Tính kháng thuốc Oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA thường được quan tâm hơn bởi những tác động của chúng lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới trong quy trình gây dịch tại các

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-* -

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

-* -

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

NGHIÊN CỨU SINH

Hoàng Vũ Mai Phương

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

 Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

 Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung Ương

Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện

cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin gửi

lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp

đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ

Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác

tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã

nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức

khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên

của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu

Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết

lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay

Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013

HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Chữ viết tắt vii

Danh mục bảng viii

Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 4

1.1 Vi rút cúm A 4

1.1.1 Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A 4

1.1.2 Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A 11

1.1.3 Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A 13

1.1.4 Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A 15

1.1.5 Khả năng gây bệnh của vi rút cúm 16

1.1.6 Tiến hóa của vi rút cúm A 17

1.2 Phòng và điều trị cúm A 18

1.2.1 Văc xin phòng cúm 18

1.2.2 Thuốc điều trị vi rút cúm A 20

1.2.3 Các thuốc kháng vi rút mới 23

1.3 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 25

1.3.1 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine 25

1.3.2 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir 26

1.4 Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 27

1.4.2 Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự

thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm 28

1.4.3 Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase 32

1.4.4 Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm 34

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3 Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 38

2.3.1 Vật liệu 38

2.3.2 Kỹ thuật xét nghiệm 42

2.4 Phân tích số liệu 51

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 53

3.1 Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 53

3.2 Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A 54

3.3 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 60

3.4 Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir 65

3.5 Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 69

3.6 Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu 72

4.1 Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu 86

4.2 Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50) 88

4.3 Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc

oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam 94

4.4 Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến

và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian 98

ABI Applied Biosystems

(Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng)

(Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản)

SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)

(Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ)

Bảng Tên bảng Trang

1.1 Các phân đoạn gen của vi rút cúm A 6 3.1 Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu 53 3.2 Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu

và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn 56

3.3 Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và

2009 60 3.4 Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm

2009 và 2011 61 3.5 Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 62

3.6 Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 62 3.7 Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với

oseltamivir 64 3.8 Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm

đột biến 70 3.9 Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu

dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) 71

Hình Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc vi rút cúm 4

1.2 Hình ảnh vi rút cúm 4

1.3 Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm 10

1.4 Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm 10

1.5 Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút 12

1.6 Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine 21

1.7 Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir 22

1.8 Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào 23

2.1 Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen 50

3.1 Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 66

3.2 Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 67

3.3 Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 68

3.4 Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 69

3.5 Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 74

3.6 Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009 75

3.7 Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 76

3.8 Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009 77

3.9 Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 79

3.10 Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 80

3.11 Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 83

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.1 Quá trình phân lập vi rút cúm 43 2.2 Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm 45

3.1 Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 55 3.2 Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên

cứu 57 3.3 Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong

nghiên cứu 58 3.4 Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên

cứu 58 3.5 Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên

cứu 59 4.1 Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 86

Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013 Bệnh cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa

Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên 21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao

Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải

có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin

sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split vaccine)…) Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir ) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1 Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút

có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau Hiện tượng kháng thuốc có thể ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh nhân và xã hội [28, 81, 90, 121]

Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan

trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Các nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51] Số liệu từ các nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1 lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến

2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009) [27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với amantadine

Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37] Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm

2001 [56, 58, 60] Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc

Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu:

- Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam

- Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50)

vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm A

1.1.1 Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A

Cấu tạo chung

8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein Về mặt cấu trúc, nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền (M1), phía ngoài màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là

lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng

sinh chất của tế bào chủ Protein M2

đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài,

tạo thành các kênh ion, làm cho pH

trong endosome thay đổi, có vai trò

quan trọng trong việc hình thành hạt

vi rút mới Trên phần vỏ có 2 loại

Hình 1.2 Hình ảnh vi rút cúm Nguồn: www.nature.comglycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1

và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid bằng đầu kỵ nước Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là neuraminidase (NA) Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp

Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid Tồn tại trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA

và các protein không cấu trúc NS (non structure)

Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A

Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút

Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã

hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể Protein HA được tổng hợp ở dạng tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0 Dưới điều kiện pH axit và các enzyme phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nốidi-sulphua [19] Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm nhiễm

Bảng 1.1 Các phân đoạn gen của vi rút cúm A

Chiều dài protein được mã hóa (Axit amin)

Chức năng

enzyme nội bào

bào chủ

xâm nhập vào tế bào chủ

quá trình nhân lên của vi rút

tế bào chất (trong tế bào chủ)

Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic Ngoài ra, HA gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118] Năm vị trí quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác với kháng thể của vật chủ Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút

Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,

neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6 Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ Việc loại

bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo

vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm Neuraminidase cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm Sự hoạt động của neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết của tế bào chủ Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động

của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm

nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122]

Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút Sử dụng HA để xác định phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi

[105] Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1

Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể

HA Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1 tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V, Q136K, R292K và N294S

Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao,

mã hóa cho hai protein M1 và M2 Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26 đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 26-

51 và từ 740-1007 [19, 65] Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp

vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của

vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào

trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57]

Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này Tuy nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52] Hiện tượng kháng amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen

M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á

Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53]

Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các

phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1.3 và hình 1.4) Trong quá trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1 Đột biến E627K (Glutamin chuyển thành Lysin) trên PB2 của vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút trên vật chủ mới - người (vi rút tồn tại và nhân lên trên gia cầm tại nhiết độ tối ưu là 37oC, khi mang gen đột biến, vi rút có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào đường hô hấp trên của người – với nhiệt độ tối ưu là 33oC) [99] Đột biến này đã được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62, 63] Một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 (87 axit amin) có chức năng thúc đẩy quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi rút cúm B và C [65, 122]

Nucleoprotein (NP): NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi

rút cúm có tính bảo tồn cao đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên, tạo thành hạt vi rút mới [43] Chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới Ngoài ra, NP tương tác

với và các protein PB1 và PB2 nhưng không xảy ra với protein PA [85] Các enzyme này khi hoạt hóa sẽ tham gia vào quá trình nhân lên và phiên mã RNA của

vi rút cúm đồng thời hoạt động như một nuclease nội bào có liên hệ với

ribonucleoprotein (RNP)

Hình 1.3 Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm

Hình 1.4 Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge

Protein không cấu trúc (NS1-NS2): NS1 và NS2 được mã hóa bởi đoạn RNA

số 8 Phần NS1 có chức năng cản trở sự di chuyển của mRNA tế bào từ nhân ra tế bào chất tạo điều kiện cho RNA của vi rút được phiên mã ở ribosome của tế bào chủ Ngoài ra, NS1 còn được cho là tham gia vào ức chế quá trình sản xuất interferon, chất có khả năng làm giảm sự nhân lên của vi rút cúm, của tế bào chủ Phần NS2 của protein không cấu trúc này được tổng hợp sau NS1 và được biết với chức năng tạo thuận lợi cho việc vận chuyển các RNP mới được tổng hợp từ nhân

ra tế bào chất tăng cường cho quá trình nhân lên của vi rút [43, 118, 122]

Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2937865/

1.1.2 Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A

Sự bám dính của vi rút

Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamagglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt

tế bào Tùy vào tế bào chủ là tế bào biểu mô đường hô hấp của người hay gia cầm

mà vi rút cúm có thể sử dụng phần α2,3 hay α2,6 axit sialic trong protein HA để bám dính vào thụ cảm thể của tế bào chủ Ngay khi quá trình bám dính hoàn thành,

vi rút tiếp tục ngay quá trình thâm nhập vào tế bào chủ

Sự thâm nhập của vi rút

Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào, toàn bộ vi rút được bao bọc bởi màng tế bào chủ và đưa vào trong tế bào chất của tế bào chủ qua thể thực bào trong điều kiện pH thấp

Sự cởi áo của vi rút

Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, đồng thời làm tăng cường sự hòa màng từng phần của protein HA trên màng sinh chất với màng của thể thực bào Dòng ion từ nội bào tràn vào hạt vi rút dẫn đến sự mất liên kết giữa các protein của vi rút, khiến cho các RNP vi rút thoát khỏi sự kiểm soát của vỏ vi rút (vi rút cởi áo) Khi quá trình hòa màng đã hoàn thành, các RNP được giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ

Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút

Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA của vi rút cúm được tổng hợp

và nhân lên tại nhân tế bào Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp polymerase gắn vào RNA của vi rút, đồng thời cắt mRNA của tế bào chủ bằng hoạt động của nuclease nội bào Nuclease nội bào của vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ

và metyl hóa của mRNA của tế bào chủ với độ dài khoảng 13 đến 15 ba-zơ và dùng đoạn này làm mồi để tổng hợp mRNA của vi rút Enzyme RNA polymerase của vi

rút thực hiện quá trình tổng hợp sợi mRNA bổ sung với RNA đơn âm Phần intron (vùng câm) của mRNA vi rút bị cắt bởi các enzyme của tế bào để các protein M1 hay NS1 được tổng hợp mà không cần thêm một sự phân cắt nào Một số protein mới được tổng hợp quay trở lại nhân tế bào gắn vào RNA để hình thành RNP Các protein còn lại di chuyển tới lưới nội bào và thể Golgi thực hiện quá trình glucosyl hóa sau đó tiếp tục tới màng tế bào và gắn vào lớp lipid kép của màng Khi quá trình gắn của các protein vào màng hoàn chỉnh, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút Cuối cùng, hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của neuraminidase (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút

Nguồn: Nature Review – Drug Discovery

1.1.3 Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A

Những thay đổi nhỏ trên gen

Polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên (khoảng một lỗi sai sau mỗi lần nhân lên) và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới Những biến đổi này xuất hiện một cách tự nhiên trên các phân đoạn gen của vi rút cúm nhưng chỉ làm xuất hiện những thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên của vi rút Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA thường được quan tâm hơn bởi những tác động của chúng lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới trong quy trình gây dịch tại các năm tiếp theo, ước tính khoảng một phần trăm khác biệt trong số axit amin của HA và NA xuất hiện trong mỗi mùa dịch [6, 43, 70] Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm Những thay đổi nhỏ xảy ra trên protein bề mặt HA và NA được ghi nhận thường xuyên nhưng lại hiếm khi với các nucleoprotein [52]

*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA

Protein HA đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện kháng nguyên của vi rút cúm Vùng đầu chỏm của protein HA mang 5 vùng quyết định kháng nguyên, mỗi

sự thay đổi trong những vùng này cũng có ảnh hưởng nhất định đến đặc tính kháng nguyên của vi rút [51, 94] Protein HA của vi rút A/H3N2 có sự thay đổi sau mỗi 3 năm Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch chéo giữa vi rút H3N2 lưu hành nổi trội với vi rút H3N2 lưu hành trước đó vẫn xảy ra [97] Điều này chứng tỏ sự thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA chưa tạo ra được sự né tránh miễn dịch toàn bộ của vi rút cúm cho dù tần suất thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H3N2 diễn ra nhanh (3 năm), những chủng H3N2 mới vẫn chịu ảnh hưởng của miễn dịch tồn lưu được tạo ra bởi vi rút lưu hành những năm trước đó

*Những thay đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa NA

Cũng giống protein HA, protein NA cũng có những thay đổi nhỏ xảy ra trong quá trình hoạt động Các nghiên cứu đã chỉ ra sự thay đổi của axit amin xảy ra trên

bề mặt của protein NA, nơi có các điểm gắn với axit sialic (vị trí 222, 329 và 344 trên gen N2) [92, 118] Tương tự kháng nguyên bề mặt HA, kháng nguyên NA cũng

có khả năng tạo kháng thể có tính bảo vệ Các đột biến, thay đổi trên protein NA (đặc biệt tại khu vực bảo tồn) ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của NA trong quá trình đáp ứng miễn dịch, vi rút cúm thay đổi để "tránh né" ảnh hưởng của kháng thể kháng NA, tạo nên một dòng kháng thể mới khác biệt so với dòng kháng thể thu được trước đây khi chưa xuất hiện đột biến [92] Tuy nhiên, chỉ miễn dịch thu được khi tác dụng với phần bảo tồn của NA mới mang tính bảo vệ

*Những thay đổi nhỏ trên gen M

Tìm hiểu về tiến hóa của gen M cho thấy M1 có sự thay đổi axit amin ở mức 26,4% và M2 có sự thay đổi 48,5% axit amin Sự khác biệt này là do gen M2 chịu

áp lực chọn lọc của kháng thể bảo vệ cao hơn M1 Tuy nhiên, sự thay đổi nhiều trên gen M2 chỉ quan sát thấy trên các vi rút cúm người và cúm lợn, hầu như không xảy

ra với các chủng cúm gia cầm Quan sát gen M1, hầu hết các thay đổi trên gen đều không dẫn đến thay đổi axit amin, ngoài ra, so sánh tần suất đột biến theo năm trên M1 và M2 và các gen còn lại của vi rút cho thấy tần suất này thấp hơn tần suất đột biến của gen còn lại, do vậy có thể coi gen M là gen có tính bảo tồn cao [29]

Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên

Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm so sánh các vi rút phân lập được từ những vụ dịch những năm 1918, 1947-1956, 1957-1967, 1968 cho thấy những vụ dịch này cùng có một nguyên nhân là cúm A phân típ H1N1 nhưng có sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên (không có hoặc có kết quả phản ứng chéo với hiệu giá không cao khi thực hiện phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu giữa vi rút mới xuất hiện và các kháng thể tồn lưu tạo ra bởi các phân típ vi rút cũ)

Như vậy, tuy cùng mang tên một phân típ vi rút (H1N1) nhưng bản chất vi rút đã

có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết

Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới (đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1) [51, 70, 97, 98] Việc xuất hiện các biến đổi lớn dẫn đến sự thay đổi hoàn toàn đặc tính kháng nguyên trên cả hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA của vi rút cúm được giải thích bằng giả thuyết của sự trao đổi và tích hợp giữa các phân típ vi rút khác nhau

1.1.4 Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với hệ gen phân đoạn như vậy, sự tái sắp xếp của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân típ khác nhau trên một vật chủ Kết quả là

sự tạo ra một loại vi rút mới có hệ gen là sự trộn và sắp xếp lại các phân đoạn gen của các vi rút cúm đồng nhiễm Trên thực tế, khi phân tích gia hệ chủng vi rút cúm A/H1N1 lưu hành từ năm 1918 đến nay thấy rằng vi rút đã trải qua nhiều lần trao đổi và tích hợp gen của từng phân đoạn gen Phân đoạn gen mã hóa PB1, NA và M xuất hiện từ đầu những 1940 vẫn lưu hành trong các vi rút của năm 1947, đặc biệt phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút gây dịch năm 1947 hoàn toàn khác so với HA của các chủng vi rút lưu hành năm 1943-1945 [12, 30, 33] Năm 2009, chủng H1N1 gây đại dịch có sự trao đổi và tích hợp giữa vi rút cúm người, cúm gia cầm và cúm lợn, trong đó các phân đoạn gen mã hóa HA, NP, NS được tích hợp từ chủng cúm lợn, NA, M từ chủng vi rút cúm lợn Á Âu, đặc biệt PA và PB2 là 2 gen có mức trao đổi tích hợp cấp ba (2 gen này là sự trao đổi của cả 3 chủng vi rút cúm từ người, gia cầm và lợn) [5, 27] Chủng vi rút cúm này mang bộ gen có sự trao đổi vào tích hợp với bộ gen có nguồn gốc từ vi rút gây bệnh cho người nên chủng vi rút mới hoàn toàn có khả năng nhân lên tại các tế bào biểu mô đường hô hấp ở người và dễ dàng lan truyền trong quân thể người với phạm vi lớn Tuy nhiên, các protein bề mặt của

vi rút mới khác biệt hoàn toàn với các chủng vi rút cúm gây bệnh cho người lưu hành trước đó và vật chủ không được bảo vệ bởi các kháng thể tồn lưu Vi rút cúm mới xuất hiện H7N9 cũng mang hệ gen có sự trao đổi và tích hợp cao, trong đó phân đoạn gen mã hóa HA tương tự gen H7 của gia cầm, phân đoạn gen mã hóa NA tương tự N9 của vi rút A/H11N9, các gen còn lại tương tự vi rút A/H9N2 [63] Ngoài ra, qua sự trao đổi và tích hợp này, vi rút cúm mới có thể mang gen kháng thuốc từ chủng vi rút cúm khác, điển hình là gen M mang đột biến kháng amantadine của vi rút H1N1pdm09 và phân đoạn gen mã hóa NA mang đột biến kháng oseltamivir của vi rút H7N9 [30, 63] Như vậy, chủng vi rút mới sẽ có thể là căn nguyên của đại dịch lan rộng toàn cầu, đe doạ sự an toàn của các quốc gia và sức khoẻ của người dân trên toàn thế giới [33, 34]

1.1.5 Khả năng gây bệnh của vi rút cúm

Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành Thời gian ủ bệnh trung bình là 2 ngày, thường kéo dài từ 1 đến 4 ngày [43], sau đó bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng như: sốt, mệt mỏi, đau mỏi cơ chủ yếu vùng lưng và các triệu chứng chảy mũi, chảy nước mắt… Bệnh nhân có thể hết sốt sau 5 đến 7 ngày kèm theo mệt mỏi và ho, sau khoảng 10 ngày thì hồi phục nếu không có biến chứng bội nhiễm [4]

Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, khởi đầu tại Tây Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cúm A/H1N1 gây nên là một trong những dịch cúm gây tỉ lệ tử vong cao, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm [43] Dịch cúm châu Á năm 1957-1958 có nguồn gốc từ Singapore do vi rút cúm A/H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong Dịch cúm xảy ra năm 1968-1969 tại Hồng Kông do vi rút cúm A/H3N2 gây nên [84] Dịch cúm A/H1N1pdm09 xảy ra năm 2009 khởi đầu tại Mexico, sau đó nhanh chóng lan sang Hoa Kỳ, Canada, châu Âu và châu Á Cuối tháng 5 năm 2009, Việt Nam ghi nhận

ca mắc cúm A/H1N1 đại dịch đầu tiên Số ca mắc bệnh tăng nhanh, đến tháng 12 năm 2009 đã có hơn mười nghìn mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm cúm A/H1N1pdm09 được gửi đến PTN cúm, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [2] Dịch cúm gia cầm đầu tiên xuất hiện tại Hồng Kong 1997-2002 gây ra bởi vi rút cúm A phân típ H5N1 Vi rút lây từ gia cầm sang người, tử vong 6/18 trường hợp mắc [95] Năm

2003, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại Việt Nam, tính đến nay đã có 125 trường hợp được khẳng định nhiễm cúm A/H5N1, có 62 trường hợp tử vong [115] Tháng

3 năm 2013, tổ chức Y tế Thế (TCYTTG) giới nhận được thông báo các trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên tại Trung Quốc, vi rút được xác định lây từ gia cầm sang người với tổng số người nhiễm là 133 và số tử vong là 34 [116]

Dựa vào các số liệu giám sát tại phòng thí nghiệm từ năm 2001 và chương trình giám sát cúm quốc gia tại Việt Nam (viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp với US-CDC từ năm 2006), bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh

rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân típ cúm A (tháng 7 – tháng 8) [5]

1.1.6 Tiến hóa của vi rút cúm A

Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen Những thay đổi nhỏ xảy ra thường xuyên có thể không tạo sự thay đổi về kháng nguyên nhưng tạo nên sự đa dạng trong kiểu gen của các chủng vi rút cúm Những thay đổi lớn gây ảnh hưởng đến tính kháng nguyên, tuy xảy ra với tần suất thấp, nhưng là sự thay đổi quan trọng trong tiến hóa của vi rút cúm Điểm đặc trưng trong tiến hóa của vi rút cúm là sự trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen để tạo ra phân típ vi rút cúm mới Hiệu ứng của sự tiến hóa này là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên, sự thay đổi vật chủ, sự tăng độc lực, tăng khả năng lây truyền, kháng thuốc…

Sự tiến hóa của vi rút cúm A được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi, chỉ xảy

ra rải rác trong quần thể vi rút cúm, dưới ảnh hưởng của một số hiện tượng như:

cùng đồng nhiễm trên một vật chủ, hoặc xuất hiện của một biến thể vi rút từ nơi khác [83] Hai phân đoạn gen mã hóa cho glycoprotein bề mặt HA và NA chịu áp lực lớn từ khả năng trung hòa của kháng thể sinh ra trong quá trình nhiễm bệnh Các phân đoạn gen còn lại tuy không chịu áp lực chọn lọc từ đáp ứng miễn dịch nhưng lại được cho rằng chúng đã phải trải qua quá trình chọn lọc để thích nghi với từng loài vật chủ trong đó điển hình là phân đoạn gen mã hóa PB2 [57]

Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa Ngoài ra, với việc sử dụng thuốc kháng vi rút, hiện tượng kháng thuốc đã xuất hiện, như vậy, vi rút đã bắt đầu thay đổi để thích nghi với môi trường và những thay đổi này sẽ là những bước tiến hóa tiếp theo của vi rút cúm

1.2 Phòng và điều trị vi rút cúm A

1.2.1 Văc xin phòng cúm

Văc xin phòng bệnh cúm bắt đầu được áp dụng từ năm 1945 với mục tiêu giảm

tỉ lệ mắc cúm, giảm gánh nặng bệnh tật do vi rút cúm gây nên Các loại văc xin đưa vào sử dụng được sản xuất trên trứng gà có phôi với kháng nguyên gồm hai chủng

A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới Sự lựa chọn các chủng vi rút được TCYTTG thực hiện vào tháng Hai hàng năm với các nước ở Bắc Bán cầu, tháng Chín hàng năm với các nước ở Nam Bán cầu [117] Để đạt được hiệu quả trong phòng bệnh, văc xin phải được tiêm chủng trong cộng đồng hàng năm, do khả năng biến đổi nhanh của vi rút trên phân đoạn gen mã hóa HA và

NA Tuy nhiên, tại Việt Nam, văc xin phòng cúm chưa được sử dụng rộng rãi trong toàn bộ quần thể dân cư, do đó hiệu quả phòng bệnh còn hạn chế

Các loại văc xin

Văc xin bất hoạt

Loại văc xin này được sản xuất từ các chủng vi rút nuôi trong túi niệu của trứng

gà có phôi sau đó bị bất hoạt bởi formandehyde hoặc β-propiolacton rồi tinh sạch bằng siêu ly tâm Loại văc xin này bao gồm văc xin toàn phần và văc xin bán phần Văc xin toàn phần an toàn và có khả năng dung nạp tốt với hiệu lực bảo vệ ở người lớn và trẻ em là 60-90% Văc xin bán phần chỉ gồm hai thành phần là protein HA và

NA, các thành phần khác của vi rút đã được loại bỏ Loại văc xin này gây ít phản ứng phụ tuy nhiên có ý kiến cho rằng văc xin kém hiệu quả trong trường hợp có sự

lưu hành của chủng vi rút mới [50]

Văc xin sống giảm độc

Văc xin này được áp dụng nhằm mục đích tăng cường đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tại chỗ (tại đường hô hấp) của cơ thể đối với vi rút cúm Khác với văc xin bất hoạt, thành phần của văc xin sống giảm độc là các chủng vi rút được thích ứng ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ cơ thể (25oC) để khi được đưa vào qua đường mũi với nhiệt độ cơ thể các vi rút sẽ bị bất hoạt nhằm kích thích sinh kháng thể ngay tại đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới đồng thời cũng tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào Loại văc xin này đã được đưa vào sử dụng tại Mỹ

vào năm 2003 và những năm trước đây tại Liên Xô cũ với độ an toàn khá cao [50]

Các loại văc xin thế hệ mới

Việc sản xuất văc xin có thành phần là các vi rút cúm được nuôi cấy trên tế bào MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) hoặc tế bào Vero có khả năng thay thế văc xin sản xuất trên trứng gà có phôi đang được các nhà sản xuất văc xin quan tâm không chỉ vì khả năng tăng năng suất mà còn bởi tác dụng phụ của loại văc xin này

được hi vọng là thấp hơn loại văc xin đang sử dụng hiện tại

Văc xin được sản xuất dựa trên ứng dụng công nghệ gen (văc xin sử dụng công nghệ di truyền ngược, văc xin DNA, văc xin protein) cũng đang được nghiên cứu với hi vọng được áp dụng rộng rãi trong tương lai

Văc xin được sản xuất dựa trên sự thay đổi về cấu trúc gen của vi rút làm giảm khả năng nhân lên (gen M2 và NS2 bị loại bỏ) và mất khả năng tổng hợp chất ức chế interferon của tế bào (loại bỏ gen NS1) có khả năng gây đáp ứng miễn dịch, không theo quy trình sản xuất văc xin hiện tại [50]

1.2.2 Thuốc điều trị vi rút cúm A

Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước (Hình 1.6) Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+ không thể đi vào bên trong vi rút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình vi rút "cởi áo" để xâm nhập vào bên trong tế bào chủ (Hình 1.6) Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm

A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [31] Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại năm vị trí 26, 27, 30, 31 và

34, làm thay đổi vị trí tương tác của amantadine với M2 Trong đó, vị trí 31 thay đổi

từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N) là vị trí thường gặp ở các chủng vi rút trong các nghiên cứu trên thế giới [9, 42, 89]

Hình 1.6 Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine

(Nguồn: http://umanitoba.ca và Drugs discovery approaches – Wiley 2007)

Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế neuraminidase

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm (Hình 1.7) Neuraminidase phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi tại cầu nối đặc hiệu α 2,3Gal-sialic hoặc α2,6 Gal-sialic Do vậy, neuraminidase giúp giải phóng hạt vi rút, tạo điều kiện cho hạt vi rút mới có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô khác, tăng cường sự phát tán của vi rút Ức chế quá trình này, vi rút chỉ có khả năng nhiễm và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế

bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút (Hình 1.8)

Neuraminidase là enzyme trên bề mặt vi rút có tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi rút cúm, các nhà khoa học dự đoán khả năng xảy ra sự kháng thuốc của vi rút đối với oseltamivir thấp hơn amantadine [21] Tuy nhiên, gần đây đã có những nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra sự xuất hiện của những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 và đặc biệt một chủng vi rút cúm gia cầm

A/H5N1 có nguồn gốc từ Việt Nam đã có biểu hiện kháng thuốc [8, 11, 26, 31] Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir [30] Hiện tượng kháng thuốc xảy ra có liên quan đến sự thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase và thuốc điều trị (oseltamivir) , cụ thể

là các vị trí E119V, R292K, H275Y và R152K trên phân đoạn gen mã hóa NA [11,

13, 26, 36, 55, 58, 59] Sự đột biến tại các vị trí này làm giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây cho thấy zanamivir dường như vẫn có tác dụng với các chủng đã kháng với oseltamivir [19] Các số liệu cho thấy đột biến tại hai điểm trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến kháng oseltamivir (H275Y và I223R trên phân đoạn gen mã hóa NA của chủng vi rút A/H1N1pdm09) làm cho mức độ kháng thuốc của vi rút tăng gấp 1000 lần so với chủng vi rút nhạy cảm [40] Các phương pháp xác định nồng độ oseltamivir bị kháng bởi vi rút đã và đang được tiến hành với mục đích xác định chính xác mức độ kháng của vi rút với thuốc [40, 41]

Hình 1.7 Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir (Nguồn: http://umanitoba.ca )

Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong

quá trình giải phóng vi rút ra khỏi tế bào Nguồn: Drug Discovery Approaches – Wiley 2007

1.2.3 Các thuốc kháng vi rút mới

Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào

Arbidol là thuốc kháng vi rút được điều chế và sử dụng đầu tiên tại Nga từ năm

1993 và sau đó tại Trung Quốc năm 2006 [18], có khả năng ức chế sự xâm nhập của

vi rút vào tế bào cảm nhiễm với khả năng phá vỡ môi trường pH thấp làm cho vi rút cúm không thể hòa màng khi xâm nhập vào tế bào và mất khả năng cởi áo giải phóng các thành phần của vi rút khi đã ở bên trong tế bào

Thuốc ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào – DAS181 – là một loại protein tái tổ hợp bao gồm phần có tác dụng xúc tác của sialidase và phần protein gắn chặt trên

bề mặt màng tế bào biểu mô đường hô hấp Axit sialic trên bề mặt tế bào chủ, thụ thể đặc hiệu của protein HA của vi rút cúm, sẽ bị phá hủy khi cho tế bào tiếp xúc với sialidase, một loại enzyme ngoại bào có tác dụng tách axit sialic ra khỏi liên kết

với các glycoprotein và glycolipid Bên cạnh đó, phần protein gắn chặt trên bề mặt màng tế bào tồn tại trên khắp bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp có khả năng làm

tăng hiệu quả tác dụng của sialidase khi đặt thêm một phân tử bên cạnh axit sialic

Các thuốc ức chế neuraminidase

Hai loại thuốc kháng vi rút mới hoạt động theo cơ chế ức chế neuraminidase đang trong quá trình thử nghiệm giai đoạn III tại Mỹ nhưng đã được cấp phép sử dụng tại Nhật và Hàn Quốc là Peramivir và Laninamivir vào các năm 2006 và 2010 Peramivir có cấu tạo tương tự axit sialic, có khả năng ức chế đặc hiệu neuraminidase, được sử dụng dạng tiêm Laninamivir có cấu trúc tương tự như zanamivir nhưng khả năng bám gắn của laninamivir với NA được đánh giá cao, có thời gian bán thải dài (khoảng 3 ngày), được coi là sự lựa chọn tốt đối với những bệnh nhân nhiễm cúm có biến chứng nặng hoặc suy giảm miễn dịch

Các thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của vi rút trong tế bào

Thuốc ức chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705 còn được biết dưới tên faviparavir, là một phân tử nonpeptide nhỏ có khả năng kháng vi rút cúm dựa trên

cơ chế ức chế sự tái tạo hạt vi rút, có tác dụng chống lại cả ba phân típ cúm A, B và

C Faviparavir tác dụng ức chế lên quá trình tổng hợp RNA của vi rút nhưng không

ức chế quá trình tổng hợp DNA và RNA của tế bào chủ T-705 đã được chứng minh có tác dụng chống lại vi rút cúm gia cầm có độc lực cao A/H5N1 và đang trong quá trình thử nghiệm giai đoạn I Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của T-705 chưa được chứng minh một cách rõ ràng [48]

Ribarivin và viramidine là 2 hoạt chất kháng vi rút phổ rộng Ribarivin được sử dụng điều trị viêm gan C phối hợp với interferon từ nhiều năm có cơ chế tác dụng trực tiếp lên quá trình sao chéo và nhân lên bộ gen của vi rút Viramidine là dạng tiền hoạt động của ribavirin, có cơ chế hoạt động tương tự ribavirin nhưng ít tác dụng phụ hơn Ribavirin được thử nghiệm điều trị nhiễm cúm nhưng kết quả điều trị kém hơn amantadine và các thuốc ức chế neuraminidase Viramidine đã được thử

nghiệm với vi rút cúm A/H5N1 và cho kết quả khả quan nhưng mới chỉ dừng ở giai đoạn thử nghiệm [100]

1.3 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút

Hiện nay, các phương pháp áp dụng chủ yếu trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc đặc hiệu kháng vi rút Văc xin phòng chống nhiễm vi rút cúm A/H5N1 hiện tại được phát triển tại một số nước, tuy nhiên vẫn chưa lưu hành trên thị trường Văc xin cúm đang phổ biến hiện tại là văc xin cúm theo mùa và chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm và chủng vi rút cúm lưu hành trong vụ dịch tương tự chủng vi rút trong thành phần văc xin Sau khi tiêm văc xin cúm, đáp ứng miễn dịch còn phụ thuộc rất nhiều vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin được sử dụng Thuốc kháng vi rút cúm đặc hiệu đang lưu hành (amantadine, oseltamivir ) được sử dụng trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút, đặc biệt là vi rút A/H5N1 Tuy vậy, một trong những tương tác của thuốc với vi rút là hiện tượng đột biến xuất hiện trong vật liệu di truyền của vi rút và

hệ quả là sự kháng thuốc của vi rút ở thế hệ sau [56, 58, 67]

1.3.1 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước Amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A [21] Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị và phòng bệnh được ghi nhận nhưng có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan truyền nhanh trong quần thể Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm

2002, tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005 Theo kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của vi rút cúm A cho thấy 100% các vi rút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine Tuy nhiên, một nghiên cứu tại Nhật năm 2008 đã xác định chủng cúm A/H3N2 có khả năng trở nên

nhạy với amantadine Sự quay trở lại này là kết quả của quá trình trao đổi và tích hợp bộ gen giữa các chủng vi rút cúm lưu hành vào mùa cúm 2002-2003, 2004-

2005 và 2005-2006 [12]

Các nghiên cứu về vi rút cúm A/H5N1 kháng amantadine cho thấy chủng H5N1 lưu hành tại các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Cambodia mang đột biến kháng thuốc chủ yếu tại vị trí S31N, đặc biệt các chủng lưu hành tại Việt Nam năm 2004 mang 2 đột biến tại vị trí 31 và 27 (V27A) trong khi các chủng lưu hành tại Trung Quốc và Indonesia lại vẫn duy trì sự nhạy cảm với thuốc amantadine [9,

15]

1.3.2 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt, neuraminidase, của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999, enzyme này có tính chất khá bảo tồn ở các chủng vi rút cúm, do vậy khả năng xảy ra sự kháng thuốc của vi rút được các nhà khoa học tiên lượng là thấp hơn amantadine [21] Tuy nhiên, gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng

vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm

2009 Tỉ lệ kháng oseltamivir của phân típ này chỉ ở mức dưới 1% [46, 59] vào những năm 2005-2006, các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm

2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm 2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu) [64, 110] Chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 cũng đã có biểu hiện kháng oseltamivir, trong đó có 2 trường hợp xuất hiện kháng thuốc trong quá trình điều trị tại bệnh viện [67] và một trường hợp mang chủng kháng thuốc không qua điều trị, ba chủng này có nguồn gốc từ Việt Nam [8, 11, 26, 31] Trong thời gian diễn ra đại dịch cúm A/H1N1pdm09, đã ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir đơn lẻ và theo nhóm tại Việt Nam, Úc và Nauy [35, 39, 58] Bệnh nhân nhiễm chủng vi rút A/H1N1pdm09 kháng thuốc ngoài các trường hợp có liên quan đến điều trị còn bao gồm những trường hợp có bệnh mạn tính, suy giảm hệ miễn dịch và không liên quan đến điều trị thuốc [37]

Ngoài ra, vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 tại Trung Quốc được thông báo mang đã mang sẵn phân đoạn gen mã hóa NA có điểm đột biến R292K gây

kháng oseltamivir [63], gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị

1.4 Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A

1.4.1 Nguyên nhân và cơ chế của hiện tượng kháng thuốc

Thuốc amatadine: Amantadine được đưa vào sử dụng từ những năm 1960 với

mục đích phòng và điều trị cúm A Theo khảo sát từ năm 1994, hiện tượng kháng amantadine đã xuất hiện [50] Tìm hiểu nguồn gốc của sự kháng thuốc, phân đoạn gen mã hóa M đã được phân tích trình tự nucleotide để xác định sự thay đổi có liên quan đến kháng thuốc Theo các nghiên cứu, hiện tượng kháng amantadine thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 có xuất hiện các điểm đột biến trên phân đoạn gen mã hóa M (phần M2) dẫn đến thay đổi các axit amin tại các vị trí gắn kết Năm

vị trí axit amin liên quan đến việc kháng amatadine là 26, 27, 30, 31 và 34, trong đó,

vị trí 31, thay đổi từ Serin (Ser-S) sang Arginine (Asn-N), là vị trí thường gặp [9,

42, 89] Các đột biến này làm vị trí tiếp xúc với thuốc được "nới rộng", không còn tương ứng với kích thước của thuốc, amantadine không gắn được vào đúng vị trí trên protein M2 [82] Do đó, vi rút không bị ức chế, vẫn tiếp tục quá trình hòa màng, "cởi áo", đưa các RNP và tế bào cảm nhiễm của vật chủ Ngoài ra, sự kháng thuốc có thể xảy ra không liên quan đến hiện tượng đột biến mà do sự trao đổi và tích hợp bộ gen (trường hợp vi rút H1N1pdm09 khi xuất hiện kháng 100% với amantadine)

Thuốc oseltamivir: Nguồn gốc của hiện tượng kháng oseltamivir là do có sự

thay đổi axit amin tại vùng tiếp xúc của neuraminidase với thuốc, cụ thể là các vị trí I117V, H275Y, N294S trên N1 và E119V, R152K, R292K, N294S trên phân đoạn gen mã hóa N2 [24, 101, 104] Sự đột biến tại các vị trí này gây giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase dẫn đến sự giảm độ nhạy hoặc kháng của vi

rút với thuốc Tuy nhiên, theo dõi sự kháng thuốc của vi rút với zanamivir, dường như zanamivir vẫn có hiệu quả trên các chủng vi rút đã kháng với oseltamivir và đây có thể do sự khác nhau về cấu trúc không gian của hai loại thuốc này [79] Tương tự như trường hợp vi rút H1N1pdm09 kháng amantadine, phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm mới xuất hiện trên người A/H7N9 cũng đã mang đột biến tại

vị trí R292K liên quan đến kháng oseltamivir thông qua quá trình trao đổi và tích hợp đoạn gen [62]

Như vậy, sự kháng thuốc của vi rút cúm A qua thời gian tập trung vào các nguyên nhân sau: đột biến tại các vị trí liên quan đến sự bám gắn của thuốc trên phân đoạn gen mã hóa NA và M; áp lực duy trì nòi giống của vi rút mà biểu hiện chính là sự trao đổi và tích hợp bộ gen, do đó vi rút hoàn toàn có khả năng mang gen kháng thuốc từ khi mới xuất hiện; sự thích nghi với nhiều loại vật chủ của vi rút cúm A tạo điều kiện thuận lợi cho sự kháng thuốc xuất hiện (vi rút cúm B có tỉ lệ kháng thuốc thấp hợp vi rút cúm A)

1.4.2 Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm

Kỹ thuật giải trình tự gen thông thường (phương pháp Sanger)

Việc xác định chủng vi rút có mang gen kháng thuốc sử dụng phương pháp giải trình tự gen thông thường đã được thực hiện từ những năm 90, qua đó có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm [93] Điển hình

là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine

*Ưu điểm

Ưu điểm của kỹ thuật là khả năng ứng dụng rộng rãi, có thể giải trình tự nucleotide cho toàn bộ gen đích hoặc từng phần gen có mang vị trí đột biến liên

quan đến kháng thuốc Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen này cũng có thể xác định được hiện tượng kháng thuốc không hoàn toàn, hoặc nhiều đột biến liên quan đến kháng thuốc Chủng vi rút mang nhiều đột biến tại các vị trí khác nhau trên gen đích cùng có tác dụng gây kháng thuốc có thể phát hiện được nhờ khả năng giải trình tự đoạn nucleotide dài Ngoài ra, các đột biến khác không liên quan đến kháng thuốc nhưng có liên quan đến sự tiến hóa, thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cũng được xác định [93]

xác định (ví dụ BspHI ) [78] Sản phẩm PCR thu được sẽ được xử lý bằng enzyme giới hạn tương ứng với mồi thiết kế Enzyme giới hạn BspHI [33] hoặc BclI [78] sẽ

cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn

*Ưu điểm

Kỹ thuật này có thể thực hiện được với số lượng mẫu lớn, giá thành thấp và có thể thực hiện trên bệnh phẩm lâm sàng và vi rút phân lập

*Nhược điểm