Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của hai loài vi tảo biển thuộc hai chi chaetoceros và tetraselmis

Mặt khác, hầu hết các chủng giống tảo đều có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình công nghệ nuôi trồng các vi tảo này chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam như biến động về nhiệt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -& -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -& -

PGS.TS ĐẶNG DIỄM HỒNG

TS HOÀNG THỊ BÍCH MAI

Nha Trang, 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu thu thập được trong quá trình thực hiện đề tài là hoàn toàn đúng với thực tế; kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào; các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Nuôi trồng thủy sản, Phòng Đào tạo đại học và Sau đại học - Trường Đại học Nha Trang sự kính trọng và lòng tự hào được học tập tại trường trong thời gian qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Đặng Diễm Hồng, TS Hoàng Thị Bích Mai đã giúp đỡ, động viên và chỉ bảo tận tình tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện

đề tài

Xin chân thành cảm ơn Ban Quản lý Dự án Hợp phần Hỗ trợ phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững (SUDA) – Chương trình FSPS – 2 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong suốt khoá học

Cảm ơn các cán bộ của Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp cơ sở vật chất thí nghiệm, tài liệu

và các kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực tập tốt nghiệp

Cảm ơn Vụ Khoa học, Công nghệ và Môi trường - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã tạo điều kiện cho tôi được học tập để nâng cao trình độ chuyên môn

Cám ơn Trường Cao đẳng Thủy sản đã hỗ trợ về cơ sở đào tạo để tôi hoàn thành khoá học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã động viên

và tiếp sức cho tôi hoàn thành chương trình học tập cũng như việc thực hiện nghiên cứu đề tài

Nha Trang, tháng 06 năm 2011

Học viên

Trần Thị Tuyết Lan

TLK Trọng lượng khô

TLT Trọng lượng tươi

VTB Vi tảo biển

1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước 4 1.2 Tình hình nghiên cứu vi tảo trong nước 10

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Chaetoceros và Tetraselmis 13

1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và

1.3.2 Ứng dụng của VTB C gracilis và T chuii trong NTTS 14 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.4.1 Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài VTB

thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis 17 2.4.1.1 Thu thập và phân lập 2 loài VTB 17 2.4.1.2 Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang

học và kính hiển vi điện tử quét (SEM) 20 2.4.1.3 Định tên khoa học hai loài VTB thuộc

2 chi Chaetoceros và Tetraselmis 21

2.4.1.4 Lưu giữ 2 loài VTB 21

2.4.2 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2 loài

VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis 26 2.4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 27 2.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 27 2.4.2.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng 27 2.4.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 27

2.4.2.6 Xác định sinh trưởng của VTB 28

2.4.3 Nuôi sinh khối 2 loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros

và Tetraselmis trong điều kiện phòng thí nghiệm 29

2.4.3.1 Nuôi sinh khối loài C gracilis Pantocsek 1982 29

2.4.3.2 Nuôi sinh khối loài Tetraselmis chuii Butcher 1959 30 2.4.3.3 Phân tích thành phần dinh dưỡng 2 loài VTB

thuộc 2 chi Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuii 31 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài VTB

thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis 34

3.1.1 Thu thập và phân lập 2 loài VTB 34

3.1.3 Lưu giữ Chaetoceros gracilis Pantocsek 1982

3.1.3.1 Lưu giữ Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuiitrên

môi trường lỏng và ống thạch nghiêng 41

3.1.3.2 Lưu giữ Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuiiở

nhiệt độ thấp (-80ºC) 43

3.2 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của loài C gracilis và T.chuii 45

3.2.1 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của loài C gracilis 45 3.2.1.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 45 3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 46 3.2.1.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng 47 3.2.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 47 3.2.1.5 Ảnh hưởng của pH 48

3.2.2 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của loài T.chuii 48 3.2.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 48 3.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối 49 3.2.2 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 50 3.2.2.4 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng 51

3.3 Nuôi sinh khối loài C.gracilis và loài T.chuii trong điều kiện

phòng thí nghiệm 52

3.3.1 Nuôi sinh khối loài C.gracilis 52

3.3.2 Nuôi sinh khối loài T.chuii

3.4.Thành phần dinh dưỡng của loài C gracilis và loài T.chuii 53

3.4.1.Thành phần dinh dưỡng của loài C gracilis 53

3.4.2 Thành phần dinh dưỡng của loài T chuii 56

giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới)

của đoạn gien 18S rRNA giữa các loài thuộc chi Chaetoceros 38 Bảng 3.2 Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm tương đồng (ma trận tam

giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới)

của đoạn gien 18S rRNA giữa các loài thuộc chi Tetraselmis 40

Bảng 3.3 Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ/ngày) của các loài C gracilis

và T chuii sau 60 ngày lưu giữ trên môi trường lỏng 42 Bảng 3.4 Nồng độ DMSO tối ưu cho bảo quản vi tảo biển quang

tự dưỡng Tetraselmis chuii ở nhiệt độ thấp - 800C 44

Bảng 3.5 Tỷ lệ sống sót của Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuii

được lưu giữ ở âm 800C với sự có mặt của 15% DMSO 45

Bảng 3.6 Thành phần dinh dưỡng trong sinh khối của loài C gracilis 54

Bảng 3.7 Hàm lượng lipit tổng số và thành phần axít béo của loài C gracilis 55

Bảng 3.8 Thành phần hoá sinh của loài Tetraselmis chuii 57

Bảng 3.9 Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của loài Tetraselmis chuii 58

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.2 Sơ đồ khối phân lập VTB 18 Hình 2.3 Sơ đồ khối lưu giữ VTB 22 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản lên khả năng

sống sót của tảo được lưu giữ ở - 800C 25 Hình 2.5 Sơ đồ khối xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của VTB 26

Hình 3.1 Hình thái tế bào C gracilis dưới kính hiển vi quang học với

độ phóng đại 1500 lần 35

Hình 3.2 Hình thái tế bào C gracilis dưới kính hiển vi điện tử quét

(SEM) với độ phóng đại 3500 lần 35

Hình 3.3 Hình thái tế bào Tetraselmis sp dưới kính hiển vi quang học

với độ phóng đại 1500 lần 36

Hình 3.4 Hình thái tế bào Tetraselmis sp dưới kính hiển vi điện

tử quét (SEM) với độ phóng đại 7500 lần 36

Hình 3.5: Kết quả tách ADN tổng số của loài Chaetoceros sp và

Tetraselmis sp 36 Hình 3.6: Kết quả nhân một phần gen 18S rRNA của loài

Chaetoceros sp., Tetraselmis sp 37 Hình 3.7: Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid tái tổ hợp mang gen

18S rRNA của loài Chaetoceros sp và Tetraselmis sp 38

Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Chaetoceros 39

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Tetraselmis 41

Hình 3.10 Lưu giữ chủng giống C gracilis và T chuii trên môi trường lỏng 42

Hình 3.11 Khuẩn lạc của Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuii mọc

trên môi trường thạch 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của

C gracilis sau 25 ngày nuôi cấy 46 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên sinh trưởng của

C gracilis sau 20 ngày nuôi cấy 46

Hình 3.14 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng lên sinh trưởng của

C gracilis sau 20 ngày nuôi cấy 47

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của C Gracilis

Hình 3.16 Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của C gracilis

Hình 3.17 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của

T chuii sau 25 ngày nuôi cấy 49

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sinh trưởng của T chuii

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của T chuii

Hình 3.20 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng lên sinh trưởng

của T chuii sau 30 ngày nuôi cấy 50

Hình 3.21: Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của T chuii

Hình 3.22 Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các

quy mô bình tam giác từ 250 ml đến bình nhựa10 lít 53

Hình 3.23 Phổ axit béo của loài vi tảo biển Chaetoceros gracilis 56

Hình 3.24 Phổ axít béo của loài vi tảo biển Tetraselmis chuii 59

MỞ ĐẦU

Vi tảo là nguồn thực phẩm chức năng quan trọng của con người và động vật,

là nguồn phân bón, nguồn khai thác các chất có hoạt tính sinh học được dùng làm thuốc, mỹ phẩm, có vai trò bảo vệ môi trường và cố định CO2 Hàng năm trên thế giới sản suất khoảng 6.000 tấn vi tảo khô và đã cho doanh thu 1,25 tỷ USD [78], [79]

Vi tảo có kích thước phù hợp, dễ tiêu hoá và ít gây ô nhiễm môi trường, có hàm lượng dinh dưỡng cao, nhiều loài không có độc tố, là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và có khả năng nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi vì thế vi tảo được coi là nguồn thức ăn sống quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm hai mảnh vỏ

(Bivalvia) như: Hầu, Vẹm, Điệp, Sò, Ngao…, là thức ăn cho ấu trùng của hầu hết các loài: tôm, cá, ốc và cho cả các động vật phù du (Copepoda, Artemia,

Rotifer….) Phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophuceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasinophyceae) [33] đã xác định rằng trong tảo đơn bào hàm lượng protein dao

động từ 6 – 52%; carbohydrate từ 5 – 23% và lipid từ 7 – 23% Các lớp tảo khác nhau không có sự khác biệt về hàm lượng protein, lipit nhưng các loài trong lớp tảo

Chlorophyceae và Prymnesiophyceae giàu hàm lượng carbohydrate hơn các loài

thuộc họ khác Ngoài ra, các loài vi tảo biển (VTB) còn giàu các axit béo không bão hoà đa nối đôi (PUFAs) đặc biệt là DHA (docosahexaenoic acid), EPA (eicosahexaenoic acid), AA (arachidonic axit), đây là các PUFAs rất cần thiết đối với con người và động vật nuôi [61] Cụ thể các loài tảo đều chứa EPA chiếm 7 –

34%, tảo Prymnesiophyceae chứa 0,2 – 11% DHA và Eustigmatophyceae lại có nhiều nhất AA 0 – 4%; Lớp tảo Prasinophyceae (Tetraselmis, Micromonas,

Pyramimonas) chứa khoảng 4-10% DHA hoặc EPA [30] Với các đặc điểm sinh

học này, VTB quang tự dưỡng đang là mối quan tâm lớn trong phát triển thương mại hoá sản phẩm công nghệ sinh học vi tảo như là thực phẩm chức năng cho người

và động vật, đặc biệt là thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS)

NTTS là một ngành mang lại giá trị xuất khẩu cao cho nền kinh tế Việt Nam

cụ thể: Năm 2010, diện tích NTTS cả nước là 1.096.722 ha (đạt 109,68% so với chỉ

tiêu) Sản lượng NTTS là 2.828.622 tấn, đạt 141,4% so với kế hoạch Về sản xuất giống, cơ bản đã đáp ứng đủ nhu cầu nuôi thương phẩm, đặc biệt là giống các đối tượng nuôi chủ lực Ví dụ, giống tôm nước lợ đạt 45 tỷ con, bằng 128,6% so với kế hoạch, giống cá Tra là 2,36 tỷ con, bằng 337,25% so với kế hoạch, giống của một số loài thủy sản kinh tế và giống cá nước ngọt truyền thống là 27,5 tỷ con, bằng 229,2% so với kế hoạch Kim ngạch xuất khẩu từ NTTS đạt 3,5 tỷ USD, bằng 125%

so với kế hoạch (www.tongcucthuysan.gov.vn) Hiện nay, việc sản xuất giống các đối tượng NTTS có giá trị kinh tế cao đang gặp khó khăn Nguyên nhân là do chưa chủ động lựa chọn và sản xuất nguồn thức ăn sống cho ấu trùng ở các giai đoạn khác nhau Đây là một khâu có tính chất quyết định, đột phá trong ngành NTTS Hầu hết các trại nuôi trồng sản xuất giống đều bị động và phải lựa chọn nguồn thức

ăn khác để thay thế, vì thế dẫn tới giá thành sản xuất tăng, giảm khả năng cạnh tranh Nguồn giống và sinh khối tảo còn phụ thuộc vào thu vớt tự nhiên nên không thuần nhất, khó lưu giữ Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập, nuôi giữ thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm, chưa có quy trình công nghệ nuôi thích hợp đảm bảo nhân nhanh sinh khối vi tảo nhất là giống ban đầu Mặt khác, hầu hết các chủng giống tảo đều có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình công nghệ nuôi trồng các vi tảo này chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam như biến động về nhiệt độ và độ mặn, vì thế sinh khối tảo đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được Do vậy, việc phân lập, định loại, nhân nuôi sinh khối và sử dụng VTB làm thức ăn sống trong sinh sản nhân tạo các loài động vật biển gặp rất nhiều khó khăn, chưa khai thác được tiềm năng về vai trò của vi tảo, chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế Xuất phát từ nhu cầu thực tế, tôi

đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của hai loài vi tảo

biển thuộc hai chi Chaetoceros và Tetraselmis” Công việc được thực hiện tại

Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mục tiêu của đề tài:

1 Mục tiêu chung: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của hai loài VTB

thuộc hai chi Chaetoceros và Tetraselmis phân lập ở Việt Nam với mục đích ứng

dụng trong NTTS

2 Mục tiêu cụ thể:

2.1 Có được bộ số liệu về phân lập, lưu giữ giống, định tên khoa học chính

xác và một số đặc điểm sinh học của hai loài VTB thuộc hai chi Chaetoceros và

Tetraselmis

2.2 Chọn được 2 loài VTB nêu trên có khả năng lưu giữ thuần chủng, nhân nhanh sinh khối có chất lượng dinh dưỡng phù hợp làm thức ăn cho NTTS

Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm:

1 Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài VTB thuộc 2 chi

Chaetoceros và Tetraselmis

2 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2 loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros

và Tetraselmis

3 Nuôi sinh khối 2 loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis trong

điều kiện phòng thí nghiệm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu thu được trong Luận văn này là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn nữa các loài vi tảo biển và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống vi tảo của Việt Nam

Kết quả nghiên cứu thu được có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống NTTS trong việc chủ động nuôi, lưu giữ và thu sinh khối vi tảo làm thức ăn cho thủy, hải sản; góp phần giải quyết vấn đề thức ăn sống - nguồn thức ăn quan trọng và cần thiết cho các đối tượng nuôi; góp phần vào việc sản xuất giống thủy sản sạch bệnh, chất lượng cao và thúc đẩy nghề nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước

Trong tự nhiên, vi tảo là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn nên chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu của nhiều đối tượng thuỷ sản như ở hầu hết các giai đoạn phát triển của nhuyễn thể, giai đoạn ấu trùng của giáp xác và cá Ngoài ra, chúng còn được sử dụng để nuôi sinh khối động vật phù du (luân trùng, copepod, artemia) làm thức ăn cho các giai đoạn ấu trùng của giáp xác và cá

Với đặc trưng về thành phần dinh dưỡng, VTB đang là mối quan tâm lớn trong việc phát triển thương mại hoá sản phẩm công nghệ sinh học vi tảo như là thực phẩm chức năng cho người và động vật, đặc biệt là thức ăn cho ngành NTTS Hàng loạt các nghiên cứu về đa dạng và ứng dụng của vi tảo, thương mại hoá sản

phẩm astaxanthin từ Haematococcus, carotenoit từ Dunalliela, Spirulina hay nghiên

cứu về ảnh hưởng của sắc tố này lên tỷ lệ sống sót và sinh trưởng của ấu trùng của

tôm Penaeus monodon đã được thông báo VTB được sử dụng trong NTTS như là nguồn thức ăn sống và nhân tạo cho nuôi ấu trùng tôm, Farfantepenaeus aztecus và

dùng thức ăn từ vi tảo như Liqualife™, Epifeed™, Zeigler™ E-Z Larvae, Zeigler™

Z-Plus and Zeigler™ E-Z Artemia thay thế từng phần thức ăn Artemia nauplii trong việc sản xuất ấu trùng tôm F Aztecus [89] Các nghiên cứu sâu về dinh

dưỡng, khả năng tiêu hoá và nuôi trồng sinh khối vi tảo cho nuôi trồng ấu trùng cá biển và động vật thân mềm hai mảnh vỏ đã được tiến hành nghiên cứu

Ở Hoa Kỳ, các loài Thalasiossira pseudomonas, Skeletonema, Chaetoceros

calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis, Chlorella minutissima được

nuôi để làm thức ăn cho luân trùng, ấu trùng hai mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá theo phương pháp từng mẻ hoặc bán liên tục trong những bể composite 2.000- 25.000 lít

Ở Hawaii, năng suất loài Nannochloropsis đạt khoảng 2,2 triệu lít/năm

Ở Đài Loan, các đối tượng nuôi chính là Tetraselmis, Nannochloropsis

oculata, Chlorella sp dùng cho ương nuôi ấu trùng họ tôm he (Penaeus), Isochrysis galbana trong ương nghêu…Riêng loài Skeletonema costatum, sản lượng nuôi có

thể đạt tới 9.000 tấn/ năm Một số loài vi tảo được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản được chỉ ra trên bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số loài vi tảo được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản [31]

Ghi chú: Mức độ sử dụng tảo cho nuôi BV: Bivalvia; AT – T: Ấu trùng tôm;

J – A: Bào ngư con; DVPD: Động vật phù du; + + được dùng nhiều hơn + Giá trị dinh dưỡng: - : < 0,2% của hàm lượng acid béo tổng cộng; + + : 1-5%;

+ + +: >20%; n.d: không xác định

* Trong nuôi sinh khối luân trùng

Luân trùng Brachionus rotundiformis và B plicatilis là nguồn thức ăn không

thay thế cho giai đoạn đầu của ấu trùng nhiều loài cá biển Việc đáp ứng đủ sinh khối luân trùng đạt chất lượng dinh dưỡng cho các bể ương ấu trùng là việc làm

không dễ cho các trại sản xuất giống VTB là nguồn thức ăn tuyệt vời nhất trong nuôi sinh khối luân trùng để đạt năng suất và cho luân trùng chất lượng dinh dưỡng cao nhất, chúng có thể tham gia điều chỉnh thành phần lipit và các axit béo của luân trùng trước khi chúng trở thành thức ăn cho ấu trùng vì thành phần axit béo của luân trùng có liên quan mật thiết với thức ăn

* Trong nuôi cá biển

Vi tảo được đưa trực tiếp vào bể ương ấu trùng của nhiều loài cá biển bằng

kỹ thuật nuôi “nước xanh” Đối với ấu trùng cá biển, không giống như nhuyễn thể

và ấu trùng giáp xác, chúng không trực tiếp ăn vi tảo mà được cung cấp dinh dưỡng

thông qua các đối tượng động vật phù du làm thức ăn như copepod, rotifer, artemia

Giá trị dinh dưỡng của các đối tượng này phụ thuộc chủ yếu vào nguồn thức ăn

chính là vi tảo Ví dụ như nuôi Rotifer bằng Dunaliella tertiolecta (ít PUFA) thì chứa ít hàm lượng PUFA trong cơ thể, ngược lại nếu nuôi bằng Pavlova lutheri

(giàu PUFA) thì cũng giàu PUFA trong cơ thể của chúng Dựa vào cỡ mồi của động vật nuôi mà các loài tảo được lựa chọn nuôi sinh khối làm thức ăn thường có kích thước từ 2-20µm và cho động vật phù du tốt nhất từ 2-12 µm [75]

* Trong nuôi tôm

Trong số 14 loài tảo thử nghiệm làm thức ăn cho ấu trùng tôm, kết quả cho

thấy ấu trùng tôm biển: tôm Sú (Penaeus monodon), tôm Thẻ (P merguiensis, P

indicus, P japonicus) ăn các loài tảo Chaetoceros muelleri, C calcitrans, Skeletonema costatum, Rhodomonas baltica, Tetraselmis suecica, Isochrysis sp cho

tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng lớn nhất [75] VTB làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng tôm biển, số lượng giảm dần theo tập tính của ấu trùng tôm từ ăn thực vật: giai đoạn Zoea (herbivorous) sang ăn động vật (carnivorous): Mysis, Postlarvae Ngoài ra vi tảo còn ổn định chất lượng nước của bể nuôi

* Trong nuôi động vật thân mềm

Vi tảo là nguồn thức ăn cho tất cả các giai đoạn của một số loài nhuyễn thể:

nghêu, hàu, sò, điệp, ốc hương, bào ngư Năm 1986, đã thử nghiệm 50 loài làm thức ăn cho động vật hai mảnh vỏ và đã chọn ra 12 loài tảo được ứng dụng rộng rãi

cho các trại sản xuất động vật thân mềm [46] Trong đó, các loài Isochrrysis glbana,

Isochrysis sp, Pavlova lutheri, Nannonchloropsis oculata, Tetraselmis suecica,

Chaetoceros gracilis, C calcitrans, Skeletonema costatum được sử dụng phổ biến

nhất với tần số sử dụng từ 40-80% ở tất cả các trại sản xuất [75]

* Tình hình nghiên cứu về lưu giữ và bảo quản vi tảo

Tình hình nghiên cứu về lưu giữ và bảo quản vi tảo được chỉ ra trên bảng 1.2 (Nguồn: Taylor R & Fletcher RL., 1999 trích theo Kim Thị Thoa, 2004) [84],

[18]

Bảng 1.2 Tình hình nghiên cứu về lưu giữ, bảo quản vi tảo

5%DMSO 10%DMSO

30 phút Có sống

Tsuru, 1973

[85]

Chlorella sp., Scenedesmus sp., Nitzshia sp., Phaeodactylum tricornutum

10% glycerol 10%DMSO

10% glycerol 5%DMSO 1%Tween 80

45- 70 phút

1-5%DMSO 5%DMSO 10%PVP

18h 5phút

0,05- 1% Đạt đến 96,7%

15 phút Ít nhất 30%

Saks, 1978

[80]

Nitzshia sp., Cylindrotheca sp., Phaeodactylum tricornutum Nannochloropsis sp., Dunaliella salina

5% glycerol 5%DMSO

5-20%DMSO 5 phút 0,1- 0,7%

0- 64,4% 20-87,1%

McLellan,

1989 [66]

5-15% glycerol 5-15% methanol

5-10%DMSO 5-10% glycerol

10% sucrose 5%PVP+ 10%

10%DMSO 5% methanol

gaditana, Nannochloropsis atomus

Rhodomnas baltica, Tetracelmis chuii, Isochrysis galbana

5-15%DMSO 1- 5% methanol

45phút 0,10- 95,3%

Hirata et al.,

1996 [53]

Chlamydomonas reinhardtii Một số vi tảo biển khác

[37] gaditana,

Nannochloropsis atomus

Rhodomnas baltica, Tetracelmis chuii

Cordero &

Voltolina, 1997

Chaetoceros sp

Phaeodactylum tricornutum

1-10%DMSO 1-10% glycerol

Day et al.,

1997 [44]

Chlorella emersonii, Tetracelmis suesica

5-10%DMSO 10% glycerol 10% methanol

70%

73%

Không xác định Day, 1998 [45] Một số loài vi tảo biển 5%DMSO

10% glycerol 10%methanol

2,6M DMSO 2,2M Glycerol 1M Proline 3,1M Methanol

5%, 10% DMSO 10%Methanol 10%Propylene glycol

Gwo et al.,

2005 [52]

Nannochloropsis oculata

DMSO, Ethylene glycol, Glycerol, Methanol, Propylene glycol

Isochrysis galbana;

Dunaliella tertiolecta…

5% và 10% DMSO 10% Methanol 10% Propylene Glycol

30 phút

* Tình hình nghiên cứu về nuôi trồng vi tảo

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp nuôi tảo Tùy vào từng mục đích, nhu cầu và điều kiện nuôi cụ thể mà nên áp dụng phương pháp nào cho phù hợp để giảm chi phí sản xuất và đem lại hiệu quả cao Nhìn chung, có một số phương pháp nuôi tảo như sau:

- Phương pháp nuôi theo mẻ (Hệ thống kín)

Là phương pháp không làm thay đổi môi trường nuôi đã có tảo giống cho đến khi thu hoạch Phương pháp này có đặc điểm giới hạn là bị giới hạn về thời

gian, trong khi có những thay đổi về thành phần dinh dưỡng của môi trường và cường độ chiếu sáng lên từng tế bào

Để khắc phục một số điểm giới hạn của phương pháp này người ta đưa ra phương pháp nuôi bán liên tục Đây là một dạng của nuôi theo mẻ nhưng sinh khối được kiểm tra định kỳ và giữ ổn định bằng phương pháp pha loãng môi trường

- Phương pháp nuôi liên tục

Là phương pháp được sử dụng rộng rãi để nuôi tảo cũng như vi khuẩn Khác với phương pháp nuôi theo mẻ là người ta bổ sung liên tục dinh dưỡng cho tảo tăng trưởng Việc thu sinh khối cũng được tiến hành liên tục sao cho mật độ tế bào tảo luôn được ổn định trong môi trường [16]

1.2 Tình hình nghiên cứu vi tảo trong nước

Ở nước ta, các nghiên cứu về tảo cũng đã thu được một số thành tựu đáng kể

Từ những năm 1970, Skeletonema costatum do Vũ Dũng phân lập và nhân giống

thành công đã được trường Đại học Thuỷ sản (nay là Trường Đại học Nha Trang) thử nghiệm nuôi trồng Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu lựa chọn môi trường, điều

kiện nuôi trồng thích hợp cho loài vi tảo này và Chaetoceros đã được tiến hành và

phổ biến cho các cơ sở sản xuất [7] Chúng được sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho

ấu trùng tôm và tôm Sú [15] Lê Viễn Chí (1996) [5], Đoàn Văn Đẩu (1991) [8],

Nguyễn Thị Xuân Thu và cộng sự (1991) [20] sử dụng Skeletonema costatum làm

thức ăn cho ấu trùng tôm He tại trại Hạ Long, Cẩm Phả, đã nâng được tỷ lệ sống của ấu trùng giai đoạn Z1-M2 lên 30-43% so với đối chứng (sử dụng thức ăn là giáp

xác) là 17% Trần Thị Tho (1999) [17] đã tiến hành nuôi các loại thức ăn sống bằng

Chlorella và các loài vi tảo khác Dương Đức Tiến đã phân lập, bảo quản một số

loài vi tảo biển và quy trình sản suất chúng phục vụ NTTS [ 22]

Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản II đã sử dụng thành công một số loài vi

tảo như Tetraselmis chuii, Chlorella sp., Nannochloropsis oculata, Platymonas sp.,

Isochrysis galbana trong “qui trình nuôi nước xanh” để ương nuôi ấu trùng cá biển

từ những năm 2000 Nhờ quy trình lưu giữ giống đạt chất lượng, nuôi sinh khối tảo đạt mật độ cao trong dung tích lớn, Trung tâm Giống Quốc gia Hải sản Nam Bộ -

Viện Nghiên cứu NTTS II đã trở thành địa chỉ cung cấp giống cá Chẽm (Lates

calcarfer), cá Mú Đen Chấm Đỏ (Epinephelus coioides) đáng tin cậy cho người

nuôi từ nhiều năm qua Và thêm đối tượng giống cá Măng (Chanos chanos) trong

ấu trùng nổi lên 70% với N oculata, Chaetoeros đơn bào, Isochrysis, Platymonas (3.000 – 10.000 tb/ml), Trai Ngọc (Pinctada maxima) giai đoạn ấu trùng chữ D- Umbo là 23%, Tu Hài (Lutraria rhynchaena) ấu trùng nổi-con giống 7-10mm lên 1,42% với N oculata, Chaetoeros, Platymonas (3.000-15.000 tb/ml) so với TH: Lansy, Fripak lên 0,34%; Điệp Quạt (Chlamys nobilis) giai đoạn ấu trùng D-spat lên 7,5-9,5% với hỗn hợp Chaetoeros muelleri, Platymonas, Isochrysis (3.000-10.000 tb/ml) so với TH: AP, BP là 0-2,5%; Hải sâm (Holothuria scabra) giai đoạn ấu trùng nổi Auricularia lên 37,3-10,4% với hỗn hợp C muelleri, N oculata (20.000- 40.000 tb/ml) so với thức ăn hỗn hợp là Spirulina khô, Fripak lên 10,4%; Nhum Sọ (Tripneustes gratilla) giai đoạn ấu trùng nổi đến cuối giai đoạn 8 tay) lên 48,2- 61,17% với tảo tươi Chaetoceros, N.oculata (6.000-8.000 tb/ml) so với TH: Fripak

0,5g/m3 là 41%; Cua Xanh (Scylla serrate) giai đoạn Zoea 1-3 lên 51,1% với N

oculata, Chaetoceros, Platymonas kết hợp với Rotifer và Artemia so với chỉ ăn

Rotifer (18,95%) hay Artemia (27,85%); Cá Chẽm (Lates calcarifer) giai đoạn 15 ngày tuổi lên 50% với tảo N oculata (3 - 4 vạn tb/ml) kết hợp với Rotifer (3 - 35con/ml) so với cho ăn chỉ Rotifer (3-35con/ml) là 24% [21]

Hiện nay ở Việt Nam tuy việc sản xuất giống các đối tượng thuỷ sản có giá trị kinh tế phát triển manh mẽ, nhưng để chủ động sản xuất thức ăn tươi sống cho các giai đoạn ấu trùng khác nhau còn gặp nhiều khó khăn Hầu hết các cơ sở sản xuất giống đều bị động và phải dùng thức ăn thay thế như thức ăn chế biến, bột đậu nành, tảo khô… Nguồn giống và sinh khối tảo còn phụ thuộc vào thu vớt tự nhiên nên không thuần nhất, khó lưu giữ Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu, nuôi giữ thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng như chưa

có quy trình công nghệ nuôi thích hợp đảm bảo nhân nhanh sinh khối vi tảo nhất là

giống ban đầu Do các chủng giống tảo có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, nên hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là không có được các chủng giống phân lập được từ Việt Nam nên tính chống chịu với nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp Do vậy, việc phân lập, định loại và sử dụng vi tảo làm thức ăn sống trong sinh sản nhân tạo các loài động vật biển gặp rất nhiều khó khăn, chưa khai thác được tiềm năng về vai trò của vi tảo, chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế Để tháo gỡ những vấn đề khó khăn đó, Viện Công Nghệ Sinh học đã tiến hành nhiều đề tài nghiên cứu như: Nghiên cứu sử dụng quy trình công nghệ nhân nhanh sinh khối ban đầu VTB làm thức ăn sống cho ấu trùng thủy sản kinh tế” do TS Trần Văn Tựa làm chủ nhiệm với nội dung thu thập và phân lập một số VTB có giá trị làm thức ăn cho ấu trùng thủy sản kinh tế; xây dựng quy trình lưu giữ giống; tìm điều kiện thích hợp cho sinh

trưởng của Nannochloropsis để nhân nhanh trong điều kiện phòng thí nghiệm; xây

dựng quy trình công nghệ nhân nuôi nhanh sinh khối của một loài tảo làm giống ban đầu…song do kinh phí hạn hẹp nên đề tài mới chỉ tập trung vào một loài vi tảo

Nannochloropsis [23] Nghiên cứu đặc điểm sinh học của Dunaliella và Chlorella

cũng đã được tiến hành nghiên cứu [10], [11] Quy trình lưu giữ một số VTB ở nhiệt độ thấp, ni tơ lỏng cũng đã được Viện nghiên cứu NTTS I nghiên cứu và công

bố Các nghiên cứu sử dụng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên so sánh trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rADN, ITS1-5,8S-ITS2 trong việc định tên các loài tảo biển và nước ngọt của Việt Nam và xây dựng cây phát sinh chủng loại đã được Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2005) [13], Hoàng Lan Anh và cộng sự (2006) [2], Ngô Thị Hoài Thu và cộng sự (2005) [19], Lê Như Hậu và Đặng Diễm Hồng (2005) [9], Dang Diem Hong và cs (2008) [42] công bố Gần đây phòng Công Nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học đã thành công trong việc định tên khoa học của các loài vi tảo biển dựa trên phương pháp PCR từ một tế bào (Single Cell PCR) [40], [41]

Từ 1/2007 đến 12/2009 Bộ Thuỷ sản cũng đã cho thực hiện đề tài cấp Bộ

“Thu thập các loài vi tảo biển làm thức ăn phục vụ cho các đối tượng thuỷ sản” do

ThS Nguyễn Thị Hương làm chủ nhiệm với mục tiêu là thu thập được 15 loài VTB, trong đó trong nước (5 loài) và ngoài nước (10 loài); lưu giữ được 15 loài VTB thu

thập được, cung cấp giống vi tảo thuần cho các đơn vị sản xuất trong và ngoài nước

Từ năm 2008-2010 đề tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản” thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản cấp Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

do PGS.TS Đặng Diễm Hồng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Việt Nam làm chủ nhiệm đã được tiến hành và kết quả nghiệm thu đạt loại khá Kết quả chính của đề tài nêu trên thu được là một tập đoàn giống gồm 18 loài vi tảo biển được phân lập từ vùng biển Việt Nam với các đặc điểm sinh học, điều kiện lưu giữ chủng giống, điều kiện nuôi trồng tối ưu trên các cấp độ khác nhau và kết quả bước đầu sử dụng sinh khối tảo thu được làm thức ăn sống cho một số đối tượng nuôi trồng như

cho nuôi vỗ hầu Thái Bình Dương (Crassotrea gigas Thunberg, 1793); cho tu hài

bố mẹ (Lutraria rhyncheana, Jonas, 1844); trong sinh sản nhân tạo Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata, Sowerby, 1851); ấu trùng cua Xanh (Scylla serata, Forskal 1775);

ấu trùng cá Bống Bớp (Bostrichthys siensis, Lacepede 1801); ấu trùng cá chẽm (Lates calcarifer) đã được công bố

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Chaetoceros và Tetraselmis

1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và Tetraselmis

* Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái

- Chi Chaetoceros

Chi Chaetoceros thuộc ngành Baccillariophyta, lớp Baccilariophyceae, bộ

Centrales, bộ phụ Biddulphiineae và thuộc họ Chaetoceroceae Nhìn chung, các loài

thuộc chi Chaetoceros có kích thước tế bào 3-5µm, tế bào dạng hợp nhiều góc Mặt

cắt ngang tế bào phần lớn là hình bầu dục, hình thoi rất hẹp, một số loài là hình tam giác, tứ giác, rất ít khi có hình dạng tròn Ở hai cực của mặt vỏ hình bầu dục hoặc hình thoi hoặc các góc của mặt vỏ có lông gai vươn ra hoặc có u lồi nổi lên trên Ở một số loài trên mặt vỏ có gai Trục cao của tế bào thường ngắn hơn hoặc dài hơn trục dài một chút Thể sắc tố của chúng là các hạt tròn nhỏ, nhiều, cũng có khi là dạng tấm [1]

- Chi Tetraselmis

Chi Tetraselmis thuộc ngành Chlorophyta, lớp Prasinophyceae, bộ

Tetraselmidales, họ Tetraselmiceae Chúng có kích thước khoảng 7 -22m [16],

dạng đơn bào, tế bào hình ovan hoặc hình giọt lệ, có khả năng chuyển động nhờ 4 roi, chiều dài của 4 roi này thường ngắn hơn so với chiều dài của tế bào, có một hạt tạo tinh bột nằm ở giữa của tế bào Hạt tạo tinh bột này được bao bọc bởi lục lạp và chiếm phần lớn diện tích của tế bào Màu của thể hạt ở các loài thuộc chi này thường là màu xanh, nhưng có một số ít có thể có màu đỏ (màu của sắc tố

carotenoid hoặc xanthophylls) Từ năm 1980, Tetraselmis lần đầu tiên được sử dụng

nuôi trồng đại trà Có thể duy trì thời gian sản xuất hơn 60 ngày với phương pháp

nuôi bán liên tục Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định rằng Tetraselmis là

nguồn thức ăn có chất lượng cao cho ấu trùng của các loại nhuyễn thể như trai, sò, ngao, hầu…[76]

* Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học của chi Chaetoceros và

Tetraselmis

Nguyễn Thị Hương (2001) [15] đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố

sinh thái lên sự phát triển của quần thể C calcitrans Paulsen, 1905 nhập nội và thấy

loài vi tảo này sinh trưởng tốt trên môi trường f/2, TT3; độ mặn 25 - 30‰; hàm lượng Nitơ thích hợp cho tảo phát triển từ 9,69 – 12,69mg/l; Phốtpho từ 0,86-1,36mg/l; silíc từ 1,15-2,30mg/l Trong khi đó, theo công bố của tác giả Sontaya

Krichnavaruk et al., 2005 [81] lại cho thấy môi trường f/2 thích hợp cho C

calcitrans sinh trưởng có nồng độ Nitơ 14mg/l; Phốtpho 1,2-2,4mg/l; Silíc 3,2mg/l;

Vitamin B12 <1µg/l; cường độ chiếu sáng 400µmol/m2/s

Đối với Tetraselmis tetrathele, công bố của tác giả Jesse D Ronquillo et al.,

1997 [59] đã cho thấy sinh trưởng của tảo tốt nhất ở nhiệt độ 25-300C; pH 8-10; độ

mặn 30-50‰ Trong khi đó, Tetraselmis chuii lại có sinh trưởng tốt nhất trong môi

trường có độ mặn 30‰, nhiệt độ 300C theo công bố của Vũ Dũng (1998) [6]

1.3.2 Ứng dụng của VTB C gracilis và T chuii trong NTTS

Trong số các VTB giàu dinh dưỡng thì Chaetoceros gracilis, Tetraselmis

chuii được sử dụng làm thức ăn phổ biến cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ, ấu

trùng giáp xác [30] Theo nghiên cứu của tác giả Susana Rivero –Rodríguez et al.,

2007 [94], hai loài C grasilis, Tetraselmis chuii có thành phần sinh hóa như sau:

cacbonhydrat từ 15,6% đến 17,7%; protein từ 34,4% đến 40,9%; lipít tổng số từ 11,1% đến 16,1%, tương ứng Đặc biệt, chúng có chứa nguồn PUFAs cần thiết cho

sinh trưởng, phát triển và chức năng của ấu trùng [26], [38] VTB Chaetoceros sp

có chứa EPA chiếm đến 16,4% so với tổng số axít béo, còn Tetraselmis sp lại là

nguồn cung cấp EPA trung bình cho đối tượng nuôi với khoảng 4,8 mg/g trọng

lượng khô [90] Trong các trại NTTS, Tetraselmis sp thường được nuôi kết hợp với

Chaetoceros gracilis hoặc C calcitran hoặc C muelleri để có thể bổ sung, hỗ trợ

cung cấp nguồn PUFAs cần thiết cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản

Tuy nhiên, hàm lượng lipít và axít béo có trong sinh khối VTB nuôi trồng được lại còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường, chế độ chiếu sáng, nhiệt

độ, dinh dưỡng, pH, độ mặn…[75], [82], [86] và cả vào giai đoạn phát triển [77], [83]

Vì vậy, để có thể làm chủ được nguồn giống vi tảo làm thức ăn sống trong NTTS ở Việt Nam, cần thiết phải có được một ngân hàng giống, làm chủ được các

kỹ thuật phân lập để có được các chủng giống của Việt Nam, định tên khoa học chúng bằng các phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái, các phương pháp sinh học phân tử, hiểu biết các đặc điểm sinh học chính của chúng để cho phép nuôi trồng thu sinh khối lớn, đáp ứng được yêu cầu thực tiễn đặt ra Chính

vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của

hai loài vi tảo biển thuộc hai chi Chaetoceros và Tetraselmis” Các kết quả nghiên

cứu thu được trong đề tài này sẽ cung cấp các số liệu khoa học cơ bản cho việc sử dụng 2 loài VTB nêu trên làm thức ăn sống cho một số đối tượng nuôi trong NTTS

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài: từ 15/5/2010 đến 15/7/2011

Địa điểm: Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi đã tiến hành đi thu mẫu VTB ở vùng biển của Hải Phòng và Khánh Hoà Các mẫu VTB được thu bằng lưới vợt thực vật phù du có kích thước mắt lưới từ

20 đến 40µm

2.2.2 Hóa chất

- Các hoá chất vô cơ tinh khiết dùng để pha môi trường Erd, f/2 và Walne do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất Thành phần và cách pha các môi trường nuôi nêu trên được tham khảo trong quyển “Algal Culturing Techniques” của tác giả Andersen (2005) [24] được chỉ ra trong phần phụ lục của luận văn

- Các hóa chất sử dụng để lưu giữ bảo quản các chủng giống VTB như glycerol, DMSO, glycerol do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp, isopropanol do Trung Quốc sản xuất

- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR gồm đệm MgCl2, dNTPs, Taq DNA

polymerase, vector tách dòng pJET và kít tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Fermentas và Promega (Mỹ) cung cấp

- Các hóa chất dùng để cố định mẫu như glutaraldehyde, formol và ethanol do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp

2.2.3 Thiết bị

Thiết bị và dụng cụ đã được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Các loại lưới vợt phù du có kích thước lỗ từ 20 - 40µm; Buồng đếm Burker - Turk (Đức); Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản); Máy nén khí (Trung Quốc); Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản); Kính hiển vi điện

tử quét (SEM) JEOL JSM – 6400 (Nhật Bản) của Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Lăng; Máy chạy PCR PTC -100 (do hãng Nyxtechnik, Mỹ sản xuất) và PCR – 9700 do hãng Applied Bio system- USA sản xuất; máy đọc trình tự ABI PRISM ® 3100- Avant

Genetic Analyzer (Mỹ); Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C; Cân phân tích Shimazu AY120 (Nhật Bản); Tủ cấy vô trùng Holten laminAir HH48 (Mỹ); Tủ nuôi cấy 280C BINDER (Đức); Máy khuấy từ Kika Labortechnik (Đức); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy đo mật độ quang học UV-1601 Shimazu (Nhật Bản); Tủ sấy Cornthem (New Zealand); Máy lắc IKA KS 260 basic (Đức); Máy li tâm Eppendorf 5415 (Eppendorf, Đức); Máy ly tâm Sorvall (R) (Đức); Máy khử trùng ALP (Nhật Bản); các loại đĩa petri; ống nghiệm có đường kính khác nhau; các loại bình tam giác từ 50, 100, 250,

500, 1000 ml; các loại pipette có thể tích khác nhau; pipette paster; lam kính; lamen; kính lúp; đèn cồn; các loại panh có kích thước khác nhau; bình nhựa có thể tích 10 lít;

xô, chậu, máy nén và sục khí, đá sứ, quả sục, dây nhựa mềm, đèn nê-ông dài 0,6 và 1,2m … được sử dụng để chiếu ánh sáng cho nuôi trồng tảo và một số dụng cụ khác

2.3 Sơ đồ khối nghiên cứu

Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài được chỉ ra trên hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài VTB thuộc 2 chi

Chaetoceros và Tetraselmis

2.4.1.1 Thu thập và phân lập 2 loài VTB

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài

VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis

Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2 loài

VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis

Nuôi sinh khối 2 loài VTB thuộc 2 chi

Chaetoceros và Tetraselmis trong điều kiện

phòng thí nghiệm

Kết luận và đề xuất ý kiến

Quy trình thu thập và phân lập 2 loài VTB được chỉ ra trên hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ khối phân lập VTB

Mẫu VTB quang tự dưỡng được thu tại các vùng bờ biển Hải Phòng và Khánh Hoà bằng lưới vợt thực vật phù du có kích thước mắt lưới phù hợp (từ 20 đến 40 µm), cho vào lọ thuỷ tinh có nút đậy đã được vô trùng, giữ trong thùng lạnh (có đá khô hoặc

đá thường) để chuyển về phòng thí nghiệm và lưu giữ ở nhiệt độ 4-100C cho đến khi tiến hành phân lập mẫu

Quy trình phân lập và làm sạch các loài VTB nói trên được tiến hành tham khảo trong quyển sách “Các kỹ thuật nuôi trồng tảo” của tác giả Andersen (2005) [24] và có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam

a Phân lập bằng kỹ thuật pha loãng (đối với các loài thuộc chi Chaetoceros)

Thu VTB từ các vùng bờ biển Hải Phòng, Khánh Hoà

Lưu giữ ở nhiệt độ 4 - 10oC

Tạo giống thuần

Đưa ra phương pháp phân lập thích hợp cho từng loại tảo

Phân lập bằng kĩ thuật pha loãng dựa vào các mức độ pha loãng tối đa tại đó dung dịch chỉ chứa một tế bào (một cơ thể), một tế bào này được nuôi trong ống nghiệm hoặc trong bản nhựa 96 giếng được dùng cho nuôi cấy tế bào Nếu biết được chính xác mật độ tế bào (MĐTB) thì sẽ tính được nồng độ pha loãng

Phương pháp nêu trên áp dụng hiệu quả cho việc phân lập các vi tảo chiếm lượng lớn trong mẫu nhiễm Nếu số lượng tế bào xấp xỉ trong mẫu cần phân lập mà chúng ta không biết và không thể tính toán ngay lập tức được khoảng MĐTB thì người phân lập cần phải tiến hành pha loãng liên tục mẫu theo cấp 10-1,10-2,10-3…sau khoảng

7 đến 10 lần pha loãng liên tục tùy thuộc vào nồng độ mẫu cũng như trạng thái mẫu thì chúng ta cũng có thể thu được mẫu nuôi chỉ có 1 tế bào

Các bước thực hiện như sau:

+/ Chuẩn bị các ống chứa mẫu (Eppendorf hoặc ống penicillin) đánh số thứ tự

từ 100, 10-1, 10-2 10-10 hút 9ml môi trường nuôi tảo vào các ống trừ ống 100

+/ Hút 10ml dịch mẫu thu từ ngoài tự nhiên cần phân lập vào ống 100 sau đó hút 1ml dịch tảo này sang ống 10-1, thay đầu pipette và hút 1ml dịch tảo từ ống 10-1sang ống 10-2, lại thay đầu pipette và hút 1ml dịch tảo từ ống 10-2 sang ống 10-3, cứ tiếp tục quy trình như vậy cho đến 10-10

+/ Các ống chứa mẫu pha loãng được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu và thường xuyên kiểm tra xem tảo phát triển như thế nào

b Phân lập trên môi trường thạch (đối với các loài thuộc chi Tetraselmis)

Phương pháp này chỉ áp dụng đối với các loài VTB có khả năng tạo khuẩn lạc riêng biệt trên bề mặt thạch, tạo thành các dòng khuẩn lạc khác nhau và từ các dòng này có thể tách ra và nuôi thành các dòng tế bào thuần chủng Đây là phương pháp phổ biến, dễ tiến hành và có thể cùng lúc tạo được nhiều dòng tế bào tảo khác nhau

Chuẩn bị môi trường thạch: Bổ sung agar với nồng độ 1% vào nước biển có độ

mặn 30‰, bổ sung 1ml/lít môi trường dung dịch đa lượng và vi lượng của môi trường Walne, sau đó hỗn hợp này được khử trùng ở điều kiện 121oC trong 30 phút và 1atm Sau khi khử trùng để nguội 40 – 500C, đem đổ vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội

và đậy nắp ở điều kiện phòng 1-2 ngày mới mang ra cấy phân lập (cần loại những đĩa thạch có thể bị nhiễm trong quá trình thao tác)

Mẫu tảo được xử lý bằng hỗn hợp kháng sinh có nồng độ như sau: Ampicillin (250 mg/l), Kanamycin (100 mg/l), Streptomycin (50 mg/l), Gentamycin (50 mg/l) để

loại bỏ vi khuẩn, nấm và các động vật nguyên sinh có trong mẫu tự nhiên Các mẫu này sau đó được làm giàu bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 5 phút, 4C Loại

bỏ phần dịch phía trên và sử dụng phần cặn dưới ống ly tâm Hút 50 - 100 µl dịch tảo

từ các mẫu tảo đã được xử lý kháng sinh rồi nhỏ dung dịch hỗn hợp kháng sinh trên mặt thạch, dùng que cấy platin để cấy thành các vùng tảo có mật độ khác nhau Để các đĩa thạch dưới điều kiện chiếu ánh sáng yếu, nhiệt độ 25oC Sau 2 tuần, tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (thời gian cần thiết cho tảo mọc trên thạch thường là 2 đến 4 tuần sau khi cấy) để phát hiện các khuẩn lạc Nếu phát hiện thấy tảo đã mọc, dùng kính lúp chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành cấy chuyển sang các đĩa thạch khác nhằm tạo các dòng tế bào thuần Lặp lại quy trình này cho đến khi thu được dòng tế bào thuần

2.4.1.2 Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Các loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis sau khi phân lập sẽ được

quan sát, chụp ảnh hình thái dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản) ở

độ phóng đại 400 lần và dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning Electron Microscope) của Viện 69 thuộc Bộ Tư Lệnh Lăng Các loài VTB có khả năng chuyển động sẽ được cố định bằng ethanol 1% trước khi quan sát hình thái tế bào

Để chụp ảnh SEM, các tế bào của các loài VTB được cố định bằng các chất cố định khác nhau như ethanol 5%, formol 4% hoặc glutaraldehyde 1% Tuy nhiên, glutaraldehyde 1% cho hiệu quả cố định tế bào vi tảo cao nhất, giữ nguyên được trạng thái tế bào Các chất còn lại làm vỡ hoặc làm biến dạng hầu hết hoặc một số tế bào

Đối với các loài VTB có roi như Isochrysis sp., Chroomonas sp và Tetraselmis sp.,

nồng độ glutaraldehyde thực tế được sử dụng là 3%

Quy trình cố định mẫu trong 1% glutaradehyde: Tảo đang phát triển ở giữa pha logarit sẽ được cố định bằng cách bổ sung glutaradehyde đến nồng độ cuối cùng là 3% Sau khi cố định, để tĩnh mẫu ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, mẫu được ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch trên và hoà tan cặn tế bào trong nước biển 5‰ bảo đảm MĐTB đạt 105TB/ml Mẫu sau khi pha loãng được lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,25 µm, để khô ở nhiệt độ phòng và cố định lên đế chụp Sau khi phủ một lớp vàng mỏng nhằm tăng tính tương phản của mẫu và giúp cho việc chụp mẫu được dễ dàng hơn, các tế bào vi tảo được quan sát và chụp dưới SEM ở độ phóng đại

từ 3.500 đến 15.000 lần Các tế bào đứng riêng rẽ và có hình dạng đặc trưng cho loài nghiên cứu sẽ được chọn để chụp ảnh

2.4.1.3 Định tên khoa học hai loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và

Tetraselmis

ADN tổng số của các mẫu VTB nói trên được tách chiết theo như mô tả trong công bố của Đặng Diễm Hồng và cs., 2002 [12]

Đoạn gien 18S rRNA của 2 mẫu VTB quang tự dưỡng thuộc các chi

Chaetoceros và Tetraselmis được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số với

cặp mồi UPro18F: 5’-TAC CAC ATC TAA GGA AGG CAG CAG-3’ và U18R: 5’- GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTG C-3’); và cặp mồi Alex F: 5’-GAG AGG GAG CTT GAG AAA TG-3’ và U18R, tương ứng Sản phẩm PCR có kích thước dự kiến là

1100 bp

Phản ứng PCR được thực hiện với 20 l hỗn hợp phản ứng chứa 1 l DNA

khuôn, 2 l đệm 10X, 1,5 l 2,5 mM dNTP mỗi loại và 0,3 l Taq polymerase Chu

trình nhiệt: 940C - phút, 35 chu kỳ (94oC – 30 giây, 55oC – 1 phút, 72oC – 1 phút) và

72oC – 5 phút

Sau khi chạy điện di để kiểm tra trên gel agarose 0,8%, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít tinh sạch Centrifuge Kit, Promega (Mỹ) được đọc trình tự trên máy ABI PRISM (R) 3100 – Avant Genetic Analyzer (Mỹ) Sử dụng các chương trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000), DNASTAR và MEGA3, cây phát sinh chủng loại của các loài nghiên cứu với các loài tương ứng được công bố tại ngân hàng gien như GenBank, DDBJ, EMBL đã được xây dựng

2.4.1.4 Lưu giữ 2 loài VTB

Sơ đồ khối lưu giữ mẫu VTB được chỉ ra trên hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ khối lưu giữ VTB

a Lưu giữ giống trên môi trường lỏng

Ưu điểm của quy trình này là dễ quan sát mẫu, thuận lợi cho việc nhân nhanh sinh khối trong một thời gian ngắn, dễ tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam Tuy nhiên, còn một số hạn chế như thời gian lưu giữ mẫu ngắn (từ 3-4 tuần), tuỳ thuộc vào chu kỳ sinh trưởng của từng chủng, chiếm diện tích trên giàn nuôi

và khả năng lây nhiễm giữa các mẫu là rất lớn do phải cấy chuyển nhiều lần cũng như

là tốn sức lực của người quản lý chủng giống

+/ Các mẫu vi tảo sẽ được nuôi trên môi trường lỏng phù hợp, đến khi tế bào vi tảo ở vào pha sinh trưởng theo hàm số mũ (ở giữa pha logarit) (có OD680 đạt khoảng 0,5-0,6), khi đó sẽ tiến hành lấy mẫu và lưu giữ giống;

+/ Hút 5 ml môi trường lỏng vào từng ống nghiệm, sau đó bổ sung lượng mẫu với tỉ lệ là 70: 30 theo thể tích (v/v) Tất cả các công đoạn trên đều thao tác trong điều kiện vô trùng, tránh bị nhiễm khuẩn Các mẫu VTB quang tự dưỡng sẽ được giữ trên 3 ống nghiệm Các ống nghiệm này đều được dán nhãn ghi rõ tên, môi trường nuôi cấy

và ngày cấy chuyển;

+/ Sau đó, chúng sẽ được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ thấp (15-20C), 2-3 ngày sau khi cấy chuyển cần phải theo dõi và kiểm tra mẫu;

Tảo giống thuần chủng

Lưu giữ trong các loại môi trường khác nhau

Môi trường lỏng Ống thạch nghiêng Nhiệt độ thấp (-80oC)

Kiểm chứng: Nhân sinh khối, kiểm tra số lượng, chất lượng và sự

phát triển (tốc độ sinh trưởng – µ) của 2 loài VTB

Tìm ra được điều kiện, môi trường lưu giữ thích hợp

cho từng loài VTB

+/ Lập sổ theo dõi sau khi cấy chuyển và ghi chép lại tình trạng phát triển của mẫu, thời gian cấy chuyển, số lượng mẫu…;

+/ Tất cả chủng giống phải được giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ)

để tránh mất giống

b Lưu giữ giống trên ống thạch nghiêng

Ưu điểm của phương pháp này là thời gian lưu giữ mẫu dài hơn, ổn định hơn, tiết kiệm được thời gian, công sức và tiền bạc mà vẫn duy trì được các đặc điểm di truyền của chính các chủng giống Tuy nhiên, phương pháp này vẫn không loại trừ

được khả năng mẫu bị nhiễm vi khuẩn và nấm

+/ Đổ ống thạch nghiêng: Hút 10 ml môi trường Walne, Erd hoặc f/2 có độ mặn 30‰ (1% agar) cho vào ống nghiệm loại 20 ml, đặt ống nghiệm nghiêng 30°, giữ ổn định cho đến khi bề mặt thạch được ổn định (trong khoảng 30 -60 phút tùy thuộc mùa tiến hành thí nghiệm trong năm)

+/ Dùng que cấy platin đã được khử trùng và hơ nóng dưới ngọn lửa đèn cồn để lấy 1 khuẩn lạc đã mọc trên đĩa thạch cấy vào ống thạch nghiêng, đưa que cấy vạch theo đường zic zắc Sau đó, đậy chặt nắp ống và để ống nghiệm dưới điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ 280C Sau khi cấy khoảng 4-8 tuần, các khuẩn lạc của mẫu có thể quan sát được

c Lưu giữ, bảo quản giống ở nhiệt độ thấp

Ưu điểm của phương pháp lưu giữ giống ở nhiệt độ thấp (-80°C) có sử dụng chất bảo quản (Cryoprotectants agent – CPAs) là DMSO, glycerol…: đảm bảo là mẫu không bị nhiễm vi khuẩn, hoặc tránh khả năng có thể bị mất giống, hình dạng tế bào luôn ổn định, bảo tồn được sự đa dạng di truyền của nguồn gen, khả năng phục hồi cao

và tiết kiệm chi phí, thời gian lưu giữ giống tảo ở -80°C có thể kéo dài từ 6 tháng đến vài năm

Sơ đồ thí nghiệm bảo quản các loài VTB quang tự dưỡng ở nhiệt độ - 80°C có

sử dụng chất bảo quản là DMSO hoặc glycerol được chỉ ra trên hình 2.4 Thí nghiệm được chia thành 2 lô: lô đối chứng (ĐC) và lô thí nghiệm (TN) Ở lô ĐC: có 3 công thức là ĐC (+), ĐC (-)1 và ĐC (-) 2

ĐC (+): Mẫu nuôi ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (môi trường F/2 hoặc Walne hoặc Erd… có độ mặn 30‰, ở 30°C, chiếu ánh sáng 100 mol/m2/s, pH 7), mục đích để

xác định sinh trưởng của tảo trong điều kiện không làm lạnh, không sử dụng chất bảo quản;

ĐC (-) 1: Mẫu có bổ sung các chất bảo quản với nồng độ khác nhau, không đưa vào -80°C với mục đích để xác định ảnh hưởng của nồng độ chất bảo quản đến sinh trưởng của tảo;

ĐC (-) 2: Mẫu không bổ sung chất bảo quản, đưa vào -80°C nhằm mục đích xác định được khả năng sống sót tự nhiên của tế bào tảo

Ở lô TN: mẫu được bổ sung chất bảo quản với nồng độ tối ưu, đưa vào -80°C trong 48 giờ Mục đích để xác định khả năng sống sót của tế bào tảo khi sử dụng chất bảo quản và được lưu giữ ở âm 800C

Với các chất bảo quản nêu trên, thời gian bảo quản sau 48 giờ trong âm 800C hay 6 tháng hoặc 1-2 năm thì tảo đều có tỷ lệ sống sót (= số tế bào phục hồi/tổng số tế bào) cao, hình thái tế bào giữ nguyên, màng tế bào nguyên vẹn, tế bào không bị vón, không nhiễm khuẩn và khi đưa vào điều kiện bình thường thì dịch nuôi cấy ở dạng huyền phù không bị bám đáy

Mẫu sau khi được bổ sung chất bảo quản được đưa vào tủ -80°C trong 48 giờ theo quy trình làm lạnh (-1C/phút) có sử dụng isopropanol Sau 2 -3 tiếng, các ống giống được lấy ra khỏi dung dịch isopropanol và đặt trực tiếp vào tủ -80oC để bảo quản giống Sau 2 ngày bảo quản, mẫu được hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng và kiểm tra sinh trưởng bằng cách đếm MĐTB cứ 2 ngày/lần hoặc đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm (OD680) trong 30 ngày kể từ khi hoạt hóa trở lại

Hoạt hóa mẫu trở lại nhiệt độ phòng: Sau một thời gian bảo quản mẫu ở nhiệt

độ -800C, mẫu được lấy ra và làm tan từ từ trong bể ổn nhiệt ở 300C trong 30 phút cho tới khi dịch tế bào đồng nhất Sau đó, ly tâm dịch tế bào với tốc độ 5.000 vòng/phút,

40C trong 5 phút Loại bỏ dịch và thu cặn Do màng tế bào rất dễ bị tổn thương do có

sự chênh lệch lớn về nhiệt độ, vì vậy, mọi thao tác ở giai đoạn này cần nhẹ nhàng, tránh va đập mạnh Rửa cặn tế bào thu được bằng nước biển khử trùng có độ mặn 30‰ nhằm loại bỏ hết chất bảo quản thừa có trong mẫu Hòa tan cặn tế bào trở lại bằng môi trường f/2 có độ mặn 30‰ tương ứng với thể tích ban đầu và mẫu được nuôi trong các ống nghiệm ở điều kiện: nhiệt độ từ 24-260C, ánh sáng yếu (10-20

mol/m2/s)

Đối chứng (-) 2

Mẫu không sử dụng CPAs được đưa vào - 80C để xác định khả năng sống sót tự nhiên của mẫu

Đối chứng (-) 1

Mẫu có sử dụng CPAs ở các nồng độ khác nhau đặt

ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (không đưa vào - 80C)

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản lên khả năng sống sót của tảo được lưu giữ ở - 800C

Mẫu không sử dụng CPAs, nuôi

ở điều kiện nuôi cấy tối ưu

Lô thí nghiệm

Mẫu có sử dụng CPAs ở các nồng độ khác nhau được đưa vào - 80C trong 48 giờ

Đưa vào tủ -80C trong 48 giờ nhờ sử dụng quy trình làm lạnh (-1C/phút) có sử dụng isopropanol

Hoạt hoá mẫu trở lại ở nhiệt độ phòng Kiểm tra sinh trưởng của tảo bằng cách đo OD680 hoặc đếm MĐTB

(2 ngày/lần) trong vòng 30 ngày nuôi cấy

Sinh trưởng của mẫu tảo sau khi hoạt hóa lại ở nhiệt độ phòng được xác định thông qua đo OD680 hoặc đếm MĐTB (triệu tế bào/ml) Theo dõi sinh trưởng của tảo sau 30 ngày kể từ ngày hoạt hóa với tần suất lấy mẫu để đo các thông số nêu trên là 2 ngày/lần Tỷ lệ sống sót của mẫu được xác định theo công thức = Số lượng tế bào đếm được sau khi hoạt hóa/ Số lượng tế bào ban đầu

2.4.2 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2 loài VTB thuộc 2 chi

Chaetoceros và Tetraselmis

Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của 2 loài VTB được chỉ ra trên hình 2.5

Hình 2.5 Sơ đồ khối xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của VTB

Để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 loài VTB thuộc 2 chi

Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện

nuôi như: môi trường dinh dưỡng (Walne, f/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 2 - 70‰), nhiệt độ (15 - 400C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11) lên sinh trưởng

và phát triển của 2 loài VTB trên (với chu kỳ sáng tối là 12:12h)[47]

Nhằm mục đích xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các loài VTB phân lập được từ vùng biển của Việt Nam hiện đang được sử dụng phổ biến tại các trại

Tảo giống thuần chủng

Nuôi trong các điều kiện khác nhau

20, 30, 40, 50‰)

Cường độ chiếu sáng (60, 100,

200, 400, 600 và

800 mol/m2s)

Nhiệt độ (20, 25,

30 và 37°C)

pH (6, 6,7-7, 8

và 10)

Xác định sinh trưởng của các loài VTB thông qua các thông số như mật độ quang OD680, mật độ tế bào, trọng lượng khô, hàm lượng sắc tố (chlorophyll a và carotenoit)

và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ, /ngày)

NTTS ở các tỉnh phía Bắc nên 3 môi trường dinh dưỡng phổ biến (do hoá chất dễ tìm,

rẻ và dễ pha, không đòi hỏi kỹ thuật cao cho người chuẩn bị môi trường) đã được lựa chọn Ngoài ra, các giới hạn trên và dưới của các yếu tố môi trường khác rất gần với cả điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện các trại NTTS như về nhiệt độ, độ mặn, pH, cường độ ánh sáng và khả năng tự thích nghi dần và cao với điều kiện ngoại cảnh khi chuyển các loài tảo nêu trên từ điều kiện phòng thí nghiệm xuống nuôi trồng ở các trại cũng đã được tính đến trong việc lực chọn loài VTB Do vậy, khă năng các loài VTB quang tự dưỡng thích nghi được với biến động rộng của các yếu tố môi trường được quan tâm đầu tiên

2.4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng: Thí nghiệm được tiến hành

với 3 môi trường dinh dưỡng f/2, Erd và Walne có nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, nhiệt độ 28°C - 30°C, pH 7

2.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của

nồng độ muối được tiến hành với dải nồng độ 5, 10, 20, 30, 40, 50‰ được điều chỉnh bởi muối NaCl và nước cất 2 lần Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy như: môi trường dinh dưỡng tối ưu, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, 30°C, pH 7

2.4.2.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh

hưởng của cường độ chiếu sáng lên sinh trưởng của tảo được tiến hành với dải cường

độ 60, 100, 200, 400, 600 và 800 mol/m2/s được đo bằng thiết bị đo cường độ chiếu sáng (Lux Lighting meter, Nga) Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, 30°C, pH 7

2.4.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt

độ lên sinh trưởng của tảo được tiến hành với dải nhiệt độ 20, 25, 30 và 37°C Chế độ nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau trong thí nghiệm này được tiến hành với các tủ ấm

vi sinh (incubator) có hệ thống chiếu sáng Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s,

pH 7

2.4.2.5 Ảnh hưởng của pH: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi

trường lên sinh trưởng được tiến hành với dải pH 6, 6,7-7, 8 và 10 được điều chỉnh bởi dung dịch NaOH và HCl Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, 30°C