Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn bacillus spp từ đầm nuôi tôm tại hải phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 : Cơ cấu sản lượng và giá trị của một số nhóm loài được nuôi trồng trên thế giới ...5 Hình 2: Chọn lọc chủng vi khuẩn Bacillus spp bằng phản ứng catalase...33 Hì

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

PHẠM THỊ HIỀN HÒA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP

TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU

SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang – 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Phạm Thị Hiền Hòa

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP

TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU

SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Ký tên

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng tới thầy hướng dẫn Ts Nguyễn Hữu Dũng- Khoa NTTS - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang, đã định hướng và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành bản luận văn này

Xin cảm ơn chân thành Ban Giám Hiệu nhà trường, Pgs Ts Lại Văn Hùng - Trưởng khoa NTTS - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian tham gia khóa học

Xin chân thành cảm ơn Lãnh Đạo Viện, các cán bộ thuộc phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển, phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Hải Sản đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện luận văn Lời cảm ơn chân thành tới Ts Nguyễn Văn Nguyên đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học này

Lời cảm ơn sâu sắc tới mẹ tôi đã luôn khích lệ và động viên tinh thần tôi tham gia khóa học này Xin bày tỏ lời cảm ơn đặc biệt tới chồng và hai con gái tôi, đây là nguồn động viên và giúp đỡ lớn lao để tôi có thể hoàn thành bản luận văn Chân thành cảm ơn tới các thành viên khác trong gia đình đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Một lần nữa, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tác giả

Phạm Thị Hiền Hòa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình NTTS trên thế giới 3

1.1.1 Sản lượng NTTS 3

1.1.2 Diện tích NTTS 5

1.2 Tình hình NTTS tại Việt Nam 6

1.2.1 Sản lượng NTTS 6

1.2.2 Diện tích NTTS 7

1.3 Tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong NTTS 9

1.3.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS 9

1.3.2 Tình trạng dịch bệnh trong NTTS 10

1.4 Các bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản 11

1.4.1 Các nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản 11

1.4.2 Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp (Vibriosis) 12

1.4.2.1 Một số đặc điểm phân loại Vibrio 12

1.4.2.2 Vibriosis trên đối tượng thủy sản 13

1.4.2.3 Các biện pháp phòng trị bệnh Vibriosis trên đối tượng NTTS 14

1.5 Probiotic và các vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm probiotic 15

1.5.1 Khái niệm về probiotic 16

1.5.2 Cơ chế hoạt động của các nhóm vi sinh vật probitic 16

1.5.3 Một số nhóm vi sinh vật probiotic 18

1.5.4 Một số đặc điểm sinh học của chi Bacillus ứng dụng làm chế phẩm probiotic 19

1.5.3.1 Đặc điểm sinh học tế bào 19

1.5.3.2 Đặc tính probiotic của chi Bacillus 20

1.6 Ứng dụng của probiotic trong NTTS 20

1.6.1 Ứng dụng probiotic trong NTTS trên thế giới 20

1.6.2 Ứng dụng probiotic trong NTTS ở Việt Nam 22

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu: 26

2.2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn 26

2.2.3 Một số thuốc thử và hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa, sinh lý 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 26

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 27

2.3.3 Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và giữ giống vi khuẩn Bacillus spp 27

2.4 Xác định khả năng ức chế Vibrio spp gây bệnh 27

2.4.1 Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus .28

2.4.2 Ức chế vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus 28

2.4.3 Đồng nuôi cấy trong nước biển 28

2.5 Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh 29

2.6 Phân loại và định danh vi khuẩn 29

2.7 Phương pháp xử lý, phân tích số liệu 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phân lập và lựa chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus spp ruột tôm sú và bùn đáy đầm nuôi tôm sú tại Hải Phòng 33

3.2 Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh tôm sú Vibrio spp 34

3.2.1 Cô lập vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus 34

3.2.2 Ức chế vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus thể hiện bằng vòng tròn kháng khuẩn 37

3.2.3 Ức chế sự phát triển của vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus trong môi trường lỏng 39

3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập 41

3.4 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái vi khuẩn phân lập 44

3.5 Phân tích trình tự gen 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn phân lập 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4 1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC

RQ Risk Quote - Chỉ số tai biến

MPN Most probable number: Mật độ vi khuẩn

WSSV White Spot Syndrome Virus: Bệnh virút đốm trắng

YHV Yellow Head Virus: Bệnh virút đầu vàng

MBV Baculovirus Monodon: Bệnh virút trên tôm

HPV Hepatopancreatic Parvovirus Disease: Bệnh gan tụy

VNN viral nervous necrosis- VNN: Bệnh hoại tử thần kinh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn) 3

Bảng 2: Các nước có sản lượng NTTS cao nhất thế giới 4

Bảng 3: Diện tích ao nuôi nước ngọt và nước lợ tại một số nước trên thế giới 6

Bảng 4: Một số loài vi khuẩn được sử dụng làm probiotic 19

Bảng 5: Khả năng cô lập vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm và bùn đáy đầm nuôi tôm .37

Bảng 6: Đường kính vòng ức chế của các chủng phân lập đối với vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus 38

Bảng 7: Kết quả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio spp của các chủng vi khuẩn phân lập (theo tỷ lệ %) 40

Bảng 8: Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 : Cơ cấu sản lượng và giá trị của một số nhóm loài được nuôi trồng trên thế

giới 5

Hình 2: Chọn lọc chủng vi khuẩn Bacillus spp bằng phản ứng catalase 33

Hình 3: Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V parahaemolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C) 34

Hình 4: Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V alginolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C) .35

Hình 5: Các đĩa thạch NA nuôi cấy chung chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) với vi khuẩn V parahaemolyticus (hàng trên, đường cấy ngang), hoặc V alginolyticus (hàng dưới, đường cấy ngang) với khi mới cấy (A, D), sau 24h (B, E) và sau 48h (C,F) .35

Hình 6: Các đĩa thạch NA nuôi cấy chung chủng QKB7 phân lập từ bùn đáy đầm nuôi tôm sú (đường cấy dọc) với vi khuẩn V parahaemolyticus (hàng trên, đường cấy ngang), hoặc V alginolyticus (hàng dưới, đường cấy ngang) với khi mới cấy (A, D), sau 24h (B, E) và sau 48h (C,F) .36

Hình 7: Đĩa thạch cấy V alginolyticus (A) và V parahaemolyticus (B) có đặt các đĩa giấy đường kính 10mm thấm dung dịch vi khuẩn phân lập từ ruột tôm sú (QKR2, QKR3) và bùn đáy ao nuôi (QKB7) sau 24 giờ nuôi cấy 38

Hình 8: Số lượng khuẩn lạc V alginolyticus và V parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKR3 theo thời gian 40

Hình 9: Số lượng khuẩn lạc V alginolyticus và V parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKR2 theo thời gian 40

Hình 10: Số lượng khuẩn lạc V alginolyticus và V parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKB7 theo thời gian 40

Hình 11: Số lượng khuẩn lạc V alginolyticus và V parahaemolyticus, chủng QKR3, QKR2 và QKB7 nuôi cấy riêng (chủng đối chứng) theo thời gian .40

Hình 12 : Chu kỳ sinh trưởng của chủng vi khuẩn QKR2, QKR3 và QKB7 42

Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKR2 42

Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKR3 .42

Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKR2 .42

Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKR3 .42

Hình 17: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKR2 43

Hình 18: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKR3 43

Hình 19: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43

Hình 20: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43

Hình 21: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43

Hình 22: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR2 .44

Hình 23: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR3 .44

Hình 24: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKB7 .45

Hình 25: Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1% 47

Hình 26: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 và các loài có quan hệ họ hàng gần 48

Hình 27: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR3 và các loài có quan hệ họ hàng gần 49

Hình 28: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKB7 và các loài có quan hệ họ hàng gần 50

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam đang là một trong những nghề phát triển nhanh

và mạnh nhất Tuy nhiên, do thiếu quy hoạch đồng bộ và phát triển quá nhanh trong 5

- 6 năm gần đây, dịch bệnh đã xảy ra ở một số khu vực nuôi thủy sản tập trung hoặc nuôi công nghiệp với tần suất khá thường xuyên

Nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi Vibrio, Pseudomonas, nấm và một số vi sinh

vật khác là tác nhân gây bệnh trên cá, giáp xác, nhuyễn thể Khi động vật thủy sản bị nhiễm bệnh thường phải dùng một số loại kháng sinh như tetracycline, streptomycin, rifampicin, oxytetraxycline để điều trị Những loại kháng sinh này nếu sử dụng trong giai đoạn sản xuất giống thường làm cho ấu trùng chậm lớn, còi cọc, các giai đoạn biến thái xảy ra không đều, dẫn đến tỷ lệ sống của ấu trùng thấp Nếu sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi thương phẩm dẫn đến hiện tượng tích lũy kháng sinh trong sản phẩm sau thu hoạch làm giảm chất lượng, chi phí sản xuất tăng trong khi giá trị sản phẩm giảm Việc lạm dụng kháng sinh trong nghề nuôi hiện nay khá phổ biến nên hiện tượng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn đang là vấn đề hết sức nan giải Liệu pháp vắc-xin còn mới mẻ ở Việt Nam và cũng không có đủ loại vắc-xin để phòng chống các bệnh phổ biến trên đối tượng nuôi Vì vậy, việc sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi

Một xu hướng mới hiện nay được áp dụng nhằm ngăn ngừa dịch bệnh với nhiều đối tượng nuôi là việc sử dụng chế phẩm men vi sinh sống (probiotics) nhằm giúp động vật thủy sản có khả năng hấp thu dinh dưỡng tốt hơn đồng thời cải tạo được môi trường nuôi, từ đó động vật thủy sản sẽ có khả năng chống chịu bệnh tật và áp lực môi trường tốt hơn

Xu hướng nghiên cứu phân lập một số vi khuẩn có tiềm năng sử dụng là probiotic trong NTTS đang là một hướng nghiên cứu mới, được phát triển ở thế giới từ những năm 1990 Ở Việt Nam, mặc dù nghề NTTS đã phát triển từ khá lâu nhưng hướng nghiên cứu này còn rất mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu lựa chọn các chủng

vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm probiotic phù hợp với điều kiện thực tiễn NTTS Việt Nam Do đó, để có cơ sở phát triển các chế phẩm probiotic trong nước có giá thành hạ, phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu Việt Nam, chúng tôi lựa

chọn đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus spp từ

đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước”

Mục tiêu của đề tài là phân lập được một số chủng vi khuẩn Bacillus spp có tiềm

năng sử dụng như là vi khuẩn probiotic với mục đích là cơ sở tạo nguồn vi khuẩn để sản xuất chế phẩm probiotic trong nước

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus và lựa chọn ngẫu nhiên một số

chủng phân lập được;

- Đánh giá khả năng đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp

trên tôm là Vibrio algilyticus và V parahaemolyticus theo 3 cách: cấy

vuông góc, đĩa giấy và đồng nuôi cấy;

- Đặc điểm sinh thái của chủng vi khuẩn lựa chọn (t0C, pH và % NaCl)

- Định danh vi khuẩn lựa chọn dựa trên đặc điểm sinh hóa, sinh lý và so

sánh trình tự gen 16S rDNA

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình NTTS trên thế giới

1.1.1 Sản lượng NTTS

Tổng sản lượng khai thác và NTTS trên toàn thế giới đạt khoảng 142 triệu tấn vào năm 2008 trong đó sản lượng từ NTTS (bao gồm cả nước ngọt và nước mặn) vào khoảng 52 triệu tấn, chiếm 46% tổng sản lượng Bảng 1 cho thấy sản lượng từ NTTS liên tục tăng từ năm 2004 đến 2009 [47]

Bảng 1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn)

1950 đã tăng lên 52,5 triệu tấn vào năm 2008, đạt tổng giá trị là 98,4 tỉ đô la Mỹ [47]

Sản lượng từ NTTS chủ yếu làm nguồn cung cấp thực phẩm cho con người Trên toàn thế giới đã tăng từ 42,6% (năm 2006) lến đến 45,7% (năm 2008) sản lượng

từ NTTS làm thực phẩm Riêng Trung Quốc, lượng thực phẩm thủy hải sản trong năm

1970 chỉ chiếm 23,6% và tăng lên đến 80,2% trong năm 2008 Riêng các nước còn lại, lượng thực phẩm thủy hải sản cũng tăng từ 4,8% trong năm 1970 lên 26,7% trong năm

2008 Mặc dù nghề NTTS có thể có truyền thống lâu đời ở một số nước, nhưng nhìn chung trên toàn thế giới thì đây còn là một nghề non trẻ, mới được phát triển nhanh trong khoảng 50 năm qua [47]

NTTS chủ yếu phát triển ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, chiếm 89% về giá trị sản lượng và 79% về giá trị kinh tế Trong đó, phải kể đến Trung Quốc là quốc gia rất mạnh về NTTS, chiếm 62% tổng sản lượng toàn cầu và 52% tổng giá trị Tỷ lệ tăng trưởng trung bình về sản lượng trên toàn thế giới giữa năm 2006 và năm 2008 là 5,3% [47]

Bảng 2: Các nước có sản lượng NTTS cao nhất thế giới

Á khác chiếm 22,8%, và các nước khác còn lại ở Châu Âu, Châu Mỹ, Úc,… chiếm 10,5% Nghề NTTS nội địa tiếp tục đóng góp chính cho nghề nuôi thủy sản nói chung, với hơn 61% sản lượng và 53% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng Nuôi thủy sản nước ngọt chiếm 58% sản lượng và 48% giá trị, nuôi biển chiếm 34% sản lượng và 36% giá trị Trong khi đó, nuôi nước lợ với tỷ lệ sản lượng thấp 8% nhưng cho tỷ lệ giá trị đến 16% do nuôi chủ yếu các loài tôm có giá trị cao Cơ cấu nhóm loài nuôi cho thấy, năm

2006, cá nước ngọt cho sản lượng cao nhất là 27,8 triệu tấn, đạt giá trị 29,5 triệu USD; động vật thân mềm và rong biển cho sản lượng và giá trị tương đương nhau Trong khi

đó, giáp xác có sản lượng chỉ 4,5 triệu tấn nhưng đạt giá trị đến 17,95 triệu USD [46,47]

( Nguồn: FAO, 2009 ) (Nguồn: FAO, 2009)

Hình 1 : Cơ cấu sản lượng và giá trị của một số nhóm loài được nuôi trồng trên thế giới

Đối tượng NTTS rất phong phú Theo Pillay, đã có 465 loài thực vật thủy sinh

- rong tảo là đối tượng nuôi trồng [86] FAO đã liệt kê 107 loài cá, 21 loài giáp xác và

43 loài nhuyễn thễ được nuôi từ năm 1994 [43] Số lượng này chắc chắn được tăng lên hàng năm Tuy nhiên, tùy từng nơi với mục đích nuôi khác nhau mà đối tượng nuôi cũng khác nhau Châu Á, Trung Quốc và Nam Á nuôi chủ yếu là các loài cá chép, trong khi Đông Á nuôi chủ yếu các loài cá biển có giá trị cao Vùng Châu Mỹ la tinh

và Caribê, nuôi chủ yếu cá hồi và tôm; Vùng Bắc Mỹ nuôi chủ yếu cá hồi đại dương [45]

Một số loài thủy sản quan trọng được nuôi gồm cá hồi Đại Tây Dương, cá chẽm, cá mè hoa, cá chình Châu Âu, cá chình Nhật Bản, cá hồi vân, cá rô phi vằn, tôm càng xanh, tôm sú, tôm he chân trắng, hầu Mỹ, hầu Thái Bình Dương, rong mứt, rong

bẹ, rong sụn v.v [127]

1.1.2 Diện tích NTTS

Số liệu thống kê từ các báo cáo tổng quan các nước trên thế giới về diện tích ao nuôi nước ngọt và nước mặn tại một số nước của FAO cho biết Trung Quốc là nước có diện tích lớn nhất với 5.583.276 ha ao nuôi thủy sản nước ngọt và 676.184 ha nước lợ [44]

Bảng 3: Diện tích ao nuôi nước ngọt và nước lợ tại một số nước trên thế giới

cá có vây, giáp xác và bào ngư đồng thời nhiều nhóm loài cũng đem lại sản lượng cao như hầu, điệp, ngao, sò… NTTS từ nước lợ chiếm 7,7% về sản lượng và 13,3% về giá trị [46]

1.2 Tình hình NTTS tại Việt Nam

1.2.1 Sản lượng NTTS

Việt Nam trong thập niên 1990 và 3 năm đầu của thế kỷ 21, sản lượng thủy sản nuôi trồng có tốc độ tăng trưởng rất cao, vượt xa tốc độ tăng trưởng của khai thác Trong thập niên cuối của thế kỷ trước, Việt Nam đã trở thành một trong 10 nước có sản lượng cá nuôi lớn nhất thế giới, sau Trung Quốc, Ấn Độ, Inđônêxia, Nhật Bản, Thái Lan, Banglađesh

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản cũng phát triển rất năng động Nghề nuôi thủy sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng Theo thống kê của Bộ Thủy sản trong năm 1999 cả nước có tổng cộng trên 524.619 ha NTTS, đạt sản lượng 480.767 tấn [3] Năm 2005, cả nước có gần 1.000.000 ha nuôi thủy sản, đạt sản lượng

Tên nước Diện tích ao nuôi

nước ngọt (ha)

Diện tích ao nuôi nước lợ (ha)

1.437.356 tấn, trong đó, sản lượng nuôi thủy sản nước lợ - măn là 546.716 tấn, sản lượng nuôi nước ngọt đạt 890.650 tấn [3] Năm 2008, tổng sản lượng NTTS tại Việt Nam đạt 2.448.000 tấn, tăng 15% so với năm 2007 Sản lượng thuỷ sản nuôi trồng năm 2009 ước tính đạt 2.569,9 nghìn tấn, tăng 4,2% so với năm trước, chủ yếu do các địa phương tiếp tục chuyển đổi và mở rộng diện tích nuôi trồng theo hướng kết hợp đa canh, đa con Bên cạnh đó, mô hình nuôi thuỷ sản lồng, bè tiếp tục phát triển, đặc biệt

là nuôi lồng, bè trên biển ở các tỉnh: Kiên Giang, Quảng Nam, Ninh Thuận, Phú Yên, Hải Phòng

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong phú Tuy nhiên, chủ lực nhất vẫn là nuôi cá tra thâm canh ở vùng nước ngọt và nuôi tôm ở vùng nước lợ ven biển Đặc biệt, năm 2008, sản lượng nuôi cá tra và basa đạt trên 1.200.00 tấn và sản lượng tôm nuôi đạt 380.680 tấn, cá biển đạt 3.510 tấn, nhuyễn thể đạt 114.570 tấn, rong biển đạt 20.260 tấn, tôm nước ngọt đạt 6.400 tấn, cá nước ngọt

và một số loài khác đạt 255.272 tấn, đạt giá trị kim ngạch xuất khẩu trên 2 tỷ đô la Mỹ [126] Một số loài nuôi thủy sản quan trọng đang được nuôi rộng rãi tại một số tỉnh thành là cá nước ngọt nhập nội (cá rô phi, cá mè trắng, mè hoa, trắm cỏ, các loài cá trôi

Ấn Độ, trê phi ), cá nước ngọt bản địa (mè vinh, thát lát, bống tượng, cá rô, cá lóc, cá sặc ), cá da trơn (tra, basa), cá biển (cá chẽm, bống mú, cá kèo, cá chình, cá giò ), giáp xác (tôm sú, tôm chân trắng, tôm càng xanh, cua biển, tôm hùm ), nhuyễn thể (nghêu, sò, tu hài, ốc hương, ngọc trai, hầu ), và rong biển (rong sụn, rong câu ) Các đối tượng nuôi được phát triển trên cả nước, tùy vào từng địa phương mà phát triển nuôi nước ngọt, nước lợ hoặc nước mặn

Tính đến hết ngày 10/12/2010 tổng sản lượng giống sản xuất cá tra cả nước đạt 2,359 tỷ con, sản lượng cá thu hoạch đạt 1.140.390 tấn, xuất khẩu đạt 538,2 nghìn tấn, đạt giá trị 1,15 tỷ USD, tăng 6,6% về khối lượng và 2,4% về giá trị Nuôi tôm nước lợ đạt 469.893 tấn, trong đó tôm sú đạt 333.174 tấn, tôm chân trắng đạt 136.719 tấn [126]

1.2.2 Diện tích NTTS

NTTS là một ngành được phát triển nhanh và mạnh trong khoảng 2 thập kỷ trở lại đây cả về sản lượng và diện tích Việt Nam là một quốc gia có đường bờ biển dài 3260km với 12 đầm phá, 112 cửa sông, nhiều eo biển, vũng vịnh Tổng diện tích mặt

nước tự nhiên khoảng 1.700.000 ha trong đó bao gồm 120.000 ha là các ao nhỏ, hồ, kênh rạch; 340.000 ha là các hồ chứa lớn; 580.000 ha là các ruộng lúa có thể NTTS và 660.000 ha là các vùng triều [1] Theo thống kê có khoảng 300.000 đến 400.000 ha các

eo biển, vũng vịnh, đầm phá nằm dọc theo bờ biển có thể sử dụng NTTS nhưng chưa được quy hoạch hoàn thiện [1] Hiện nay, tổng số loài nuôi nước ngọt là 544 loài, nuôi nước lợ và mặn là 186 loài

Với tiềm năng mặt nước rất phong phú và đa dạng, các hình thức và thủy vực nuôi trên cả nước được chia thành nuôi nước ngọt (nuôi ao, nuôi lồng), nuôi ven biển (nuôi ao, đầm, lồng)

Việt Nam có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt Đến năm 2003, trên cả nước

đã sử dụng 612.778 ha nước mặn, lợ và 254.835 ha nước ngọt để nuôi thuỷ sản [126] Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465 ha Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích NTTS lớn nhất nước, tốc độ cũng tăng nhanh nhất so với các vùng miền khác trong cả nước Gần đây, mô hình nuôi cá tra ao đã đạt đến diện tích trên dưới 6.000 ha, với sản lượng xuất khẩu đạt gần 600.000 tấn trong năm 2008 (gấp

3 lần sản lượng tôm xuất khẩu) [126]

Diện tích nuôi tôm sú năm 2009 ước tính đạt 549,1 nghìn ha, giảm 10,7% so với năm trước, một số diện tích nuôi tôm sú đã chuyển đổi sang nuôi tôm thẻ chân trắng cho năng suất và thu nhập cao hơn Đến nay diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng năm nay ước tính đạt 13,5 nghìn ha, tăng 75,5% so với năm 2008; sản lượng đạt 63 nghìn tấn, gấp trên 2 lần Tính chung số lồng bè nuôi thuỷ sản năm 2009 của cả nước đạt 98,4 nghìn chiếc, tăng 12,6 nghìn chiếc (tăng 14,7%) so với năm 2008 [126]

Diện tích NTTS 6 tháng đầu năm 2010 đạt 972.5 nghìn ha, tăng 3,2% so với cùng kỳ năm trước, bao gồm 312 nghìn ha nuôi cá (3,749 ha cá tra), tăng 8% và 623.5 nghìn ha nuôi tôm, tăng 3% Đồng bằng sông Cửu Long chiếm 70% - 75% diện tích và sản lượng nuôi trồng, tập trung chủ yếu vào cá tra, basa, tôm sú và tôm thẻ chân trắng Trong đó, An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ là các tỉnh có sản lượng lớn về cá tra và Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng có thế mạnh về tôm Thống kê đến 10/12/2010, diện tích nuôi cá tra và basa đạt 5.400 ha, diện tích nuôi tôm sú đạt 613.718 ha, diện tích nuôi tôm he chân trắng 25.397 ha [126]

1.3 Tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong NTTS

1.3.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS

Bên cạnh sự bùng phát về sản lượng và diện tích nuôi, ngành NTTS trên cả nước, đặc biệt là ở những khu vực nuôi thủy sản tập trung hiện đang phải đối mặt với

sự ô nhiễm môi trường NTTS đã có những tác động đến môi trường, làm suy thoái chất lượng môi trường ở ven biển hoặc nguồn nước mặt nội địa Khi nguồn nước đã bị

ô nhiễm lại được sử dụng để NTTS dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên trầm trọng, khó xử lý Hơn nữa, do thói quen của những người dân NTTS là sử dụng thức ăn sống nhiều, nước thải ra không qua xử lý nên dễ dẫn đến ô nhiễm cả vùng nuôi, lan truyền bệnh tật cho động vật thủy sản

Tham khảo số liệu từ Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Biển - Viện Nghiên cứu Hải sản thuộc hoạt động quan trắc chất lượng môi trường một

số vùng nuôi biển trong thời gian tháng 9 - 10/2008 như sau:

Khu vực nuôi cá lồng bè Hải Phòng

Hàm lượng muối dinh dưỡng N-NO2- : 0,009 - 0,142mg/l; N-NO3- :0,050 - 0,403mg/l; N-NH4+:0,003 - 0,069mg/l; P-PO43- : 0,014 - 0,041mg/l Nước biển khu vực nuôi cá lồng tại Bến Bèo, Tùng Gấu, gần cảng Cát Bà bị ô nhiễm với chỉ số tai biến (RQ) dinh dưỡng = 0,76 ở mức nguy cơ tai biến môi trường, ô nhiễm nhất là N-

NO2- với hàm lượng vượt GHCP 1,0 - 7,1 lần; mật độ Coliform tại Bến Bèo, Tùng Gấu vượt GHCP 1,8 - 2,2 lần [12]

Khu vực nuôi ngao bãi triều ven biển Thái Bình - Nam Định

Muối dinh dưỡng N-NO2- :0,078 - 0,204mg/l, N-NO3- :0,054 - 0,505mg/l;

N-NH4+: 0,011 - 0,318mg/l; P-PO43- : 0,004 - 0,024mg/l Mật độ Coliform dao động trong khoảng 2 - 460MPN/100ml Chỉ số RQ dinh dưỡng = 1,55 khu vực bị ảnh hưởng tai biến môi trường, hàm lượng muối dinh dưỡng N-NO2- vượt GHCP 3,9 - 10,2 lần, N-NO3- tại cửa Trà Lý vượt GHCP 1,1 lần [12]

Khu nuôi cá lồng bè tại Nghi Sơn - Tĩnh Gia (Thanh Hóa)

Hàm lượng N-NO2- :0,027 - 0,028mg/l; N-NO3- :0,065 - 0,068mg/l;

N-NH4+: 0,118 - 0,137mg/l; P-PO43- : 0,014 - 0,020mg/l Hàm lượng N-NO2- vượt GHCP 1,4 lần; mật độ Coliform cao hơn GHCP 1,2 - 2,4 lần [12]

Khu vực nuôi cá lồng bè, nuôi hầu và trai ngọc Long Sơn (Bà Rịa - Vũng Tàu)

Hàm lượng N-NO2- :0,015 - 0,019mg/l; N-NO3- :0,049 - 0,062mg/l;

N-NH4+: 0,094 - 0,209mg/l; P-PO43- : 0,041- 0,130mg/l Mật độ Coliform cao 1.014 - 1.280MPN/100ml Hàm lượng ôxy hoà tan trong nước thấp (DO thấp hơn 5,0 mg/l tại tầng đáy), chỉ số RQ N-NO2- = 0,86: ở mức nguy cơ tai biến môi trường [12]

Khu vực nuôi nghêu Tân Thành - Gò Công Đông - Tiền Giang

Hàm lượng N-NO2- :0,025 - 0,039mg/l; N-NO3- :0,085 - 0,116mg/l; P-PO43- : 0,041 - 0,108mg/l Mật độ Coliform 93 - 1.100MPN/100ml RQ dinh dưỡng = 0,77: môi trường nước ở mức nguy cơ tai biến môi trường, hàm lượng N-NO2- cao vượt GHCP 1,3 - 2,0 lần, khu vực Cửa Tiểu có hàm lượng P-PO43- cao hơn GHCP 1,1 lần [12]

Như vậy, có thể thấy được tại một số vùng nuôi hải sản tập trung đã xảy ra tình trạng ô nhiễm môi trường, trong đó chủ yếu là phì dưỡng, ô nhiễm dầu mỡ và ô nhiễm

vi sinh vật Khi chất lượng nước NTTS bị ô nhiễm sẽ là tiền đề cho các mầm bệnh phát triển, dẫn đễn khả năng bùng phát dịch bệnh là rất cao [12]

1.3.2 Tình trạng dịch bệnh trong NTTS

Bệnh là mọi sự thay đổi bất thường về cấu trúc, chức năng của cơ thể Bệnh chuyển thành dịch khi có trên 30% số cá thể trong quần thể bị mắc bệnh truyền nhiễm Tác nhân gây bệnh có thể do yếu tố nội sinh (bẩm sinh, di truyền, tuổi tác), ; do ngoại sinh (vô sinh như dinh dưỡng, độc tố và hữu sinh như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm, địch hại ) [9] Dịch bệnh xuất hiện khi môi trường thuận lợi cho tác nhân gây bệnh phát triển, bất lợi cho đối tượng nuôi, khi đối tượng nuôi có sức đề kháng yếu, khi có tác nhân gây bệnh xâm nhập vào môi trường nuôi với số lượng đủ lớn và độc tính đủ mạnh để tác động đến vật chủ [9]

Những năm gần đây, dịch bệnh đã phát sinh trên diện rộng ở các loại cá, tôm nuôi với diễn biến rất phức tạp gây nhiều thiệt hại đối với người NTTS Dịch bệnh xảy

ra tất cả loại hình nuôi nước ngọt, mặn và lợ và trên nhiều đối tượng như cá tra, cá basa, nhuyễn thể (ngao, tu hài, ốc hương…), cá biển (cá song, cá chẽm, cá bớp…) và tôm các loại (tôm sú, tôm he chân trắng, tôm hùm…) Không chỉ các động vật nuôi trong ao, đầm, lồng bè bị bệnh mà ngay cả từ con giống cũng có nguy cơ bị bệnh

Theo báo cáo thực hiện kế hoạch năm 2008 của Trung Tâm Tin học và Thống

kê thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn cho thấy tình hình dịch bệnh xảy ra trên một số đối tượng nuôi chính trên cả nước như sau:

- Đối với tôm sú : Tôm sú được nuôi nhiều nhất ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu,

Sóc Trăng, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, với các hình thức nuôi thâm canh, bán thâm canh và quảng canh cải tiến Theo số liệu báo cáo đến nay diện tích tôm sú bị bệnh là 75.253 ha, chiếm 21% tổng diện tích nuôi [20]

- Đối với tôm chân trắng : Diện tích nuôi tôm chân trắng chủ yếu được chuyển

từ diện tích nuôi tôm sú kém hiệu quả sang, tập trung ở các tỉnh Phú Yên, Quảng Ngãi, Quảng Ninh Diện tích tôm chân trắng bị bệnh khoảng 470 ha, chiếm 3,7% Tôm chân trắng còn có nguy cơ nhiễm bệnh nguy hiểm là hội chứng Taura Một số địa phương như Nam Định, Nghệ An đã phát hiện bệnh Taura ở tôm chân trắng (xuất hiện trên 28,4 ha tôm chân trắng của các huyện Nghĩa Hưng - Nam Định, làm chết 100%) [20]

- Đối với tôm hùm : Vẫn còn hiện tượng tôm bị bệnh sữa xảy ra rải rác ở Cam

Ranh, Vạn Ninh, Ninh Hoà, Nha Trang (Khánh Hoà), Bình Thuận, Phú Yên, nhưng số lượng tôm hao hụt không đáng kể [20]

- Đối với cá tra : bệnh chỉ xảy ra rải rác, xuất hiện nhiều nhất vào đầu mùa

nước đổ (cuối tháng 6) Các bệnh như bệnh đốm trắng ở gan, thận; bệnh trắng gan, trắng mang; bệnh xuất huyết, lở loét, đốm đỏ, thường xuất hiện ở giai đoạn cá nhỏ dưới 200 g/con, cá có trọng lượng trên 200 g/con có tỷ lệ nhiễm bệnh thấp [20]

1.4 Các bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản

1.4.1 Các nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản

Bệnh trên đối tượng thủy sản được phân ra thành những nhóm sau: bệnh truyền nhiễm (tác nhân gây bệnh là virus, vi khuẩn, nấm…); bệnh ký sinh trùng (protozoa, giun sán, giáp xác…), bệnh do yếu tố vô sinh (dinh dưỡng, môi trường, di truyền) [9]

Nhóm virus: nhóm sinh vật có kích thước rất nhỏ, cấu tạo tế bào đơn giản,

không có khả năng sinh sản trong môi trường tổng hợp nhưng khi tấn công được vào

tế bào vật chủ thì mức độ phân bào rất nhanh và phát tác rất mạnh, vì vậy dễ dàng tạo thành dịch bệnh lớn và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế Hầu hết chưa tìm được thuốc trị bệnh do virus gây ra, chủ yếu áp dụng các biện pháp phòng trị bệnh chung để hạn chế dịch bệnh [9]

Nhóm vi khuẩn: thường xuyên có mặt trong môi trường Bệnh xuất hiện khi

kèm theo các yếu tố bất lợi khác như môi trường nhiễm bẩn, ấu trùng đã bị bệnh khác như nấm, ký sinh trùng… Bệnh có thể gây chết hoặc làm cho ấu trùng chậm lớn, mức

độ thiệt hại tùy theo cường độ nhiễm Có thể chữa khỏi bằng các loại thuốc, hóa chất Phần lớn hiệu quả điều trị không cao nhưng chi phí lớn [9]

Nấm: rất phổ biến trong sản xuất giống thủy sản, đặc biệt khi chất lượng nước

xấu, ô nhiễm hữu cơ Mặc dù không gây dịch lớn, không gây chết hàng loạt nhưng việc chữa trị dứt điểm rất khó và gây chết rải rác, tỉ lệ sống của ấu trùng rất thấp, ấu trùng chậm lớn [9]

Nhóm ký sinh trùng: rất phổ biến trong sản xuất giống thủy sản, có thể gây chết

hàng loạt hoặc rải rác, ấu trùng chậm lớn Mức độ gây thiệt hại về kinh tế không cao, thường xử lý bằng các loại hóa chất chuyên trị nhưng khó dứt điểm, dễ tái phát [9]

Nhóm Riketsia và Clamydia: là nhóm trung gian giữa virus và vi khuẩn, hiện

nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về nhóm này Tuy nhiên, bước đầu nghiên cứu cho thấy nhóm này cũng gây bệnh trên giáp xác và cá ở tất cả các giai đoạn [9]

Nhóm yếu tố vô sinh cũng có thể gây bệnh ở các giai đoạn phát triển của vật

nuôi thủy sản bao gồm giai đoạn giống và thương phẩm [9]

Tùy theo từng nhóm loài (tôm, cá nước ngọt, cá biển, cua…) và môi trường nuôi (nước mặn, nước ngọt, nước lợ) mà có những loại bệnh thường gặp Ví dụ như đối với cá tra, cá basa nuôi ở vùng đồng bằng sông Mê Kông thì bệnh phổ biến và gây

nguy hiểm là bệnh gan thận mủ do nhóm vi khuẩn Edwardsiella spp gây ra, bệnh

virus đốm trắng (WSBV), virus đầu vàng (YHV), bệnh MBV, bệnh gan tụy (HPV) là những bệnh thường hay xảy ra trên tôm he, bệnh xuất huyết do virus xảy ra trên cá

chép, hoại tử thần kinh (VNN) ở cá; bệnh vibriosis do nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây

ra trên nhiều đối tượng nuôi thủy sản, hội chứng lở loét ở cá, bệnh đục cơ của tôm càng xanh… [9]

1.4.2 Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp (Vibriosis)

Vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh do các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio

gây ra ở các loài động vật thủy sản

1.4.2.1 Một số đặc điểm phân loại Vibrio

Vi khuẩn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường nước biển, vùng nước

lợ ven biển, phân bố ở các tầng nước khác nhau, có thể tìm thấy ngay cả trong trầm

tích đáy hoặc trên bề mặt của các sinh vật sống trong vùng nước đó Theo nghiên cứu

của Đỗ Thị Hòa, ở Việt Nam cho thấy vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến trong nước

biển, mật độ đặc biệt tăng cao vào những ngày có bão, gió mùa hoặc áp thấp nhiệt đới

[8] Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceace, tế bào có dạng hình que hoặc hình dấu

phảy, kích thước tế bào 0,3-0,5x 1,4-2,6µm, bắt màu gram (-), đa phần có phản ứng Oxidase (+), có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với Vibriostat (0/129) Hầu hết các loài của giống

Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20 - 400/00, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 700/00 Vibrio spp có thể mọc tốt trên môi trường chọn lọc

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar) Dựa vào màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chọn lọc TCBS có thể chia thành 2 nhóm: nhóm có khuẩn lạc màu vàng, có khả năng lên men đường sucrose và nhóm có khuẩn lạc màu xanh lá cây, không có khả năng lên men đường sucrose [9]

1.4.2.2 Vibriosis trên đối tượng thủy sản

Vi khuẩn Vibrio spp có thể cảm nhiễm và gây nhiều bệnh khác nhau ở động vật

thủy sản nước mặn, đặc biệt là cá biển và giáp xác (tôm, cua) Theo nghiên cứu của

Austin, đã ghi nhận được 8 loài Vibrio là tác nhân gây bệnh cho cá biển, bao gồm V alginolyticus, V anguillarum, V carchariae, V cholerae, V damsela, V ordalii, V salmonicida và V vulnificus [24] Những loài vi khuẩn này chủ yếu gây bệnh nhiễm

trùng máu biểu hiện bằng các vết lở loét trên da và tổn thương nội quan Tác nhân gây

bệnh Vibriosis thường gặp là V parahaemolyticus, V harveyi, V vulnificus, V splendidus, V alginolyticus, V anguilarum, V damsela và V cholerae [9, 38, 72, 74]

Bệnh Vibriosis bao gồm một số bệnh sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, cua:

tác nhân gây bệnh là V harveyi, V vulnificus, và V parahaemolyticus, [9]; bệnh hoại

tử cục bộ ở giáp xác (còn được gọi là bệnh vỏ, bệnh đốm nâu, đốm đen…) do vi khuẩn

V alginolyticus, V parahaemolyticus và V ordalii gây ra [9]; bệnh xuất huyết lở loét

ở cá biển do vi khuẩn V anguilarum, V alginolyticus, V parahaemolyticus, V damsela, V ordalii … [24]

Ngoài ra, Vibrio spp có thể tham gia vào các bệnh khác như gây bệnh đường

ruột, gây bệnh hoại tử gan ở giáp xác [9]

Vi khuẩn Vibrio phân bố rộng rãi trong môi trường nước mặn, lợ Đại đa số các loài Vibrio gây bệnh cho động vật thủy sản là các tác nhân gây bệnh cơ hội Trong

điều kiện bình thường, chúng tồn tại trong môi trường nuôi thủy sản nhưng không gây bệnh cho vật nuôi Khi điều kiện sống có những thay đổi bất lợi như các yếu tố về khí hậu, môi trường, dinh dưỡng… hoặc do mắc các bệnh khác gây trạng thái “stress”, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, lúc đó vi khuẩn này sẽ vượt qua đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ và gây bệnh Theo Pitogo, bệnh vi khuẩn ở tôm nuôi luôn luôn xuất hiện cùng với những quá trình bệnh lý khác hoặc phản ánh hậu quả của việc phá vỡ cân bằng sinh thái trong bể hoặc ao nuôi [87] Nghiên cứu của Chanratchakool cho

thấy, tôm nuôi trước khi cảm nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio đã có sự thay đổi từ màu sắc

tự nhiên sang màu đỏ, điều đó chứng tỏ là tôm nuôi bị “stress” Sự suy giảm môi trường từ ao nuôi tôm đóng một vai trò quan trọng trong việc gây “stress” của tôm dẫn đến sự cảm nhiễm thứ phát của vi khuẩn Vibrio [37]

Vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào các hệ thống NTTS theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống như artemia và có thể là đã phân bố sẵn trên thành bể hoặc dưới đáy ao [9]

1.4.2.3 Các biện pháp phòng trị bệnh Vibriosis trên đối tượng NTTS

Để phòng và trị bệnh Vibriosis, người ta thường sử dụng phối hợp kháng sinh

và hóa chất tùy theo giai đoạn phát triển của đối tượng nuôi Có thể sử dụng hóa chất

diệt khuẩn như chlorine hoặc formandehyde Đỗ Thị Hòa et al., đã đưa ra một số

phương pháp phòng bệnh như sau [9]:

+ Cần khử trùng dụng cụ, bể nuôi, ao và các vật dụng trước khi sản xuất hoặc nuôi

+ Nguồn nước sử dụng trong sản xuất giống cần phải được khử trùng để tiêu

diệt các tác nhân gây bệnh trong đó có Vibrio

+ Sử dụng các biện pháp cơ học để loại bỏ các chất hữu cơ lắng đáy, giảm thức

ăn dư thừa, thay nước, hạn chế hoặc không dùng thức ăn tươi sống khi nuôi thâm canh

+ Có thể dùng các chế phẩm sinh học (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm thiểu lượng chất thải hữu cơ trong ao nuôi, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh, tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi

+ Có thể làm tăng hệ miễn dịch tự nhiên của đối tượng nuôi bằng cách bổ sung vitamin C, A, E và β glucan, hạn chế dùng hóa dược trong NTTS

Khi đã bị nhiễm bệnh Vibriosis, đối tượng nuôi cần được trị bệnh bằng kháng sinh (nhóm được phép sử dụng theo danh mục) theo 2 hướng [9]:

+ Diệt vi khuẩn cảm nhiễm bên trong cơ thể bằng cách trộn kháng sinh vào thức ăn như một số kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid như: Sulfamethoxine, bactrim, cotrim trong vòng 5 - 7 ngày, thuốc được trộn vào thức ăn với liều lượng 15 - 20g/kg thức ăn; Oxonilic acid 25%: 2- 5g/kg thức ăn trong 5 - 7 ngày

+ Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường nuôi bằng một số biện pháp kỹ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng thuốc diệt khuẩn như Benzalkonium chloride (BKC), Iodine … sau đó thay một phần nước trong ao

Tuy nhiên, ở giai đoạn tiền và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi với thuốc là rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn do vậy dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả

1.5 Probiotic và các vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm probiotic

Sự phát triển về quy mô và đa dạng loài trong NTTS đã đem lại sự tăng trưởng vượt bậc về sản lượng nuôi trồng trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Sản lượng nuôi tăng cao là do thay đổi phương thức nuôi, chủ yếu nuôi theo hình thức thâm canh hoặc công nghiệp Mật độ vật nuôi tăng cao trong mô hình nuôi thâm canh/công nghiệp sẽ dẫn đến môi trường bị ô nhiễm và chất lượng môi trường trở nên khó kiểm soát, vật nuôi dễ bị rơi vào trạng thái “stress”, các vấn đề liên quan đến bệnh

và sự suy giảm chất lượng môi trường thường xuyên xảy ra Để phòng trừ, chữa bệnh, các loại thuốc và hóa dược được đưa vào sử dụng Thuốc và hóa dược sử dụng không đúng liều lượng và phác đồ điều trị, tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh ngày càng phổ biến nên hiện tượng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn đang là vấn đề hết sức nan giải Bên cạnh đó, kháng sinh còn tồn tại trong cơ thể tạo thành dư lượng thuốc kháng sinh, làm chất lượng giống kém, tốc độ tăng trưởng của cua giống thấp dẫn đến việc nuôi cua thương phẩm có hiệu quả kinh tế thấp Vì vậy, việc sản xuất giống, nuôi thương phẩm các loài thủy hải sản có chất lượng, nâng cao tỷ lệ sống đang gặp nhiều khó khăn

Yasuda và Taga chỉ ra rằng vi khuẩn không chỉ hữu hiệu cho thực phẩm mà còn

là chất ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cá và là chất hoạt hóa quá trình tái tạo dinh dưỡng [125] Xu hướng mới hiện nay được áp dụng với nhiều đối tượng nuôi biển là

sử dụng chế phẩm probiotic gồm các nhóm vi khuẩn có ích, giúp hạn chế khả năng bị

vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm và cải thiện chất lượng môi trường nước [25, 56, 65]

1.5.1 Khái niệm về probiotic

Từ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ pro có nghĩa là dành

cho và biosis có nghĩa là sự sống Probiotic đã được Fuller định nghĩa như sau: Probiotic là một sản phẩm từ nuôi cấy hoặc dạng thức ăn có bổ sung vi sinh vật sống nhằm đem lại lợi ích cho vật chủ bằng cách cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột [52] Năm 2001, chuyên gia của FAO và WHO đã định nghĩa về probiotics “là những cơ thể

vi sinh vật sống, khi được đưa vào cơ thể vật chủ với một lượng nhất định chúng sẽ đem lại lợi ích về sức khoẻ cho vật chủ” [48]

1.5.2 Cơ chế hoạt động của các nhóm vi sinh vật probitic

Chế phẩm men vi sinh sống (vi khuẩn có lợi) được sử dụng khá nhiều hiện nay trong lĩnh vực NTTS vì có thể kiểm soát được mầm bệnh thông qua sự đa dạng về cơ chế chuyển hóa, được coi như là một lựa chọn thay thế cho việc sử dụng thuốc kháng sinh [25]

a) Tiết ra các hợp chất ức chế

Những quần thể sinh vật có thể tiết ra những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm vi khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi khuẩn khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường [50, 73, 90] Sự hiện diện những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết ra trong ruột của vật chủ hoặc trên bề mặt

tế bào vi khuẩn hay trong môi trường nuôi cấy đều được coi là rào cản ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh (tác nhân cơ hội) [119]

Cơ chế vi khuẩn kháng lại những vi khuẩn gây bệnh là do những yếu tố sau, có thể là một yếu tố hoặc là sự kết hợp nhiều yếu tố: vi khuẩn sinh ra chất kháng sinh [123], chất diệt khuẩn [34, 90, 116], siderophores, lysozyme, protease, H2O2, acid hữu

cơ [110], hình thành nên ammonia và diacetyl [116]

b) Cạnh tranh dinh dưỡng hoặc năng lượng dự trữ

Khu hệ vi sinh vật trong môi trường NTTS chủ yếu chiếm ưu thế là nhóm vi khuẩn dị dưỡng cạnh tranh các cơ chất hữu cơ ví dụ như nguồn cacbon và nguồn cung

cấp năng lượng Rico-Mora et al., đã chọn lọc một chủng vi khuẩn có thể sinh trưởng

trong điều kiện môi trường nghèo chất hữu cơ và nuôi cấy trong môi trường nuôi tảo

silic có mặt của chủng vi khuẩn V alginolyticus [98] Kết quả cho thấy vi khuẩn Vibrio này không phát triển và thử nghiệm in-vitro không thấy có sự ức chế vì

chủng vi khuẩn này có thể sử dụng chất tiết ra từ dịch tảo silic làm nguồn dinh dưỡng

[98] Do đó, chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh cô lập Vibrio trong điều kiện

nghèo hữu cơ Do vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và dinh dưỡng

Ngoài ra, còn có thể xảy ra sự cạnh tranh về sắt giữa các vi sinh vật Siderophores là những những chất có ion sắt có dạng kết cấu đặc biệt với trọng lượng phân tử thấp, có thể hòa tan, dễ dàng cho vi sinh vật hấp thụ Hầu hết các loài vi sinh vật đều cần sắt để phát triển [94] Theo nghiên cứu của Gatesoupe, những nhóm vi khuẩn vô hại có thể tiết ra sidephores có thể sử dụng như là probiotic để cạnh tranh với những nhóm vi khuẩn gây bệnh không thể tự sản sinh ra sắt mà phải phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy [57]

c) Cạnh tranh các điểm bám dính

Một cơ chế khác có thể có ở nhóm probiotic là ngăn chặn sự hình thành cụm khuẩn lạc của vi sinh vật gây bệnh bằng việc cạnh tranh các điểm bám dính trên thành ruột hoặc trên bề mặt các mô khác trong cơ thể vật chủ Khả năng bám dính được vào lớp màng nhầy và vào thành ruột của là rất cần thiết để vi khuẩn tạo thành quần thể trong ruột của cá [84, 85, 121] Sự bám dính vi khuẩn vào bề mặt mô là rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu bị xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh [71], sự cạnh tranh bề các thụ thể bám dính với các mầm bệnh có thể là những tác dụng đầu tiên của nhóm probiotic [79] Khả năng bám dính và phát triển bên trên hoặc bên trong ruột hoặc màng nhày bên ngoài đã được một số nghiên cứu chứng minh trong các thí nghiệm in vitro cho vi khuẩn gây bệnh

trên cá là Vibrio anguillarum và Aeromonas hydrophila với chủng probiotic Carnobacterium K1 [54, 67]

d) Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Các chất kích ứng miễn dịch là các hợp chất hóa học có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của động vật và đáp ứng miễn dịch để có khả năng chống chịu với sự xâm nhiễm của virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng [93] Quan sát một số thí nghiệm trên các động vật máu nóng đã cho thấy nhóm probiotic - vi khuẩn lactic acid nếu được bổ sung theo đường thức ăn có thể làm tăng khả năng chống lại sự xâm nhiễm vào bên trong

cơ thể [64] Mặc dù hiệu quả này chưa rõ ràng [119] nhưng một số ghi nhận ban đầu đã cho thấy hợp chất vi khuẩn probiotic có thể hoạt động như là một chất kích ứng miễn dịch trong hệ miễn dịch của tôm, cá [101]

e) Cải thiện chất lượng nước

Trong một số nghiên cứu đã ghi nhận được sự cải thiện chất lượng nước khi sử

dụng chủng vi sinh probiotic Bacillus spp Nhóm vi khuẩn Gram (+) Bacillus spp có khả

năng chuyển hóa những chất hữu cơ thành CO2 hiệu quả hơn nhóm vi khuẩn Gram (-) vì nhóm này thường chuyển hóa các bon hữu cơ thành sinh khối hoặc dịch nhớt [107]

Verschuere et al tổng hợp tài liệu cho rằng các nghiên cứu về việc cải thiện chất lượng

nước của vi khuẩn probiotic còn ít, chỉ ghi nhận được quá trình chuyển hóa nitrit (NO2-) thành nitrat (NO3-) [119]

f) Tương tác với thực vật thủy sinh

Một số báo cáo gần đây đã ghi nhận nhiều chủng vi khuẩn có chất diệt tảo có tác dụng trên một số loài vi tảo, đặc biệt là nhóm loài gây thủy triều đỏ [51, 98, 112] Tuy nhiên, cơ chế tương tác này cũng vẫn chưa rõ ràng

1.5.3 Một số nhóm vi sinh vật probiotic

Nhóm probiotic được sử dụng phổ biến cho người và động vật trên cạn chủ yếu

tập trung vào nhóm vi khuẩn acid lactic mà đại diện của chúng là chi Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus và Streptococcus [52, 105] Do đó, một khái niệm thông

thường nhất về probitic là sử dụng nhóm vi khuẩn acid lactic có lợi thích hợp với việc sinh trưởng và phát triển trong đường tiêu hóa vì khả năng chịu đựng được môi trường axit và các muối mật [52, 105] Những nhóm vi khuẩn này có thể được tìm thấy trong các sản phẩm sữa lên men bao gồm sữa chua, váng sữa dùng cho người [99, 104], sản phẩm bổ sung thực phẩm cho chăn nuôi gia cầm [53], gia súc [68] Nhóm probiotic được dùng cho NTTS bao gồm cả nhóm vi khuẩn Gram (-), Gram (+), nấm men và vi tảo

Bảng 4: Một số loài vi khuẩn được sử dụng làm probiotic

(Nguồn: Irianto và Austin, 2002)

probiotic

Vi khuẩn Gram (+)

Cá tuyết (Gadus morhua) Cho ăn

vân

1.5.4 Một số đặc điểm sinh học của chi Bacillus ứng dụng làm chế phẩm probiotic

Nhiều loài trong chi Bacillus được coi là thích hợp để làm probiotic, không chỉ

trong thực phẩm dành cho người mà trong cả các chế phẩm dùng cho chăn nuôi,

NTTS Probiotic gồm các chủng Bacillus spp cũng có những hiệu quả rất tích cực do

chi vi khuẩn này có một số đặc điểm và đặc tính rất phù hợp để phát triển thành probiotic dưới dạng chế phẩm

1.5.3.1 Đặc điểm sinh học tế bào

Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong đất, nước và không khí do chúng có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu khí Chi Bacillus là vi khuẩn Gram (+), tế

bào hình que và thẳng, kích thước tế bào từ 0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 µm, di động bằng chu mao [58] Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc Các tế bào thường có hoạt tính catalase (+) Do có khả năng hình

thành nội bào tử nên Bacillus có khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô hạn, chịu mặn, chịu chất khử và các phân tử có hại khác [58] Chi Bacillus rất đa dạng về sinh lý

và sinh thái Một số chủng là hiếu khí bắt buộc nhưng một số khác lại là kỵ khí không bắt buộc Các chủng của một số loài sinh trưởng tốt trong môi trường chứa glucose, amonsulphat và một vài muối khoáng khác nhưng các chủng khác lại cần nhân tố sinh trưởng Đa số các chủng sinh trưởng tốt ở pH = 7 [58]

1.5.3.2 Đặc tính probiotic của chi Bacillus

Nghiên cứu của Rengpipat et al., cho rằng chủng Bacillus sp (chủng S11) có

khả năng kháng bệnh cho tôm sú do có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch dịch thể và

miễn dịch tế bào tôm sú [96] Một số tác giả nhận thấy Bacillus có khả năng cô lập vi khuẩn gây bệnh như Vibrio sp.[61] Bacillus là nhóm vi khuẩn có khả năng sinh bào

tử, có cấu trúc cơ thể đặc biệt nên vẫn có thể sinh trưởng và phát triển trong môi trường rất khắc nghiệt về yếu tố vật lý và hóa học, có vòng đời dài [63] Bên cạnh đó,

Bacillus thường tiết ra nhiều enzyme ngoại bào thuộc 8 nhóm: carbonhydrase,

protease, penixilinase, nuclease, các enzyme phân hủy vi khuẩn, lipase, phospholipase, titaminase với tổng số là 42 loại enzyme khác nhau [58]

Mỗi tế bào Bacillus chỉ sinh ra một bào tử trong điều kiện khắc nghiệt về dinh

dưỡng và điều kiện sống Bào tử có cấu tạo gồm nhiều lớp: lớp ngoài cùng, lớp áo bào

tử, vỏ bào tử và lớp lõi Mỗi lớp có cấu tạo và vai trò khác nhau, giúp bào tử có thể thích nghi với môi trường sống để đảm bảo sự sống sót Mỗi tế bào chỉ có thể sinh ra một bào tử [58]

1.6 Ứng dụng của probiotic trong NTTS

1.6.1 Ứng dụng probiotic trong NTTS trên thế giới

Blancheton bổ sung các chất hữu cơ giàu nitơ vào nguồn nước để làm giầu vi khuẩn nitrit hóa và thực vật phù du, tạo thành những bông tụ là nguồn thức ăn bổ sung

cho ấu trùng tôm [30] Đây cũng là tiền đề cho các nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn probiotic

Theo Nair et al., vi khuẩn lactic acid và một số nhóm vi khuẩn khác có khả năng tiết ra chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus [82]

Theo nghiên cứu của Foster, đã bổ sung vi khuẩn probiotic Bacillus subtilis, các

enzym được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy đầm [49]

Maeda và Liao sử dụng vi khuẩn phân lập từ đất PM-4 cho vào môi trường

ương, nhận thấy có ảnh hưởng tốt đối với tỷ lệ sống của ấu trùng tôm Penaeus monodon, do chúng có thể ức chế mầm bệnh [77]

Dòng PM-4 được cấy hàng ngày trong 7 ngày liền vào vào bể ương ghẹ 200

m3 (Portunus trituberculatus), kết quả mật độ Vibrio tỷ lệ nghịch với mật độ PM-4 Tỷ lệ

sống trung bình của 7 lần thử nghiệm với PM-4 là 27,2%, tỷ lệ sống của 6 trên 9 lần thử nghiệm không có PM-4 là 6,8% [78, 83]

Qiao Zhenguo et al., nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) dùng cải thiện chất lượng môi trường nước

[91]

Năm 1995, Garriques và Arevalo đã tóm lược quy trình sản xuất và sử dụng

những vi khuẩn probiotic Vibrio alginolyticus để điều khiển hệ vi khuẩn trong việc sản xuất giống tôm Penaeus vannamei ở Ecuador Chủng vi khuẩn giúp làm tăng tốc độ

sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng tôm một cách đặc biệt, do sự cạnh tranh với những vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng Vì vậy đã giảm nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh

và những chất hóa học phòng trị bệnh [55]

Những kết quả tương tự về tác dụng của Bacillus subtilis C- 3102 (FERM

BP-1096) cũng đã chứng minh về việc tăng cân và tăng hiệu quả nuôi trồng cá, gia cầm, gia súc [124] Theo nghiên cứu của Logan và Bartlett việc bổ sung một số lượng nhất

định các chủng vi khuẩn Bacillus lentimorbus, Bacillus stearothermophilus vào hồ

nuôi thủy sản tập trung có tác dụng làm tăng sản lượng cá đến 25% [76]

Garriques và Arevalo (1995) đưa dòng Vibrio alginolyticusvào bể ương ấu

trùng tôm (Litopenaeus vannamei) mỗi ngày Tỷ lệ sống trung bình và trọng lượng

thân cao nhất trong bể có thêm vi khuẩn hữu ích so với bể xử lý bằng kháng sinh

oxytetracyline và đối chứng Số bể có bổ sung vi khuẩn Vibrio alginolyticus , không

thấy xuất hiện vi khuẩn gây bệnh V parahaemolyticus , trong khi các nghiệm thức còn lại có khoảng 10% mẫu có mặt vi khuẩn này [55]

Griffith cho rằng nhờ đưa men vi sinh vào trong bể ương tôm giống ở Ecuador nên các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh các bể nuôi, sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% [60]

Năm 1996, Boyd đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm

các chủng Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và Rhodopseudomonas Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,

và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa tan, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản [33]

Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các men sinh trong nuôi tôm, đặc

biệt ở Thái Lan Jiravanichpaisal et al., đã sử dụng Lactobacillus sp trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) [66] Rengpipat và Rukpratanporn cho rằng Bacillus S11 là vi khuẩn hữu ích có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho ấu trùng

tôm sú ăn [96] Kết quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỉ lệ sống 100%

khi gây cảm nhiễm với V harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 26% [96]

Sử dụng Bacillus trong nuôi tôm thịt ở Indonesia sẽ an toàn trong 160 ngày, các trại không sử dụng Bacillus hầu như gặp thất bại, bệnh vi khuẩn phát sáng

do Vibrio thường làm tôm chết trước 80 ngày [80]

Dòng BY-9 được cấy với mật độ 106 CFU/ml vào bể ương ấu trùng tôm sú làm giảm mật độ Vibrio và cho tỷ lệ sống cao hơn đối chứng [109]

Nghiên cứu của Wang Xiang- Hong et al., cũng cho biết một số vi khuẩn hữu ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo Tác giả còn cho biết thêm những vi khuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu cơ có hại Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi [120]

1.6.2 Ứng dụng probiotic trong NTTS ở Việt Nam

Ở nước ta nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu của công nghệ sinh học trong thuỷ sản vẫn còn rất mới mẻ, mặc dù đã có rải rác những ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất đại trà một số đối tượng như cá rô phi đơn tính, rô phi đỏ, việc tạo ra các men probiotics hay vaccine cho tôm còn rất mới [21]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng men vi sinh để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít Trong những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh [2]

và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt Tuy nhiên, cần có một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp

sử dụng

Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh

học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được Lê Thị Bích Phượng et al., Lê Tấn Hưng

et al., Võ Thị Hạnh et al., Trần Thị Cẩm Hồng khảo cứu [5,6, 10, 11, 14]

Những nhóm vi khuẩn probiotic có tiềm năng được sử dụng làm thức ăn nuôi

thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Moraxella [16]

Thành phần men vi sinh trong NTTS gồm những sản phẩm chính là dùng vi sinh vật sống

Những nhóm thường sử dụng bao gồm: Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Nitrosomonas, Nitrobacter, Saccharomyces

Theo thông tin trên sản phẩm một số chế phẩm sinh học, thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy ao thường

bổ sung các chủng xạ khuẩn và nấm sợi (thuộc nhóm Streptomyces, Aspergillus ).

Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs., tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và nhịp sử dụng khác nhau Tác giả cho biết với nghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì nghiệm thức sử dụng hàng ngày là tốt nhất Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển

sang tôm bột ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng cũng thấp và các yếu tố môi

trường cũng luôn giữ được ổn định Điều này cho thấy hiệu quả tích cực của men vi sinh trong sản xuất giống tôm càng xanh [13]

Theo Nguyễn Đình Trung, một trong những cơ chế hoạt động của men vi sinh

là các men có tác dụng phân huỷ các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất hữu

cơ đơn giản Vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ trong

ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong trong ao nuôi tôm các tháng

cuối không nhỏ hơn 30 cm Vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trường thích hợp

sẽ phát triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của nguyên sinh động

vật, các vi sinh vật và Vibrio có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng, giảm các tác

nhân gây bệnh cho tôm nuôi Nhờ đó, hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh, giảm thay nước trong quá trình nuôi, góp phần cải thiện chất lượng nước trong hệ thống NTTS [19]

Theo Võ Thị Thứ và cs., thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước nuôi tôm

sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng nhanh [17, 18]

Nghiên cứu sử dụng 3 loại men vi sinh Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng

vi khuẩn Vibrio spp trong môi trường bể ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm

càng xanh khá cao, dao động từ 59,1-76,6% Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu về hiệu quả và phương thức sử dụng men vi sinh trong môi trường ương nuôi tôm càng xanh nhằm cải thiện môi trường và nâng cao năng suất ương ấu trùng [15]

Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh (ES-01 và BS-01 của Trung tâm nghiên cứu ứng dụngsinh học phục vụ NTTS Sóc Trăng) góp phần đưa năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng suất [128]

Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh [126]

Tóm lại, ứng dụng probiotic trong nghề NTTS sẽ đem lại lợi ích tích cực trong việc phòng tránh bệnh và cải thiện môi trường Dù trong nước đã sản xuất được một số chế phẩm men vi sinh nhưng số lượng cũng như chủng loại còn hạn chế, mang tính đặc trưng vùng miền Người dân làm nghề NTTS hiện nay chủ yếu tiêu dùng sản phẩm men vi sinh có nguồn gốc xuất xứ từ nước ngoài như Pond clear, Vitabio AQ, Super

VS, có giá thành cao, chưa thật phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng trong nước Một đặc điểm nữa của chế phẩm men vi sinh là khả năng thích ứng với môi trường nhanh, có sự trao đổi giữa các chủng bản địa và chủng công nghiệp trong chế phẩm nên sự thoái hóa chủng xảy ra nhanh, chủng công nghiệp khó duy trì đặc tính tốt trong thời gian lâu Có thể một vài năm đầu sử dụng chế phẩm này là tốt nhưng năm sau lại không có hiệu quả Vì vậy, thị trường luôn đòi hỏi các chế phẩm mới có bổ sung những chủng giống mới Xuất phát từ thực tế trong nước, hướng nghiên cứu của

đề tài là phù hợp và cần thiết, làm cơ sở cho sự phát triển nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm probiotic trong nước

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2010 đến tháng 5/2011

Địa điểm thu mẫu: Mẫu tôm sú Penaeus monodon (5 con/mẫu, khối lượng

25÷30g/con) và mẫu bùn (0,5kg/mẫu) được thu ở đầm nuôi tôm tại khu vực Quý Kim - phường Hải Thành - quận Dương Kinh - thành phố Hải Phòng

Địa điểm phân tích, xử lý mẫu: Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển - Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Vi khuẩn Bacillus spp có trong bùn ao nuôi tôm và hệ tiêu hóa của tôm sú

2.2.2 Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn

a Môi trường phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus spp [23]:

- Môi trường NA (Nutrient agar) có bổ sung thêm 1,5% NaCl (w/v)

- Môi trường NB (Nutrient broth) có bổ sung thêm 1,5% NaCl (w/v)

b Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus [9, 23]

- Môi trường TCBS (Thiosulphate citrate Bilesalt Sucroza agar)

- Môi trường LB (Luria Bertani broth)

2.2.3 Một số thuốc thử và hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa, sinh lý [4]

- Dung dịch H2O2 3% dùng cho phản ứng catalase

- Dung dịch Tetramethyl P-Phenylenediamin - cotihydrochloride 1% dùng cho phản ứng oxidase

- Muối NaCl tinh khiết cho nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

- Mẫu tôm sú và bùn được thu ngẫu nhiên trong đầm nuôi tôm sú vào lúc sáng sớm, sau đó được đem về phòng thí nghiệm xử lý và phân tích

- Vợt được rửa bằng xà phòng, sau đó rửa lại bằng nước máy, rửa lại bằng nước trong đầm nuôi tôm Dùng vợt để bắt tôm trong đầm, chọn tôm khỏe mạnh, cho vào túi nilon sạch, đã được khử trùng, giữ trong đá lạnh đem về phòng thí nghiệm

- Rửa gầu (cuốc) thu mẫu đáy giống như rửa vợt Dùng gầu xúc bùn từ đáy ao, sau đó cho vào túi nilon sạch được khử trùng giữ trong đá lạnh đem về phòng thí nghiệm

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

- Toàn bộ dụng cụ và dung dịch NaCl 1,5% (w/v) đều được khử trùng theo tiêu chuẩn sử dụng cho vi sinh vật Mọi thao tác đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng

- Mẫu tôm được rửa sạch bằng dung dịch NaCl 1,5%, dùng dao chuyên dụng

mổ lấy ống tiêu hóa (ruột và dạ dày) Ống tiêu hóa được nghiền nát bằng chày và cối

sứ Dịch nghiền được hòa vào 5ml dung dịch NaCl 1,5%, sau đó cho sốc nhiệt bằng cách ủ trong bể nước nóng 800C trong 20 phút, sau đó ngâm ngay vào nước lạnh (nước máy) Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn [88]

- Mẫu bùn được pha vào dung dịch NaCl 1,5% Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn

2.3.3 Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và giữ giống vi khuẩn Bacillus spp

+ Phân lập: Thực hiện phân lập vi khuẩn gồm các bước sau [4]:

- Tiến hành pha loãng hệ thống (hệ số pha loãng 10), dịch huyền phù đến độ pha loãng 10-4 bằng nước muối sinh lý 0,85% Ở mỗi mức pha loãng, lấy 100µl cho vào hộp lồng có môi trường NA Dùng que trang bằng thủy tinh dàn đều dịch pha loãng trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch ráo nước Úp ngược hộp lồng và đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h

- Vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus được nuôi cấy riêng rẽ

trong môi trường TCBS ở nhiệt độ 28 – 300C trong 24h

- Khuẩn lạc Bacillus spp được tinh sạch lại, sau đó cấy chuyển sang ống thạch

nghiêng bằng cách cấy ria, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C

- Khuẩn lạc Bacillus spp được lưu giống bằng dung dịch Glycerol 20% ở nhiệt

độ -800C

2.4 Xác định khả năng ức chế Vibrio spp gây bệnh

- Vi khuẩn gây bệnh V alginolyticus và V parahaemolyticus sử dụng trong

nghiên cứu này do Trung tâm Nghiên cứu Môi trường và Dịch bệnh Thủy sản- Viện

Nghiên cứu NTTS I cung cấp, gồm mỗi loài 1 chủng, được trung tâm phân lập từ tôm

sú bị bệnh tại đầm ao nuôi khu vực Quý Kim - Hải Phòng

2.4.1 Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus

Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp của Lemos et al., và Purivirojkul

et al., [73, 88] Cấy vạch chủng V alginolyticus và V parahaemolyticus trước, sau đó cấy các chủng Bacillus spp vuông góc với đường cấy Vibrio Thực hiện kiểm tra này

trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl (w/v) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 24h và 48h

2.4.2 Ức chế vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus

Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp kháng sinh đồ (Purivirojkul, 2007)

[88] và được lặp lại 3 lần:

- Nuôi cấy chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V parahaemolyticus trong

môi trường lỏng LB trong vòng 24h Sau đó, lấy dịch huyền phù vi khuẩn (100µl) cấy gạt sang hộp lồng có chứa môi trường NA

- Các chủng vi khuẩn Bacillus spp được nuôi cấy trong môi trường lỏng NB có

bổ sung 1,5% NaCl (w/v) ở nhiệt độ 300C trong vòng 24h Dùng các đĩa giấy có

đường kính 10mm đã khử trùng, nhúng vào dịch nuôi các chủng vi khuẩn Bacillus spp Sau đó được đặt lên mặt hộp lồng có vi khuẩn Vibrio đã cấy gạt, ủ trong tủ ấm ở nhiệt

độ 300C, theo dõi trong vòng 24h và 48h

2.4.3 Đồng nuôi cấy trong nước biển

Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp của Purivirojkul [88] và được lặp

- Chuẩn bị dãy ống nghiệm 8ml nước biển khử trùng (20ppt), sau đó từng

chủng vi khuẩn Bacillus (1ml/chủng) được cho vào ống nghiệm Cho tiếp từng chủng

vi khuẩn Vibrio (1ml/chủng) vào cùng ống nghiệm Nuôi cấy riêng rẽ Các chủng Vibrio và Bacillus trong các ống nghiệm có nước biển khử trùng (20 ppt) làm đối

chứng Theo dõi sự phát triển theo 0h, 24h, 48h bằng cách lấy dịch nuôi, gạt trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl và TCBS để đếm số lượng khuẩn lạc

2.5 Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng sinh trưởng và phát triển của các chủng

vi khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh

- Theo dõi sự sinh trưởng của các chủng Bacillus spp trong môi trường NB có

bổ sung 1,5% NaCl Kiểm tra mật độ tế bào tại các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h sau khi cấy bằng máy đo mật độ quang UV/VIS ở bước sóng 620nm

- Theo dõi các điều kiện phát triển tối ưu của các chủng vi khuẩn Bacillus spp

với các điều kiện nhiệt độ, độ muối, pH Môi trường nền là NB có bổ sung 1,5% NaCl, sau đó được điều chỉnh các thông số nhiệt độ, pH và độ muối theo các dãy giá trị khác nhau Nuôi cấy trong tủ ấm ở điều kiện 300C (pH và độ muối) Sau 24h đọc kết quả sinh trưởng ở các dãy giá trị thí nghiệm bằng máy đo mật độ quang UV-VIS ở bước sóng 620nm Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần

+ dãy giá trị nhiệt độ thí nghiệm : 150C, 280C, 350C, 450C, 500C (nhằm để tìm hiểu khả năng thích nghi với nhiệt độ môi trường vùng nuôi và nhiệt độ thích ứng với quy mô sản xuất công nghiệp)

+ dãy giá trị độ muối thí nghiệm (%NaCl): 0; 1,5; 2; 3; 4; 5; 7 (Nhằm xác định khả năng thích nghi tối đa với nồng độ muối, từ đó xác định có thể thích nghi với môi trường ao nuôi)

+ dãy giá trị pH thí nghiệm: 4;5;7;8,5;9,5 (Nhằm xác định khả năng thích nghi với môi trường ao nuôi)

2.6 Phân loại và định danh vi khuẩn

Sau khi kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thủy sản V alginolyticus và V parahaemolyticus, các chủng vi khuẩn phân lập được xác định các

đặc điểm hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm gram, đặc tính sinh lý và sinh hóa

a Phương pháp nhuộm gram

- Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl trong 24h, sau đó được đem làm tiêu bản nhuộm Gram Sau khi cố định vết bôi, nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng

30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí Soi dưới kính hiển vi quang học (vật kính dầu 100x), vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (−) bắt màu đỏ [4]

b Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa [4]:

- Sinh lý: Lấy một phần khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập, sau đó hòa vào môi trường NB (10ml) có bổ sung 1,5% NaCl, nuôi lắc ở điều kiện 120 vòng/phút, từ

28 - 300C cho các thí nghiệm về độ muối (0 đến 7% NaCl), pH (3 đến 9,5) Quan sát định tính khả năng sinh trưởng của các chủng trong ống nghiệm Trong các thí nghiệm

về nhiệt độ, các ống nghiệm được nuôi tĩnh ở các nhiệt độ khác nhau (15 đến 550C) Sau đó, ghi nhận định tính sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong ống nghiệm Các thí nghiệm về sinh lý vi khuẩn được kiểm tra sau 24h và 48h nuôi cấy

- Sinh hóa:

+ Phản ứng catalase: nhỏ dung dịch H2O2 3% vào khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn phân lập đã được tinh sạch Nếu xuất hiện O2 qua việc tạo thành bọt khí thì được gọi là có phản ứng dương tính (+), ngược lại là âm tính (-)

+ Phản ứng oxidase: đặt khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn lên trên mặt giấy lọc, nhỏ dung dịch Tetramethyl P-Phenylenediamin - cotihydrochloride 1% Nếu xuất hiện màu tím trong khoảng 10 giây, được gọi là phản ứng dương tính (+), nếu không

có màu được gọi là phản ứng âm tính (-)

c Phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên gen 16 S rDNA

+ Tách DNA và thực hiện phản ứng PCR: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy

lấy dịch và tách chiết DNA theo mô tả của Sakiyama và cs., [102] Sau đó thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi:

- mồi xuôi 27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

- mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày chi tiết ở Phụ lục 1 Các sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose (1%), nhuộm với ethidium bromide trong 20 phút và quan sát trên máy soi gel Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ QIA Gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm

ở bước sóng 260 và 280nm, tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7 Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR cho bước giải trình tự gen bằng các cặp mồi:

27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';

780F : 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R : 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'