PHÂN lập, TUYỂN CHỌN và sử DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG bảo QUẢN cá GIÒ tươi NGUYÊN LIỆU

Vì thế, việc tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn và sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi” với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LƯU THỊ THÚY

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC SINH BACTERIOCIN TRONG BẢO QUẢN CÁ GIÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN VĂN DUY

TS VŨ NGỌC BỘI

Nha Trang - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

- ii -

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Văn Duy – Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang và TS Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đề tài, hai thầy đã cung cấp và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẽ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 4

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4

1.1.2 Phân loại 5

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 7

1.1.4 Ứng dụng 8

1.2 Bacteriocin 11

1.2.1 Phân loại bacteriocin 12

1.2.2 Một số tính chất của bacteriocin 14

1.3 Cá Giò 16

1.4 Biến đổi chất lượng nguyên liệu thủy sản sau khi chết 18

1.4.1 Hệ vi sinh vật trong cá tươi 18

1.4.2 Biến đổi chất lượng của nguyên liệu thủy sản sau khi chết 19

1.5 Các phương pháp bảo quản cá 24

1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm 28

1.6.1 Trên thế giới 28

1.6.2 Trong nước 29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Nước dưa 31

2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị 31

- iv -

2.1.3 Cá giò 32

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 32

2.1.5 Hóa chất, môi trường 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic 33

2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic 33

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 34

2.2.4 Xác định cơ chế kháng khuẩn của chủng phân lập 34

2.2.5 Xác định mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic 35

2.2.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của vi khuẩn lactic 35

2.2.7 Xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 36

2.2.8 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên cá Giò nguyên liệu 36

2.2.9 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 37

2.2.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng kháng Salmonella, Vibrio của vi khuẩn lactic trong quá trình bảo quản 37

2.2.11 Thí nghiệm bảo quản cá Giò bằng vi khuẩn lactic 37

2.2.12 Đánh giá chất lượng của cá 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ nước dưa muối lên men truyền thống 40

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 41

3.3 Phổ ức chế của 5 chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn 43

3.4 Xử lý dịch chiết tế bào với enzym proteinase K và α-Chymotrypsin 49

3.5 Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic T13 50

3.6 Đặc điểm sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng T13 trên môi trường MRS 51

3.7 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 53

3.7.1 Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic T13 53

3.7.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 54

3.7.3 Ảnh hưởng của pH đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 55

3.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 56

3.8 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T13 trên da cá giò 57

3.8.1 Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 57

3.8.2 Sự phát triển của tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá sau khi được nhúng vào dịch vi khuẩn lactic T13 58

3.9 Thử nghiệm sử dụng vi khuẩn lactic T13 trong bảo quản cá giò tươi nguyên liệu 59

3.9.1 Kết quả đánh giá cảm quan 59

3.9.2 Kết quả đánh giá chỉ tiêu hóa học 61

3.9.3 Kết quả kiểm tra vi sinh vật 62

3.10 Qui trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi bằng vi khuẩn lactic T13 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

(Vi khuẩn lactic)

(Môi trường nuôi cấy Lactobacillus)

(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

(Mật độ quang)

(Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

(Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin 14 Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 15 Bảng 2.1 Bảng chỉ tiêu cảm quan của cá giò 39 Bảng 3.1 Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic 41 Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của 5 chủng lactic T4, T13, T12, T8, O16 với các chủng chỉ thị 45

- viii -

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic 8

Hình 1.2 Cấu trúc một số bacteriocin 13

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các loại bacteriocin của vi khuẩn lactic 14

Hình 1.4 Ảnh cá giò 18

Hình 2.1 Ảnh nước dưa chua 31

Hình 2.2 Ảnh Cá giò nguyên liệu tươi 32

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định phổ ức chế của vi khuẩn lactic đối với một số vi khuẩn gây bệnh 36

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản cá giò 38

Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T13 trên môi trường thạch MRS 40

Hình 3.2 Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 40

Hình 3.3 Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XL 42

Hình 3.4 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị Vibrio C1 (A) và Bacillus B1.1 (B) 42

Hình 3.5 (A) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng Salmonella Sal1 và Bacillus (B1.1, B2.3) 46

Hình 3.5 (B) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng E Coli (H10b, L2.1, TN3, TN4.1, TN4.2, TN5.2 ) 47

Hình 3.5 (C) Vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn lactic với chủng chỉ thị

E coli GA, Vibrio (C1, V3.3, CR6, CR7), S aureus 48

Hình 3.6 Hình ảnh vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ chủng T13 khi xử lý với proteinase K (A) và với α-chymotrypsin (B) .49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô của vi khuẩn lactic T13 lên sự sinh trưởng của Bacillus B1.1 50

Hình 3.8 Mối quan hệ giữa sự sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic T13 nuôi trên môi trường MRS, ở pH 6,8 và nhiệt độ 37OC 52

Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T13 đối với Bacillus B1.1 trên

môi trường thạch mềm TSA bổ sung xanh metylen ở nhiệt độ 370C .53

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 54

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 55

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 56

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lacticT13 57

Hình 3.14 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò theo thời gian 57

Hình 3.15 Sinh trưởng của tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 59

Hình 3.16 Biểu đồ đánh giá cảm quan về chất lượng cá giò theo thời gian bảo quản 61

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn hàm lượng NH3 theo thời gian bảo quản 62

Hình 3.18 Vi khuẩn Salmonella trên cá giò sau khi gây nhiễm ở ngày thứ 5 63

Hình 3.19 Đồ thị so sánh mật độ tế bào của vi khuẩn Salmonella trên mẫu cá giò bảo quản với vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng 63

Hình 3.20 Tổng số vi khuẩn Vibrio trên cá giò sau khi gây nhiễm ở ngày thứ 5 64

Hình 3.21 Đồ thị so sánh mật độ tế bào của vi khuẩn Vibrio trên mẫu cá giò bảo quản với vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng 64

Hình 3.22Tổng vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày bảo quản 65

Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn tổng số vi khuẩn hiếu khí theo thời gian bảo quản 65

Hình 3.24 Ảnh cá giò sau 5 ngày bảo quản 67

Hình 3.25 Sơ đồ qui trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi 68

- 1 -

LỜI MỞ ĐẦU

Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài

Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò nguyên liệu nói riêng là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu không được bảo quản một cách hợp lý Hiện các loại nguyên liệu thủy sản chủ yếu được bảo quản theo phương pháp ướp đá nhưng để bảo quản trong thời gian dài thì cần phải có đủ lượng đá để giữ nhiệt độ trong lòng khối nguyên liệu ≤40C Thêm vào đó khi bảo quản nguyên liệu thủy sản theo phương pháp ướp đá thường phải có dụng cụ chứa đựng lớn Nhưng thực tế cho thấy việc bảo quản nguyên liệu thủy sản sau đánh bắt và thu hoạch của người dân còn nhiều hạn chế như thiếu lượng đá, thiếu dụng cụ chứa đựng, điều kiện vệ sinh nơi bảo quản còn hạn chế… Vì thế chất lượng nguyên liệu thủy sản bảo quản của người dân thường rất hạn chế Để giữ nguyên liệu thủy sản lâu dài người dân thường lạm dụng các loại hóa chất độc hại như hàn the, urê, trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạnh mất an toàn thực phẩm Do đó hiện nay vấn đề “ an toàn vệ sinh thực phẩm” đang là vấn đề được toàn xã hội quan tâm Vì vậy việc nghiên cứu, tìm kiếm phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn với người sử dụng là yêu cầu rất cấp thiết

Nhiều nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu thay thế những chất bảo quản hóa học bằng các phương pháp sinh học không gây mất an toàn cho người tiêu dùng tiêu dùng thực phẩm Một trong các hướng là nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin Bacteriocin là một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ do vi khuẩn sinh ra để chống lại các vi khuẩn khác có trong môi trường sống của chúng Trong số này, vi khuẩn lactic được công nhận là an toàn để sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm truyền thống [18] Trong quá trình sống ngoài việc sinh ra bacteriocin, vi khuẩn này còn sinh ra acid lactic và acid lactic cũng là tác nhân ức chế sinh trưởng của nhiều lọai vi khuẩn Vì thế từ ngàn xưa con người đã sử dụng phương pháp lên men lactic như một biện pháp bảo quản sản phẩm hữu hiệu

Cá giò (Rachycenton canadum) hay còn gọi là cá bớp là lọai cá biển có thịt ngon

và giá thành cao Hiện cá giò là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cả trong thị trường nội địa và quốc tế Nên hiện nay cá giò được nuôi khá phổ biến ở nhiều tỉnh ven biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu và Kiên Giang Hiện nay cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh Do vậy việc nghiên cứu

bảo quản nguyên liệu cá giò làm hạn chế hư hỏng có ý nghĩa kinh tế lớn Hiện cá giò nguyên liệu tươi cũng giống như nhiều loại nguyên liệu thủy sản khác chỉ được bảo quản theo phương pháp ướp đá hoặc sử dụng các chất bảo quản không rõ nguồn gốc xuất xứ gây độc hại cho người sử dụng thậm chí có thể gây bệnh cho người Vì thế,

việc tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn và sử dụng vi khuẩn lactic

sinh bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi” với mục tiêu tuyển chọn

các chủng vi khuẩn lactic có kháng sinh bacteriocin và thử nghiệm sử dụng các vi khuẩn lactic này để bảo quản sinh học cá giò tươi nguyên liệu

Ý nghĩa thực tiễn

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có thể được

sử dụng làm chất bảo quản sinh học để bảo quản thủy sản nói chung và cá giò nói riêng, đồng thời vẫn đảm bảo được tính an toàn thực phẩm Bên cạnh đó vi khuẩn lactic này sẽ là một chất bảo quản sinh học giá thành rẻ góp phần làm giảm chi phí sản xuất cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản và đảm bảo tính an toàn cho người tiêu dùng

Mục đích của đề tài

Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối nhằm thử nghiệm ứng dụng vào bảo quản cá giò tươi nguyên liệu

Nội dung nghiên cứu của đề tài

1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

2 Xác định phổ ức chế vi khuẩn gây bệnh thực phẩm của vi khuẩn lactic

3 Xử lý dịch chiết tế bào với enzyme proteinaza K và α-Chymotrypsin

4 Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn lactic

5 X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên môi trường MRS

6 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

- 3 -

7 X ác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu

8 Đánh giá khả năng sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản nguyên liệu cá giò tươi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ

Lactobacteriacae Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: hình que

ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu ở dạng đơn, đôi, xếp thành nhóm hoặc chuỗi Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to hơn, tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid [5]

Vi khuẩn lactic có phổ kháng khuẩn khá rộng với nhiều cơ chế khác nhau Một trong các cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là sự hình thành lactic acid Ngoài

ra, vi khuẩn lactic còn sinh ra các phân tử có hoạt tính sinh học khác như diacetyl, reuterin và reutericyclin Đặc biệt, vi khuẩn lactic có thể sản sinh ra các phân tử bacteriocin và những phân tử tương tự bacteriocin để chống lại hoạt động của các vi khuẩn gần gũi Một vài chủng vi khuẩn lactic còn có thể tổng hợp những peptide kháng khuẩn khác Những chất kháng sinh có bản chất protein này đang được ứng dụng để nâng cao chất lượng bảo quản và an toàn vệ sinh thực phẩm [12,17]

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic [5]

Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có rất nhiều điểm khác nhau nhưng nhìn chung

về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất, gồm một số đặc điểm chung như sau:

- Vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh bào tử

- Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất của vi khuẩn này rất yếu

- Là loại vi khuẩn kị khí tùy nghi, có khả năng lên men kị khí cũng như hiếu khí

- Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid

- Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra lactic acid; chúng là nhóm lên men bắt buộc, không chứa cytochrome, catalase và men

- Vi khuẩn lactic có thể sống từ kị khí tới vi hiếu khí Vi khuẩn lactic có nhu cầu

về chất sinh trưởng rất phức tạp Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, nicotinic acid, folic acid, biotin)

và các amino acid …

- 5 -

- Vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide Các vi khuẩn lactic không

lên men được tinh bột và các polysaccharide khác Ngoại trừ loài L.delbrueckii là đồng

hóa được tinh bột Một số khác chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng được pentose và citric acid Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính protease: thủy phân được protein của sữa thành peptide và amino acid Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao nhất

- Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra chất kháng sinh để ức chế các vi khuẩn gây bệnh

Một số vi khuẩn lactic dị hình như sau:

Lactobacillus pasterianus, thuộc loại trực khuẩn Gram (+), tế bào có kích thước

rộng 0,5-1µm, dài 7,0-35 µm Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ không di động Chúng sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 29-330C, và pH 8,0

Lactobacillus brevis, thuộc loại trực khuẩn Gram (+), tế bào có kích thước rộng

0,7-1µm, dài 2,4 -4,0 µm Trong tự nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi, không

di động Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactat canxi như nguồn cung cấp cacbon Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C Vi khuẩn có nhiều trong sữa, trong dưa chua

Lactobacillus lycopessici là loại trực khuẩn Gram (+) Trong tự nhiên chúng tồn

tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử Trong quá trình lên men đường chúng tạo ra cồn, lactic acid, acetic acid và CO2

Streptococcus cumoris thuộc loại cầu khuẩn, trong tự nhiên chúng tồn tại thành

từng chuỗi rất dài Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 300C Chúng không phát triển ở nồng độ muối 4% Khi lên men đường tạo ra acetic acid, diacetyl và CO2 Chúng có khả năng sinh ra chất kháng khuẩn

Streptococcus lactic thuộc chuỗi cầu khuẩn Gram (+), nhiệt độ phát triển từ

10-450C, có khả năng chịu được nồng độ muối 4% Khi lên men đường như glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharoe, monnitol, salicin, chúng tạo ra lactic

acid, acetic acid CO2, và diacetyl Chúng không khả năng lên men được raffinose, insulin, glycerol và sorbitol

Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ sinh

trưởng ở 10-450C Chúng có khả năng chịu được nồng độ muối 5% và có khả năng lên men đường glucose, maltose, trehalose và silicin

- Vi khuẩn lactic đồng hình

Vi khuẩn lactic đồng hình là nhũng vi khuẩn trong tế bào của chúng có chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase Khi lên men các loại đường chúng sinh ra chủ yếu là lactic acid

Một số vi khuẩn lactic điển hình:

Lactobacillus axitophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6-0,9µm, dài

1,5-6,0 µm Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và có khả năng chuyển động chúng có khả năng lên men một số loại đường như glucose, maltose, galactose, lactose, mannose, saccharose để tạo ra lactic acid Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, glycerol, mannitol, sorbitol…

Lactobacillus bulgaricus là loài thuộc trực khuẩn có kích thước rất dài liên kết

với nhau tạo thành chuỗi Chúng không có khả năng di chuyển Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose Nhưng không có khả năng lên men xylose, dextrin, mannitol, inulin…

Lactobacillus casein là trực khuẩn nhỏ có kích thước ngắn, chúng có thể tạo

thành chuỗi không chuyển động Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose…Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-lactic acid Nhiệt độ phát triển tối ưu là 38-400C

Lactobacillus causasiccus là loại trực khuẩn ngắn không có khả năng chuyển

động Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, mannose, mannitol Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48-500C

Lactobacillus leichmannii là trực khuẩn Gram (+) Kích thước tế bào 0,6-2 µm

Trong tự nhiên chúng có khả năng tạo thành chuỗi ngắn Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, saccharose Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-lactic acid Nhiệt độ phát triển tối ưu 360C

- 7 -

Lactobacillus delbruckii là trực khuẩn dài, kích thước 0,5-0,8 µm, 0,2-9,0 µm,

không di động Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, maltose, fructose và dextrin

Lactobacillus helveticcus là loại trực khuẩn có kích thước 0,7-0,9 µm, 2,0-6,0

µm Trong tự nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào cũng như có thể tạo thành chuỗi tế bào Nhiệt độ phát triển thích hợp là 40-420C Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose, fructose, maltose, mannose Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai cứng

Lactobacillus thermophilus là trực khuẩn Gram (+),có kích thước tế bào 0,5-3,0

µm, không có khả năng di động Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, chịu được 65-750C

Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua, phomai

Lactobacillus plantarum là trực khuẩn Gram (+), có kích thước tế bào 0,7-1,0

µm, 3,0-8,0 µm Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C Có khả năng chịu được nồng độ muối 5,5% Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [5]

Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sử dụng được các hợp chất hữu cơ phức tạp

có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ Vì vậy để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein, pepton…

Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường mono và disaccharide, còn các polysaccharide thì hầu như không thể lên men Tốc độ lên men các loại đường monosaccharide, disaccharide và oligosaccharide là khác nhau Nếu khi nhân giống người ta dùng một loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này

mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon khác

Các vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển Thường phải bổ sung vào môi trường các chất chứa vitamin như khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nấm men và

nhiều chất khác Vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin

Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, lưu huỳnh, mangan Đặc biệt là mangan vì mangan ngăn cản sự phân cắt của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của của vi khuẩn sau này Mặt khác một vài enzym có sự tham gia của các ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2 trong cấu trúc của trung tâm hoạt động

Ngoài acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng như: acid hữu cơ (acid acetic…) có tác động đến sự sinh trưởng của tế bào, các bazơ nitơ như adenine, guanine, urasin, thimin…sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn, các acid amin như L-asparagin, L-glutamin

Nhiệt độ, pH là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của vi khuẩn lactic Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sự sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và loại ưu ấm Loại ưa

nhiệt gồm có: Lactobaterium bulgaricus, L thermophilus, L delbruckii…phát triển tốt

ở 45÷620C Loại ưa ấm gồm có: L causasicus, L lactic, L helveticus, L acidophilus,

L bifidus phát triển tốt ở 370C÷450C, L casein, L plantarum, L leichmanii, L brevis,

L buchneri, L pastorianus phát triển tốt ở 28÷320C, pH thích hợp từ 6,3÷6,5

Hình 1.1 Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic [35, 36, 37]

1.1.4 Ứng dụng

Từ xa xưa, vi khuẩn lactic được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực Chúng được dùng để sản xuất acid lactic theo cách lên men đồng hình Nguyên liệu dùng để sản xuất lactic là rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hóa Nồng độ đường sử dụng cho quá trình lên men lactic từ 8÷20% Nếu nguyên liệu là rỉ mật phải làm trong để loại bỏ

- 9 - các hợp chất chứa nitơ Quá trình lên men lactic xảy ra rất tốt trong môi trường acid, tuy nhiên vi khuẩn lactic không có khả năng chịu được nồng độ acid quá cao Khi nồng độ acid quá cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic vì vậy cần phải điều chỉnh độ pH của môi trường từ 6,3÷6,5 Trong thực tế sản xuất người ta thường xuyênbổ sung cacbonatcanxi để giữ pH của môi trường không thay đổi Acid lactic thu được sẽ ở dạng muối canxilactat Trong quá trình lên men lactic có nhiều vi khuẩn tham gia vì vậy sản phẩm thu được ngoài acid lactic còn có CO2 và một số sản phẩm phụ khác

Ứng dụng vi khuẩn lactic trong công nghệ thực phẩm [2]

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên Chúng tham gia vào nhiều hoạt động sống của con người trong đó đặc biệt quan trọng là ứng dụng trong chế biến thực phẩm

Ứng dụng để sản xuất dưa chua

Quá trình muối chua rau quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Trong quá trình phát triển của chúng trong rau quả, khi lên men sẽ tạo thành acid lactic và acid acetic cùng một số loại acid hữu cơ khác Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tượng gây thối rữa rau, quả Mặt khác, nhờ có lượng acid hữu cơ được tạo thành sẽ làm tăng hương vị của khối ủ rau quả Chính vì thế, người ta cho rằng muối chua rau quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản

Ứng dụng trong sản xuất tôm chua

Từ xưa con nguời đã biết ứng dụng rộng rãi vi khuẩn lactic trong sản xuất các sản phẩm lên men chua trong đó có sản phẩm tôm chua Quá trình lên men lactic trong các sản phẩm lên men chua làm tăng giá trị dinh dưỡng, vừa có thể chữa bệnh đường ruột giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hoá mà còn có tác dụng bảo quản sản phẩm lâu hơn, lại vừa đảm bảo an toàn sinh học

Ứng dụng trong sản xuất tương

Sản xuất tương theo phương pháp của người miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nước đậu sau khi rang Quá trình ngả nước đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị chua sản phẩm

Ứng dụng trong sản xuất đậu phụ

Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu Phương pháp truyền thống thường dùng là nước chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành

Ứng dụng sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa

Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic Nhờ có quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic mà casein được kết tủa và tạo cho sản

phẩm có hương vị đặc trưng

Ứng dụng để ủ thức ăn gia súc

Một ứng dụng khác mà từ lâu người ta đã biết là sử dụng quá trình lên men lactic

để ủ chua thức ăn gia súc Phương pháp ủ chua thức ăn gia súc đặc biệt cần thiết đối với các trại chăn nuôi gia súc Nguyên liệu dùng làm thức ăn cho gia súc nếu đem phơi khô sẽ làm giảm 50% giá trị của chúng Nhưng nếu ta đem ủ chua thì chỉ giảm khoảng 10% giá trị Đặc biệt bằng phương pháp ủ chua sẽ tăng nhiều chỉ số dinh dưỡng khác của thức ăn

Ngoài ra để sản xuất phomat người ta dùng enzym đông kết tủa casein trong sữa, sau đó tiếp tục cho lên men lactic với nồng độ muối loãng Tùy loại phomat mà trong quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau Các vi sinh vật thường được sử dụng để làm chín phomat là vi khuẩn propionic, nấm mốc…

Ứng dụng trong y học

Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột

Thực ra việc ứng dụng này đã được biết đến từ lâu Việt Nam Khi người ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1-2 chén nước dưa chua Phương pháp này tỏ

ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển Dựa vào hiệu quả sử dụng của vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic

Hiện nay vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacteriocin [12], một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu

- 11 - thành tế bào Vì vậy, bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, sữa tươi, nước giải khát, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là bảo quản nguyên liệu thủy sản

1.2 Bacteriocin

Trong những năm gần đây, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong điều trị bệnh của người và động vật Vì thế việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng một số protein của vi khuẩn có hoạt tính kháng sinh Trong số đó, bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả

Bacteriocin có bản chất là peptide hoặc protein kháng khuẩn, được sinh ra bởi vi khuẩn này để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng [12] Loài vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài

ra, bacteriocin không gây ra phản ứng dị ứng với con người và không gây ra các vấn

đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease và ít khi gây ra hiện tượng kháng kháng sinh

Hiện nay bacteriocin đã được tìm thấy ở hầu hết các nhóm vi khuẩn khác nhau Tuy nhiên nhóm vi khuẩn lactic vẫn được coi là an toàn với con người [13] Điều đáng chú ý là một số chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập có khả năng sản sinh bacteriocin với phổ ức chế rộng các vi sinh vật đích [15] Vì vậy, chúng có tiềm năng lớn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, giúp giảm bổ sung các chất bảo quản hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, do đó làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên hơn và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng Nó có thể được thay thế để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn tươi ngon, thực phẩm ăn, những thực phẩm chế biến ít nhất và làm giá trị gia tăng và tính chất cảm quan của sản phẩm (như giảm tính acid, hoặc thành phần muối thấp hơn)

Hiện nay bacteriocin càng ngày được ứng dụng rộng rãi hơn Ngoài bacteriocin

có tính thương mại như nisin và pediocin PA-1/AcH thì sử dụng những bacteriocin khác cũng có tác dụng bảo vệ thực phẩm khỏi hư hỏng Chẳng hạn, bacteriocin giúp

bảo vệ thực phẩm kháng chọn lọc đối với Listeria monocytogenes và không ảnh hưởng

đến các vi sinh vật khác Bacteriocin có thể thêm vào thực phẩm như chất bảo quản

thực phẩm, kéo dài hạn sử dụng, hoặc được xem như là chất phụ gia có tác dụng phụ trợ hoặc bảo vệ Bacteriocin cố định cũng được ứng dụng trong bao bì thực phẩm có hoạt tính sinh học [18]

Nisin một bacteriocin đầu tiên được thương mại hóa và đang trở thành chất phụ gia trong công nghiệp thực phẩm tại hơn 50 nước trên toàn thế giới [22] Đây là một polypeptide thuộc lớp Lantibiotic, trong mạch có 34 acid amin được tạo ra nhờ quá

trình lên men của Lactococcus lactis [23] Tuy nhiên, độ bền của nisin chỉ thể hiện tốt

trong điều kiện acid Khi tăng pH từ 3 tới 7, nisin trở nên không bền với ảnh hưởng của nhiệt độ, giảm một nửa hoạt tính khi xử l í ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút

Trong những năm gần đây việc ứng dụng bacteriocin như một công nghệ bảo quản mới và được chú ý lớn Một số bacteriocin thể hiện tính chất phụ gia hay có hiệu quả khi được sử dụng kết hợp với tác nhân kháng khuẩn khác bao gồm chất bảo quản hóa học, hợp chất phenol cũng như protein kháng khuẩn khác Đây có thể cũng là phương pháp tiếp cận hấp dẫn để tránh phát triển của các chủng đối kháng Để tăng hiệu quả bảo quản, người ta có thể sử dụng kết hợp của bacteriocin với các phương pháp xử lý vật lý như xử lý áp suất cao hoặc xung điện từ trường Hiệu quả của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi nhân tố môi trường như pH, nhiệt độ, cấu trúc và thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật thực phẩm Thực phẩm được xem như

hệ sinh thái phức tạp trong đó vi khuẩn có nhiều mối tương tác bao gồm sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại Sự phát triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh vật phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn về hiệu quả của bacteriocin trong thực phẩm Đồng thời gần đây những nghiên cứu về sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể tiết lộ các các nguồn sinh bacteriocin mới [18]

1.2.1 Phân loại bacteriocin

Bacteriocin được phân loại theo nhiều cách, trong đó chủ yếu dựa vào chủng sản

xuất và cơ chế kháng khuẩn Lớp I lantibiotic là những peptide hoạt động theo cơ chế tương tác với cấu trúc màng tế bào, có chứa các aminoacid như lanthionine Nisin cũng thuộc vào nhóm này Lớp II bacteriocin có trọng lượng phân tử thấp, bền nhiệt,

không có chứa lanthionine Lớp III bacteriocin, đã được tìm thấy trong Lactobacillus,

bao gồm protein không bền nhiệt, có khối lượng phân tử lớn Lớp IV bacteriocin là nhóm các protein phức tạp [26]

sự tổng hợp thành tế bào dẫn đến tế bào chết

Ngoài ra, chúng có thể sử dụng lớp lipid II như phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến tế bào nhanh chóng Lantibiotic có hai chuỗi peptid tham gia nên ví dụ như lacticin 3147, chúng có thể có cả hai cơ chế hoạt động Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một cơ chế hoạt động gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc xoắn lưỡng cực được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến sự khử cực và chết Bacteriocin của nhóm III như lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào vi khuẩn Gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc

Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin

- Kém bền nhiệt

- Có cấu trúc domain

- Dạng vòng

- Kém bền nhiệt

- Có cấu trúc domain

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của các loại bacteriocin của vi khuẩn lactic [33]

1.2.2 Một số tính chất của bacteriocin

a) Độ bền nhiệt

Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy các loại bacteriocin của những loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau Mỗi loại bacteriocin có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II Bacteriocin

ST28MS và ST26MS được sản xuất bởi Lactobaccillus plantarum không giảm khả

- 15 - năng kháng khuẩn sau khi xử lý 90 phút tại 1000C hay 20 phút tại 1210C [28] Người

ta cho rằng đặc điểm chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin

b) Độ bền pH

Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt trong những khoảng pH nhất định Bacteriocin ST28MS và ST26MS [30] ngoài có độ bền nhiệt cao, chúng còn có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12 Ví

dụ, tại pH kiềm plantaricin C, một peptide có khối lượng 3,5kDa có nguồn gốc từ

Lactobacillus plantarum LL441, bị bất hoạt nhưng phục hồi hoạt tính trở lại tại pH

acid [21] Những đặc tính này đều do thành phần cấu trúc của bacteriocin đó Độ bền nhiệt và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm Tùy vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ sung vào sao cho phù hợp với mục đích sản xuất

c) Độ bền với các enzym

Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [28]

Tên bacteriocin Nhiệt độ cho phép Khoảng pH bền Enzym thủy phân

1 1 Megacin A-216 600C/30 phút 2-7

Chymotrypsin Pepsin Trypsin

2 Clostocin A 1000C/30 phút 4-9

Trypsin Chymotrypsin Pronase P, Rnase, Dnase

3 Clostocin B 800C/10 phút 4-9

Trypsin Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase

4 Clostocin C 800C/10 phút 4-9

Trypsin Chymotrypsin, Pronase P Rnase, Dnase

5 Clostocin D 1000C/30 phút 4-9

Trypsin Chymotrypsin, Pronase P, Rnase, Dnase

6 Boticin E-S5 1000C/10 phút 1,1-9,5

Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pronase P, Rnase,

Dnase

7 Boticin P 600C/30 phút 6,5-7,5

Trypsin, Rnase, Dnase, Alkaline phosphotase, Phospholipases C,D

8 Butyricin 7423 1000C/10 phút 2-12 Trypsin

9 Perfreingocin 11105 1000C/30 phút 2-12 Trypsin

Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các amino acid khác nhau nên sẽ chịu

sự phân cắt đặc hiệu của các enzym khác nhau, thích hợp với nó Sự phân cắt bởi các enzym này sẽ làm cho bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời đây cũng

là dấu hiệu giúp ta nhận biết một chất có hoạt tính kháng khuẩn có phải là bacteriocin không (Bảng 1.2)

1.3 Cá giò

Trong thời gian gần đây, cá giò (Rachycenton canadum) đã được nuôi phổ biến

trong lồng bè ở vùng biển các địa phương Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ An và Vũng Tàu Chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh, từ con giống cỡ 20÷25g/con sau một năm nuôi có thể đạt 4÷5kg/con Ðây là đối tượng có rất nhiều triển vọng đối với nghề nuôi biển ở nước ta Hiện nay, hầu hết các lồng nuôi chỉ sử dụng con giống từ nguồn sinh sản nhân tạo vì sự khan hiếm con giống loài này ở tự nhiên Chính vì vậy, nhu cầu con giống đang ngày càng gia tăng ở nhiều địa phương

Từ năm 1997 - 1999 Viện Nghiên cứu Hải sản đã tiến hành nghiên cứu sinh sản

cá giò và đã thành công, sản xuất được cá giò giống và biên soạn dự thảo quy trình sản xuất vào năm 2000 (đề tài nghiên cứu cấp nhà nước) Từ năm 2001 đến nay, được sự tài trợ của Hợp phần SUMA và Dự án NORAD, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản

I tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình tại các địa điểm Hải Phòng, Quảng Ninh, Nghệ An và đã thu được nhiều kết quả Hiện nay, quy trình sản xuất giống cá giò đã

ổn định và được đơn giản hoá để áp dụng rộng rãi, kể cả tại các cơ sở không có điều kiện đầu tư

Những kỹ thuật này bao gồm sinh sản nhân tạo đại trà bằng cách cho đẻ tự nhiên

cá bố mẹ được nuôi vỗ, ương nuôi ấu trùng, ương cá giống trên bể, ao và lồng gần bờ,

- 17 - nuôi thịt trong lồng ngoài khơi Sinh sản nhân tạo của loài cá này tương đối dễ dàng vì

cá thành thục sinh dục trong vòng hai năm nuôi Mùa đẻ trứng ngoài tự nhiên diễn ra suốt năm ở nhiệt độ từ 23÷27oC, với đỉnh cao vào mùa xuân và mùa thu Trứng thụ tinh nở trong vòng 21÷37h ở nhiệt độ nước 31÷22oC Ấu trùng tăng trưởng nhanh và

có khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt rất cao so với ấu trùng của một số loài

cá biển khác Cá bột có thể được sản xuất hàng loạt trong ao ngoài trời với giá thành tương đối rẻ Cá ương từ 20 ngày tuổi trở đi được chuyển sang cho ăn bằng thức ăn viên Ương cá từ 10÷30g lên 100g được tiến hành trong các ao ngoài trời hoặc lồng

gần bờ Bệnh thường gặp ở cá giò chủ yếu là bệnh do vi khuẩn (Pasteurella, Vibrio, và

Streptococcus), ký sinh trùng (Myxosporidea, Trichodina, Neobenedenia và Amyloodinium), virus (Lymphocystis)

Những năm gần đây, hệ thống thâm canh và tuần hoàn siêu thâm canh dùng cho ương cá giống (từ 2g lên 100÷150 g) được phát triển với tỉ lệ sống hơn 90% Trong ương và nuôi thịt trong lồng xa bờ, cá giò từ 100÷600 g nuôi trong vòng 1÷1,5 năm đạt kích thước xuất khẩu 6÷8 kg cho thị trường Nhật, hoặc 8÷10 kg cho thị trường nội địa Hiện nay, khoảng 80% lồng nuôi cá biển ở Đài Loan dành cho nuôi cá Giò Tuy nhiên vẫn còn một số vấn đề tồn tại cần được quan tâm và giải quyết trong nuôi cá Giò

để nâng cao sản lượng như là tỷ lệ tử vong cao do sốc khi vận chuyển từ bể ương/lồng ương gần bờ đến lồng nuôi thịt, bệnh dịch trong quá trình ương và nuôi thịt làm cho tỉ

lệ sống thấp dẫn đến thu hoạch kém Trứng được thu ngay sau khi đẻ, tách riêng và ấp

ở nhiệt độ 28-30oC Sau 24-28 giờ, trứng sẽ nở thành cá bột có chiều dài 4-4,2 cm Thức ăn cho ấu trùng cá: ở ngày tuổi thứ 3, cá bắt đầu ăn sinh vật phù du cỡ nhỏ như luân trùng, ấu trùng hầu hà, nauplius của copepoda; tiếp đến là loại cỡ lớn như

copepoda trưởng thành, Artemia ấu trùng và trưởng thành, sau đó có thể luyện chúng

ăn thức ăn hỗn hợp Để giải quyết thức ăn tươi sống cho ấu trùng cá người ta nuôi tảo thuần trên túi ni lông; nuôi luân trùng thâm canh trên bể nhỏ; gây nuôi sinh vật phù du trên ao đất vùng nước lợ Vì vậy, việc áp dụng quy trình sản xuất giống cá giò đã dễ dàng, thuận lợi và có điều kiện mở rộng

Hiện nay cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá sống hoặc chế biến đông lạnh Do vậy việc nghiên cứu bảo quản nguyên liệu cá giò làm hạn chế hư hỏng có ý nghĩa kinh tế lớn

Hình 1.4 Ảnh cá giò [34]

1.4 Biến đổi chất lượng nguyên liệu thủy sản sau khi chết

1.4.1 Hệ vi sinh vật trong cá tươi

Vi sinh vật tồn tại trong cá có hai nguồn gốc [7]: bị lây nhiễm khi còn sống (nước

là môi trường nhiều vi sinh vật Vi sinh vật lây nhiễm vào cá qua vết xây xát, vào tuần hoàn và hệ hô hấp và ăn thức ăn) Mặt khác nó còn bị lây nhiễm sau khi đánh bắt đây

là hướng chính (qua dụng cụ đánh bắt, chuyên chở, chứa đựng, dụng cụ, máy móc chế biến và con người trực tiếp sản xuất)

Cá khi còn sống ngoài da có một lớp nhớt là môi trường sinh sống tốt cho vi sinh vật, số lượng vi sinh vật trên da cá từ 102 đến 105 tế bào trên 1cm2 da cá Ở đây tồn tại

các loại trực khuẩn sinh và không sinh bào tử như Pseudomonas fluorescens, Proteus

vulgaris, Micrococus reseus, E coli và một số nấm men sống trong nước

Trong cá có rất nhiều vi sinh vật, ở đây đa số là nhóm vi sinh vật hiếu khí thường

gặp là Pseudomonas fluorescens Trong mang còn tồn tại nhiều vi sinh vật của nước

và đất bùn

Trong ruột cá có nhiều vi sinh vật của nước, đất bùn và của thức ăn đưa vào, có

nhiều vi khuẩn kị khí sinh bào tử Trong ruột cá thường thấy Clostridium sporogenes,

Cl putrificus aerobacter và nhóm E coli Số lượng vi sinh vật trong ruột cá khoảng

- 19 - Biên độ dao động trên thể hiện số lượng vi sinh vật có trong cá phụ thuộc vào nguồn gốc cá sống (nguồn nước ô nhiễm nhiều hay ít)

Nhìn chung, hệ vi sinh vật trong cá rất đa dạng và phong phú, gồm đầy đủ các loại vi sinh vật trong nước, trong đất bùn và thức ăn Thường cá ở vùng nhiệt đới thì trên cơ thể có nhiều vi khuẩn Gram dương, cá ở vùng ôn đới thì vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế Ngoài vi khuẩn trong cá còn có cả nấm mốc

Các loại vi khuẩn thường gặp ở cá là:

Nhìn chung, khi cá còn sống thịt cá hầu như vô trùng Tuy nhiên, sau khi cá chết,

vi sinh vật từ nội tạng cá sẽ nhiễm vào thịt, từ nhớt cá sẽ đi sâu vào thịt cá Điều này cho thấy cá trước khi đưa vào chế biến phải có khâu xử lý sơ chế để loại bỏ tạp chất và

vi sinh vật [7]

1.4.2 Biến đổi chất lượng của nguyên liệu thủy sản sau khi chết

Động vật thủy sản sau khi chết thì xảy ra hàng loạt biến đổi phức tạp đặc biệt là các biến đổi sâu sắc về hóa học Đó là quá trình phân giải tự nhiên làm cho nguyên liệu biến chất hoàn toàn không thể sử dụng được nữa

Sự biến đổi của động vật thủy sản sau khi chết bao gồm các quá trình cơ bản sau đây:

chất nhớt Sau khi chết chúng vẫn tiếp tục tiết chất nhớt cho đến khi tê cứng và lượng chất nhớt cũng tăng dần, đó là sự tự vệ cuối cùng của chúng

Chất nhớt là những hạt nhỏ thuộc loại glucoprotein ở trong tổ chức của tế bào, sau khi hút nước thì trương lên rồi tích tụ lại trong tế bào, sau đó dần dần tiết ra ngoài

da Thành phần chủ yếu của chất nhớt là mucin, vì vậy nó là môi trường rất tốt cho vi sinh vật phát triển

Sau khi động vật thủy sản chết, kháng thể của chúng không còn, vi khuẩn bám ở ngoài da gặp môi trường tốt sẽ phát triển rất nhanh và xâm nhập vào cơ thể Sự phân hủy chất nhớt làm cho chất nhớt nhão nát ra và biến dần từ trạng thái trong suốt sang vẫn đục và tiếp đến là quá trình thối rửa xảy ra nhanh chóng

• Sự tê cứng sau khi chết

Cá và các động vật thủy sản sau khi chết qua một thời gian sẽ tê cứng lại Trước tiên là cơ thịt ở lưng tê cứng sau đó lan ra toàn thân Sự tê cứng đó sẽ kéo dài một thời gian và tiếp theo thì dần dần trở lại mềm Khi cá cứng cơ thịt vẫn giữ tính chất đàn hồi Miệng và mang khép chặt, cơ thịt cứng, thân cá nhợt nhạt

Trong quá trình tê cứng xảy ra các biến đổi quan trọng như: sự phân giải glycogen, phân giải creatinphotphat, sự tạo thành phức chất actomiozin

Quá trình tiết nhớt và tê cứng thể hiện ra bên ngoài, chúng ta có thể nhận biết được nhờ giác quan Cá sau khi chết chất nhớt được tiết ra nhiều hơn, máu đục mất tính chất miễn dịch là nơi rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Cũng từ chất nhớt này vi sinh vật sẽ xâm nhập vào thịt Khi mới chết, cơ cá duỗi hoàn toàn, cá mềm mại, dễ uốn, tính đàn hồi của cơ thịt cao do cấu trúc của cá lúc này chắc Sau đó các cơ co lại làm thịt cá cứng đờ và mất tính đàn hồi Sau giai đoạn tê cứng, chúng ta có thể nhận biết được sự thay đổi mùi vị trạng thái của cá Sự ươn thối của cá

có thể phát triển đầu tiên ở khoang bụng, sau đó đến da, vẩy, mang, mắt Để đánh giá chất lượng của cá phải kiểm tra đánh giá một cách tổng quát các yếu tố sau:

- Kiểm tra đánh giá cảm quan

- Thành phần hóa học

- Kiểm tra lý học

- Phân tích vi sinh

- 21 - Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tê cứng bao gồm sự khác nhau về giống loài và trạng thái dinh dưỡng Sự khác nhau về giống loài thì hàm lượng glycogen cũng khác nhau, vì vậy ảnh hưởng đến thời gian tê cứng của cá

Cá sau khi đánh bắt, giết chết, cần được bảo quản và vận chuyển cẩn thận nhẹ nhàng, không làm cá tổn thương vì thời gian tê cứng sẽ đến muộn và quá trình cũng sẽ kéo dài Nhiệt độ bảo quản càng thấp thì thời gian tê cứng càng sẽ đến muộn và quá trình tê cứng sẽ kéo dài

• Quá trình tự phân giải

Cá sau khi tê cứng dần dần trở lại mềm, ta gọi đó là sự phân giải hoặc là quá trình

tự chín Quá trình này do các loại men nội tại trong cá hoạt động phân giải Khi động vật còn sống do sự tồn tại của kháng thể nên các loại men thủy phân không hoạt động

tự phân giải tổ chức của mình Sau khi động vật chết sức chống đỡ mất đi nên hoạt động của men sẽ dễ dàng Quá trình tự phân giải này bắt đầu khi cá còn tê cứng

Trong quá trình tự phân giải, tổ chức cơ thịt sản sinh ra nhiều biến đổi về lý hóa,

cơ thịt mềm mại, hương vị thơm tươi, có độ ẩm lớn và dễ bị tác dụng của men tiêu hóa hơn Giai đoạn đầu của quá trình tự chín liên quan đến quá trình ngược lại của quá trình tê cứng vì lúc đó xuất hiện sự phân hủy của actomiozin phần nào thành actin và miozin Sự phân ly này dẫn tới làm tăng số lượng trung tâm ưa nước của protein co rút, làm tăng khả năng liên kết nước của mô cơ Tiếp theo là quá trình phân giải protit của các enzyme làm cho mô cơ mềm dần ra

Quá trình tự chín sẽ làm tăng hương vị của cơ thịt Để phát huy ưu điểm đó, chúng ta cần tiến hành quá trình chín ở nhiệt độ dương thấp (khoảng 1÷40C) để hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn gây thối rữa Trong quá trình tự phân giải, các chất ngấm ra chịu sự biến đổi quan trọng tạo thành những mùi vị đặc trưng Đặc biệt trong quá trình này hàm lượng của hypoxanthin, acid glutamic và muối của nó, acid anozinic, inozin, các andehyt và xeton, đều tăng lên, đó là những thành phần quan trọng của hương vị Hypoxanthin, inozin tự do trong quá trình chín là do ATP trong cơ thịt tự phân giải mà có

Hương vị của thực phẩm nói chung và của cá nói riêng là một vấn đề phức tạp, bởi vì những chất gây hương vị trong thực phẩm chỉ với một lượng rất nhỏ và lại có tính bốc hơi Hương vị của cá không phải chỉ do một hay hai chất nào đó tạo nên mà là

cả một tổ hợp mùi gồm rất nhiều thành phần, cũng có những chất gây mùi tanh của cá

sau khi chết là do trimetylamin (TMA) gây nên Trong quá trình chín này không có sự tham gia của vi sinh vật thì mùi vị đặc trưng của sản phẩm nổi lên rất rõ và cho các giá trị cảm quan cao Nếu hiểu một cách máy móc thì quá trình tự phân giải là do men nội tại hoạt động, còn thối rữa là do vi sinh vật ở bên ngoài xâm nhập vào hoạt động Sản vật của quá trình tự phân giải cuối cùng là axit amin và các chất đạm hòa tan, còn sản vật của quá trình phân hủy thì quá trình phân giải sẽ không tăng lên vô hạn mà đến một mức độ sản phẩm nào đó thì đạt tới trạng thái cân bằng (vì men không hoạt động nữa) Do đó, quá trình tự phân làm tăng thêm mùi vị, nhưng đối với thủy sản thì thường lẫn lộn với quá trình thối rữa cho nên để quá trình tự phân có khi lại làm giảm phẩm chất của cơ thịt Chất béo cũng bị biến đổi trong quá trình tự phân chủ yếu do men lipase và song song với sự phân giải protit Trong quá trình tự phân giải, chỉ số axit của axit béo trong động vật thủy sản có tăng lên Quá trình tự phân tuy làm cho cá biển từ cứng sang mềm nhưng cá vẫn còn tươi tốt

• Những nhân tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân

- Giống loài: sự khác nhau về giống loài dẫn đến sự hoạt động của men khác nhau Tác động tự phân giải ở động vật máu lạnh nhanh hơn loài máu nóng vì men trong động vật máu lạnh mạnh hơn trong động vật máu nóng Trong cá thì các loài cá nổi bơi lội nhiều như cá thu, cá ngừ, tác dụng tự phân giải nhanh hơn loài cá sống ở dưới đáy biển như cá bơn, nguyên nhân cũng do men gây ra

- Môi trường pH: Nếu tăng độ axit của môi trường tức là giảm pH thì tác dụng tự phân giải tăng lên Tuy nhiên, nếu giảm pH đến một mức độ nhất định làm men không hoạt động được nữa thì tác dụng tự phân giải lại giảm Nồng độ của bazơ cho vào càng nhiều thì pH càng tăng và như vậy tác dụng phân giải cũng giảm

- Ảnh hưởng của các loại muối: Muối ăn có tác dụng làm trở ngại cho quá trình tự phân, nồng độ muối ăn càng cao làm trở ngại càng lớn, nhưng không làm ngừng được quá trình tự phân giải

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tê cứng và tự phân giải cũng như quá trình thối rữa sau này Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ phân giải tăng 2÷3 lần Khi nhiệt độ giảm thì tốc độ tự phân giải sẽ giảm như cá ướp lạnh chẳng hạn, nhưng nếu nhiệt độ cao quá nhiệt độ thích hợp thì tốc độ tự phân giải cũng giảm Lý do là vì nhiệt độ quá cao hay quá thấp

- 23 - đều làm giảm hoạt động của men Nhiệt độ thích hợp của từng loại cá khác nhau, nói chung đối với cá biển là 40- 500C, còn đối với cá nước ngọt là 23- 300C

• Quá trình thối rữa

Cá sau khi chết, gặp nhiều điều kiện thuận lợi thì các loại vi sinh vật phát triển rất nhanh, đối với quá trình gây thối rữa của nguyên liệu không phải các loài vi sinh vật

đều tác dụng như nhau mà trong đó họ Pseudomonas là tích cực nhất, còn các loài

khác thì phát triển ít và một số thì giảm đi Cá sau khi chết không kịp thời bảo quản thì

số lượng vi sinh vật tăng lên rất nhanh, đặc biệt là ở phạm vi nhiệt độ cao Khi cá ươn thối, số lượng vi sinh vật trong 1 gam thịt cá đạt tới 107 ÷ 109 tế bào

Sự thối rữa của động vật thủy sản bắt đầu do vi khuẩn yếm khí ký sinh trong cơ thể động vật còn sống Khi cá chết, do điều kiện thích hợp như chất dinh dưỡng cao, nước nhiều, ánh sáng mặt trời và không khí ít, chúng bắt đầu phát triển nhanh chóng

Bộ phận thứ hai phát triển cũng mạnh là ở mang Đồng thời vi khuẩn hiếu khí dính trên da cá cũng bắt đầu phát triển ăn dần vào tổ chức cơ thịt Thời gian xâm nhập của

vi khuẩn vào cơ thịt cá khoảng 24- 60 giờ tùy theo sự lớn nhỏ, chủng loại, nhiệt độ, phương pháp xử lý bảo quản, loại vi khuẩn, gây nên Còn vi khuẩn yếm khí phát triển từ trong nội tạng ăn dần ra cơ thịt Hiện tượng thối rữa xảy ra đầu tiên ở mang, mang mất màu và xám lại, chất nhớt trên da đục ngầu, vảy dễ bong tróc, bốc mùi hôi thối Quá trình thối rữa phân hủy các acid amin thành các sản vật cấp thấp như indol, skatol, phenol, cadaverin, putresin, các loại axit có đạm, axit béo cấp thấp, H2S, thioalcol, CH4, NH3, CO2. nhuưng cũng còn phân hủy các chất khác

Thịt cá rất dễ thối rửa là vì:

- Lượng nước trong thịt cá cao và nói chung thì lượng mỡ tương đối ít

- Sau khi chết, cá dễ chuyển sang môi trường kiềm tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển

- Kết cấu của tổ chức thịt cá lỏng lẻo, mềm nhão

- Khi ở nhiệt độ bình thường, vi khuẩn sống trên thân cá rất nhiều, đặc biệt là lớp chất nhớt là môi trường rất tốt cho vi khuẩn phát triển

- Trong thịt cá chết rất ít chất miễn dịch tự nhiên kháng thể kém

- Cá có nhiều men nội tại và hoạt tính của chúng rất mạnh, khi cá chết sẽ phát triển theo hướng thủy phân tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật gây thối rữa Quá trình thối rữa làm cho thịt cá thiu thối, mất giá trị dinh dưỡng

Quá trình thối rữa còn bị ảnh hưởng của quá trình tự phân giải, ảnh hưởng của phương pháp đánh bắt và bảo quản nguyên liệu [9]

1.5 Các phương pháp bảo quản cá

Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò rất dễ bị biến chất và hư hỏng Nguyên nhân gây hư hỏng do tự bản thân trong tế bào có sẵn enzym thúc đẩy quá trình oxy hóa xảy ra, do vi sinh vật và các yếu tố bên ngoài (như nhiệt độ và độ ẩm) Vì vậy cần có những phương pháp xử lý, bảo quản để giữ được chất lượng, hạn chế tổn hao dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm cho nguyên liệu thủy sản cũng như cá giò

Những năm gần đây, xuất khẩu thủy sản Việt Nam có những bước tiến nhảy vọt Năm 2002, lần đâu tiên kim ngạch xuất khẩu vượt qua con số 2 tỷ đô la Chất lượng hàng thủy sản tiêu thụ nội địa cũng không ngừng được cải thiện, đáp ứng yêu cầu ngày một cao của nhân dân Đạt được những thành công đó, một trong những yếu tố quan trọng là nhờ những người làm công việc khai thác và nuôi trồng thủy sản đã bảo quản tốt nguyên liệu cho khâu chế biến, tạo thành một dây chuyền đồng bộ, khép kín, giữ cho sản phẩm luôn được tươi tốt

Tùy tùng điều kiện cụ thể của từng ngư dân, doanh nghiệp sản xuất thủy sản mà

có phương pháp bảo quản cá và nguyên liệu thủy sản khác nhau: Phương pháp truyền thống, phương pháp hiện đại hoặc kết hợp nhiều phương pháp Có thể bảo quản cá ở nhệt độ thấp, hóa chất bảo quản, chất kháng sinh, xung điện trường…

a Bảo quản cá nguyên liệu ở nhiệt độ thấp

Dựa vào nguyên lý chung là khi nhiệt độ hạ thấp thì enzym và vi sinh vật trong nguyên liệu bị giảm hoạt động hoặc có thể bị đình chỉ sự sống, như vậy nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian Trong phạm vi nhiệt độ bình thường, cứ nhiệt độ hạ xuống 100C thì phản ứng sinh hóa giảm xuống 1/2 đến 1/3, khi nhiệt độ hạ xuống thấp

sẽ làm ức chế hoạt động sinh lý của vi sinh vật cũng như enzym Ví dụ như nhiệt độ nhỏ hơn 100C, vi khuẩn gây thối rữa và vi khuẩn gây bệnh bị kìm chế phần nào, ở 00C thì tỷ lệ phát triển của chủng rất thấp, ở -50C đến -100C thì hầu như không phát triển được Nhưng vẫn có loài vi khuẩn khi nhiệt độ hạ xuống -150C vẫn phát triển được

như: Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium…

Giữ tươi ở nhiệt độ thấp có hai phương pháp là ướp lạnh và ướp đông

• Phương pháp ướp lạnh sơ bộ

Ướp lạnh sơ bộ được ngư dân sử dụng phổ biến để bảo quản nguyên liệu mới đánh bắt Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm nhưng giữ tươi trong thời gian ngắn

- 25 - Phương pháp ướp lạnh là hạ nhiệt độ xuống 00C hoặc -10C có thể sử dụng kho lạnh, nước biển lạnh hoặc nước đá để bảo quản Trong đó bảo quản bằng nước đá là phổ biến nhất, người ta sử dụng nước đá vảy hoặc nước đá vụn kết hợp với muối ăn để tăng khả năng làm lạnh Tỷ lệ muối ăn dùng 15 – 20 % so với lượng nước đá và lượng nước đá là 100 – 128% so với lượng cá như vậy có thể làm cho nhiệt độ hạ xuống -8 ÷ -100C Tiến hành bảo quản bằng cách cứ một lớp muối đá rồi một lớp cá ướp cho vào thùng gỗ, dung tích thùng chứa 25 ÷ 30 kg và chiều cao lớp nguyên liệu không nên quá 30 cm [9]

Tùy vào mục đích và thời gian bảo quản mà người ta chọn nhiệt độ bảo quản khác nhau có thể -180C, -250C…Phương pháp này chỉ áp dụng với các nhà máy chế biến với quy mô lớn, sử dụng các kho, tủ cấp đông Để tăng hiệu quả bảo quản trước khi cấp đông nguyên liệu có thể được lấy hết ruột rửa sạch nội tạng

b Bảo quản cá nguyên liệu bằng hóa chất

Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo quản nguyên liệu rất có hiệu quả Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với nhiệt độ thấp, có lạnh thì giữ được tươi hơn

Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản

Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: Muối vô

cơ, acid, chất hữu cơ

Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khác nhau:

• Muối vô cơ

Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite Ca(OCl)2, natri nitrit (NaNO2), natri chlorua (NaCl) bằng cách chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá ướp, còn khi pha thành đung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2÷5 phút sau đó mang bảo quản lạnh

ta còn dùng rơm, cỏ khô, mùn cưa…được tẩm acid để bảo quản

• Chất hữu cơ

Nói chung các chất hữu cơ thường được sử dụng hạn chế trong bảo quản nguyên liệu tùy theo quy định của các nước

Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối natri của

nó, formaldehyt và sulfathiazol…và chúng được sử dụng dưới dạng chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch

c Bảo quản bằng cách dùng thuốc chống oxy hóa

Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay sinh

ra sản phẩm ôi khét, ôi thối Nguyên nhân là do hiện tượng oxy hóa, đốt cháy mỡ sinh

ra Để ngăn chặn hiện tượng đó người ta tiến hành bảo quản lạnh kết hợp với chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa được dùng như: Acid citric, acid tactric, tocopherol (vitamin E), butyl hydroxyanizol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT)…Chúng không

có khả năng phục hồi lại các chất béo đã hỏng mà có tác dụng chống sự oxy hóa hoặc

để chống oxy Chất chống oxy hóa được sử dụng dưới dạng dung dịch, nước đá [9]

- 27 -

d Bảo quản bằng phương pháp sinh học kết hợp bảo quản lạnh

Sử dụng phương pháp sinh học để làm chậm thời điểm bắt đầu tê cứng hoặc kéo dài quá trình tê cứng của cá để giữ cá được tươi, có nghĩa là làm chậm sự phân giải ATP Muốn làm giảm sự phân giải ATP trong tổ chức cơ thịt cá thì tìm mọi cách làm cho cá chết ngay, không để cho cá giãy giụa hoạt động Có nhiều cách làm cho cá ngừng hoạt động như thả cá vào nước 20C, dùng điện trường, các chất gây mê cho cá ngủ trong một thời gian nhất định Cá sau khi chết phải thả ngay vào nước biển hoặc nước muối pha loãng 1÷2 giờ để rửa sạch máu, nhiệt độ nước rửa phải thấp hơn nhiệt

độ cá sống 2÷30C, không được thấp quá sẽ làm cơ thịt co rút lại và mau tê cứng Cá sau khi rửa xong vớt ra bảo quản 100C khi vận chuyển cá đi nơi khác dùng nước đá để bảo quản Cá được xếp trong bao polyethylene và xếp thành từng con vào thùng gỗ, nước đá chỉ phủ phần đầu không ướp nước đá xuống thân để phòng hạ thấp nhiệt độ Trong quá trình vận chuyển tránh mọi va chạm, giữ cá được yên tĩnh [9]

e Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh

Truớc đây chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo quản nguyên liệu Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên cứu và sử dụng thận trọng hơn

f Bảo quản cá nguyên liệu bằng dịch bacteriocin

Bacteriocin là những đoạn peptid hoặc protein có hoạt tính kháng khuẩn được sản xuất trừ nhiều loại vi khuẩn khác nhau Bacteriocin được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và nó được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để giảm chất bảo quản hóa học đưa vào thực phẩm và nó tốt hơn phương pháp xử lý nhiệt Bảo quản bằng bacteriocin thì thực phẩm giữ được các tính chất đặc trưng về cảm quan và dinh dưỡng Đây là phương pháp bảo quản tự nhiên, nó có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về sản phẩm ăn liền tiện lợi, an toàn, tươi, sạch của chế biến thực phẩm và phát triển các sản phẩm mới Ngoài các sản phẩm thương mại sẵn có như nisin, pediocin PA – 1/AcH còn có các loại khác như lacticin 3147, enterocin AS-

48 hoặc variacin cũng đầy hứa hẹn

Bacteriocin được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu cũng như trong thực phẩm dưới các hình thức cho vào phụ gia, làm chất độn, nuôi cấy vi sinh vật bổ sung vào

nguồn nguyên liệu để nó tự sản sinh bacteriocin, cũng có thể tạo các bacteriocin cố định trên bao bì bảo quản [19]

Trong những năm gần đây việc kết hợp giữa bacteriocin với xử lý nhiệt hay xung điện trường, bảo quản lạnh, điều chỉnh hỗn hợp khí…cho kết quả tốt hơn khi dùng riêng bacteriocin để bảo quản Các phương pháp này ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong bảo quản thực phẩm nhưng ở Việt Nam còn hạn chế Ngoài ra, người ta còn xử dụng bacteriocin kết hợp với phương pháp điều chỉnh hỗn hợp khí, bức xạ điện ly nhưng nó ít được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản

1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

1.6.1 Trên thế giới

Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác Đặc tính này là do vi khuẩn lactic có thể sinh sản không chỉ các acid hữu cơ mà còn sản sinh ra các bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm [17]

Gao và đồng tác giả (2010) đã nghiên cứu sản xuất bacteriocin từ Lactobacillus

sake C2 được tách ra từ bắp cải lên men Kết quả sakacin C2 đã thể hiện được phổ

kháng khuẩn rộng có độ bền nhiệt tốt (15 phút ở 121oC) và bền pH acid (pH 3,0-8,0) Sakacin C2 nhạy cảm với protease nhưng không nhạy cảm với lipase, α-amylase và β-amylase [20]

Zhang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu ứng dụng pectocin 31-1 (Lactobacillus

pentosus 31-1 phân lập từ Xuan Wei Ham lên men truyền thống ở Trung Quốc) nhằm

bảo quản thịt heo ở 40C Kết quả trong 15 ngày bảo quản, thịt heo có màu sắc, cấu trúc, mùi tốt hơn là chỉ bảo quản lạnh [31]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có các tính chất ưu việt khi dùng cho bảo quản thực phẩm như an toàn với người sử dụng; không độc đối với tế bào nhân chuẩn; bị phân hủy bởi protease trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã vi sinh vật trong ruột người; hoạt động trong khoảng pH rộng và chịu nhiệt; có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền [19]

- 29 -

Một nghiên cứu về các chủng Lactobacillus phân lập từ phế liệu rau quả tại các

chợ địa phương ở Ấn Độ đã cho thấy chúng có thể sinh tổng hợp các loại bacteriocin bền nhiệt ở 100°C hoặc 121°C trong 10 phút [24]

Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm và nhận thấy sử dụng bacteriocin có thể kéo dài thời gian bảo quản, tăng cường bảo vệ thực phẩm trong các điều kiện nhiệt độ bất thường, làm giảm nguy

cơ truyền bệnh qua chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư hỏng thực phẩm, giảm

tỷ lệ sử dụng phụ gia trong bảo quản thực phẩm…[19]

Về mặt công nghệ, bacteriocin đã và đang được sử dụng kết hợp với hàng loạt kỹ thuật khác để tăng cường khả năng bất hoạt vi sinh vật đích Người ta có thể sử dụng kết hợp bacteriocin với các chất kháng khuẩn khác, với xử lý nhiệt độ, với áp lực thủy tĩnh cao trong công nghệ HHP (high hydrostatic pressure), với trường xung điện trong công nghệ PEF (Pulsed electric field), hay với siêu âm, chiếu xạ, vi sóng…[19] Lựa chọn kỹ thuật nào phụ thuộc chủ yếu vào loại thực phẩm và thành phần vi sinh vật

1.6.2 Trong nước

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản thực phẩm, thủy sản còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan

Trong những năm 2004, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã khảo sát đa dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa động vật (Đề tài khoa học cơ bản 2004-2005, mã số: 62 05 04) Nhóm tác giả Đại học Quốc Gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh bacteriocin của chủng

Lactobacillus plantarum L24 và nhận thấy vi khuẩn này vừa có khả năng sinh lactic

acid vừa có khả năng sinh bacteriocin II [6] Bacteriocin đã được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel và điện di trên gel SDS-PAGE có trọng lượng phân tử vào khoảng 10-30 kDa

Ngoài ra, một nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản sinh bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như E

coli, Samonella và một số vi khuẩn lactic khác [3] Nghiên cứu này còn cho thấy

bacteriocin bắt đầu được sản sinh ở L.acidophilus từ giờ thứ 12, ở nhiệt độ 30÷370C với pH 5÷7 và vi khuẩn có thể sử dụng các loại đường như manitol, maltose, lactose