Nhân đoạn gen mã hóa 16s rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối conus bằng kỹ thuật PCR

Vì vậy, trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngà

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Phạm Thu Thủy, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP Nha Trang - Khánh Hòa Cô đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá

trình thực hiện để hoàn thành đồ án này

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa chất và các dụng cụ thí nghiệm

ThS Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu và thầy Ứng Trọng

Thuấn, Bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật

Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang

Các bạn trong lớp 48CNSH, Trường Đại học Nha Trang

Cuối cùng xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công

Nha Trang, tháng 6 năm 2010 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tiến Lâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH iv

LỜI NÓI ĐẦU 1

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về ốc cối 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm chung 4

1.2 Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại các động vật thân mềm .12

1.2.1 Chỉ thị ty thể .12

1.2.2 Chỉ thị nhân .13

1.3 Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối .14

1.3.1 Trên thế giới .14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước .18

Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu .20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .20

2.1.2 Hoá chất .20

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng .21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 22

2.2.2 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR .24

2.2.3 Điện di gel agarose .27

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tách chiết DNA tổng số ốc cối .29

3.2 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật PCR .32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Danh mục bảng:

Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus 12

Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng 13

Bảng 3.1: Danh sách các loài ốc cối Conus đã tách chiết được DNA 32

Bảng 3.2: Các thông số của mồi 33

Bảng 3.3: Danh sách các loài ốc cối đã nhân gen 36

Bảng 3.4: Danh sách các loài ốc cối đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 36

Danh mục hình: Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus 09

Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam 10

Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2 16

Hình 1.4: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 19

Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 26

Hình 3.1: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA 30

Hình 3.2: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 32

Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối 35

LỜI NÓI ĐẦU

Loài ốc cối Conus sống tại vùng biển nhiệt đới vốn nổi tiếng là nguồn nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và nhiều bệnh khác Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối (conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc giảm đau hiện nay Vì vậy, trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào

Tuy nhiên cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới 70.000 độc tố của ốc cối

Do vậy, các nghiên cứu sâu hơn về ốc cối và độc tố ốc cối vẫn đang và sẽ được tiếp tục tiến hành trong đó có các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối

Hơn thế nữa, các loài ốc cối có quan hệ di truyền gần nhau thường chứa các peptide độc tố giống nhau hơn là các loài có mối quan hệ xa nhau Do vậy, các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối không chỉ làm cơ sở cho việc phát hiện các loài ốc cối mới, mà còn góp phần quan trọng vào quá trình nghiên cứu các conotoxin mới, nhằm phát huy hết tiềm năng vốn có của chúng

Bên cạnh giá trị đối với y học, các loài ốc cối còn có giá trị kinh tế cao Do

có màu sắc và hoa văn đẹp, vỏ của các loài ốc cối thường được khai thác để làm

đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm Tình trạng khai thác một cách bừa bãi các loài ốc cối đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự đa dạng loài của ốc cối Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng lại ở mức độ thống kê các loài đặc hữu và mô tả các đặc điểm hình thái giải phẫu Hiện chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối ở mức độ phân tử Vì vậy, nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là điều rất cần thiết

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân đoạn gen mã hóa

16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR”,

làm cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh chủng loại và tìm kiếm các loài ốc cối mới ở Việt Nam

Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau đây:

 Tách chiết DNA tổng số của các loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam

 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối bằng kỹ thuật PCR, làm cơ sở cho việc giải trình tự gen nhằm xác định loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Sự thành công của đề tài này sẽ góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn

và khai thác hợp lý nguồn gen các loài ốc cối Việt Nam

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về ốc cối

1.1.1 Phân loại

Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm Cho đến nay, trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc chi Conus

Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758)

Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795)

Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997)

Liên họ: Conoidea (Fleming, 1822)

được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng

đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005)

Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus

(http://www.conidae.info )

Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường

Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo, ) (Hình 1.2) Các loài phổ biến là ốc cối địa lý (Conus

geographus) và ốc cối hoa lưới (Conus textile)

Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam

(Nguyễn Ngọc Thạch, 2007)

Chú giải hình 2.1

Danh sách vùng ven biển Việt Nam

1: Hạ Long 12: Đại Lãnh 23: Vũng Tàu

2: Hải Phòng 13: Vạn Gĩa 24: Cần Giờ

3: Hà Nam 14: Hòn Khói 25: Mỹ Tho

4: SầmSơn 15: Nha Trang 26: Cần Thơ

5: Cửa Lò 16: Cam Ranh 27: Hà Tiên

6: Huế 17: Phan Rang 28: Hòn Chồng

7: HộiAn 18: Phan Rí 29: Rạch Gía

8: Sa Huỳnh 19: Mũi Né 30: An Biên

9: Quy Nhơn 20: Phan Thiết 31: Cái Nuốc

10: Sông Cầu 21: Long Hải 32: Sông Đốc

11: Tuy Hòa 22: Bà Rịa

Danh sách các đảo Việt Nam

I: Đảo Cát Bà IV: Đảo Bãi Miếu VII: Đảo Côn Sơn II: Đảo Cù Lao V: Đảo Phú Qúy VIII: Đảo Phú Quốc III: Đảo Lý Sơn VI: Đảo Trường Sa IX: Đảo Nam Du

X: Đảo Thổ Chu

Danh sách các tỉnh ven biển Việt Nam

A: Quảng Ninh J: Thừa Thiên Huế S: Bà Rịa - Vũng Tàu B: Thái Bình K: Tp.Đà Nẵng T: Tp Hồ Chí Minh C: Nam Định L: Quảng Nam U: Bến Tre

D: Ninh Bình M: Quảng Ngãi V: Trà Vinh

E: Thanh Hóa N: Bình Định W: Sóc Trăng

F: Nghệ An O: Phú Yên X: Bạc Liêu

G: Hà Tĩnh P: Khánh Hòa Y: Cà Mau

H: Quảng Bình Q: Ninh Thuận Z: Kiên Giang

I: Quảng Trị R: Bình Thuận

Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống Thức ăn chính của chúng là các loài cá nhỏ (piscivorous), giun biển (vermivorous), nhuyễn thể (molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối khác ( Terlau và Olivera, 2004; Olivera và cs, 2002) Do di chuyển chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển nhanh như cá, chúng sử dụng độc tố để tấn công, làm tê liệt con mồi Độc tố ốc cối được tiết ra từ cơ quan miệng có răng sừng dạng kim và một ống xoắn gắn với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp Khi tiếp cận con mồi, vòi của chúng thò ra và bộ phận hình mũi tên (răng sừng) đâm con mồi rồi phóng chất độc vào

Độc tố ốc cối (conotoxin) là những đoạn peptide nhỏ dài 12 - 46 aa, giàu liên kết disulfide Tùy theo cấu trúc, chúng được chia làm các nhóm chính sau, mỗi nhóm được mã hóa bởi một siêu họ gen (bảng 1.1) Các độc tố trong một siêu họ có thể có các đích tác dụng khác nhau như ức chế hoặc kìm hãm đối với một kênh ion hoặc receptor gắn với protein G đặc trưng (Becker và Terlau, 2008)

Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus

4 T CC CC Chưa xác định Chưa biết

CC -CXOCb  Vận chuyển Catecholamine

5 S

C-C-C-C-C-C-C C-C-C

 Thụ thể Serotonin

S Thụ thể Nicotin

6 P C-C-C-C-C-C Chưa xác định Chưa biết

7 I1/I2 C-C-CC-CC-C-C Chưa xác định Kênh K+

8 J C-C-C-C Chưa xác định Kênh K+ ?

(Olivera và cs, 2006)

Tín hiệu thần kinh từ tủy sống đưa lên não cần có sự vận chuyển các ion canxi qua lại màng tế bào trước synap qua các kênh canxi Kênh canxi có nhiều loại: L, T, P, R, Q, … Đặc biệt kênh canxi loại N có nhiều ở các mô cơ thần kinh đóng vai trò quan trọng trong sự nhạy cảm với các cơn đau Kênh canxi này bao gồm 5 tiểu đơn vị, trong đó, tiểu đơn vị α2-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ ω-conotoxin MVIIA Độc tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với tiểu đơn vị α2-δ, làm thay đổi cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua màng tế bào, sự truyền tín hiệu của các nơron thần kinh bị khóa Khả năng ngăn chặn này rất chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc bình thường (Becker và Terlau, 2008; Olivera và cs, 1987; Hillyardetal, 1992) Do vậy, các độc tố ốc cối được sử dụng trong điều trị các cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson, bệnh thuộc hệ thần kinh tự động, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác Cho đến nay, có 6 độc tố ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng, trong đó, Prialt (tên

thường gọi là Ziconitide), ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus, đã được cấp

phép sử dụng trong điều trị các cơn đau bởi Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) vào tháng 12 năm 2004 Ngoài ra, 2 độc tố khác cũng đang được thử nghiệm cận lâm sàng (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng

Peptide độc tố Ứng dụng Công ty Thử nghiệm

ω-MVIIA

(Prialt; Zicontide) Điều trị các cơn đau

Elan (Neurex)

Được cấp phép bởi Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

-PVIIA

(CGX-1051) Nhồi máu cơ tim Cognetix

Thử nghiệm cận lâm sàng

O-MrVIB

(CGX-1002) Điều trị các cơn đau Cognetix Thử nghiệm cận lâm sàng

Các loài ốc cối cung cấp nguồn dược phẩm quan trọng nhất và lớn nhất so với bất kỳ loài sinh vật nào trong tự nhiên (Chivian và cs, 2003) Mặc dù vậy, cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới ~70.000 peptide độc tố ốc cối Trong đó, 95% nghiên cứu chỉ được thực hiện trên 3 loài trong số 700 loài ốc cối (Espiritu

và cs, 2001; Chivian và cs, 2003) Vì vậy, các nghiên cứu nhằm khám phá các độc tố mới vẫn đang được tiệp tục tiến hành Do các loài ốc cối có quan hệ gần gũi thường chứa các peptide độc tố giống nhau Vì vậy, các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối góp phần quan trọng làm sáng tỏ quan hệ loài và phát hiện các độc tố mới

1.2 Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại các động vật thân mềm

Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu tạo của hệ thống tiêu hóa, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt

là đối với các loài có quan hệ gần gũi và do vậy có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết

Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau Với những loài

có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng Song với các loài có quan

hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao) Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân

1.2.1 Chỉ thị ty thể

Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công

cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3,

atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và

Robert, 2005)

Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ Năm 2006, trình tự DNA ty thể hoàn chỉnh của động vật thân mềm có độc đầu tiên được công bố -

của loài ốc độc Lophiotoma cerithiformis, có chiều dài 15.380 nucleotide, mã

hóa 13 protein ty thể, 2 rRNA và 22 tRNA Các mRNA, rRNA và 13 tRNA được phiên mã từ cùng một sợi trong khi các tRNA còn lại được phiên mã từ sợi còn

lại (Bandyopadhyay và cs, 2006) Sự sắp xếp các gen ty thể của L cerithiformis

có sự giống nhau đáng kể so với hệ gen ty thể của hai loài ốc Haliotis rubra,

Katharina tunicate, và loài bạch tuộc Octopus vulgaris Trình tự DNA ty thể của

L cerithiformis là cơ sở để các nhà nghiên cứu giải mã trình tự DNA ty thể và

nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc độc khác

1.2.2 Chỉ thị nhân

Trong nghiên cứu phát sinh chủng loại, do marker nhân có mức độ tiến hóa thấp hơn nhiều nên việc sử dụng marker nhân để bổ sung thông tin di truyền nhằm giải quyết mức độ tiến hóa của các loài có mối quan hệ gần nhau Do vậy

sử dụng kết hợp giữa marker nhân và marker ty thể trong nhiều trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các loài được rõ ràng hơn (Espiritu và cs, 2002) Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin và vùng không mã hóa như các đoạn chèn ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1) và ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2) nằm giữa các gen mã hóa rRNA (xem hình 1.3)

Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2

Trong đó, đoạn chèn ITS2 đã được Cylinder và Darioconus khẳng định là thành phần quan trọng trong việc khám phá và mô tả các đoạn peptide mới từ tuyến độc của các loài động vật thân mềm mà trước đây sử dụng chỉ thị ty thể không thể phân định một cách rõ ràng

1.3 Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối

1.3.1 Trên thế giới

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Tuy nhiên, cho tới nay mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để, do các marker phân

tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi mức bảo thủ của chúng quá cao trong việc

áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005) Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây, các marker DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn

Một ví dụ điển hình là các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối thu thập được tại quần đảo Cape Verde thuộc Đại Tây Dương, phía tây Senegal - một trong những khu vực có số lượng loài ốc cối đa dạng trên thế giới (với khoảng 50 loài đã được thống kê)

Năm 2005, Duda và Rolan đã sử dụng gen mã hóa cytochrome oxidase I

để phân tích phát sinh chủng loại của 90 loài ốc cối Conus, trong đó có 30 loài đặc hữu của Cape Verde Kết quả cho thấy, các loài này được phân làm 2 nhánh (Duda và Rolan, 2005)

Cũng trong năm này, Cunha và cs đã sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, cytochrome b) kết hợp với một gen nhân (gen

mã hóa một lipoprotein giống megalin) để xây dựng cây phát sinh chủng loại của

49 loài ốc cối thuộc Cape Verde, trong đó có 3 loài chưa được định danh Kết quả một lần nữa khẳng định nghiên cứu trước đó của Duda và Rolan, các loài ốc cối này cũng được chia làm hai nhánh chính: nhánh thứ nhất bao gồm các loài ốc cối có vỏ lớn và nhánh thứ hai bao gồm các loài có kích thước nhỏ hơn Cả hai nhánh đều chứa các loài đặc hữu và di cư, điều này chứng tỏ tổ tiên của chúng đã

di cư tới Cape Verde một cách độc lập (Cunha và cs, 2005)

Cunha và cs, 2008 tiếp tục nghiên cứu phát sinh chủng loại của 4 loài ốc

thuộc nhánh có vỏ lớn là C ateralbus, C pseudonivifer, C trochulus, và C

venulatus sử dụng các gen coxI (mã hóa cytochrome oxidase I) và nad4 (mã hóa

tiểu đơn vị 4 của NADH dehydrogenase) (tiến hành trên 200 mẫu ốc thu thập tại

16 địa điểm thuộc các đảo Sal, Boavista và Maio) Kết quả cho thấy, các mẫu ốc thuộc 4 loài này được chia làm 3 nhánh rõ ràng, tương đối cách xa nhau mà việc phân loại dựa vào màu sắc vỏ và hoa văn không thể thấy được (Cunha và cs, 2008)

Duda và cs, 2001, sử dụng chỉ thị 16S và calmodulin đã xây dựng phát sinh chủng loại của 76 loài ốc cối Conus, trong đó 75 loài có nguồn gốc từ các vùng biển Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và 1 loài có nguồn gốc từ Đông Đại Tây Dương (Duda và cs, 2001)

Duda và Kohn, 2005 đã sử dụng gen mã hóa 16S rRNA (ty thể) và protein calmodulin (gen nhân) để nghiên cứu phát sinh chủng loại của 138 loài ốc cối Conus thu thập tại các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, Đông Thái Bình Dương, Đại Tây Dương (Duda và Kohn, 2005)

Duda và cs, 2008 đã sử dụng các gen ty thể (mã hóa 16S rRNA và cytochrome oxidase) và một gen nhân để phân định và mô tả một số loài ốc

trong giống Conus spp: Conus sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis,

Conus musicus và Conus parvatus tại miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và Conus nux đông Thái Bình Dương mà trước đây biện pháp mô học thông thường

chưa thực hiện được Kết quả trong sự phân tích phát sinh của Conus nanus và

Conus sponsalis cho thấy sự tiến hóa khác biệt, hoàn toàn phù hợp với hình thái

khác nhau của chúng, và cũng đã xác định được một vài loài bí ẩn mà mức độ

loài tiến hóa khác nhau Ba hình thái xuất hiện đại diện cho C.nanus nhưng khác

nhau về kích thước vỏ đối với các loài lớn hoặc khác nhau về màu vỏ (Duda và

cs, 2008)

Nam và cs, 2009 sử dụng đoạn gen ty thể và gen nhân ITS2 để giải quyết mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối có mối quan hệ gần gũi mà chưa được hiểu biết một cách cặn kẽ khi sử dụng 16S rRNA ty thể Kết quả cho thấy các loài này được chia làm 3 nhánh riêng biệt Conus (Nam và cs, 2009)

Năm 2008, trình tự DNA ty thể của Conus textile đã được giải mã hoàn

toàn (hình 1.4) có chiều dài 15.562 nucleotide và có cấu trúc tương tự như DNA

ty thể loài ốc L cerithiformis (Bandyopadhyay và cs, 2008) Hệ gen ty thể Conus

textile bao gồm 15.562 nucleotide mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA

Trong đó, các gen mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho cytochrome oxidase 1-3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho

16S rRNA) và 22 gen mã hóa các tRNA Hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ của rRNA

được sao chép từ cùng một sợi trong khi các tRNA cho M, Y, C, W, H, G, E, và

T được sao chép từ các sợi bổ sung

Hình 1.4 Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile Hệ gen ty thể của Conus textile là

một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15.562 nucleotide, mã hóa cho: 13 protein ty thể [3

cytochrome oxidase (các gen coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase (gen atp6 và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; 2 rRNA; 22 tRNA [D, V, L (1), L (2), P, S

(1), S (2), H, F, K, A, R, N, I, M, Y, C, W, H, G, E và T] (Bandyopadhyay và cs, 2008)

Khoảng cách giữa các gen thay đổi từ 0 - 35 nucleotide trừ hai vùng liên

gen coxI - coxII và tRNAPhe - coxIII tương đối lớn có kích thước tương ứng là

165 và 126 nucleotide Từ hệ gen trên để làm cơ sở cho việc nghiên cứu các loài

ốc cối khác

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại ốc cối ở mức độ phân tử, và đã có nhiều thành công trong việc xác định loài mới cũng như khám phá, mô tả các conotoxin mới như đã giới thiệu ở trên

Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ đang dừng lại ở mức độ mô tả đặc điểm hình thái, giải phẫu, thống kê loài (Nguyễn Anh Tuấn, 2009) cũng như các thông tin cảnh báo về loài ốc cối có thể gây ngộ độc cho con người Theo Đào Việt Hà và cs, ở Việt Nam hiện đã thống kê được

76 loài ốc cối, chủ yếu là ốc cối hoa lưới (C textile) và ốc cối địa lý (C

geographus) Đây cũng chính hai loài ốc cối đã được Viện hải dương học Nha

Trang xếp vào danh mục “các loài hải sản độc hại gây chết người” (Đào Việt Hà

và cs, 2006)

Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối Việt Nam được tiến hành

ở mức độ phân tử Vì vậy, việc nghiên cứu về định danh loài cũng như xây dựng cây phát sinh chủng loại các loài ốc cối ở Việt Nam là điều rất cần thiết

Chương II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU