Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn clostridium perfringens bằng phản ứng multiplex PCR

Vi khuẩn C.perfringens thường có mặt trong dạ cỏ và ruột của dê, cừu khỏe mạnh, bình thường chúng không gây bệnh nhưng do một số yếu tố tiền đề như: thay đổi khẩu phần ăn đột ngột, stre

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, TS Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân Viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn: PGS TS Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu

để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

- Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên - Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 6

1.2 Đặc tính của vi khuẩn C.perfringens 7

1.2.1 Đặt điểm hình thái và tính bắt màu 8

1.2.2 Đặt tính nuôi cấy 8

1.2.3 Đặt tính sinh vật, hóa học 9

1.2.4 Đặt tính di truyền 10

1.3 Các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens 11

1.3.1 Alpha toxin (CPA) 11

1.3.2 Beta toxin (CPB) 12

1.3.3 Epsilon toxin (ETX) 12

1.3.4 Iota toxin (CPI) 13

1.3.5 Enterotoxin (CPE) 13

1.3.6 Delta toxin 13

1.3.7 Theta toxin 13

1.4 Các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens và khả năng gây bệnh 14

1.4.1 Type A 15

1.4.2 Type B 15

1.4.3 Type C 16

1.4.4 Type D 17

1.4.5 Type E 17

1.5 Phản ứng PCR 18

1.5.1 Nguyên tắc thực hiện 18

1.5.2 Các thành phần cơ bản tham gia phản ứng PCR 19

1.5.3 Các bước tiến hành 21

1.5.4 Phân tích kết quả 22

1.5.5 Các yếu tố ảnh hưởng 23

1.5.6 Phản ứng Multiplex PCR 26

1.5.7 Những lợi ích của phản ứng PCR 26

1.5.8 Các loại PCR 27

1.5.9 Giải pháp tối ưu hóa PCR 28

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.1 Kiểm tra đặt tính sinh học, hóa học 30

2.2.2 Xác định gen mã hóa độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 32

2.2.3 Phương pháp thử độc lực 35

2.3 TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 37

2.4 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 37

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 37

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 GIÁM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 38

3.2 Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 42

3.2.1 Xác định type độc tố 42

3.2.2 Kiểm tra gen mã hóa độc tố đương ruột và beta2 44

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG 46

3.3.1 Độc lực của canh khuẩn trên chuột nhắt trắng 46

3.3.2 Độc lực của độc tố trên chuột nhắt trắng 47

3.4 Xác định MLD của độc tố vi khuẩn 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

1 KẾT LUẬN 50

2 ĐỀ NGHỊ 50 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C perfringens 11

Bảng 2.2 : Các type vi khuẩn C perfringens và độc tố chính 14

Bảng 2.3: Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C perfringens 14

Bảng 2.1: Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong Mutiplex – PCR 33

Bảng 2.2: Các thành phần của phản ứng Multiplex – PCR 34

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex –PCR 35

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra đặc tính sinh học, hóa học 39

Bảng 3.2: Kết quả xác định type loại độc tố của vi khuẩn C perfringens 43

Bảng 3.3: Kết quả xác định gen mã hóa độc tố Beta2 toxin và Enterotoxin 44

Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type A 47

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type D 47

Bảng 3.7: Kết quả xác định MLD của độc tố trên chuột 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vi khuẩn C perfringens 7

Hình 2.2 Hiện tượng dung huyết beta 8

Hình 2.3 Phản ứng PCR 17

Hình 2.4 Chu trình nhiệt PCR 18

Hình 3.1 Phương pháp tiêm canh khuẩn vào xoang phúc mạc 34

Hình 3.2 Phương pháp tiêm độc tố vào tĩnh mạch đuôi chuột 35

Hình 4.1.Hình thái vi khuẩn, trực khuẩn Gram dương 38

Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn, phương pháp soi tươi 38

Hình 4.3 Dung huyết beta trên môi trường thác máu 39

Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường SPS 39

Hình 4.5 Trên môi trường Egg yolk 39

Hình 4.6 Trên Litmus 39

Hình 4.7 Môi trường đường chưa nuôi cấy 39

Hình 4.8 Manitol - , Glucose + , Lactose + , Maltose + , Sucrose + 39

Hình 4.9 Phản ứng CAMP 40

Hình 4.10 Phản ứng O-F 40

Hình 4.11.Kết quả xác định gen mã hóa các loại độc tố bắng phản ứng multiplex PCR … 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm qua, nhờ chính sách đầu tư phát triển Nông nghiệp, xóa đói giảm nghèo của Chính phủ đã thúc đẩy nghề chăn nuôi nói chung và chăn nuôi dê, cừu nói riêng phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng Tổng đàn dê, cừu cả nước tăng từ 572.448 con năm 2001 lên đến 1.777.600 con năm 2007, trong đó 3 tỉnh duyên hải Nam Trung bộ (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận) chiếm 15,87% (khoảng 282.125 con) Tuy nhiên, việc thực hiện các quy trình kỹ thuật như quản lý giống, chuồng trại, thú y, chăm sóc nuôi dưỡng của các địa phương còn nhiều hạn chế, trình độ kỹ thuật và quản lý còn yếu kém Bên cạnh đó việc nghiên cứu về thức ăn, chăm sóc nuôi dưỡng, phòng trị bệnh tật cho động vật nuôi cũng chưa tương xứng với nhu cầu và tốc độ tăng trưởng của nghề chăn nuôi dê, cừu Dịch bệnh gia súc là một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển của chăn nuôi Vì vậy, trong thời gian tới ngành Nông nghiệp đã xác định nhiệm vụ trước hết

là khống chế các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, sau đó từng bước khống chế các bệnh truyền nhiễm mãn tính, các bệnh do ký sinh trùng, các bệnh nội khoa, Một

số bệnh thường gặp ở dê, cừu như bệnh tụ huyết trùng, bệnh đậu, bệnh viêm lở

miệng,… trong đó, bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn Clostridium perfringens

gây ra đã làm tổn thất lớn cho người chăn nuôi

Vi khuẩn C.perfringens phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy ở trong đất, chất hữu cơ Vi khuẩn C.perfringens thường có mặt trong dạ cỏ và ruột

của dê, cừu khỏe mạnh, bình thường chúng không gây bệnh nhưng do một số yếu tố tiền đề như: thay đổi khẩu phần ăn đột ngột, stress vận chuyển, sức đề kháng giảm tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sôi, phát triển và sinh độc tố gây bệnh Các độc tố của vi khuẩn được giải phóng ra rất nhanh và được hấp thu vào máu, khi đó thì các triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện như: tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt có mùi thối khắm, co giật toàn thân, nghiến răng, chảy nước giải và chết sau vài giờ

Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C.perfringens sản sinh hơn 17 loại độc

tố khác nhau như: độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2,

Enterotoxin, Theta, vv… Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha,

beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C.perfringens thành 5 type độc tố

(toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E) Trong đó type A sản sinh độc tố Alpha; type B sản sinh độc tố Alpha, Beta, Epsilon; type C sản sinh độc tố Alpha, Beta; type D sản sinh độc tố Alpha, Epsilon; và type E sản sinh độc tố Alpha và Iota

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của C.perfringens

gây bệnh đường tiêu hóa ở gia súc như bệnh viêm ruột họai tử, viêm dạ múi khế ở loài nhai lại, hội chứng tiêu chảy ở bò, dê, lợn (Mainil và cộng sự, 2006) Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn

C.perfringens (Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự, 1995; Nguyễn Bá Hiên và cộng sự,

1999; Nguyễn Văn Sửu và cộng sự, 2003; Lê Lập và cộng sự, 2007) Tuy nhiên,

hiện chưa có công trình nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn C.perfringens trong

bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu nuôi tại khu vực miền Trung một cách đầy đủ và

hệ thống

Có nhiều phương pháp phát hiện độc tố của vi khuẩn C.perfringens như phản

ứng trung hòa độc tố trên chuột, phản ứng ELISA, PCR Trước đây phản ứng trung hòa độc tố trên chuột thường được sử dụng phổ biến, tuy nhiên phương pháp này cồng kềnh, tốn tiền, mất nhiều thời gian Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt để phát hiện các gen quy định các yếu tố gây bệnh của các loài vi sinh vật Ưu điểm của phản ứng là có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả trong một thời gian ngắn Vì thế, chúng tôi đặc vấn đề nghiên cứu:

“Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng

phản ứng Multiplex PCR”

Mục đích của đề tài: góp phần cung cấp thông tin về chủng C.perfringens

đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu trong những năm gần đây, giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả để giảm thiểu tối đa những thiệt

hại do vi khuẩn C.perfringens gây ra

Nội dung của đề tài:

1) Giám định các đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Clostridium perfringens được phân lập từ dê, cừu mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy tại

3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận;

2) Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR;

3) Đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn C perfringens đã phân lập

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế

Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện Em xin chân thành cám ơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Dựa trên phản ứng trung hòa trên chuột, Wilsdon (1931) đã phân

C.perfringens thành 4 type độc tố: từ type A đến D Wilsdon nhận thấy kháng

huyết thanh của type A chỉ trung hòa được type A, type B trung hòa được tất cả các type còn lại, type C trung hòa được tất cả ngoại trừ type D, type D trung hòa được

cả type A và B Ông nhận thấy rằng các kháng thể có trong huyết thanh làm mất tác dụng của tất cả các loại kháng nguyên Các kháng nguyên sau này được mô tả: alpha có ở tất cả các type, beta có ở type B và C, epsilon có ở type B và D Bosworth (1943) đã phát hiện thêm type E, type này chỉ trung hòa được chính nó và type A Ông cho rằng có một độc tố chưa được phát hiện, sau này mô tả là độc tố iota [18]

Uzal và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi: alpha (Titbal et al 1989), beta (Hunter, 1992), epsilon (Havard, 1992), iota (Perelle 1993) Theo ông thì các gen độc tố có kích thước như sau: alpha: 247 bp; beta 1025 bp; epsilon: 403 bp; iota: 298 bp Kết quả này gen độc tố: alpha: 242 bp; beta: 980 bp; epsilon: 404 bp [43]

Han Sang Yoo và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để định

type độc tố của vi khuẩn C.perfringens trên các đối tượng trâu, bò, lợn và gia cầm ở

Hàn Quốc Kết quả thu được đoạn khuếch đại gen có kích thước như sau: Độc tố

alpha: 402 bp; beta: 236 bp; epsilon: 541 bp; iota: 317 bp [27]

Petrillo và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nam 12 tuổi sau khi ăn ruột lợn bị nhiễm

C.perfringens Kết quả cho thấy kích thước của các gen mã hóa loại độc tố được

khuếch đại như sau: alpha: 324 bp, beta:196 bp và epsilon: 655 bp (epsilon

primers), iota: 446 bp (iota primers), cpb2: 567 bp (beta 2 primers) [42]

Augustynowicz và cộng sự (2002) đã thực hiện phản ứng PCR với việc dùng

cặp mồi PL3/PL7 cho đoạn pcl (gen mã hóa cho C.perfringens phospholipase C) và

cặp mồi PL145/PL146 cho cpe (mã hóa cho C.perfringens Enterotoxin) Kết quả

thu được 70% mẫu lấy từ các ca ngộ độc thực phẩm là type A, 66% mẫu có mang

gene cpe Trong tổng số 63 mẫu đem phân tích có 21 mẫu (33%) pcl+, cpe-, CPE - ;

26 mẫu (41%) pcl+, cpe+, CPE+; 16 mẫu (25%) pcl+, cpe+, CPE- Chỉ có

C.perfringens type A mới mang gene cpe [24]

Bueschel D M và cộng sự (2002) đã xác định tỷ lệ gene cpb2 tìm thấy ở các type vi khuẩn C perfringens bằng việc cải tiến kỹ thuật Multiplex PCR (Meer và Songer, 1996) bằng việc kết hợp thêm cặp mồi đặc hiệu cpb2 (Garmory và cộng sự năm 2000) vào trong phản ứng Tác giả đã sử dụng 3270 chủng C.perfringens phân

lập được từ động vật mắc bệnh viêm ruột và động vật khỏe Kết quả cho thấy: Phần lớn các trường hợp động vật bị bệnh đều định được type vi khuẩn (85,5%), trong đó

chủ yếu là type A chiếm 92,4% Tỷ lệ cpb2 xác định được 37,2% trong tổng số mẫu phân lập Tỷ lệ cpb2 tìm thấy có sự khác nhau giữa các loài Ở lợn bị bệnh viêm ruột tỷ lệ dương tính với cpb2 là 85,8% (n = 1132), có sự tương quan giữa lợn

sơ sinh mắc bệnh viêm ruột hoặc tiêu chảy với tỷ lệ cpb2 (91,8% với n = 256) và

phần lớn là type A, do đó type A là nguyên nhân chính gây bệnh ở lợn sơ sinh Tỷ

lệ cpb2 tìm thấy ở bò là 12,8%(n = 1537), trong đó bò bị bệnh viêm ruột, nhiễm độc

máu, đột tử là 21,4% (n = 336), và ở bê bị viêm ruột và dạ múi khế là 47,3% (n = 93

) Tỷ lệ cpb2 ở dê là 11,7% (n = 34), cừu là 19,2% (n = 52) [19]

Sipos và cộng sự (2003) đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex PCR định type độc tố

vi khuẩn C.perfringens trên các loại động vật khác nhau Kết quả: Ở cừu: 8/10

chủng thuộc type A và 2/10 chủng thuộc type D (chủ yếu tìm được ở cừu non dưới

3 tuần tuổi) Ở lợn: 47/52 chủng thuộc type A (chủ yếu ở lợn con theo mẹ), 5/52 chủng thuộc type C Còn ở dê: 18/26 mẫu thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A và 2/26 mẫu thuộc type E [38]

Wen và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và thấy rằng nguyên nhân gây ngộ độc

do vi khuẩn C.perfringens chủ yếu là do type A sản sinh độc tố Enterotoxin Gene

mã hóa độc tố này nằm trên nhiễm sắc thể Nha bào của những chủng này đều có khả năng chịu được nhiệt độ cao [35]

Kalender và cộng sự (2005) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện các gene mã hóa cho alpha-toxin, beta-toxin, epsilon-toxin, iota-toxin, enterotoxin Kết quả phân lập trong 52 chủng phân lập từ cừu mắc bệnh từ 104 mẫu cừu mắc bệnh viêm ruột hoại tủ có 33 chủng (64%) thuộc Type A, 11 chủng (21%) thuộc Type D, 8 chủng (15%) thuộc Type C Trong 61 chủng phân lập từ cừu khỏe mạnh

từ 194 mẩu cừu khỏe mạnh có 58 chủng (95%) thuộc Type A, 3 chủng (5%) thuộc Type D và không phát hiện gene mã hóa độc tố enterotoxin từ các chủng phân lập

được Từ kết quả đó cho thấy độc tố enterotoxin của C.perfringens không đóng vai

trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử trên cừu [30]

Effat và cộng sự (2007) đã phân lập được vi khuẩn C.perfringens từ các mẫu

gà bị bệnh tại các trang trại gà ở Cario - Ai Cập tại các trang gà bị bệnh viêm ruột hoại tử Kết quả nghiên cứu: tất cả những vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu (trơn, nhẵn, xám, lồi) với hai vòng dung huyết Soi trên kính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không

di động Xác định type độc tố vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu cho 4 gene quy định sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota của vi khuẩn Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [25]

Miyashiro và cộng sự (2007) đã tiến hành mổ khám và nghiên cứu dê 18 tháng tuổi đã chết và có các biểu hiện xung huyết và phù gan và ruột, thận xung huyết Tác

giả phân lập được các chủng vi khuẩn C.perfringens type A từ ruột và type D từ thận

Xét ở mức vi thể thấy xuất hiện một vùng rộng động mạch thận bị tổn thương nghiêm trọng (bệnh mềm thận) Gan xuất hiện hiện tượng xung huyết và tổn thương các tiểu thùy gan Tổn thương nhung mao thành ruột, phù phổi, xung huyết tiểu não và đại não [34]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự (1995) đã nghiên cứu vai trò

của vi khuẩn C.perfringens của hươu, nai và chọn lựa được chủng cường độc để

điều chế vắc-xin giải độc tố [7]

Nguyễn Bá Hiên và cộng sự (1999) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một gam phân trâu, bò bị tiêu chảy (42,73 x 106) cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình thường (7,53 x 106) [4]

Lê Văn Tạo và cộng sự (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn yếm khí

C perfringens từ trâu, bò chết đột ngột tại các tỉnh phía Bắc, vi khuẩn có độc lực

cao trên động vật thí nghiệm

Nguyễn Văn Sửu và cộng sự (2003) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một gam phân bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình thường

Tác giả khẳng định vi khuẩn C.perfringens có vai trò quan trọng trong hội chứng

tiêu chảy ở gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng [10]

Lê Lập và cộng sự (2007) nghiên cứu sự lưu hành các type độc tố của các vi

khuẩn C.perfringens phân lập từ bò, bê, dê và cừu mắc bệnh tiêu chảy nuôi tại một

số tỉnh duyên hải miền Trung bằng kỹ thuật Multiplex PCR Kết quả cho thấy

những chủng vi khuẩn C.perfringens phân lập từ phân bò, bê, dê, cừu tiêu chảy đều thuộc type A mang gen cpa mã hóa sản sinh độc tố anpha, song những chủng phân lập từ phủ tạng của dê, cừu tiêu chảy lại thuộc type D, mang gen cpa và etx [3]

Để xác định vai trò của vi khuẩn yếm khí C.perfringens gây hội chứng tiêu

chảy, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) đã tiến hành phân lập và giám định các đặc tính sinh học của vi khuẩn trong phân bò, lợn mắc hội chứng tiêu chảy nuôi tại

Hà Nội và vùng lân cận Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập mang đầy

đủ các đặc tính sinh học của loài, có độc tố gây chết chuột Kết quả định typ bằng

kỹ thuật multiplex PCR cho thấy: các chủng C.perfringens phân lập từ bò thuộc typ

A (48,1%) và typ D (51,9%); các chủng phân lập từ lợn thuộc typ A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta2 (18,9%) [2]

1.2 Đặc tính của vi khuẩn C.perfringens

Feser (1865) lần đầu tiên phát hiện C.perfringens, sau đó các tác giả khác lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra Loài C.perfringens lần

đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892) trong tổ chức có hơi

của xác người chết và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii

Hiện nay C perfringens được phân loại như sau [49]:

1.2.1 Đặt điểm hình thái và tính bắt màu

Vi khuẩn C.perfringens là trực khuẩn ngắn, yếm khí, bắt màu thuốc nhuộm

Gram dương (hình 1.1) Vi khuẩn có thể đứng riêng rẽ, kết thành chuỗi hoặc đứng song song Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4 × 1,3 – 19 µm ) [21], [22]

Hình 1.1: Vi khuẩn C perfringens

Vi khuẩn không có khả năng di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật Vi khuẩn có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50°C, phát triển chậm ở 20°C, phát triển nhanh ở 43 - 47°C Thời gian thế hệ vào khoảng 8 - 10 phút

và trong quá trình phát triển có sản sinh khí [17], [3] Kích thước bộ gene của

C.perfringens nằm trong khoảng 3.0 - 3.7 Mb và tỷ lệ G - C của DNA của C.perfringens là 24 - 27% [17]

1.2.2 Đặt tính nuôi cấy

C perfringens là vi khuẩn dinh dưỡng hữu cơ yếm khí Vi khuẩn phát triển tốt

ở nhiệt độ từ 200C - 500C, ở nhiệt độ tối thích 450C sau 8 giờ vi khuẩn sẽ mọc [9]

Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan và hơi lệch tâm nhưng không tìm thấy nha bào trong những môi trường thông thường Việc hình thành nha bào đòi hỏi sự có mặt của đường và protein và trong những điều kiện đặc biệt [9]

- Trên môi trường Fluid thioglycolate: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường

- Trên môi trường thạch máu: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của

C.perfringens tròn, nhẵn và bóng; được bao bởi một vòng bên trong dung huyết

hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha) Hiện tượng này là dung huyết beta (hình 1.2) trên môi trường nuôi cấy thạch máu [22]

Trên môi trường SPS (Perfringens Slection Agar) hoặc TSC agar (Tryptose Sulfit-Cycloserin Agar): Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen, do vi khuẩn sinh H2S kết hợp với Fe (Fe có sẵn trong môi trường) tạo thành FeS có màu đen [22]

Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm đục môi trường

Hình 1.2 Hiện tượng dung huyết beta 1.2.3 Đặt tính sinh vật, hóa học

- Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, maltose, sucrose Không lên men Mannitol, không sinh Indol [17]

- Trên môi trường Egg yolk, vi khuẩn C perfringens phát triển sản sinh men

Lecithinase phân giải Lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc

- Trên môi trường Litmus milk, vi khuẩn lên men đường Lactose, làm đông vón Casein Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH Litmus Khi cục axit vỡ sẽ tạo thành gas

1.2.4 Đặt tính di truyền

C.perfringens là loài điển hình để nghiên cứu genome vì chúng có khả năng

phát triển nhanh chóng và việc thao tác trên bộ gene của C.perfringens cũng dễ

dàng hơn các chủng khác

Năm 2002, cấu trúc bộ gene của C.perfringens đã được công bố Bộ nhiễm sắc

thể bao gồm 3.031.430 cặp bp; có 2.660 vùng mã hóa cho các protein; 10 loại RNA vận chuyển và hàm lượng C+G vào khoảng 28.6%

Khi so sánh hệ gene của C.perfringens với hệ gene của những loài vi khuẩn không có khả năng gây bệnh như C.acetabutylicum thì ta thấy rằng sự khác biệt

chính giữa hai bộ gene của hai loài này chủ yếu là do những gene có khả năng sinh

độc tố của C.perfringens [16]

Ngoài những gene đã biết, Shimuzu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác

có trong hệ gene của C.perfringens 5 gene có khả năng gây dung huyết được xác

định dựa vào các loài vi khuẩn có khả năng dung huyết khác đã được phân loại trước đó, do giữa chúng có sự tương đồng với nhau Hai type có gene qui định

protein liên kết với fibronectin được xác định là tương tự gene của Listeria

monocytogenes và Bacillus subtilis Từ đó cho thấy các tác nhân gây độc có mối

liên quan đến nhau [16]

Việc xác định trình tự bộ gene của vi khuẩn C.perfringens cho thấy các gene

gây độc không có tác động cộng gộp với nhau mà có sự tác động riêng rẽ Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng độc tố alpha là loại độc tố được tất cả các type vi

khuẩn C.perfringens sản sinh ra Gene mã hóa các loại độc tố ở vi khuẩn này không

chỉ nằm trên nhiễm sắc thể mà còn có trên plasmid

Bảng 1.1 Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens

1.3 Các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens

1.3.1 Alpha toxin (CPA)

Tất cả các type của vi khuẩn C.perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố này Gene mã hóa cho độc tố alpha là cpa Cpa nằm trên nhiễm sắc thể của vi

khuẩn Trọng lượng phân tử của gen khoảng 43kDa, gồm 1.197 nucleotid mã hóa cho 399 axit amin Hàm lượng G + C thấp, chỉ khoảng 34% tổng Nu trong bộ gen

cpa Điểm đẳng điện pI 5,4 [28]

CPA là một phospholipase C, có khả năng thủy phân phosphotidylcholine và sphingomyeline Phản ứng chỉ xảy ra khi có mặt enzyme phosphotidase, enzym này chỉ hoạt động được khi có ion Ca2+ trong tế bào [22] Phản ứng đặc trưng để nhận biết sự có mặt của độc tố CPA là phản ứng phân giải lecithin trên môi trường Egg yolk, tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc Khả năng tạo vòng dung huyết trên môi trường thạch máu Để chứng minh cho khả năng tạo ra 2 phản ứng trên của CPA, Titball và cộng sự (1989) đã tiến hành chèn đoạn gene mã hóa độc tố

CPA vào plasmid của vi khuẩn E.coli và nhận thấy rằng vi khuẩn E.coli mang

plasmid tái tổ hợp này có khả năng tạo ra phản ứng phân giải lecithin trên môi

trường Egg yolk và tạo vòng dung huyết trên môi trường thạch máu [41]

Khi xâm nhập vào cơ thể, CPA sẽ làm tăng tính thấm thành mạch, tăng tính bám của tiểu cầu, gây xung huyết và hoại tử cơ Độc tố này gây bệnh hoại thư sinh hơi, hoại tử ruột và gây nhiễm độc máu ở một số động vật như bò, dê, ngựa…[22]

1.3.2 Beta toxin (CPB)

Là độc tố được sản sinh bởi vi khuẩn C.perfringens type B và type C Gene

mã hóa cho độc tố beta là cpb, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn Cpb có

trọng lượng phân tử khoảng 40 kDa, tương đương với 1.113 nucleotid mã hóa cho

371 axit amin, điểm đẳng điện pI = 5,6 Cả 2 đặc tính trên đều gần giống cpa, vì vậy

rất khó để phân tách được 2 độc tố CPA và CPB nếu chỉ dựa vào 2 đặc điểm trên

Hàm lượng G + C trên cpb tương đối thấp, chỉ chiếm khoảng 28,5% Nu tổng số

[22]

Theo Lawrence và Cook năm 1980, CPB ở vi khuẩn C.perfringens type C bị

ức chế bởi sự hoạt động của enzyme protease Khi con vật còn nhỏ chúng rất mẫn cảm với bệnh gây ra bởi CPB so với con trưởng thành, bởi vì trong đường ruột của con vật còn non có ít enzym có khả năng bất hoạt độc tố này Mặc khác, trong sữa đầu của mẹ có yếu tố làm ức chế hoạt động của enzym protease, điều này càng làm tăng tính dễ bị tổn thương của con non đối với độc tố beta CPB còn có khả năng giải phóng catecholamines vào máu, làm huyết áp tăng nhanh, nhịp tim giảm mạnh

ở động vật mắc bệnh [31] CPB là nguyên nhân gây nên bệnh viêm ruột hoại tử ở heo, dê, cừu và cả ở người, chúng gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ Ngoài ra, CPB còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến quá trình trao đổi Canxi màng gây rối loạn các chức năng thần kinh bình thường [22]

1.3.3 Epsilon toxin (ETX)

Độc tố epsilon được tạo ra bởi vi khuẩn C.perfringens type B và type D ETX được mã hóa bởi gene etx, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn, trọng

lượnaephan tử khoảng 34,25 kDa ETX được tiết ra dưới dạng tiền độc tố và được hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin [35] Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho EXT hoạt động [22] ETX được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong Tại đây độc tố làm tăng áp lực trong thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan

và thận [28] ETX tác dụng lên nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên

màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận

1.3.4 Iota toxin (CPI)

Độc tố Iota được tiết ra bởi vi khuẩn C.perfringens type E Gen mã hóa độc tố

này nằm trên plasmid CPI là độc tố gồm 2 phần là 2 polypeptid độc lập với nhau

Vị trí hoạt hóa enzyme gọi là Iota a (gene mã hóa Ia) và vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích Iota b (gene mã hóa Ib) Chuỗi nặng Ib có trọng lượng phân tử

khoảng 71,5 kDa, pI = 4,2, sẽ gắn độc tố với tế bào biểu mô đích và giúp cho chuỗi nhẹ Ia có trọng lượng phân tử 47,5 kDa, pI = 5,2 thấm qua màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào CPI gây nên các triệu chứng về bệnh nhiễm độc

tố, bệnh đường ruột ở cả bò, bê, chuột lang và thỏ Ngoài ra, khi vào cơ thể CPI sẽ

là tăng tính thấm thành mạch của tế bào vật chủ [22]

1.3.6 Delta toxin

Được sản sinh bởi vi khuẩn C.perfringens type B và type C Gene mã hóa độc

tố này có trọng lượng phân tử khoảng 42 kDa và pI = 7,1 Độc tố Delta là chất gây nên hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê, và heo Tuy nhiên, độc tố này lại bị ức chế bởi các hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các loại động vật có vú khác [22]

1.3.7 Theta toxin

Được tạo ra bởi tất cả các type của vi khuẩn C.perfringens Là yếu tố tạo nên một trong hai vòng dung huyết của khuẩn lạc vi khuẩn C.perfringens, khi nuôi cấy

chúng trên môi trường thạch máu Độc tố này có khả năng tiêu hủy tế bào và rất dễ

bị biến đổi hoạt tính khi có oxi Gene mã hóa của Theta nằm trên nhiễm sắc thể của

vi khuẩn [39] Thời gian gần đây nhiều tác giả còn đề cập đến beta 2 toxin (Beta2)

Gen mã hóa độc tố Beta2 nằm trên plasmid Độc tố thường gây triệu chứng tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên

1.4 Các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens và khả năng gây bệnh

C.perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau Dựa vào 4 loại độc tố

chính (alpha, beta, epsilon, iota) mà vi khuẩn sinh ra người ta chia ra thành 5 type khác nhau (A, B, C, D và E)

Bảng 2.2 Các type vi khuẩn C.perfringens và độc tố chính

Các type độc tố khác nhau thường gây các thể bệnh khác nhau ở gia súc, gia

cầm và ở người được thể hiện ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens

Type độc

tố

A α Ngộ độc thức ăn, tiêu chảy ở người, viêm ruột hoại tử ở gia

cầm, viêm ruột kết ở ngựa, hoại thư sinh hơi…

B α, β, ε Bệnh lỵ ở cừu non, tiêu chảy mãn tính ở cừu trưởng thành,

viêm ruột hoại tử ở bê và ngựa sơ sinh…

C α, β Viêm ruột hoại tử ở gia cầm, các bệnh đường ruột cấp tính

ở cừu trưởng thành, xuất huyết đường ruột ở ngựa, heo, bê…

D α, ε Bệnh đường ruột ở cừu, bê, bò, viêm ruột kết ở dê non và

dê trưởng thành…

E α, ι Bệnh lỵ ở cừu, viêm ruột kết ở bò, bê, chuột lang, thỏ…

1.4.1 Type A

Các chủng C.perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột, môi

trường sống của những động vật máu nóng và đất [17] Độc tố type A gây nên sự viêm nhiễm ở các vết thương, gây hoại thư sinh hơi và còn là yếu tố chính gây nên các bệnh về đường ruột ở động vật Các chủng type A cũng thường được phân lập

từ vùng tai giữa, dạ múi khế ở bê mắc bệnh Triệu chứng thường thấy ở những con vật này là xuất huyết niêm mạc dạ múi khế Cũng có thể xuất hiện một vài hiện tượng của bệnh tiêu chảy nhưng những thương tổn đường ruột thường không thể nhận thấy vì quá trình tự phân diễn ra rất nhanh [11]

C.perfringens type A cũng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Triệu chứng

đầu tiên khi gà bị mắc bệnh là giảm cân, sau đó là suy nhược, biếng ăn, tiêu chảy Những triệu chứng trên thường diễn ra trong một thời gian rất ngắn, khó quan sát được hiện tượng và khi phát hiện thì gà đã chết Vi khuẩn type A thường tồn tại trong đường tiêu hóa của gà, đất, bụi và những phần thức ăn bị ôi thiu Chế độ ăn

uống không hợp lý cũng có thể làm gia tăng số lượng vi khuẩn C.perfringens trong

ruột gà lên, dẫn tới bệnh hoại tử đường ruột ở gà Số lượng gà chết do vi khuẩn

C.perfringens sẽ là rất ít nếu chúng được tiêm chủng với 2 loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoặc Enterococcus faecalis Việc phát triển một trong hai

loại vi khuẩn này trong đường ruột gà sẽ ngăn chặn khả năng sản sinh độc tố alpha

của vi khuẩn C.perfringens [11]

Bệnh đường ruột do type A gây nên cũng được phát hiện ở lợn sữa, với những triệu chứng thường thấy như rụng lông hay hoại tử đường ruột dạng nhẹ Hiện tượng trên thường phát triển ở những vùng ruột nhỏ của lợn như ruột chay và ruột hồi Khi nuôi cấy vi khuẩn từ những vùng tổn thương này thì số lượng vi khuẩn

C.perfringens thấy được là rất lớn [11]

1.4.2 Type B

C.perfringens type B là tác nhân chính gây nên bệnh lị ở cừu non và cả cừu

trưởng thành Cừu non có thể mắc bệnh lị ngay từ những ngày đầu tiên khi mới sinh ra Nguyên nhân là do sự lây nhiễm vi khuẩn này từ cừu mẹ và môi trường sang cừu con Lúc này, vi khuẩn trong đường ruột sẽ tăng lên một cách nhanh

chóng, đặc biệt là khi cừu con bú sữa mẹ Kết quả là ruột cừu sẽ bị loét và xuất huyết, rồi chết một cách nhanh chóng Triệu chứng cấp tính có thể nhận thấy là cừu không ăn uống, đau bụng, cộng với hiện tượng tiêu chảy ra máu, nằm nghiêng, hôn

mê và chết chỉ trong vòng 24 giờ Tỷ lệ mắc bệnh này ở cừu khoảng 30%, trong một vài trường hợp tỷ lệ này có thể lên đến 100% Bệnh mãn tính ở những cừu trưởng thành cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng sẽ không bị tiêu chảy Ngoài ra, type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất huyết đường ruột ở dê,

bê, lừa và ngựa [11]

Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây độc của vi khuẩn type B này đối với động vật Khả năng gây độc của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại độc

tố khác thì vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi [17]

1.4.3 Type C

Vi khuẩn C.perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà, chó và

cả người Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất Vi khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ Sự thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một yếu tố

thuận lợi cho sự xâm nhiễm của vi khuẩn C.perfringens type C vào cơ thể vật chủ

Tỷ lệ lây nhiễm thường khác nhau ở những bầy đàn, chuồng trại khác nhau, thông thường khoảng 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn kịp thời trong vòng 24 tiếng thì tỷ lệ đó có thể lên đến từ 50 – 100% Lợn con là loài dễ bị lây nhiễm hơn cả, bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ từ 1 đến 2 ngày tuổi Triệu chứng

đi kèm là suy nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ, xuất hiện máu và những tế bào ruột

bị hoại tử ở trong phân Đối với lợn được 1 đến 2 tuần tuổi, khi mắc bệnh thời gian điều trị sẽ phải kéo dài, vì lúc này các triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn nhiều, như mất nước, tiêu chảy cấp, niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại

tử Hoại tử không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả màng cơ nhẵn trong một số lớp màng nhầy khác [11] Triệu chứng bệnh cũng được thấy tương tự ở dê, bò và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất phương hướng…

nếu không được điều trị kịp thời [16]

Cừu khoảng từ 3 đến 10 tuần tuổi hay những con cừu cái đang cho con bú sẽ rất dễ bị mắc bệnh do độc tố type D gây ra Cừu non sau khi cai sữa sẽ không sử dụng sữa mẹ như là thức ăn chính nữa mà thay vào đó là những loại cây cỏ hay thức

ăn có hàm lượng tinh bột cao Chính sự thay đổi thành phần, hàm lượng các chất có trong thức ăn làm rối loạn hoạt động của đường ruột trong một thời gian ngắn Vì vậy, đây là lúc mà con vật dễ bị tiêm nhiễm độc tố type D nhất [23] Độc tố này cũng gây nên các bệnh tương tự ở dê, bê, bò, ngựa Tuy nhiên, riêng đối với dê, còn xuất hiện một số triệu chứng khác như viêm chảy, tơ huyết, xuất huyết đường ruột, nhưng lại không bị mềm thận như ở cừu…

1.4.5 Type E

Trước đây, khả năng gây bệnh của type vi khuẩn này còn chưa được nhiều tác giả nói đến, vì những nghiên cứu về nó vẫn chưa nhiều Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc xác định được gene mã hóa độc tố iota của vi khuẩn

C.perfringens type E đã tạo nên những bước ngoặc mới Khả năng gây độc của độc

tố iota ở C.perfringens cũng tương tự như độc tố ở vi khuẩn C.spiroforme, một loại

vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều [16] Ngoài khả năng gây nhiễm độc tố đường ruột ở bò bê, chuột lang và thỏ, thì độc tố này còn có thể gây nên bệnh lỵ ở cừu

1.5 Phản ứng PCR

Phương pháp PCR được Kleppe và cộng sự phác thảo lần đầu tiên vào năm

1971 và sau đó được nhà hóa sinh học K Mullis biến thành hiện thực năm 1985, là phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các

đoạn DNA mà không qua tạo dòng Kỹ thuật này được gọi là polymerase chain

reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền

Bằng phương pháp PCR đã phát hiện được các tác nhân gây bệnh nguy hiểm

là những vi sinh vật, phát hiện được các bệnh lý do rối loạn hay đột biến phân tử, truy tìm các dấu ấn di truyền để tìm hiểu các mối quan hệ huyết thống Đặc biệt mở

ra một triển vọng ứng dụng trong theo dõi điều trị bệnh AIDS bằng thuốc kháng AIDS cũng như trong nghiên cứu quy trình công nghệ sinh học chế tạo các dược phẩm protein

1.5.1 Nguyên tắc thực hiện

PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzym DNA polymerase Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu

trình nhiệt lặp lại (có thể lên đến 40 lần) gồm: đun nóng (950C), làm nguội

(37-650C) và ủ dài ở 720C Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng

Nhờ vậy 1 mạch kép DNA, sau phản ứng do DNA polymerase thực hiện sẽ

thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới: 2 thành 4 và

4 thành 8 theo cấp số nhân Phản ứng PCR thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ,

có mẫu DNA, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống có điều chỉnh thành chu kì nâng nhiệt và làm nguội theo chương trình định sẵn gọi là themocycler,

đây chính là máy luân nhiệt PCR [12]

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo

lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi

Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật PCR, dẫn đến kết quả là một đoạn DNA định trước sẽ được “nhân lên” với một số lượng lớn [1]

Hình 1.3 Phản ứng PCR 1.5.2 Các thành phần cơ bản tham gia phản ứng PCR

* Mồi

Là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu 3’ của đoạn DNA cần khuếch đại Mồi gồm có mồi xuôi và mồi ngược Mồi xuôi là trình tự nucleotide bắt cặp với đầu 5’ của đoạn DNA cần khuếch đại [14] Mồi ngược là mồi bắt cặp với đoạn 3’ của đoạn DNA khuôn mẫu Trình tự primer cần có kích thước hợp lí, khoảng 18 và 25 nucleotide Việc chọn lựa trình tự primer cũng có vai trò quan trọng Cần chọn thế nào để tránh sự bắt cặp bổ sung bên trong hoặc bên ngoài phân tử không như ý [12]

Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi Mồi quá ngắn

sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính Nhiệt độ biến tính quá cao, ví

dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt

độ đó Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C

* DNA khuôn mẫu

Vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR là DNA làm khuôn, có chứa đoạn gene

mà ta cần nhân lên trong quá trình thực hiện phản ứng PCR

Hàm lượng DNA làm khuôn cần cho phản ứng rất nhỏ Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 100 nanogram (ng) DNA làm khuôn là đủ Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể thực hiện thành công chỉ

từ một phân tử DNA riêng rẽ, tức là chỉ cần DNA làm khuôn từ duy nhất một tế bào

Một ưu thế khác đối với mẫu là không cần sự tinh sạch cao Nhờ vậy, có thể dùng PCR cho các vết máu, mẫu khảo cổ, DNA cổ xưa hoặc vi khuẩn đã bị hấp khử trùng Tuy vậy, trong nhiều trường hợp cần chuẩn bị mẫu tốt để kết quả chắc chắn hơn [12]

* dNTPs (Deoxynucleotide triphosphat)

Là dung dịch gồm 4 thành phần deoxynucleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) Nồng độ sử dụng dung dịch dNTP sẽ tuỳ thuộc vào các điều kiện phản ứng chung

* Enzyme DNA – polymerase

Có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu Các enzyme DNA – polymerase hiện nay đều có tính chịu nhiệt, không bị huỷ ở

giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của enzyme DNA – polymerase Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR

1.5.3 Các bước tiến hành

Hình 1.4 Chu trình nhiệt PCR

Phản ứng PCR được tiến hành từ 25 -40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1 (Biến tính): nhiệt độ 94 - 960C Ở nhiệt độ này, cầu nối hydrogen của mạch DNA kép (ds DNA) sẽ bị phá vỡ, tách sợi DNA ra thành các sợi đơn (ss DNA) Trong kỹ thuật PCR, thông thường người ta thực hiện bước biến tính DNA trước khi bước vào chu kỳ, để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn

và chỉ còn sợi đơn Thời gian thường 1 – 2 phút

- Bước 2 (Bắt cặp của mồi vào sợi khuôn): nhiệt độ 45 - 600C Sau bước 1, hai sợi DNA tách ra, lúc này nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào đặc tính của đoạn mồi, nhiệt

độ sai trong giai đoạn này dẫn đến đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian khoảng 1 - 2 phút

- Bước 3 (Kéo dài chuỗi): nhiệt độ 68 - 720C Ở bước này, DNA polymerase bắt đầu bám vào và làm việc dọc theo sợi DNA Sự tổng hợp này cần sự hiện diện của các deoxynucleotid triphosphate ( dNTP ) Thời gian của bước này phụ thuộc vào chiều dài DNA polymerase và DNA khuôn mẫu Mất 1 phút cho 1 đoạn gene có kích thước 1kb

Tùy vào số lượng DNA cần khuếch đại, mà số chu kỳ trong phản ứng PCR có thể dao động từ 25 - 40chu kỳ Ở chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong 5

- 10 phút sao cho tất cả các sợi DNA có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối cùng, nhiệt độ được hạ xuống 40C để bảo quản mẫu [1]

1.5.4 Phân tích kết quả

Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 ÷ 2% để phát hiện đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp)

Nguyên tắc: Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích

các đại phân tử tích điện Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường

sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA

bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR

Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về các cực Vận tốc di chuyển của các phân tử tuỳ thuộc vào tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của chính các phân tử này Như vậy giữa các phân tử có cùng điện tích, phân tử nào có khối lượng lớn hơn sẽ di chuyển về cực ngược dấu chậm hơn

Acid Nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm vì vậy chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường Trên cùng một bản gel có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển trên trên gel càng chậm Vì vậy tuỳ theo kích thước phân tử và tuỳ theo mức

độ cần phân tách mà người ta chọn loại gel và nồng độ gel thích hợp để dùng trong điện di

Có hai loại gel thường dùng trong điện di là:

- Gel agarose: Thích hợp trong phân tích các DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp base Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

- Gel polyacrylamide: Thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn có kích thước dưới 500bp Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai phân

tử DNA chỉ sai khác nhau 1 nucleotide

Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp hiện hình Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide (C21H20BrN3)

Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của các phân

tử DNA Do đó các phân tử DNA sẽ gắn kết với ethidium bromide và phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia tử ngoại Dựa vào vị trí các vệt huỳnh quang này người ta biết vị trí các đoạn DNA trên gel Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay bằng các đầu đọc tử ngoại chuyên biệt

Trong điện di, người ta thường dùng thang DNA chuẩn với mục đích so sánh

và ước lượng kích thước của các phân tử điện di Các thang chuẩn này là hỗn hợp nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA) hay protein (đối với thang protein) đã biết kích thước Dựa vào kích thước đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào

sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thước các phân tử mục tiêu[15]

1.5.5 Các yếu tố ảnh hưởng

* DNA mẫu làm khuôn

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1 ÷ 1,5 kb Mẫu DNA tinh sạch

sẽ cho kết quả tốt Tuy nhiên, kỹ thuật chẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không cần có độ tinh sạch cao, như vết máu khô, những mẫu vật khảo cổ (tóc, móng tay người đã chết) Phương pháp này cho phép xác định DNA với một lượng thấp, khoảng nhỏ hơn 100ng (1g =109ng)[14]

* Enzyme DNA polymerase

Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase (do phản ứng luôn phải thực hiện ở nhiệt độ khác nhau)

Đầu tiên người ta sử dụng các đoạn Klenow của DNA – polymerase I từ E

coli ở 37oC, vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả không cao (phải thêm enzyme mới vào mỗi phản ứng sau một lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân huỷ, và sự nhân bản giả cao) do đó đã nhận được đoạn cần nhân không tinh sạch Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng

với sự phát triển của enzyme Taq - polymerase có nguồn gốc vi khuẩn Thermus

aquaticus sống ở suối nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao Với enzyme này cho

phép nhân được các DNA tinh sạch Điều này cho phép tự động hoá tất các bước của chu trình nhân bản DNA Từ đó, máy chu trình nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển về cả nhiệt độ và thời gian Ngày nay có rất nhiều hãng trên thế giới sản xuất máy chu trình nhiệt PCR như: Perkin Elmer, MJ, Eppendorf

Nhược điểm của enzyme này là không tổ hợp được trình tự DNA dài quá 3kb, hơn nữa, enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép Hiện nay

có nhiều enzyme polymerase chịu nhiệt mới được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn, như là Tth - polymerase tách từ vi khuẩn

Themus thermophilus, Elogase (bao gồm nhiều enzyme kết hợp trong đó có sự tham

gia của Taq - polymerase)

* Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuyếch đại đặc trưng và

có hiệu quả cao Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:

- Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc

- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuyếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)

- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi quá ngắn (<10 nucleotit) mồi sẽ không đặc hiệu, nếu mồi quá dài (>30 nucleotit) chu kỳ nhiệt ở giai đoạn 3 sẽ ảnh hưởng đến cơ chế bám của mồi

- Nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72oC

* Ảnh hưởng của nucleotide

Cần phải có bốn loại nucleotide dạng deoxynucleotit triphosphat bao gồm: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ mỗi loại nuleotide cao hay thấp hơn sẽ dẫn đến hiện tượng sao chép giả

* Môi trường phản ứng

Ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ

Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150 ÷200µM Nồng độ chuẩn cho từng khoảng tương ứng, phải được thực hiện trong điều kiện nhất định

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kì ion lạ nào Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và enzyme phân huỷ acid nucleic Môi trường dung dịch đệm phải ổn định

* Thời gian và số lượng chu kỳ

Qua nghiên cứu cho thấy: Tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau Ngoài ra, thời gian cho mỗi phản ứng còn phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần nhân dòng

Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR thông thường trong khoảng 30 đến 40 chu kỳ Bởi vì phản ứng PCR diễn biến theo hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, và đến một giới hạn nào đó thì bản sao giảm, hiệu quả khuyếch đại giảm do các nguyên nhân:

- Nồng độ nucleotide giảm

- Xuất hiện sản phẩm phụ

- Do các bản sao không bắt cặp với mồi mà chúng bắt cặp với nhau

- Ngoài ra, số chu kỳ phụ thuộc vào số bản mẫu ban đầu, nếu số bản mẫu là

105 thì thực thiện 25 ÷ 30 chu kỳ, còn số mẫu 102 ÷ 103 thì thực hiện 35 ÷ 40 chu

kỳ

* Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng Tuy nhiên, ứng với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng cu khuyếch đại riêng

Phương pháp này đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA gồm có phân tích mất đoạn đột biến, đa hình hoặc trong các phương pháp định lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR)

1.5.7 Những lợi ích của phản ứng PCR

Phương pháp PCR có ý nghĩa rất lớn đối với khoa học và thự tiễn Đây thực

sự là một cuộc cách mạng lớn trong kỹ thuật di truyền Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn:

- Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm Trong khi đó phương pháp tạo dòng của kỹ thuật tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn

- Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu và được sử dụng đồng thời Trong khi đó, phương pháp tạo dòng điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotide triphosphat mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần các thao tác khéo léo đặc biệt

- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic axit thô Ví dụ, mẫu máy bay hay các dấu vết trong phân tích pháp y Điều này ngược lại với kỹ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gene hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết

Khó khăn nhất của phương pháp này là phải biết trình tự của nucleotide của đoạn DNA cần được khuếch đại Phương pháp nạy không thay thế phương pháp tái

tổ hợp DNA mà nó góp phần bổ sung cho phương pháp tái tổ hợp DNA

Nhờ các lợi ích trên, PCR đã có sức hấp dẫn ngay từ lúc ra đời trong việc khuếch đại các trình tự nucleic acid đặc hiệu và chuẩn đoán phân tử

Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng trong các lĩnh vực sau:

- Phân tích di truyền vệt máu khô

- Chuẩn đón bệnh lây truyền, di truyền

- Dự báo sai hỏng về di truyền

- Nghiên cứu các DNA từ các mẫu khảo cổ [8]

1.5.8 Các loại PCR

Từ khi ra đời đến nay, PCR có vai trò cách mạng hóa trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau như chuẩn đoán nhanh, giải trình tự chuỗi bộ gene, gây đột biến điểm định hướng….Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế bào) với cả DNA và RNA Sức mạnh của PCR kết hợp với các kỹ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới

Do dễ thực hiện, đơn giản và có nhiều ứng dụng rộng rãi, nên PCR được hoàn thiện không ngừng Trong một thời gian ngắn, nhiều biến dạng PCR mới ra đời

- RT - PCR (reverse transcriptase PCR) là kỹ thuật mà RNA có thể được dùng làm khuôn mẫu cho sự khuếch đại PCR sau khi chuyển đổi thành c-DNA, còn gọi là RNA - PCR hay RT – PCR RT – PCR nhạy hơn các phương pháp khác được dùng cho sự phân tích RNA

- RT - PCR cạnh tranh (competitive RT – PCR) là kỹ thuật thường được dùng trong định lượng các loại mRNA chuyên biệt

- Real - Time PCR (PCR thực thời) là phương pháp có thể giúp phát hiện những sản phẩm PCR tại thời điểm thực tế trong quá trình khuếch đại gene Nhờ vậy, có thể đánh giá sự tích lũy sản phẩm và định lượng qPCR (quantitative PCR –

là PCR định lượng)

- PCR - ELISA (enzym linked immunoassay) là sự kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đoán