, con vật thường đau bụng, có thể kêu rên hoặc không Phân lúc đầu nhão, sền sệt, nhưng sau đó trở nên lỏng như nước, có mùi hôi thối Triệu chứng lâm sàng có thể kéo dài 3 đến 4 ngày [39]

- Thể mãn tính

Thường mắc bệnh ở dê trưởng thành, bệnh xuất hiện theo từng giai đoạn, có định kỳ vài tuần lại lặp lại, dê buồn bã, giảm sản lượng sữa, kém ăn Dê giảm thể trọng cùng với sự tiêu chảy gián đoạn phân nhão

Như vậy, các triệu chứng điển hình của bệnh này: Trợn, chớp mắt liên tục,

co giật, cong lưng, nghiến răng, chảy nước dãi và chết trong vòng vài giờ Có khi tiêu chảy phân lẫn máu, niêm mạc và đặc biệt có mùi thối khẳm Nhu động dạ cỏ yếu dần rồi mất hẳn, dê thường chết [38]

1.6 ENZYME TRYPSIN

Khái niệm chung

Trypsin có trong dịch tụy của người và động vật Trypsin được Kiihne khám phá và tách chiết vào năm 1848 Năm 1931 Northrop và Kunitz thu được trypsin và trypsinogen ở dạng tinh thể [7]

Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nên được gọi là protease kiềm tính [7]

- Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của trypsin là nhiệt độ cơ thể nhưng

nó vẫn có thể hoạt động tốt ở trong khoảng nhiệt độ 30 - 40°C

- Trypsin cắt các liên kết được tạo ra bởi nhóm carboxyl (- COOH) của lysine hay argine (ngoại trừ histidine) với nhóm amine (- NH2) của acid amin bất

kỳ và trypsin không cắt liên kết giữa lysine và arginine [7]

1.7 PHƯƠNG PHÁP PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in

vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuân là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch

đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn này Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm…[2]

1.7.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này Mồi

là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài

để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase [2]

Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số