Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi

Ngoài ra, để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinh để bảo quản.. Đa số mỗi sinh vật có môi trường

Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:

 TS Nguyễn Văn Duy, thầy Lê Đình Đức đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi

 Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,

đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại phòng thí nghiệm

 Chị Lưu Thị Thúy học viên cao học và các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của khóa 49, 50 Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã giúp đỡ cho tôi Các bạn lớp 49 SH – những người bạn đồng hành luôn bên cạnh và giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết

ơn vô hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

Sinh viên thực hiện Hoàng Thị Giang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn lactic 3

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 3

1.1.2 Phân loại lactic 3

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic 5

1.1.4 Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6

1.2 Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò 8

1.2.1 Đặc điểm chung về cá giò 8

1.2.2 Các phương pháp bảo quản cá giò 9

1.3 Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic trong thực phẩm 14

1.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước 14

1.3.2.Những nghiên cứu trong nước 16

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Vi sinh vật 18

2.1.2 Nguyên liệu cá giò 19

2.1.3 Hóa chất và môi trường 19

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Xác định khả năng sinh trưởng 21

2.2.2 Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 22

2.2.3 Thí nghiệm nhúng da cá giò trong dịch tế bào vi khuẩn lactic 22

2.2.4 Thí nghiệm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi nguyên con bằng dịch tế bào vi khuẩn lactic kết hợp bảo quản lạnh 24

2.2.5 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 24

2.2.6 Xác định tổng vi khuẩn lactic 26

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 27

3.1 Tổng số vi khuẩn lactic trên da cá giò nguyên liệu tươi 31

3.2 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò nguyên liệu tươi 33

3.4 Tổng số vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36

3.5 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

(Vi khuẩn lactic)

(Môi trường nuôi cấy LactoBacillus)

(Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

(Mật độ quang)

(Môi trường rắn nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

(Môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn tổng số)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Thành phần môi trường MRS 20

Bảng 2 Thành phần môi trường TSB 20

Bảng 3 Khả năng sinh trưởng, đường kính vòng kháng khuẩn, hoạt độ riêng của chủng T8 trên môi trường MRS 29

Bảng 4 Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 31

Bảng 5 Sự phát triển tổng vi khuẩn hiếu khí trên da cá giò 33

Bảng 6 Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36

Bảng 7 Khả năng sinh bacteriocin của tổng vi khuẩn lactic 36

Bảng 8 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Vi khuẩn lactic T8 nuôi trên môi trường MRS sau 48 giờ ở nhiệt độ 370C

18

Hình 2 Vi khuẩn Bacillus trên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ 370C 19

Hình 3 Cá giò nguyên liệu tươi 19

Hình 4 Mặt ngoài da cá 23

Hình 5 Mặt trong da cá 23

Hình 6 Mẫu 1: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 cho vào túi PE 23

Hình 7 Mẫu 2: Mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic không cho vào túi PE 24

Hình 8 Mẫu 3: Mẫu đối chứng 24

Hình 9 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 6 -18 giờ nuôi 27

Hình 10 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 15 - 19 giờ nuôi 28

Hình 11 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 - 24 giờ nuôi 28

Hình 12 Vòng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic T8 đối với Bacillus B1.1 sau 12 - 27 giờ nuôi 29

Hình 13 Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T8 30

Hình 14 Vi khuẩn lactic trên môi trường thạch MRS, nuôi ở nhiệt độ 370C sau 48 giờ nuôi cấy 31

Hình 15 Sự phát triển của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giò 32

Hình 16 Sự phát triển tổng vi sinh vật hiếu khí trên da cá giò 33

Hình 17 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên môi trường PCA sau 48 giờ 34

Hình 18 Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 36

Hình 19 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic ở mẫu 1 37

Hình 20 Khả năng kháng Bacillus của vi khuẩn lactic T8 theo thời gian bảo quản 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày 37

Hình 21 Vi khuẩn lactic T8 sau 3 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 39 Hình 22 Vi khuẩn lactic T8 sau 5 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 40 Hình 23 Vi khuẩn lactic T8 sau 7 ngày bảo quản ở mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 40 Hình 24 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 41 Hình 25 Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 0 ngày 43 Hình 26 Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 3 ngày 44 Hình 27 Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 5 ngày 45 Hình 28 Tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu đối chứng và mẫu nhúng dịch tế bào vi khuẩn lactic T8 lúc 5 ngày và 7 ngày 46

LỜI MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản thủy sản trước kia vốn chỉ góp phần nhỏ bé trong tổng sản lượng thủy sản toàn cầu, tuy nhiên từ những năm 1950 đến năm 2008 đã tăng 50 lần và hiện nay chiếm gần 50% trong tổng sản lượng sản xuất trên toàn thế giới Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng: năm 2004 đạt 1,4 triệu tấn, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản, năm 2010 sản lượng thủy sản đạt 2706,8 nghìn tấn bằng 105,4% so với cùng kỳ năm 2009 và 102,1% so với kế hoạch năm 2010 Kỳ vọng năm 2011, theo kế hoạch nghành thủy sản phấn đấu mức tăng trưởng chung là 7% so với năm 2010 Tổng sản lượng năm 2011 phấn đấu đạt khoảng 5,3 triệu tấn, trong đó khai thác là 2,3 triệu tấn và nuôi trồng là 3 triệu tấn Mặc dù, nghành nuôi trồng đạt được nhiều kết quả nhưng nó đang đối mặt với những thách thức về môi trường nuôi, dịch bệnh, công nghệ sau thu hoạch…

Nguyên liệu thủy sản nói chung là loại nguyên liệu dễ bị hư hỏng nếu không được bảo quản hợp lý Hiện nay, các loại nguyên liệu sau đánh bắt và thu hoạch của người dân chủ yếu bảo quản bằng phương pháp ướp đá lạnh Ngoài ra,

để giữ nguyên liệu thủy sản tươi lâu người dân sử dụng các loại hóa chất độc hại như ure, borit, nitrat, hàn the, chất kháng sinh để bảo quản Những chất bảo quản này nếu sử dụng không hợp lý sẽ gây nên tình trạng mất an toàn thực phẩm, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng Do đó, việc sử dụng hóa chất

để bảo quản nguyên liệu ít được sử dụng và một số chất bảo quản độc hại bị cấm Yêu cầu đặt ra phải tìm được phương pháp bảo quản nguyên liệu an toàn và kinh

tế Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu thay thế những chất bảo quản hóa học bằng phương pháp sinh học an toàn hơn cho người sử dụng và người tiêu dùng Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng, gây thối nguyên liệu, an toàn cho người tiêu dùng Một trong những nhóm

vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được công nhận là an toàn để sử dụng, nó được sử dụng trong quá trình bảo quản như lên

men dưa chua, nem chua, sữa chua…vì trong quá trình sống vi khuẩn lactic ngoài việc sinh bacteriocin còn sinh acid lactic là tác nhân ức chế nhiều vi sinh vật

Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King fish) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng

bè ở các vùng biển tại các địa phương như: Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh, Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Kiên Giang Hiện nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000đ/kg Do đó việc nghiên cứu bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao

Sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ với các điều kiện bên ngoài, môi trường nuôi cấy Đa số mỗi sinh vật có môi trường nuôi cấy đặc hiệu, MRS là môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic nói chung, ở đó vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển tốt nhưng khi ứng dụng vi khuẩn này bảo quản nguyên liệu thủy sản như cá giò thì sao?

Để trả lời cho câu hỏi đó chúng tôi tiến hành đề tài “Đặc điểm sinh trưởng của vi

khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS và trên cá giò nguyên liệu tươi”

Mục tiêu của đề tài:

- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS

- Xác định khả năng sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên môi trường MRS

- Xác định khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trên cá giò nguyên liệu tươi

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, bất động, không sinh bào

tử, có khả năng lên men đường thành acid lactic Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác

nhau như: trực khuẩn hoặc cầu khuẩn Cầu khuẩn xếp các giống Streptococcus và Leuconostoc, còn trực khuẩn thành một giống Lactobacillus MRS là môi trường để

phân lập và nuôi cấy chủng lactic Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, đôi khi khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn lồi Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí, vi hiếu khí Vi khuẩn lactic có nhu cầu

về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose Đa số chúng cần các loại vitamin như: Lactoflavin, tiamin, pantotenic acid, folic acid, và các amino acid… Các vi khuẩn lactic lên men được đường monno và disaccharide nhưng không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác, ngoại trừ

L.delbrueckiin đồng hóa được tinh bột Đa số vi khuẩn lên men lactic dị hình có

khả năng sử dụng pentose và acid citric, một số có hoạt tính protease (Lương Đức Phẩm, 2002)

1.1.2 Phân loại lactic

Dựa vào khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, người ta chia thành hai nhóm vi khuẩn lactic: vi khuẩn lactic dị hình và vi khuẩn lactic đồng hình

 Vi khuẩn lactic lên men đồng hình

Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase Khi lên men các loại đường chúng sinh ra chủ yếu là acid lactic Vi khuẩn lactic lên men đồng hình như:

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casein, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum

Một số vi khuẩn lactic điển hình:

Streptococcus lactic - cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết

song đôi hoặc thành chuỗi ngắn Giống này ưa ấm, phát triển tốt ở 30 - 350C, làm đông tụ sữa sau 10 - 12 giờ Trong môi trường nó tích tụ được 0,8 - 1% acid Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 100C, tối đa là 40 - 450C Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nizin

Steptococcus lactic - liên cầu khuẩn lacitic được sử dụng rộng rãi trong

chế biến các sản phẩn sữa như sữa chua, crem - bơ chua, phomat Khi đông tụ sữa các cục vón chặt và nhẵn được tạo thành

Streptococcus cremoris - tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và

tạo acid trong môi trường Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 250C, tối thiểu

là 100C, tối đa là 36 - 380C Khi sử dụng phải phối trộn với Str lactic Một số chủng thuộc giống Diplococus sinh bacterioxin ở dạng diplocoxin (Lương Đức

Phẩm, 2002)

 Vi khuẩn lactic lên men dị hình

Vi khuẩn lactic lên men dị hình là vi khuẩn khi lên men các loại đường chúng không chỉ tạo ra acid lactic mà còn tạo ra các sản phẩm khác như acid

acetic, acid propionic, ethanol Vi khẩn lactic dị hình như: Lactobacillus pasterianus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopessici, Streptococcus cumoris, Streptococcus lactic

Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình điển hình:

Lactobacillus brevis (tên cũ là L brassica fermeentati) tìm thấy chủ yếu

trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột Vì vậy nó được gọi là trực khuẩn cải bắp Trong lên men, ngoài acid lactic nó còn tạo ra acid axetic, rượu etylic và

CO2, nó còn tạo cho sản phẩm có hương thơm dễ chụi

Lactobacillus lycopersici - trực khuẩn sinh hơi, đứng riêng lẻ hoặc liên kết

thành chuỗi, gây hư hỏng cà chua (thối nhũn cuống) cũng như cà chua đóng hộp, nước cà chua thanh trùng chưa triệt để Ngày nay, giống này được coi như là biến

chủng của L.brevis

Streptococcus lactic thuộc chuỗi cầu khuẩn Gram (+), nhiệt độ phát triển

từ 10 - 450C, có khả năng chụi được nồng độ muối 4% Khi lên men đường như maltose, lactose, xylose chúng tạo ra acid lactic, acid acetic, CO2 và diacetyl Chúng không có khả năng lên men insulin, glycerol, sorbitol, raffinose

Streptococcus falcalis thường sống thành chuỗi tế bào hình cầu, nhiệt độ

sinh trưởng 10 - 450C Chúng có khả năng chụi được nồng độ muối 5% và có khả năng lên men đường glucose, maltose, trehalose và silicin

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

 Nguồn cacbon

Vi sinh vật là giới sinh vật duy nhất có khả năng đồng hóa được nhiều nguồn cacbon khác nhau Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi sinh vật không phải là giống nhau ở nhiều nguồn cacbon khác nhau: có những nguồn cacbon dễ sử dụng và những nguồn cacbon khó sử dụng, thậm chí phải huy động nhiều vi sinh vật cùng tham gia phân hủy từ từ Thông thường vi sinh vật trong

tự nhiên hay trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo sẽ tiến hành phân hủy nguồn cacbon có cấu tạo đơn giản có mức độ oxy hóa mạnh sau đó mới phân hủy nguồn cacbon phức tạp và có mức độ oxy hóa thấp Nhìn chung vi sinh vật dễ hấp thu cacbon từ hydratcacbon, trong đó glucose là chất được đa số vi sinh vật sử dụng

Đối với vi khuẩn lactic thì đường mono và disaccharide là nguồn cacbon tốt nhất, còn các polysaccharide hầu như không thể lên men được Tốc độ lên men của các loại đường khác nhau là khác nhau nhưng khi nhân giống ta dùng một loại đường cố định thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau chúng phát triển hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này

 Nguồn nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật thường ở hai dạng: nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nitơ vô cơ Trong đó nguồn nitơ được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là protein như: Cao thịt, cao nấm men, trypton,

dịch thủy phân casein từ sữa… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều và có hiệu quả nhất trong phòng thí nghiệm

 Vitamin

Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Vitamin B6 là vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các amino acid ở vi khuẩn lactic

 Muối khoáng

Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong qua trình trao đổi chất ở vi sinh vật Các chất khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là những chất khoáng ở dạng hợp chất, đơn chất, có thể ở dạng vô cơ hay hợp chất hữu cơ Một số muối khoáng được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật là:

K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaSO4,…

Trong các loại muối khoáng đó photpho là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic cần Số lượng photpho trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật Nếu hàm lượng quá cao vi sinh vật khó phát triển, nếu quá ít sẽ không đủ cho quá trình trao đổi chất và như vậy

sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sự đồng hóa hydratcacbon

 Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sinh trưởng vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và

loại ưa ấm Loại ưa nhiệt bao gồm: L bulgaricus, L thermophilus, L delbrueckii…phát triển tốt ở 45 - 600C Loại ưa ấm gồm: L causasicus, L lactic,

L acidophilus…phát triển tốt ở 37 - 450C và L brevis, L buchner và L.pastorianus phát triển tốt ở 28 - 32 0C

1.1.4 Vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật khá phổ biến trong điều trị bệnh cho người cũng như động vật Nguyên nhân

là do con người lạm dụng thuốc kháng sinh để điều trị một số bệnh cho vật nuôi cũng như bảo quản thực phẩm Để hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh trong thực

phẩm và chăn nuôi người ta đã nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật để ức chế lại vi sinh vật gần gũi với chúng

Bacteriocin có bản chất là những peptide hoặc là những protein có hoạt tính kháng khuẩn và là sản phẩm của nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau (Antonio Gálvez

và cs, 2007) Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra các loài bacteriocin nào thì có khả năng chống lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây phản ứng dị ứng cho con người và các vấn đề về sức khỏe, phân hủy nhanh bởi protease, lipase Đa số bacteriocin có tính kháng nguyên cao nhưng có phổ ức chế hẹp, hoạt động tốt dưới những khoảng pH, nhiệt độ nhất định Ví dụ như ST28MS và ST26MS được

sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút

tại 1000C hay 20 phút ở 1210C (Torodov và Dicks, 2005) Hầu hết bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn Gram (-), có hoạt tính ức chế các loại cùng họ hàng tuy nhiên một số loài vi khuẩn Gram (-) bị ức chế bởi bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) Những vi khuẩn Gram (+) sinh bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn Gram (-) như: Lactobacillus, Bacillus crecus, Streptococci, Staphylococci…Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram (+) có hoạt

tính ức chế các loại vi khuẩn Gram (+) Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi sinh vật khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi sinh vật, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào

Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều chủng sinh bacteriocin như Vibrio, Bacillus…Trong đó lactic là nhóm vi khuẩn được quan tâm nhiều do chúng sinh

bacteriocin có phổ ức chế rộng hơn các nhóm vi khuẩn khác, đồng thời nó được xem là nhóm vi khuẩn an toàn cho con người Ngày nay, người ta ứng dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong nhiều lĩnh vực khác nhau: công nghiệp, y dược, thức ăn động vật, chế biến thực phẩm…

Bacteriocin của nhóm vi khuẩn lactic sử dụng trong quy trình chế biến thực phẩm để rửa sạch rau quả trước khi dùng, nó tác động và làm giảm lượng vi khuẩn gây bệnh, gây thối rửa (Allende và cs, 2007) Bacteriocin được thêm vào trong thành phần của thực phẩm, lúc này chúng sẽ chống lại sự hư hỏng thực

phẩm và vi sinh vật gây bệnh (Cleveland và cs, 2001) Trong việc tìm ra các loại thuốc cho con người, bacteriocin có thể sử dụng để chống các loài gây bệnh nghiêm trọng cho người, ví dụ như MRSA và VRE (Lawton và cs, 2007) Trong sản xuất thuốc thú y chứa bacteriocin, nó ức chế sự phát triển tác nhân gây bệnh viêm vú ở bò (Ryan và cs, 1999)…Trong những năm gần đây, bacteriocin được chý ý hơn trong công nghệ ứng dụng bảo quản thực phẩm Nó thay thế chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh đồng thời giữ cho thực phẩm ở trạng thái tự nhiên, tươi ngon và đặc biệt là không độc với con người Ngoài bacteriocin có tính thương mại như nisin và pediocin PA-1/AcH thì sử dụng các bacteriocin khác từ nhóm vi khuẩn lactic (lactisin 3147, enterocin AS-48 hoặc variancin) cũng có tác dụng bảo vệ thực phẩm tránh khỏi sự hư hỏng Chẳng hạn

bacteriocin bảo quản thực phẩm kháng chọn lọc đối với Listeria monocytogenes

mà không ảnh hưởng đến vi sinh vật khác Để nâng cao hiệu quả của quá trình bảo quản nguyên liệu người ta kết hợp bổ sung bacteriocin với phương pháp xử

lý vật lý áp suất cao hoặc xung điện từ trường, bacteriocin kết hợp áp suất thủy tĩnh cao, bacteriocin với phương pháp bảo quản lạnh…Hiệu quả tác động của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi nhân tố môi trường như pH, nhiệt độ, cấu trúc và thành phần thực phẩm cũng như hệ vi sinh vật của thực phẩm Sự phát triển gần đây trong lĩnh vực vi sinh vật phân tử, đồng thời những nghiên cứu về sinh học phân tử của bộ gen vi khuẩn có thể tiết lộ các nguồn sinh bacteriocin mới (Gálvez và cs, 2007)

1.2 Cá giò và các phương pháp bảo quản cá giò

1.2.1 Đặc điểm chung về cá giò

Cá giò (Rachycentron canadum) hay còn gọi là cá bớp (Cobia/Black King fish) phân bố ở vùng biển nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nước ấm của biển ôn

đới Trong tự nhiên, cá giò sống ở vùng nước mặn hoặc nước lợ ven biển, rạn san hô cho đến vùng biển khơi Cá giò thuộc loại cá dữ, ăn thịt động vật, thức ăn

tự nhiên gồm cua, tôm, ốc và các loại cá con Tốc độ sinh trưởng của cá nhanh,

có thể đạt cỡ 4 - 6 kg sau một năm nuôi Cá giò thành thục lần đầu tiên sau 2 năm tuổi, mùa sinh sản của cá giò ở miền Bắc từ tháng 4 đến tháng 7 hằng năm

Quy trình sản xuất cá giò tương đối ổn định và được đơn giản hóa để áp dụng rộng rãi, kể cả các cơ sở không có điều kiện đầu tư Kỹ thuật này bao gồm sinh sản nhân tạo đại trà bằng cách cho đẻ tự nhiên, cá bố mẹ được nuôi vỗ, ương nuôi ấu trùng, ương cá giống trên bể, ao và lồng gần bờ, nuôi cá thương phẩm trong lồng ngoài khơi Cá giò có giá trị kinh tế cao nên nó được nuôi phổ biến trong lồng bè ở các vùng biển tại các địa phương như Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Ninh, Vũng Tàu, Huế, Phú Yên, Khánh Hoà, Vũng Tàu, Kiên Giang Hiện nay, cá giò được tiêu thụ ở các thành phố lớn trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài ở dạng cá tươi hoặc chế biến đông lạnh Trên thị trường, sự chênh lệch giữa cá giò tươi và cá giò ươn lớn có thể tới 60.000 đ/kg Do đó việc nghiên cứu phòng và chữa bệnh cũng như bảo quản cá giò có ý nghĩa kinh tế cao

1.2.2 Các phương pháp bảo quản cá giò

Nguyên liệu thủy sản nói chung và cá giò rất dễ bị biến chất và hư hỏng Nguyên nhân gây hư hỏng do tự bản thân trong tế bào có sẵn enzym thúc đẩy quá trình oxy hóa xảy ra, do vi sinh vật và các yếu tố bên ngoài (như nhiệt độ và độ ẩm) Chính vì những lẽ đó cần có những phương pháp xử lý, bảo quản để giữ được chất lượng, hạn chế tổn hao dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm cho nguyên liệu thủy sản cũng như cá giò

Những năm gần đây, xuất khẩu thủy sản Việt Nam có những bước tiến nhảy vọt Năm 2002, lần đâu tiên kim ngạch xuất khẩu vượt qua con số 2 tỷ đô la Chất lượng hàng thủy sản tiêu thụ nội địa cũng không ngừng được cải thiện, đáp ứng yêu cầu ngày một cao của nhân dân Đạt được những thành công đó, một trong những yếu tố quan trọng là nhờ những người làm công việc khai thác và nuôi trồng thủy sản đã bảo quản tốt nguyên liệu cho khâu chế biến, tạo thành một dây chuyền đồng

bộ, khép kín, giữ cho sản phẩm luôn được tươi tốt

Tùy từng điều kiện cụ thể của từng ngư dân, doanh nghiệp sản xuất thủy sản

mà có phương pháp bảo quản cá và nguyên liệu thủy sản khác nhau: bảo quản cá ở nhệt độ thấp, hóa chất bảo quản, chất kháng sinh, xung điện trường…

a Bảo quản cá nguyên liệu ở nhiệt độ thấp

Dựa vào nguyên lý chung là khi nhiệt độ hạ thấp thì enzym và vi sinh vật trong nguyên liệu bị giảm hoạt động hoặc có thể bị đình chỉ sự sống, như vậy nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian Trong phạm vi nhiệt độ bình thường, cứ nhiệt độ hạ xuống 100C thì phản ứng sinh hóa giảm xuống 1/2 đến 1/3, khi nhiệt độ hạ xuống thấp sẽ làm ức chế hoạt động về sinh lý của vi sinh vật cũng như enzym Ví dụ như nhiệt độ nhỏ hơn 100C vi khuẩn gây thối rữa và vi khuẩn gây bệnh bị kìm chế phần nào, ở 00C thì tỷ lệ phát triển của chủng rất thấp, -50C đến -

100C thì hầu như không phát triển được Nhưng vẫn có loài vi khuẩn khi nhiệt độ hạ xuống -150C vẫn phát triển được: Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium…

Giữ tươi ở nhiệt độ thấp có hai phương pháp là ướp lạnh và ướp đông

 Phương pháp ướp lạnh sơ bộ

Ướp lạnh sơ bộ được ngư dân sử dụng phổ biến để bảo quản nguyên liệu mới đánh bắt Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm nhưng giữ tươi trong thời gian ngắn Phương pháp ướp lạnh là hạ nhiệt độ xuống 00C hoặc -10C có thể sử dụng kho lạnh, nước biển lạnh hoặc nước đá để bảo quản Trong đó bảo quản bằng nước đá là phổ biến nhất, người ta sử dụng nước đá vảy hoặc nước đá vụn kết hợp với muối ăn

để tăng khả năng làm lạnh Tỷ lệ muối ăn dùng 15 - 20 % so với lượng nước đá và lượng nước đá là 100 - 128% so với lượng cá như vậy có thể làm cho nhiệt độ hạ xuống -8 ÷ -100C Tiến hành bảo quản bằng cách cứ một lớp muối đá rồi một lớp cá ướp cho vào thùng gỗ, dung tích thùng chứa 25 - 30 kg và chiều cao lớp nguyên liệu không nên quá 30 cm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006)

 Phương pháp làm lạnh đông

Phương pháp làm lạnh đông là hạ thấp nhiệt độ của nguyên liệu xuống -80C Như vậy một lượng nước lớn ở trong nguyên liệu sẽ bị đông kết lại làm ngừng đến mức tối đa hoặc đình chỉ hoàn toàn hoạt động của enzym nội tại, vi sinh vật sẵn có

và vi sinh nhật xâm nhập vào gây thối rữa Hiện nay, đây là phương pháp giữ tươi nguyên liệu tốt nhất, đảm bảo được tính chất, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu Mặc dù vậy trong quá trình bảo quản chất lượng của nguyên liệu cũng

có sự biến đổi như protid bị đông đặc biến tính, chất béo bị thủy phân hoặc bị oxy

hóa, đặc biệt là các biến đổi về vật lý và cấu trúc của nguyên liệu Nguyên liệu làm lạnh đông trước khi đưa vào chế biến hoặc tiêu thụ phải được tiến hành giải đông

Tùy vào mục đích và thời gian bảo quản mà người ta chọn nhiệt độ bảo quản khác nhau có thể -180C, -250C…Phương pháp này chỉ áp dụng với các nhà máy chế biến với quy mô lớn, sử dụng các kho, tủ cấp đông Để tăng hiệu quả bảo quản trước khi cấp đông nguyên liệu có thể được lấy hết ruột rửa sạch nội tạng

b Bảo quản cá nguyên liệu bằng hóa chất

Cho đến nay người ta đã nghiên cứu nhiều loại hóa chất dùng trong bảo quản nguyên liệu rất có hiệu quả Dùng hóa chất bảo quản tốt nhất là kết hợp với nhiệt độ thấp thì giữ được tươi hơn

Yêu cầu của hóa chất dùng để bảo quản là không độc với con người, không

có mùi vị lạ, tính chất hóa học phải ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản

Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: muối vô cơ, acid chất hữu cơ

Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khac nhau:

 Muối vô cơ

Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite (Ca(OCl)2), natri nitrit (NaNO2), natri chlorua (NaCl) bằng cách chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá ướp, còn khi pha thành dung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2 - 5 phút sau đó mang bảo quản lạnh

dùng hỗn hợp acid với chất hóa học phòng thối khác để nâng cao hiệu quả bảo quản Ngoài ra, người ta dùng rơm, cỏ khô, mùn cưa… được tẩm acid để bảo quản

 Loại chất hữu cơ

Nói chung các chất hữu cơ thường được sử dụng hạn chế trong bảo quản nguyên liệu tùy theo quy định của các nước

Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối natri của nó, formaldehyt và sulfathiazol…và chúng được sử dụng dưới dạng chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch

c Bảo quản bằng cách dùng thuốc chống oxy hóa

Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay sinh ra sản phẩm ôi khét, ôi thối nguyên nhân là do hiện tượng oxy hóa, đốt cháy

mỡ sinh ra Để ngăn chặn hiện tượng đó người ta tiến hành bảo quản lạnh kết hợp với chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa được dùng như: Acid citric, acid tactric, tocopherol (vitamin E), butyl hydroxyanizol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT)…Chúng không có khả năng phục hồi lại các chất béo đã hỏng mà có tác dụng chống sự oxy hóa hoặc để chống oxy

Chất chống oxy hóa được sử dụng dưới dạng dung dịch, nước đá (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006)

d Bảo quản bằng phương pháp sinh học kết hợp bảo quản lạnh

Sử dụng phương pháp sinh học để làm chậm thời điểm bắt đầu tê cứng hoặc kéo dài quá trình tê cứng của cá để giữ cá được tươi, có nghĩa là làm chậm sự phân giải ATP Muốn làm giảm sự phân giải ATP trong tổ chức cơ thịt cá thì tìm mọi cách làm cho cá chết ngay, không để cho cá giãy giụa hoạt động Có nhiều cách làm cho cá ngừng hoạt động như thả cá vào nước 20C, dùng điện trường, các chất gây

mê cho cá ngủ trong một thời gian nhất định Cá sau khi chết phải thả ngay vào nước biển hoặc nước muối pha loãng 1 - 2 giờ để rửa sạch máu, nhiệt độ nước rửa phải thấp hơn nhiệt độ cá sống 2 - 30C, không được thấp quá sẽ làm cơ thịt co rút lại

và mau tê cứng Cá sau khi rửa xong vớt ra bảo quản 100C Khi vận chuyển cá đi nơi khác dùng nước đá để bảo quản Cá được xếp trong bao polyethylene và xếp

thành từng con vào thùng gỗ, nước đá chỉ phủ phần đầu không ướp nước đá xuống thân để phòng hạ thấp nhiệt độ Trong quá trình vận chuyển tránh mọi va chạm, giữ

cá được yên tĩnh (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006)

e Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh

Truớc đây chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo quản nguyên liệu Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh

có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên cứu và sử dụng thận trọng hơn Chất kháng sinh là chất hữu cơ do vi sinh vật hoặc động thực vật cao đẳng sinh ra hoặc dùng phương pháp tổng hợp như chloromyxetin

Aureomycin và teramycin là chất kháng sinh được sử dụng để bảo quản hải sản nhiều nhất, ngoài ra người ta nghiên cứu sử dụng các chất như penicillin, nizin, tylozin…

Chất kháng sinh được sử dụng trong bảo quản bởi vì nó làm cho một vài cơ năng nào đó trong vi sinh vật không hoạt động được và làm rối loạn sự trao đổi chất, do

đó làm vi sinh vật bị yếu hoặc bị chết Tác dụng đó của chất kháng sinh rất mạnh cho nên chỉ dùng liều nhỏ đã có hiệu lực bảo quản

Có 3 phương pháp sử dụng chất kháng sinh: ngâm, phun và chế thành nước

đá

Phương pháp ngâm: nguyên liệu đem rửa sạch ngâm vào dung dịch chất kháng sinh từ 5 - 10 phút, sau đó đem bảo quản, nồng độ kháng sinh thường dùng là

5 - 20ppm, bảo quản cá thường dùng chất kháng sinh có nồng độ 10ppm

Phương pháp phun: nguyên liệu rửa sạch sau đó dùng dung dịch khánh sinh

có nồng độ hơi cao để phun đều trên nguyên liệu Phương pháp này thích hợp với các loại cá to

Phương pháp chế thành nước đá: dùng chất kháng sinh hòa thành dung dịch sau đó làm lạnh cho đóng băng rồi đem nghiền nhỏ ra để bảo quản nguyên liệu, khi bảo quản chất kháng sinh sẽ tan ra ngấm vào nguyên liệu Dùng dung dịch chất kháng sinh để chế thành nước đá sẽ làm chất kháng sinh phân bố không đều trong

nước đá, nước đá có thể làm mất hoạt tính chất kháng sinh hoặc gây kết tủa

(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 2006)

f Bảo quản cá nguyên liệu bằng dịch bacteriocin

Bacteriocin là những đoạn peptid hoặc protein có hoạt tính kháng khuẩn được sản xuất trừ nhiều loại vi khuẩn khác nhau Bacteriocin được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và nó được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để giảm chất bảo quản hóa học đưa vào thực phẩm và nó tốt hơn phương pháp xử lý nhiệt Bảo quản bằng bacteriocin thì thực phẩm giữ được các tính chất đặc trưng về cảm quan và dinh dưỡng Đây là phương pháp bảo quản tự nhiên, nó có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về sản phẩm ăn liền tiện lợi, an toàn, tươi, sạch của chế biến thực phẩm và phát triển các sản phẩm mới Ngoài các sản phẩm thương mại sẵn có như nisin, pediocin PA-1/AcH còn có các loại khác như lacticin 3147, enterocin AS-48 hoặc variacin

Bacteriocin được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu cũng như trong thực phẩm dưới các hình thức cho vào phụ gia, làm chất độn, nuôi cấy vi sinh vật bổ sung vào nguồn nguyên liệu để nó tự sản sinh bacteriocin, cũng có thể tạo các bacteriocin cố định trên bao bì bảo quản (Antonio Gá levez* và cs, 2007)

Trong những năm gần đây, ứng dụng của bacteriocin như là một phần của công nghệ xử lý Việc kết hợp giữa bacteriocin với xử lý nhiệt hay xung điện trường, bảo quản lạnh, điều chỉnh hỗn hợp khí…tốt hơn khi dùng bacteriocin để bảo quản Các phương pháp này ứng dụng rộng rãi ngoài nước trong bảo quản thực phẩm nhưng ở Việt Nam còn hạn chế

Ngoài những phương pháp bảo quản trên còn sử dụng phương pháp điều chỉnh hỗn hợp khí, bức xạ điện ly nhưng nó ít được sử dụng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản

1.3 Tình hình nghiên cứu về sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic trong thực phẩm

1.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có tính chất

ưu việt để dùng cho bảo quản thực phẩm như an toàn với người sử dụng, không

độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi protease trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người, hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh

và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác

di truyền (Gálvez và cs, 2007)

Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ và sinh ra bacteriocin kháng khuẩn và kháng nấm (De Vuyst và Leroy

Người ta đã nghiên cứu được các chủng lactic sinh bacteriocin: LAB (lactic acid

bacteria) ETO5, ETO6, ET30, ET34 Những chủng này phải được sàng lọc bằng cách thử hoạt tính decarboxylase tyrosine và histidine

Năm 2009, Gao J và cộng sự phân lập được các chủng Lactobacillus subsp và L paracasei Paracin 1.7 là bacteriocin được sản xuất từ vi khuẩn L paracasei HD 1.7, bền với nhiệt độ và pH acid nhưng nhạy cảm với enzym thủy

phân protein Khi bảo quản ở 40C sau 4 tháng hoạt động ức chế của paracin 1.7

chỉ giảm 4,19 % Paracin 1.7 có phổ ức chế rộng kháng lại Bacillus, Escherichia, Staphylococcus, Microccus, Pseudomonas, Salmonella, Sacharomyces, Enterobacter

Về mặt công nghệ, bacteriocin đã và đang được sử dụng kết hợp với hàng loạt kỹ thuật khác để tăng cường khả năng bất hoạt vi sinh vật đích Người ta có

thể sử dụng kết hợp bacteriocin với các chất kháng khuẩn khác, xử lý nhiệt độ,

áp lực thủy tĩnh cao, xung điện…( Gálvez và cs, 2007)

Gao và cộng sự (2010) đã nghiên cứu sản xuất bacteriocin từ

Lactobacillus sake C2 được phân lập từ cải bắp lên men Kết quả sakacin C2 phổ

kháng khuẩn rộng và hoạt động ổn định ở nhiệt độ cao 1210C , pH ổn định trong khoảng 3 - 8, nhạy cảm với protease nhưng không nhạy cảm với lipase, α -amylase và β - amylase

1.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên những nghiên cứu về ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm , thủy sản còn nhiều hạn chế

Lactic là chủng vi khuẩn được sử dụng đầu tiên để làm chế phẩm sinh học cho người và động vật giúp kích thích khả năng tiêu hóa Tuy nhiên trong chế phẩm

xử lý nước nuôi trồng thủy sản, vi sinh vật đóng vai trò hoàn toàn khác là cạnh tranh và hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh cho động vật nuôi Hai

chủng vi khuẩn Bacillus sp HY1 và vi khuẩn lactic CC4K được phân lập từ nước nuôi tôm và nước dưa đều có khả năng ức chế tốt các vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus HH1, V furnisii VT14 – 1, V Harvey NC5 – 1 và V vulnificus

HH2 Trong đó chủng CC4K chỉ có khả năng kháng một số vi sinh vật nhân sơ là

S aureus, S luted, B stutilis không kháng được vi sinh vật nhân chuẩn (Đặng

Phương Nga và cs, 2007) Năm 2006, Đặng Phương Nga và cộng sự nghiên cứu khả

năng đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm của một số chủng vi sinh vật lựa chọn Kết quả chọn được ba chủng: Bacillus sp HY1, Pseudomonas aeruginosa HL1 và Lactobacillus buchneri DC4 có khả năng kháng Vibrio

Trong những năm 2004, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội đã khảo sát đa dạng sinh học, khả năng sinh bacteriocin và tính chất probiotic của hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa đường ruột (đề tài khoa học cơ bản 2004 - 2005, mã số 620504) Nhóm tác giả Đại học Quốc Gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng sinh

bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum L24, kết quả thấy vi khuẩn này

vừa có khả năng sinh acid lactic vừa có khả năng sinh bacteriocin (Nguyễn Thị

Hoài Hà và cs, 2002) Bacteriocin đã được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel và điện di trên gel SDS - PAGE có trọng lượng phân tử khoảng 10 - 30kDa

Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản

xuất bacteriocin cố khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm

như E.coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác (Lê Thị Hồng Tuyết và cs,

2004) Nghiên cứu này còn cho thấy bacteriocin bắt dầu được sản xuất ở

L.acidophilus từ giờ thứ 12, ở nhiệt độ 30 - 370C với pH 5 - 7 và vi khuẩn có thể

sử dụng các loại đường như manitol, maltose và glucose

Nhóm nghiên cứu ở trường Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã

thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố

định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi

sơ chế Kết quả cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên

BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, khối lượng và số lượng bacteriocin so với đối chứng Khi sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml để bảo quản thịt tươi sơ chế, tối thiểu cho thấy thời gian bảo quản đến 3 ngày mầ vẫn đảm bảo chất lượng theo TCVN 7046:2002

Trong việc nghiên cứu quy trình muối chua nha đam (Lê Thanh Mai, 2002) tiến hành thí nghiệm dựa trên hai phương pháp: lên men có bổ sung giống

Lactobacillus plantarum và lên men không bổ sung giống Kết quả cho thấy muối

chua có bổ sung giống cho thành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn

Ngoài ra còn rất nhiều nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định về mặt cảm quan hơn là thực phẩm lên men truyền thống Tuy nhiên những nghiên cứu trực tiếp về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thủy sản, thực phẩm còn hạn chế

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin phân lập từ nước dưa cải được lấy

từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

Chủng vi khuẩn lactic T8 sinh bacteriocin được nuôi trên môi trường lỏng MRS (bảng 1), trong tủ ấm 37oC Chúng tôi đã bảo quản giống lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS và trong glycerol Bảo quản vi khuẩn lactic trên môi trường thạch nghiêng MRS, các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6oC Định kỳ cấy truyền giống, 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần Bảo quản giống trong glycerol 30% với tỷ lệ thể tích giữa dịch giống / glycerol là 70 µl / 30 µl, các ống được giữ ở -

700C

 Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus phân lập từ mẫu tôm sú được lấy từ bộ sưu tập chủng vi

sinh vật của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

Sau khi có chủng gốc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus trên

môi trường lỏng TSB (bảng 2) ở nhiệt độ 28 - 300C, lắc 200 vòng/phút Bảo quản

giống Bacillus trên môi trường thạch nghiêng (TSA), các ống được bảo quản ở

nhiệt độ 4 - 6oC Định kỳ cấy truyền giống, 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần Bảo quản giống trong glycerol 30% với tỷ lệ thể tích giữa dịch giống / glycerol là 70 µl /

30 µl, các ống được giữ ở -700C

Hình 2 Vi khuẩn Bacillus trên môi trường TSA sau 24 giờ nuôi ở nhiệt độ

37 0 C 2.1.2 Nguyên liệu cá giò

Hình 3 Cá giò nguyên liệu tươi

Cá giò (Rachycenton canadum) nguyên liệu tươi thu mua tại lồng nuôi cá

giò ở Lương Sơn - Nha Trang - Khánh Hòa

2.1.3 Hóa chất và môi trường

 PCA (Plate Count Agar)

PCA là môi trường tổng hợp nên pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất: pha 20,5 g trong 1000 ml nước cất, pH khoảng 7,0 - 7,2 Môi trường được hấp khử trùng 1210C trong vòng 15 phút (Trần Linh Thước, 2008)

 MRS (de Man, Rogosa và Sharpe)

Nếu sử dụng môi trường thạch bổ sung agar (20 g) Chỉnh pH về 6,2 - 6,8 rồi hấp khử trùng 1210C trong vòng 15 phút (Haddadin, 2005)

Môi trường MRS tổng hợp (Lactobacillus MRS broth) pha theo chỉ dẫn của

nhà sản xuất (Merck, Đức): pha 55,15 g trong 1 lít, chỉnh pH về 6,2 - 6,8 hấp khử trùng 1210C trong 15 phút ở 1 atm

 TSB (Trypticase Soy Broth)

Môi trường tổng hợp pha theo chỉ dẫn của nhà sản xuất: pha 30 g trong

1000 ml nước chỉnh pH về 7,3 ± 0,2 Phân bố vào các bình tam giác rồi hấp khử trùng 1210C trong vòng 15 phút (Trần Linh Thước, 2008)

 TSA (Trypticase Soy Agar)

Môi trường thạch mềm TSA có bổ sung chất màu methylene blue để thử

hoạt tính sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin Cân 10 g agar trong 1 lít môi trường TSB

 Nước muối sinh lý

Cân 8,5 g natri clorua trong 1 lít nước cất, phân phối vào ống nghiệm rồi hấp khử trùng 1210C trong vòng 15 phút (Trần Linh Thước, 2008)

 Methylene Blue (C 16 H 18 CIN 3 S.3H 2 O)

Pha 0,8 g trong 20 ml nước cất, hút 1 ml vào mỗi ống ependof Mỗi lần dùng lấy ra từ các ống đã pha sẵn

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng

Một số thiết bị chuyên dụng được sử dụng trong đề tài bao gồm: Tủ cấy vô trùng (Ohaus, Tây Ban Nha); tủ sấy (Binder, Germany); nồi hấp thanh trùng (Sturdy, Đài Loan); máy đồng nhất mẫu, lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc); máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (Varian, Úc), tủ ấm (Memmert, Đức);…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định khả năng sinh trưởng

Xác định khả năng sinh trưởng của chủng T8 trên môi trường MRS bằngd phương pháp đo độ đục Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù (dịch nuôi cấy) tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập được mối quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục

Do đó có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua độ đục bằng máy so màu ở bước sóng từ 550 - 610nm (Trần Linh Thước, 2008)

Hoạt hóa chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin (T8) trong môi trường MRS lỏng, cho vào tủ ấm 370C đo OD600 đạt từ 1 – 2 lấy dịch mang đi nuôi cấy