Tính kháng thuốc Oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012 (tóm tắt)

Kết quả nghiên cứu so sánh về sự tương đồng di truyền học giữa các vi rút cúm A được xác định giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A lưu hành t

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thế kỷ XX, căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm đe doạ tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người, điển hình là các

vụ dịch xảy ra như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm

2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013 Tại Việt Nam, số người mắc cúm có xu hướng tăng lên sau mỗi năm Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu Văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm Sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir )

là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm Sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây sự kháng thuốc của vi rút Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc và mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể Tại Việt Nam quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ báo cáoở mức độ từng ca bệnh hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, mà chưa có một nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá của chủng vi rút cúm A theo thời gian Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ

và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A

Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với

Những đóng góp mới của luận án:

1 Đây là công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên thực hiện có hệ thống để xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn từ 2001 đến 2012

2 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là các kỹ thuật xét nghiệm mới cập nhật trong những năm gần đây

3 Kết quả nghiên cứu đã xác định được giá trị IC50 ngưỡng,tỉ lệ và mức độ giảm

mức độ kháng thuốc của vi rút cúm A, từ đó có thể phối hợp với bác sĩ lâm sàng đưa ra phác đồ điều trị phù hợp

4 Kết quả nghiên cứu so sánh về sự tương đồng di truyền học giữa các vi rút cúm A được xác định giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A lưu hành trong nước, trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012 cho thấy sự các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành song song cùng với các chủng cúm thông thường khác, kết quả này cũng bổ sung thêm thông tin về sự tiến hóa của vi rút cúm A tại Việt Nam

5 Nghiên cứu về tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm theo chiều dọc thời gian từ 2001-2012 với các số liệu thu thập được là cơ sở dữ liệu đầu tiên về sự tương tác của vi rút cúm với oseltamivir tại Việt Nam

Bố cục luận án: Luận án dày 103 trang gồm:

Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp

nghiên cứu

16 trang

Luận án có 23 hình vẽ, 11 bảng, 6 biểu đồ và 2 sơ đồ Trong 123 tài liệu tham khảo

có 6 tài liệu Tiếng Việt và 117 tài liệu Tiếng Anh

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm A

1.1.1 Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A

Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A

Hệ gen của vi rút cúm A: Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein

Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần Đoạn RNA 1,

3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA.Phân đoạn 2, 7 và 8 mỗi phân đoạn mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1-NS2

Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút:

Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa

bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu

sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào thụ thể alpha 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể alpha 2,3 axit sialic; trên

tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể

Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme,

neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6 Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide NA xúc tác cho

Các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau Các phân típ

NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9)

Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và

M2.Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút M2 là một protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm

Các polymerase PB1, PB2, PA và nucleoprotein (NP):Tồn tại trong hệ gen của vi

rút cúm còn có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase: phức hợp PA-PB1-PB2.NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao, chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới

1.1.2 Cơ chế nhân lên của virút cúm A

Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: Sự bám dính, sự thâm nhập, sự cởi áo, tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α2,3 hoặcα 2,6 axit sialic) Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của tế bào chủ RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme neuraminidase

1.1.3 Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A

Những thay đổi nhỏ trên gen

Enzyme polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA tác động lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm

Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên

Sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên tạo nên vi rút tuy cùng mang tên một phân typ vi rút (vd: H1N1) nhưng bản chất vi rút đã có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết

Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới (đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1)

đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân typ khác nhau trên một vật chủ, kết quả

là sự tạo ra một loại vi rút thế hệ mới trong đó cấu trúc gen là sự trộn và sắp xếp lại của các vi rút cúm đồng nhiễm

1.1.5 Khả năng gây bệnh của vi rút cúm

Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua là qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm Bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân typ cúm A (tháng 7 – tháng 8)

1.1.6 Tiến hóa của vi rút cúm A

Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen Sự tiến hóa của vi rút cúm A còn được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa

1.2 Phòng và điều trị vi rút cúm A

1.2.1.Văc xin phòng cúm

Các loại văc xin đưa vào sử dụng gồm hai chủng A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới Các loại văc xin cúm bao gồm: Văc xin bất hoạt, Văc xin sống giảm độc, Các loại văc xin thế hệ mới (reverse genetic văc xin, DNA văc xin)

1.2.2 Thuốc điều trị vi rút cúm A

Các thuốc dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm

Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+không thể đi vào bên trong virút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình ”cởi áo” vi rút để xâm nhập vào bên trong tế bào chủ Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2)

Các thuốc dòng ức chế neuraminidase

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm Ức chế quá trình phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi, vi rút chỉ có khả năng nhiễm

và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút Sự đột biến trên protein NA làm giảm

hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase

1.2.3 Các thuốc kháng vi rút mới

Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào (ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào

1.3.Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút

1.3.1 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine

Được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước, amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm

A Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị

và phòng bệnh có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan truyền nhanh trong quần thể Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm 2002 tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005 Theo kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của virút cúm A cho thấy 100% các virút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine

1.3.2 Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir

Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999 Gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm 2009 Các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm 2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm

2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu) Các phân típ H5N1, H1N1pdm09 cũng đã được ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir trên thế giới và tại Việt Nam

1.4 Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm

A

1.4.1 Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm

Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger (phương pháp thông thường):Kỹ thuật được thực

hiện có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm Điển hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine

Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism): Enzyme giới hạn BspHI hoặc BclI sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị

trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn

Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định sequencing): Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến có sẵn

(pyro-trên cỡ mẫu lớn trong thời gian ngắn

Kỹ thuật realtime RT-PCR: Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm

2008 với ứng dụng tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của virút cúm A/H1N1

Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi

thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút

Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir

*Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa học

Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào

sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence) Kết quả thu được

từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US CDC), PTN tại viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản

*Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang

Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của enzyme neuraminidase với thuốc ức chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir ) có sử dụng chất huỳnh quang trong thành phần của phản ứng Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc

ức chế 50% hoạt động của vi rút Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN

do khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y

tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút

1.4.3 Giám sát sự kháng thuốc virút cúm

Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm

Các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm

Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm

Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút thuộc Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác(ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT-PCR Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne-Úc và NIID-Nhật Bản Theo quy trình này, các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi rút cúm thuộc nhóm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1, A/H1N1 đại dịch 09 phân lập được tại phòng thí nghiệm cúm từ năm 2001 đến 2012 từ các nguồn: Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005, chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012 và giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012

Các chủng vi rút được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh Hóa

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút (ref) Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA

2.3 Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm

Chủng vi rút: Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng

bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến

2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012

Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập vi rút, xác định nồng độ oseltamivir ức chế

neuraminidase và giải trình tự gen

Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC) phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử dụng bộ

kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase sử dụng bộ kit của hãng Life Technology, Mỹ, oseltamivir được cung cấp bởi hãng Roche

2.4 Phân tích số liệu

Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ Giá trị ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad Prism 6.0.2, Mỹ

Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood Các trình tự phân đoạn gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com)

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ

3.1 Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012

Số lượng các vi rút lưu hành trong mỗi năm cũng như ưu thế của từng phân típ vi rút thể hiện sự khác nhau Phân típ vi rút A/ H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (100%) trong các năm 2001, 2002 và 2006, và tỷ lệ này giảm tại năm 2003 (74%), 2008 (54%)

2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau Sự xuất hiện lần đầu tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1% (2009) và ở mức 46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011và không phát hiện trong năm 2012 Phân típ A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006 (0%) nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm) với tỷ

lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012) Với vi rút cúm gia cầm A/H5N1, lần đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 cũng có mặt trong nghiên cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1% (2009) đến 60% (2005) Vi rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào các năm 2006, 2011 và

2012

3.2 Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A

Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác định giá trị ngưỡng cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động loại bỏ các cá thể có những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy số cá thể vi rút sử dụng trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút sử dụng trong nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút; A/H1N1pdm09 là 152/157 vi rút và A/H5N1 là 21/28 vi rút Kết hợp với phân tích tứ phân vị, chúng tôi

có thể xác định được giá trị IC50 ngưỡng của các vi rút tương đương với giá trị trung bình

IC50 và giá trị trung vị (Q2) (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Giá trị IC50 trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu

và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn

3.2.1 Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1

Giá trị ức chế 50% (IC50) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu có giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM Độ tập trung của giá trị cho thấy tổng số 30/42 cá thể có giá trị IC50 dưới giá trị IC50 trung bình (0,413nM) và

12 cá thể còn lại có IC50 lớn hơn giá trị ngưỡng So sánh với vi rút chuẩn A/Mississippi/03/2001 có giá trị IC50 là 0,5nM, giá trị IC50 ngưỡng được xác định cho phân típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC50 trung bình đã

được xác định là 0,413 ± 0.352 nM

3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09

Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC50 trong tổng số 152 vi rút được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 cá thể vi rút xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC50của vi rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 là 0,6nM, vì vậy giá trị ngưỡng của vi

rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM

3.2.3 Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2

Toàn bộ vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC50 vi rút trung bình dao động từ 0,04 đến 0,29 nM Giá trị IC50 trung bình 0,164 nM của các vi rút H3N2 tương đương với giá trị IC50 0,2 nM của vi rút tham chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004, giá trị IC50 ngưỡng của phân típ vi rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM

3.2.4 Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1

Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo chương trình Graphpad prism Cụ thể theo từng vi rút cho thấy giá trị IC50 nhỏ nhất

là 0,13 nM, lớn nhất là 8,98 nM Các vi rút A/H5N1 có giá trị IC50 tập trung gần hoặc dưới giá trị IC50 trung bình 2,947 nM (17/21), giá trị IC50 của vi rút chủng vi rút tham chiếu chuẩn A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM Giá trị ngưỡng của

phân típ cúm A/H5N1 được xác định là 2,947 ± 2,539 nM

3.3 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A

3.3.1 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1

Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase, đã xác định được 12 vi rút H1N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu Toàn bộ các vi rút này được xác định

là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3)

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm A/H1N1pdm09

là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC50 125.99nM năm 2009 và A/Vietnam/36530/11 127.91nM năm 2011 Giá trị IC50 của các chủng này tăng từ 350 – 400 lần so với giátrị IC50 ngưỡng của vi rút

Bảng 3.3 Giá trị IC50 của H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009

Năm Tên chủng/Số chủng Giá trị IC 50

(nM)±SD

Giá trị

IC 50 ngưỡn

g

Giá trị IC 50 / Giá trị IC50 ngưỡng

3.3.2 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09

H1N1pdm09 Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC50 của ba chủng H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 Giá trị IC50 của H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011

(nM)±SD

Giá trị IC50 ngưỡng

Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng

3.3.3 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H3N2

Kết quả thử nghiệm NAI thực hiện trên 157 chủng vi rút A/H3N2 cho thấy giá trị IC50 của các chủng H3N2 dao động trong khoảng 0,038 – 0,29nM, không phát hiện

cá thể vi rút nào có giá trị nào vượt giá trị ngưỡng (0,164nM) từ 10 lần trở lên

3.3.4 Mức độ giảm độ nhạy, kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A/H5N1

Số chủng vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu là 28 vi rút phân lập trên bệnh nhân nhiễm vi rútA/H5N1trong giai đoạn từ 2004-2010 Kết quả nghiên cứu đã xác định được 2 vi rút A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08 lưu hành năm

2008 có giá trị IC50 đạt mức 19,04nM và 14,48nM Hai vi rút này có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng lần lượt là 6 lần và 5 lần Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN30408/05 có giá trị IC50 đã được xác định năm 2005 tăng 30 lần so với giá trị ngưỡng (Bảng 3.6)

Bảng 3.6 Giá trị IC50 của hai chủng H5N1 năm 2005 và 2008

(nM)±SD

Giá trị

IC 50 ngưỡng

Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng

là giảm độ nhạy với osetlamivir Toàn bộ số chủng vi rút cúm A/H3N2 trong nghiên cứu đều được xác định là nhạy cảm với oseltamivir

3.4 Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir

Các vi rút được phân tích trong nghiên cứu này là A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H5N1 thuộc phân típ NA1 (N1), vì vậy một số đột biến tương đồng và thường gặp trên phân đoạn gen mã hóa N1 được ghi nhận là H275Y, N295S hoặc I117V sẽ được phân tích

bằng phương pháp phân

Bảng 3.7 Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir

Giá trị IC50/

Giá trị IC50 ngưỡng

A/Vietnam/TB289/08 3933 A/Vietnam/TX200/08 1104 A/Vietnam/TX233/08 1097 A/Vietnam/BT241/08 1643 A/Vietnam/LS324/08 145

2009

A/Vietnam/32036/09 1705 A/Vietnam/EL197/09 1407 A/Vietnam/Q271/09 1126 A/Vietnam/31808/09 1278 A/Vietnam/34381/09 1273 A/Vietnam/N116/09 1370

Vi rút A/H1N1pdm09

2009

A/Vietnam/32043/09 1422

GMĐNCcủa vi rút với oseltamivir

A/Vietnam/32060/09 1072 A/Vietnam/32067/09 2944 A/Vietnam/33419/09 417

tích trình tự chuỗi thông thường (Sanger sequecing) Kết quả sẽ được xác nhận khi so sánh với trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút không có biểu hiện giảm độ nhạy

hoặc kháng oseltamivir và các vi rút tham chiếu chuẩn

3.4.1 Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1 liên quan đến kháng thuốc oseltamivir

Năm vị trí đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trên phân đoạn gen mã hóa NA của các vi rút cúm A/H1N1 thường gặp là Q137K, Y156H, I223V, S247G và H275Y Kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA của

12 vi rút cúm A/H1N1 cho thấy: toàn bộ các vi rút này đều phát hiện đột biến tại vị trí 275 Cụ thể, trình tự nucleotide đã có sự thay đổi từ CAC sang TAC, và protein